Tiêu chuẩn TCVN XI-5:2025 Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 5: Vắc xin và sinh phẩm y tế

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN XI-5:2025

BỘ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA VỀ THUỐC – PHẦN 5: VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ

Set of national standards for medicines - Part 5: Vaccines and biological products

 

Lời nói đầu

TCVN XI-5:2025 do Hội đồng Dược điển Việt Nam biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

Lời giới thiệu

Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc TCVN XI-5:2025 được xây dựng trên nguyên tắc nối tiếp Bộ TCVN I:2017, Bộ TCVN II:2012, Bộ TCVN III:2014, Bộ TCVN IV:2015, Bộ TCVN V:2017 và Bộ TCVN VI:2017, Bộ TCVN VII:2021, Bộ TCVN VIII:2022, Bộ TCVN IX:2024 và Bộ TCVN X:2025.

Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc này gồm 10 tiêu chuẩn về Vắc xin và sinh phẩm y tế.

Danh pháp, thuật ngữ trong Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc được viết theo quy định của Hội đồng Dược điển Việt Nam, Bộ Y tế. Các thuật ngữ dược phẩm được viết dựa trên nguyên tắc việt hoá tên chung quốc tế Latin (DCI Latin) một cách hợp lý nhằm giữ các ký tự cho sát với thuật ngữ quốc tế. Tên hợp chất hữu cơ được viết theo danh pháp do Hiệp hội quốc tế hoá học thuần túy và ứng dụng (I.U.P.A.C) quy định. Trong một số trường hợp cá biệt, các thuật ngữ tiếng Việt đã quen dùng đối với một số nguyên tố, hoá chất vẫn tiếp tục sử dụng.

 

BỘ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA VỀ THUỐC – PHẦN 5: VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ

Set of national standards for medicines - Part 5: Vaccines and biological products

1 Phạm vi áp dụng

Bộ tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm nghiệm, bảo quản và các yêu cầu có liên quan đến chất lượng đối với vắc xin và sinh phẩm y tế.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn có ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả sửa đổi bổ sung (nếu có).

TCVN I-1:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm Quy định chung và các Phụ lục như sau:

Phụ lục 1: Từ phụ lục 1.1 đến phụ lục 1.24;

Phụ lục 2: Từ phụ lục 2.1 đến phụ lục 2.5;

Phụ lục 3: Từ phụ lục 3.1 đến phụ lục 3.6;

Phụ lục 4: Từ phụ lục 4.1 đến phụ lục 4.4;

Phụ lục 5: Từ phụ lục 5.1 đến phụ lục 5.7;

Phụ lục 6: Từ phụ lục 6.1 đến phụ lục 6.11;

Phụ lục 7: Từ phụ lục 7.1 đến phụ lục 7.11;

Phụ lục 8: Từ phụ lục 8.1 đến phụ lục 8.3;

Phụ lục 9: Từ phụ lục 9.1 đến phụ lục 9.10;

Phụ lục 10: Từ phụ lục 10.1 đến phụ lục 10.19;

Phụ lục 11: Từ phụ lục 11.1 đến phụ lục 11.8;

Phụ lục 12: Từ phụ lục 12.1 đến phụ lục 12.20;

Phụ lục 13: Từ phụ lục 13.1 đến phụ lục 13.10;

Phụ lục 14;

Phụ lục 15: Từ phụ lục 15.1 đến phụ lục 15.41;

Phụ lục 16: Từ phụ lục 16.1 đến phụ lục 16.2;

Phụ lục 17: Từ phụ lục 17.1 đến phụ lục 17.8;

Phụ lục 18.

TCVN I-5:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 5: Vắc xin và sinh phẩm y tế.

TCVN II:2012, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm các phụ lục như sau: Phụ lục 1.25; phụ lục 4.5; phụ lục 6.12; phụ lục 12.21 và phụ lục 12.22.

TCVN III:2014, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm các phụ lục như sau: Phụ lục 15.42 và phụ lục 15.43. Phần 5: Vắc xin.

TCVN IV:2015, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm phụ lục 10.20. Phần 6: Vắc xin.

TCVN V:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc và chuyên mục; gồm các phụ lục như sau: Phụ lục 1.26; phụ lục 6.13; phụ lục 10.21; phụ lục 10.22; phụ lục 11.9; phụ lục 11.10; phụ lục 12.23; phụ lục 13.11; phụ lục 15.44; phụ lục 15.45; phụ lục 15.46 và phụ lục 15.47. Phần 5: Vắc xin.

TCVN VI:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc và chuyên mục; gồm các phụ lục như sau: Phụ lục 1.27; phụ lục 4.6; phụ lục 4.7; phụ lục 4.8 và phụ lục 12.24. Phần 5: Vắc xin.

TCVN VIII:2022, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phụ lục 17 đồ đựng cấp 1 dùng cho chế phẩm dược; gồm các phụ lục như sau: 17.3.4; 17.9.8; 17.9.9; 17.9.10.

3 Chữ viết tắt

Tên hóa chất, thuốc thử in nghiêng kèm theo các chữ viết tắt sau đây trong ngoặc đơn biểu thị thuốc thử đó phải đạt yêu cầu quy định tại Phụ lục 2.

 

VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ

VẮC XIN PHỐI HỢP SỞI VÀ RUBELLA (VẮC XIN MR)

Vaccinum Morbillorum et Rubellae vivum

Định nghĩa

Vắc xin phối hợp Sởi và Rubella là chế phẩm đông khô, được sản xuất từ chủng virus sởi, virus rubella sống, giảm độc lực, nuôi cấy trên tế bào thích hợp.

Vắc xin được hoàn nguyên với nước hồi chỉnh ngay trước khi sử dụng, tạo thành dung dịch trong, cho màu khi có mặt của chỉ thị pH.

Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu dưới đây.

Sản xuất

Chủng sản xuất: Chủng sản xuất được dựa trên hệ thống chủng gốc (Master seed) virus giảm độc lực được cơ quan Quốc gia có thẩm quyền phê duyệt. Các yêu cầu kiểm định chất lượng chủng sản xuất được cơ quan quốc gia có thẩm quyền phê duyệt

Tế bào sản xuất: Tế bào có nguồn gốc từ tế bào người, động vật hay dạng khác đạt tiêu chuẩn, không có tác nhân gây bệnh. Nguồn gốc tế bào sản xuất và các yêu cầu kiểm định chất lượng tế bào được cơ quan Quốc gia có thẩm quyền phê duyệt. Tế bào chủng gốc được bảo quản ở nhiệt độ -70 °C hoặc trong nitơ lỏng.

Quy trình sản xuất và kiểm định sản xuất: Chủng virus sởi, rubella được nuôi cấy trên tế bào tiên phát hoặc tế bào từ ngân hàng tế bào trong môi trường thích hợp. Hỗn dịch virus được gặt, hộn, bổ sung chất bảo quản, lọc, pha loãng, đóng lọ và đông khô theo quy trình đã được phê duyệt.

Phải thực hiện các thử nghiệm kiểm định trong quá trình sản xuất ở các công đoạn: Vật liệu đầu (trứng, môi trường sử dụng cho sản xuất, huyết thanh bào thai bê, trypsin tách tế bào,...), tế bào sử dụng cho sản xuất, mẻ gặt đơn, bán thành phẩm trước lọc, bán thành phẩm sau lọc, vắc xin thành phẩm.

Các mẻ gặt đơn

Các mẻ gặt đơn từng thành phần sởi, rubella phải đáp ứng yêu cầu sau:

Từng mẻ gặt đơn được thu từ một quy trình nuôi cấy virus trên tế bào thường trực hoặc tiên phát theo phương pháp thích hợp được cơ quan Quốc gia có thẩm quyền phê duyệt. Những mẻ gặt đơn được bảo quản ở nhiệt độ dưới -60 °C cho đến khi thử nghiệm được hoàn thành. Không được sử dụng chất kháng sinh trong công đoạn này.

Các mẻ gặt đơn từng thành phần virus sởi, rubella phải được kiểm tra tính vô khuẩn, Mycoplasma, số lượng virus sống bằng các phương pháp thích hợp theo hướng dẫn của tổ chức y tế thế giới, hoặc của nhà sản xuất đã được cơ quan Quốc gia có thẩm quyền phê duyệt.

Bán thành phẩm cuối cùng

Các mẻ gặt đơn virus được trộn lại sau khi tinh sạch và loại bỏ xác tế bào. Các chất bảo quản, tá dược hoặc nước hồi chỉnh được cơ quan quốc gia có thẩm quyền phê duyệt mới được cho vào bán thành phẩm. Chất bảo quản không được làm ảnh hưởng, đến tính an toàn và hiệu lực của sản phẩm. Các bán thành phẩm có thể pha loãng khi cần thiết và được đóng thành lọ, rồi đông khô. Không bổ sung chất kháng sinh trong giai đoạn này.

Vô trùng

Đạt yêu cầu vô trùng (Phụ lục 15.7).

BSA tồn dư

Định lượng BSA tồn dư (Phụ lục 15.45) bằng phương pháp ELISA.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Không được quá 50 ng/liều:

Kiểm định vắc xin thành phẩm

Chỉ những vắc xin thành phẩm cuối cùng đạt yêu cầu các thử nghiệm dưới đây mới được sử dụng trên người. Thử nghiệm xác định BSA tồn dư có thể không yêu cầu nếu đã thực hiện và đạt yêu cầu đối với vắc xin bán thành phẩm cuối cùng.

Nhận dạng

Vắc xin có chứa virus sởi và rubella.

Sử dụng phương pháp liều gây nhiễm 50 % tế bào (CCID ₅₀ ) hoặc phương pháp khác (RT-PCR, qPCR....) đã được cơ quan Quốc gia có thẩm quyền phê duyệt.

Phương pháp liều gây nhiễm 50 % tế bào (CCID ₅₀ ): Thử trên tế bào Vero (đối với virus sởi), tế bào RK-13 (đối với virus rubella). Sau khi pha loãng kháng nguyên, kháng thể ở hàm lượng phù hợp, dùng quy trình phù hợp để kết hợp rồi gây nhiễm trên tế bào. Vắc xin chứa đúng virus sởi, rubella khi tế bào Vero và tế bào RK-13 không bị hủy hoại bởi các virus trên.

Công hiệu

Sử dụng phương pháp liều gây nhiễm 50 % tế bào (CCID ₅₀ ) hoặc phương pháp khác đã được cơ quan Quốc gia có thẩm quyền phê duyệt.

Tiêu chuẩn chấp nhận:

Hiệu giá của virus sởi ≥ 3,0 lg PFU/0,5 ml (liều).

Hiệu giá của virus rubella ≥ 3,0 lg PFU/0,5 ml (liều).

Dùng ít nhất 3 lọ vắc xin (0,5 ml hoặc 0,7 ml) để kiểm tra hiệu giá cho mỗi thành phần virus sởi, rubella.

Thử nghiệm có giá trị khi sự chênh lệch hiệu giá giữa các lọ không được quá 0,3 lg. Công hiệu của mẫu chuẩn xác định không vượt quá 0,5 lg so với nhãn.

(Đơn vị tính hiệu giá có thể sử dụng CCID ₅₀ , PFU, TCID ₅₀ ,... được cơ quan quốc gia có thẩm quyền chấp thuận).

Tính ổn định nhiệt

Vắc xin MR bảo quản ở 37 °C trong 7 ngày.

Tiêu chuẩn chấp nhận:

Hiệu giá của mỗi thành phần không được giảm quá 1,0 lg so với vắc xin quản ở 2 - 8 °C.

Yêu cầu và phương pháp thử theo hướng dẫn tại phần Công hiệu.

An toàn chung

Đạt yêu cầu (Phụ lục 15.11).

Vô khuẩn

Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

Độ ẩm tồn dư

Không được quá 3,0 % (Phụ lục 15.35).

Cảm quan

Quan sát bằng mắt thường: Lọ vắc xin được đóng nút chặt chẽ, không có vật thể lạ. Sau khi hoàn nguyên với nước hồi chỉnh được dung dịch trong, không màu và thời gian hoàn nguyên theo đăng ký của nhà sản xuất đã được phê duyệt.

Bảo quản

Bảo quản ở nhiệt độ dưới 8 °C, tránh ánh sáng. Hạn sử dụng theo đăng ký của nhà sản xuất được cơ Quốc gia có thẩm quyền phê duyệt.

Cách dùng, liều dùng

Tiêm dưới da, liều 0,5 ml hoặc 0,7 ml theo khuyến cáo của nhà sản xuất được cơ quan có thẩm quyền phê duyệt. Không nên tiêm vắc xin đối với phụ nữ mang thai hoặc trước khi dự định có thai hai tháng.

Ghi nhãn, hướng dẫn sử dụng

Theo quy định hiện hành và cần có các thông tin như sau:

- Tên chủng virus được sử dụng trong sản xuất.

- Loại tế bào sử dụng gây nhiễm chủng virus.

- Hiệu giá thấp nhất của virus.

- Lượng kháng sinh còn tồn dư trong vắc xin, chất bảo quản và liều lượng (nếu có).

- Bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng (vắc xin chưa hoàn nguyên và sau khi hoàn nguyên).

- Các yếu tố tránh tiếp xúc trực tiếp với vắc xin.

- Lượng nước hồi chỉnh để hoàn nguyên vắc xin.

 

BACILLUS CLAUSII

Bacillus clausii

Định nghĩa

Bacillus clausii là vi khuẩn ưa kiềm, Gram dương, hình que, sinh bào tử, di động, hiếu khí tùy ý. Bacillus clausii được sản xuất dưới dạng nguyên liệu chứa bào tử chủng Bacillus clausii thuần chủng xác định bằng phương pháp phun sấy khô. Các tá dược như chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải có số lượng vi khuẩn sống Bacillus clausii không ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn.

Chủng UBBC07: Bacillus clausii UBBC07 là chủng vi khuẩn đặc trưng, thuần chủng thuộc loài Bacillus clausii.

Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng đối với chủng Bacillus clausii UBBC07.

Định tính

A. Định tính bằng kính hiển vi

Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Tế bào sinh dưỡng hình que. Bào tử hình bầu dục có thể xuất hiện ở cuối tế bào sinh dưỡng tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng.

B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic

Nước vô khuẩn, dung dịch đệm TBE 0,5X, dung dịch đệm TE 1X, dung dịch đệm TAE 1X: Xem phụ lục 1.26, mục “Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử”.

Dung dịch mẫu DNA: Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch BHI thu được trong mục Định lượng. Lấy 2 ml dung dịch đệm TE 1X (TT) cho vào ống li tâm. Dùng que cấy vô khuẩn, cẩn thận lấy các tế bào ra khỏi thạch (chọn 1 khuẩn lạc lớn mọc trên bề mặt, hoặc 2 đến 3 khuẩn lạc nhỏ, trung bình hoặc kéo dài thời gian ủ thêm vài giờ để tạo ra các khuẩn lạc lớn trên bề mặt thạch), và phân tán tế bào trong ống li tâm có chứa dung dịch đệm TE 1X (TT). Có thể tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp tách chiết DNA trực tiếp hoặc sử dụng bộ kít tách chiết DNA vi khuẩn phù hợp. Trước khi tiến hành thử nghiệm, pha loãng dung dịch DNA sau tách chiết bằng nước vô khuẩn hoặc dung dịch pha loãng DNA tương đương để thu được dung dịch mẫu DNA chứa 50 ng đến 90 ng DNA/μL. Cặp mồi: Xem Bảng 1.

Bảng 1 - Các cặp mồi và Tiêu chuẩn chấp nhận

* Phải đáp ứng tiêu chuẩn chấp nhận đối với mỗi cặp mồi để đạt yêu cầu định tính đến mức chủng.

Dung dịch mồi: Pha mồi đến nồng độ 10 μM bằng nước vô khuẩn và bảo quản ở nhiệt độ từ -20 °C đến -80 °C.

Mẫu thử. Đối với mỗi cặp mồi đặc hiệu, chuẩn bị dung dịch chứa 10 μl PCR master mix ¹ , 1 μl dung dịch mồi xuôi (10 μM), 1 μl dung dịch mồi ngược (10 μM), 7 μl nước vô khuẩn và 1 μl dung dịch mẫu DNA (khoảng 50 - 90 ng), hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng âm: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μl dung dịch DNA mẫu bằng 1 μl nước vô khuẩn hoặc dung dịch pha loãng DNA tương đương.

Mẫu chứng dương: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μl dung dịch mẫu DNA bằng 1 μl dung dịch DNA của chủng đối chiếu Bacillus clausii UBBC07 hoặc thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng UBBC07 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus clausii.

Tiến hành: Tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương bằng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp.

Chu trình nhiệt: Bước 1: ủ ở 98 °C trong 30 s; Bước 2: ủ ở 98 °C trong 30 s; Bước 3: ủ ở nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi đặc hiệu trong 30 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 30 s. Lặp lại các bước 2 đến 4 trong 30 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng. Điện di sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Bacillus clausii UBBC07 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus clausii thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn.

Sử dụng gel agarose 1,5 % (w/v) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT) hoặc trong dung dịch đệm TBE 0,5X (TT).

Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL và rửa gel bằng nước.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này. Có thể sử dụng thuốc nhuộm gel phù hợp khác.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của các sản phẩm khuếch đại. (Bảng 1). Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.

Có thể sử dụng hệ thống điện di tự động kèm bộ kít DNA (automated on-chip electrophoresis system) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào.

Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại có số cặp base đặc hiệu được quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận (Bảng 1). Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus clausii, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại có số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố.

Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không mong muốn, tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Xem Bảng 1.

Định lượng

Dung dịch nước muối sinh lý. Chuẩn bị dung dịch natri clorid (TT) 0,9 % (kl/tt) và điều chỉnh đến pH 7,0 bằng dung dịch acid lactic (TT). Tiệt khuẩn dung dịch trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường thạch BHI (Brain heart infusion agar): Chuẩn bị môi trường có công thức ghi trong Bảng 2 hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 2 - Thành phần môi trường thạch BHI

Hòa các thành phần trên trong 1 L nước trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng. Đun sôi trong 1 min để môi trường hòa tan hoàn toàn, có thể phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp, sau đó tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường và bảo quản ở 2 °C đến 8 °C. Hỗn dịch mẫu: Trong điều kiện vô khuẩn, cân 1,0 g mẫu probiotic vào bình thủy tinh dung tích 250 ml chứa 200 ml dung dịch nước muối sinh lý và lắc trộn bằng máy trộn đồng nhất mẫu ở tốc độ 12000 - 16000 rpm trong 3 min, thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 0,5 x 10 ^{- 2} . Sử dụng các đầu pipet vô khuẩn có màng lọc, tiến hành pha loãng bằng cách lấy 1,0 ml hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 0,5 x 10 ^-2 vào các ống nghiệm vô khuẩn chứa 9,0 ml dung dịch nước muối sinh lý. Tiếp tục pha loãng như trên đến khi thu được hỗn dịch mẫu ở độ pha loãng cuối cùng dự kiến chứa 25 - 250 CFU/ml. Ủ ống nghiệm chứa hỗn dịch mẫu thử ở độ pha loãng cuối trong bể ổn nhiệt ở 75 °C trong 30 min, sau đó làm nguội ngay về nhiệt độ dưới 45 °C. Tiến hành trộn môi trường với hỗn dịch mẫu này trong 10 đến 20 phút sau bước chuẩn bị hỗn dịch mẫu. Lắc đều ống nghiệm chứa hỗn dịch mẫu và bình môi trường trước khi tiến hành thử nghiệm.

Tiến hành: Trong điều kiện vô khuẩn, hút riêng biệt 1,0 ml hỗn dịch mẫu vào ba đĩa petri vô khuẩn kích thước 15 mm x 100 mm, được ghi nhãn thích hợp, sau đó đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường thạch BHI đã tan chảy và giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C vào mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa petri, sau đó xoay nhẹ các đĩa để trộn đều mẫu vào môi trường thạch. Chuẩn bị một đĩa mẫu trắng chỉ chứa môi trường thạch BHI và đĩa mẫu trắng thứ hai chứa 1,0 ml dung dịch nước muối sinh lý trộn với môi trường thạch BHI.

Để yên các đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi thạch đông, lật ngược đĩa và ủ các đĩa ở 40 ± 2 °C trong 48 h. Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc ở mỗi đĩa. Lựa chọn các đĩa có 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Tính giá trị trung bình số lượng khuẩn lạc của các đĩa có cùng nồng độ pha loãng sau đó tính số khuẩn lạc theo đơn vị CFU/g.

Các đĩa mẫu trắng không được xuất hiện khuẩn lạc nào.

Giới hạn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống không ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn. Số lượng vi khuẩn được ghi theo đơn vị CFU/g.

Mất khối lượng do làm khô

Không được quá 5% (Phụ lục 9.6).

(1 - 2 g, 100 °C, áp suất không quá 133,3 Pa, 4 h).

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Tổng số nấm: Không quá 10 ² CFU/g (Phụ lục 13.6).

Escherichia coli, Salmonella sp.: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).

Cần thêm quy định không được có Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus hoặc Pseudomonas aeruginosa nếu nguyên liệu hoặc thành phẩm probiotic có nguy cơ tạp nhiễm các vi sinh vật này. Phương pháp phát hiện các vi sinh vật này phải là phương pháp tiêu chuẩn hoặc phương pháp đã được thẩm định.

Đóng gói và bảo quản

Để nơi mát, khô ráo trong đồ đựng kín.

Ghi nhãn

Phải ghi đầy đủ tên chi, loài, chủng kèm theo số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc đơn vị tương đương.

Chú thích:

¹ Dream Taq Green PCR Master mix (2X) của hãng Thermo Fisher www.thermofisher.com), hoặc tương đương.

 

BACILLUS COAGULANS

Bacillus coagulans

Định nghĩa

Bacillus coagulans là vi khuẩn sinh acid lactic, Gram dương, hình que, sinh bào tử, hiếu khí đến vi hiếu khí. Nguyên liệu Bacillus coagulans chứa bào tử của các chủng được chỉ định thuộc loài Bacillus coagulans. Các tá dược như chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải có số lượng vi khuẩn sống Bacillus coagulans không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Chủng GBI-30, 6086: Bacillus coagulans GBI-30, 6080 là chủng đặc trưng và thuần chủng thuộc loài Bacillus coagulans.

Chủng Unique IS-2: Bacillus coagulans Unique IS-2 là chủng đặc trưng và thuần chủng thuộc loài Bacillus coagulans.

Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng cho chủng Bacillus coagulans GBI-30, 6080 và chủng Bacillus coagulans Unique IS-2.

Định tính

A. Định tính bằng kính hiển vi.

Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Các bào tử nhỏ, hình bầu dục, có thể co rút và ở cuối mỗi tế bào sinh dưỡng hình que. Số lượng tế bào sinh dưỡng có bào tử tùy thuộc vào điều kiện sinh trưởng.

B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic.

Nước vô khuẩn, dung dịch đệm TAE 1X: Xem phụ lục 1.26, mục “Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử”.

Thuốc thử pha mẫu: Sử dụng thuốc thử PrepMan™ Ultra Sample Preparation Reagent ¹ . Có thể sử dụng phương pháp chiết DNA trực tiếp hoặc bộ kít tách chiết DNA vi khuẩn phù hợp khác.

Dung dịch mẫu DNA: Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch BC cao nấm men glucose (Glucose Yeast Extract BC agar) thu được trong mục Định lượng.

Lấy 100 μl thuốc thử pha mẫu vào ống ly tâm 2,0 ml có nắp vặn. (Lưu ý: Quá trình lấy thuốc thử pha mẫu được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Dùng que cấy vô khuẩn lấy các tế bào tử một khuẩn lạc bề mặt và phân tán vào thuốc thử pha mẫu trong ống. Đậy nắp ống và trộn đều bằng máy lắc xoáy trong 10 đến 30 s hoặc cho đến khi tế bào phân tán thành hỗn dịch đồng nhất trong thuốc thử pha mẫu. Ủ hỗn dịch trong bể ổn nhiệt ở 100 °C trong 10 min, sau đó ly tâm hỗn dịch trên ở 16000 x g trong 3 min. Chuyển phần dịch nổi phía trên sang một ống ly tâm mới. Dung dịch này chứa DNA của Bacillus coagulans. Trước khi tiến hành thử nghiệm, pha loãng dung dịch DNA sau tách chiết bằng nước vô khuẩn để thu được dung dịch mẫu DNA có nồng độ như yêu cầu trong bảng 2.

Cặp mồi: Xem Bảng 1.

Bảng 1 - Các cặp mồi và tiêu chuẩn chấp nhận

*Phải đáp ứng tiêu chuẩn chấp nhận đối với mỗi cặp mồi để đạt yêu cầu định tính đến mức chủng.

Dung dịch mồi ^** :

Chủng GBI-30, 6086: Pha mồi đến nồng độ 0,3 μM bằng nước vô khuẩn và bảo quản ở -20 °C đến -80 °C. Ngay trước khi sử dụng, pha loãng mồi với nước vô khuẩn (1 : 5, tt/tt).

Chủng Unique IS-2: Pha mồi đến nồng độ 10 μM bằng nước vô khuẩn và bảo quản ở -20 °C đến -80 °C.

** Nồng độ mồi trong thành phần phản ứng PCR có thể được tối ưu hóa tùy thuộc vào điều kiện thử nghiệm của từng phòng thí nghiệm.

Chuẩn bị mẫu thử và thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: Xem bảng 2.

Với mỗi cặp mồi đặc hiệu, tiến hành phản ứng PCR với các mẫu thử bằng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp hoặc theo khuyến cáo của master mix thương mại sử dụng.

Bảng 2 - Chuẩn bị mẫu thử và thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Mẫu chứng âm: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL dung dịch mẫu DNA bằng 1 μL nước vô khuẩn.

Mẫu chứng dương: Đối với từng chủng, chuẩn bị tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL dung dịch mẫu DNA bằng 1 μL dung dịch DNA của chủng đối chiếu tương ứng, hoặc thay các cặp mồi đặc hiệu cho các chủng đối chiếu bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus coagulans.

Tiến hành: tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương với chu trình nhiệt mô tả như Bảng 2. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Bacillus coagulans GBI-30, 6086/Unique IS-2 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus coagulans thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn.

Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm kít DNA (automated on-chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose (TT) 2,0 % (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT).

Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/ml và rửa gel bằng nước.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thi nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp khi tiếp xúc thuốc thử này. Có thể sử dụng thuốc nhuộm gel phù hợp khác.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của các sản phẩm khuếch đại (Bảng 1). Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.

Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại có số cặp base đặc hiệu như quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận (Bảng 1). Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus coagulans, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại có số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào.

Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Xem Bảng 1.

Định lượng

Dung dịch pepton: Chuẩn bị dung dịch pepton (TT) 0,1 % (kl/tt) và điều chỉnh pH 7,0 bằng dung dịch acid lactic (TT). Tiệt khuẩn dung dịch trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Dung dịch khoáng vi lượng (Trace mineral solution): Chuẩn bị dung dịch có thành phần như bảng 3, pha trong nước trao đổi ion hoặc sử dụng dung dịch thương phẩm có sẵn.

Bảng 3 - Dung dịch khoáng vi lượng

Lưu ý: Dung dịch có màu hơi hồng, bảo quản lạnh không quá 2 tháng. Có thể dùng các muối có dạng ngậm nước khác miễn là nồng độ muối khoáng được duy trì đúng trong dung dịch cuối cùng.

Môi trường thạch BC cao nấm men glucose: Chuẩn bị môi trường có thành phần như bảng 4, hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 4 - Môi trường thạch BC cao nấm men glucose

Hòa các thành phần trên trong 1 L nước trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Bổ sung 15,0 g thạch (TT). Điều chỉnh pH 6,3 bằng dung dịch acid lactic (TT). Đun hỗn hợp đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn, có thể phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp. Hấp tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường và bảo quản ở 2 °C đến 8 °C.

Chuẩn bị và tiến hành thử nghiệm trên 2 hỗn dịch mẫu độc lập.

Hỗn dịch mẫu: Chuyển 1,0 g bột mẫu probiotic vào túi polyetylen vô khuẩn (túi dập mẫu). Thêm 199 ml dung dịch pepton đã tiệt khuẩn vào túi. Trộn bằng máy lắc cơ học đến khi thu được hỗn dịch đồng nhất hoặc sử dụng máy dập mẫu (stomacher) với tốc độ 150 đến 200 rpm trong 5 min.

Lưu ý: Trong một số trường hợp, cần tăng lượng mẫu probiotic để thu được kết quả định lượng chính xác. Đối với mẫu probiotic có liều dùng (serving size) từ 2 g đến 50 g thì lấy 2 g đến 50 g bột mẫu probiotic thêm vừa đủ 200 ml dung dịch pepton (độ pha loãng từ 2 g/200 ml đến 50 g/200 ml), hoặc thêm vừa đủ 300 ml dung dịch pepton (độ pha loãng từ 2 g/300 ml đến 50 g/300 ml). Đối với mẫu probiotic có liều dùng lớn hơn 50 g, lấy lượng mẫu probiotic bằng một nửa liều dùng hoặc lấy mẫu probiotic đại diện khoảng dưới 50 g, thêm vừa đủ 200 đến 300 ml dung dịch pepton.

Kiểm tra pH của hỗn dịch mẫu. Nếu pH dưới 7,0, điều chỉnh pH đến 8,5 ± 0,2 bằng dung dịch natri hydroxyd 5 N (TT). Nếu pH trên 8,7, điều chỉnh pH đến 8,5 ± 0,2 bằng dung dịch acid lactic (TT) 5 N. Chuyển 20 đến 30 ml hỗn dịch đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml vô khuẩn có nắp. Ủ ống trong bể ổn nhiệt ở 75 °C trong đúng 30 min, sau đó làm nguội xuống 45 °C. Chuyển 1,0 ml hỗn dịch này vào ống nghiệm vô khuẩn chứa 9 ml dung dịch pepton. Trộn kỹ bằng máy lắc xoáy, thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 0,5 x 10 ^{- 3} . Tiếp tục pha loãng như trên đến khi thu được hỗn dịch mẫu ở độ pha loãng cuối cùng dự kiến chứa khoảng 25 CFU/ml. Tiến hành thử nghiệm với hỗn dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng cuối. Cần trộn hỗn dịch mẫu với môi trường trong 10 đến 20 min sau bước chuẩn bị hỗn dịch mẫu.

Lưu ý: Có thể xử lý mẫu probiotic bằng quy trình khác với hướng dẫn trên nếu được chứng minh là phù hợp.

Tiến hành: Với mỗi nồng độ pha loãng, hút riêng biệt 1,0 ml hỗn dịch mẫu vào ba đĩa petri vô khuẩn kích thước 15 mm x 100 mm, được ghi nhãn thích hợp, sau đó đổ khoảng 15 đến 20 ml môi trường thạch BC cao nấm men glucose đã tan chảy và giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C vào mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa petri, sau đó xoay nhẹ các đĩa để trộn đều hỗn dịch mẫu vào môi trường thạch.

Chuẩn bị một đĩa mẫu trắng chỉ chứa môi trường thạch BC cao nấm men glucose và đĩa mẫu trắng thứ hai chứa 1,0 ml dung dịch pepton trộn với môi trường thạch BC cao nấm men glucose. Để yên các đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi thạch đông, lật ngược đĩa và ủ các đĩa ở 38 °C đến 42 °C trong 48 h. Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa mẫu thử và các đĩa mẫu trắng. Lựa chọn các dĩa có 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Chỉ đếm các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái như sau: khuẩn lạc trên bề mặt có đường kính từ 1 đến 5 mm, màu trắng đến kem, lồi, có bờ đều và bề mặt nhẵn; khuẩn lạc bên trong thạch có đường kính 0,5 đến 1 mm, giống các chấm nhỏ màu kem. Tính giá trị trung bình số lượng khuẩn lạc của các đĩa có cùng nồng độ pha loãng, sau đó tính số khuẩn lạc theo đơn vị CFU/g.

Đối với mẫu probiotic có khối lượng lớn hơn 1 g, có thể coi khối lượng mẫu probiotic là một đơn vị. Tính số khuẩn lạc trung bình trên mỗi đĩa, sau đó nhân số khuẩn lạc trung bình đếm được với nghịch đảo của hệ số pha loãng để thu được tổng số khuẩn lạc trong mẫu đó (CFU/mẫu probiotic). Để tính số lượng khuẩn lạc trong mỗi g mẫu probiotic (CFU/g), chia kết quả CFU/mẫu cho khối lượng mẫu probiotic thực tế.

Ví dụ: nếu khối lượng mẫu probiotic là 50 g và thể tích cuối cùng là 300 ml (50 g mẫu probiotic cộng với 250 ml dung dịch pepton), thì hệ số pha loãng đầu tiên là 1/300 (coi toàn bộ khối lượng mẫu probiotic là một đơn vị). Nếu thực hiện thêm 5 lần pha loãng với tỷ lệ 1/10, hệ số pha loãng cuối cùng là 1/300 x 1/10 x 1/10 x 1/10 x 1/10 x 1/10 = 1/300 x 1/10 ⁵ . Nếu số khuẩn lạc trung bình đếm được trên các đĩa của độ pha loãng cuối cùng là 200, thì số lượng khuẩn lạc trong 50 g mẫu probiotic là 200 x 300 x 10 ⁵ = 6 x 10 ⁹ CFU/50 g và số lượng khuẩn lạc trong mỗi gam mẫu probiotic là 6/50 x 10 ⁹ = 1,2 x 10 ⁸ CFU/g.

Sự có mặt của bất kỳ khuẩn lạc nào không phù hợp với mô tả ở trên cho thấy hỗn dịch mẫu có thể bị tạp nhiễm và cần điều tra nguyên nhân. Dựa trên kết quả điều tra nguyên nhân, có thể loại bỏ kết quả hoặc tiến hành thử nghiệm lại. Cả hai đĩa trắng phải hoàn toàn không có bất kỳ loại khuẩn lạc nào. Trường hợp các đĩa trắng xuất hiện khuẩn lạc, toàn bộ quy trình phải được lặp lại, bao gồm cả việc chuẩn bị dung dịch pha loãng và môi trường, phụ thuộc vào đĩa trắng nào bị tạp nhiễm.

Giới hạn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Mất khối lượng do làm khô

Không được quá 6 % (Phụ lục 9.6).

(2 - 3 g, 100 °C, áp suất không quá 133,3 Pa, 4 h)

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Lưu ý: Phương pháp vi sinh vật đề cập trong phép thử giới hạn nhiễm khuẩn là đại diện cho các phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp. Có thể sử dụng các phương pháp đã được thẩm định khác để thay thế cho các phương pháp được nêu trong phần này.

Tổng số nấm men

Chỉ áp dụng đối với chủng Bacillus coagulans GBI-30, 6086.

Dung dịch pepton: Chuẩn bị dung dịch pepton (TT) 0,1 % (kl/tt) và điều chỉnh pH 7,0 bằng dung dịch acid hydrocloric (TT). Tiệt khuẩn dung dịch trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường thạch nấm men (Yeast agar medium): Chuẩn bị môi trường có công thức như trong Bảng 5 hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 5 - Thành phần môi trường thạch nấm men Dicloran Glycerol 18 % (DG - 18)

Hòa các thành phần trên trong 800 ml nước trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn. Thêm nước vào môi trường đến thể tích 1000 ml. Bổ sung 220 g glycerol (TT), sau đó tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường sau tiệt khuẩn có pH 5,6. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường và bảo quản ở 2 °C đến 8 °C.

Chuyển 25 g mẫu probiotic vào túi dập mẫu (stomacher) vô khuẩn. Thêm 225 ml dung dịch pepton vô khuẩn vào túi và trộn đều với tốc độ khoảng 150 đến 200 rpm trong 2 min, thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10 ^-1 . Có thể xử lý mẫu probiotic bằng quy trình khác với hướng dẫn trên nếu được chứng minh là phù hợp.

Chuyển 1,0 ml hỗn dịch mẫu trên vào ống nghiệm vô khuẩn chứa 9 ml dung dịch pepton, trộn kỹ bằng máy lắc xoáy thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10 ^-2 . Tiến hành trộn môi trường với hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10 ^{- 1} và 10 ^-2 , thử nghiệm trong 10 đến 20 min sau bước chuẩn bị hỗn dịch mẫu.

Tiến hành: Với mỗi nồng độ pha loãng, hút riêng biệt 1,0 ml hỗn dịch mẫu vào 3 đĩa petri vô khuẩn kích thước 15 mm x 100 mm, được ghi nhãn thích hợp, sau đó đổ khoảng 20 đến 25 ml môi trường thạch nấm men đã tan chảy và giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C vào mỗi đĩa. Đậy nắp dĩa petri, sau đó xoay nhẹ các đĩa để trộn đều hỗn dịch mẫu vào môi trường thạch. Chuẩn bị một dĩa mẫu trắng chỉ chứa môi trường thạch nấm men và đĩa mẫu trắng thứ hai chứa 1,0 ml dung dịch pepton trộn với môi trường thạch nấm men.

Để yên các đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi thạch đông, lật ngược đĩa và ủ các đĩa (trong tối) ở 25 °C trong 5 ngày. Đếm số lượng các khuẩn lạc nấm mọc trên đĩa. Nếu sau 5 ngày chưa xuất hiện khuẩn lạc, ủ tiếp các đĩa thêm 48 h và đếm số lượng khuẩn lạc. Trên môi trường thạch nấm men, khuẩn lạc nấm hình đĩa mọc riêng lẻ. Nếu số lượng khuẩn lạc lớn hơn 150 CFU, tiến hành thử nghiệm ở độ pha loãng cao hơn để thu được số đếm chính xác. Cả hai đĩa trắng không được có bất kì khuẩn lạc nào. Tính giá trị trung bình số lượng khuẩn lạc của các đĩa có cùng nồng độ pha loãng sau đó tính số khuẩn lạc theo đơn vị CFU/g.

Nếu tất cả các đĩa ở cả hai độ pha loãng không có khuẩn lạc, báo cáo số lượng là < 10 CFU/g.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Tổng số nấm men không được quá 100 CFU/g.

Tổng số nấm

Không quá 10 ² CFU/g (chỉ áp dụng đối với chủng Bacillus coagulans Unique IS-2) (Phụ lục 13.6).

Vi sinh vật gây bệnh

Escherichia coli, Salmonella sp.: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).

Cần thêm quy định không được có Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus cereus nếu nguyên liệu có nguy cơ tạp nhiễm các vi sinh vật này. Phương pháp phát hiện các vi sinh vật này phải là phương pháp tiêu chuẩn hoặc phương pháp đã được thẩm định.

Bảo quản

Bảo quản trong đồ đựng kín, để nơi khô ráo, thoáng mát.

Ghi nhãn

Phải ghi đầy đủ tên chi, loài, chủng kèm theo số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc đơn vị tương đương.

Chú thích:

¹ Applied Biosystem PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent của Applied Biosystems (www.appliedbiosystems.com) hoặc tương đương.

^{2 .} New England Biolabs Phusion High-Fidelity PCR master mix với đệm GC (http://www.neb.com), Dream Taq PCR master Mix (2x) (http://www.thermofisher.com) hoặc tương đương.

 

NANG BACILLUS COAGULANS

Capsulae Bacilludis coagulandis

Định nghĩa

Viên nang Bacillus coagulans chứa số lượng vi khuẩn sống Bacillus coagulans GBI-30, 6086 không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Định tính

Phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic.

Nước vô khuẩn, dung dịch đệm TBE 0,5X, dung dịch đệm TAE 1X: Xem phụ lục 1.26, mục “Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử”.

Thuốc thử pha mẫu: Sử dụng thuốc thử PrepMan™ Ultra Sample Preparation Reagent ¹ . Có thể sử dụng phương pháp chiết DNA trực tiếp hoặc bộ kít tách chiết DNA vi khuẩn phù hợp khác.

Dung dịch mẫu DNA: Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch BC cao nấm men glucose (Glucose Yeast Extract BC agar) thu được trong mục Định lượng.

Lấy 100 μl thuốc thử pha mẫu vào ống ly tâm 2,0 ml có nắp vặn. (Lưu ý: Quá trình lấy thuốc thử pha mẫu được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Dùng que cấy vô khuẩn lấy các tế bào tử một khuẩn lạc bề mặt và phân tán vào thuốc thử pha mẫu trong ống. Đậy nắp ống và trộn đều bằng máy lắc xoáy trong 10 s đến 30 s hoặc cho đến khi tế bào phân tán thành hỗn dịch đồng nhất trong thuốc thử pha mẫu. Ủ hỗn dịch trong bể ổn nhiệt ở 100 °C trong 10 min, sau đó ly tâm hỗn dịch trên ở 16000 x g trong 3 min. Chuyển phần dịch nổi phía trên sang một ống ly tâm mới. Dung dịch này chứa DNA của Bacillus coagulans GBI-30, 6086. Trước khi tiến hành thử nghiệm, pha loãng dung dịch DNA sau tách chiết bằng nước vô khuẩn (1 : 100, tt/tt) thu được dung dịch mẫu DNA.

Cặp mồi: Xem Bảng 1.

Bảng 1 - Các cặp mồi và tiêu chuẩn chấp nhận

* Phải đáp ứng tiêu chuẩn chấp nhận đối với mỗi cặp mồi để đạt yêu cầu định tính đến mức chủng.

Dung dịch mồi ^** : Pha mồi đến nồng độ 0,3 μM bằng nước vô khuẩn và bảo quản ở -20 °C đến -80 °C. Ngay trước khi sử dụng, pha loãng mồi với nước vô khuẩn (1 : 5, tt/tt).

** Nồng độ mồi trong thành phần phản ứng PCR có thể được tối ưu hóa tùy thuộc vào điều kiện thử nghiệm của từng phòng thí nghiệm.

Mẫu thử: Đối với mỗi cặp mồi đặc hiệu, chuẩn bị dung dịch chứa 7,5 μL PCR master mix ² ,1 μL dung dịch mồi xuôi ^** (khoảng 0,06 μM), 1 μL dung dịch mồi ngược ^** (khoảng 0,06 μM ), 4,5 μL nước vô khuẩn và 1 μL dung dịch mẫu DNA (khoảng 10 ng đến 100 ng), hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng dương: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL dung dịch mẫu DNA bằng 1 μL dung dịch DNA của chủng đối chiếu Bacillus coagulans GBI-30, 6086, hoặc thay các cặp mồi đặc hiệu cho chủng đối chiếu bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus coagulans.

Mẫu chứng âm: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL dung dịch mẫu DNA bằng 1 μL nước vô khuẩn.

Tiến hành: tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương bằng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp.

Chu trình nhiệt: Bước 1: ủ ở 98 °C trong 30 s; Bước 2: ủ ở 98 °C trong 10 s; Bước 3: ủ ở nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi đặc hiệu trong 10 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 45 s. Lặp lại các bước 2 đến 4 trong 30 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Bacillus coagulans GBI-30, 6086 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus coagulans thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.

Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương bằng hệ thống điện di tự động kèm kít DNA (automated on-chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose (TT) 2,0 % (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT) hoặc trong dung dịch đệm TBE 0,5X (TT).

Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/ml và rửa gel bằng nước.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này. Có thể sử dụng thuốc nhuộm gel phù hợp khác.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của các sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.

Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại có số cặp base đặc hiệu như quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận (Bảng 1). Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bacillus coagulans, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại có số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào.

Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.

Định lượng

Dung dịch pepton: Chuẩn bị dung dịch pepton (TT) 0,1 % (kl/tt) và điều chỉnh pH 7,0 bằng dung dịch acid lactic (TT). Hấp tiệt khuẩn dung dịch trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Dung dịch khoáng vi lượng (Trace mineral solution): Chuẩn bị dung dịch có thành phần như bảng 2, pha trong nước trao đổi ion hoặc sử dụng dung dịch thương phẩm có sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 2 - Dung dịch khoáng vi lượng

Lưu ý: Dung dịch có màu hơi hồng, bảo quản lạnh trong không quá 2 tháng. Có thể dùng các muối có dạng ngậm nước khác miễn là nồng độ muối khoáng được duy trì đúng trong dung dịch cuối cùng.

Môi trường thạch BC cao nấm men glucose: Chuẩn bị môi trường có thành phần như bảng 3, hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 3 - Môi trường thạch BC cao nấm men glucose

Hòa các thành phần trên trong 1 L nước trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Bổ sung 15,0 g thạch (TT). Điều chỉnh pH 6,3 bằng dung dịch acid lactic (TT). Đun hỗn hợp đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn và có thể phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp. Hấp tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường và bảo quản ở 2 °C đến 8 °C.

Chuẩn bị và tiến hành thử nghiệm trên 2 hỗn dịch mẫu độc lập.

Hỗn dịch mẫu: Cân lượng bột mẫu probiotic của không ít hơn 20 viên nang và xác định khối lượng trung bình bột trong nang. Chuyển 1,0 g bột mẫu probiotic vào túi polyetylen vô khuẩn (túi dập mẫu). Thêm 199 ml dung dịch pepton đã tiệt khuẩn vào túi. Trộn bằng máy lắc cơ học đến khi thu được hỗn dịch đồng nhất hoặc sử dụng máy dập mẫu (stomacher) với tốc độ 150 đến 200 rpm trong 5 min. Kiểm tra pH của hỗn dịch. Nếu pH dưới 7,0, điều chỉnh pH đến 8,5 ± 0,2 bằng dung dịch natri hydroxyd 5 N (TT). Nếu pH trên 8,7, điều chỉnh pH đến 8,5 ± 0,2 bằng dung dịch acid lactic (TT) 5 N. Chuyển 20 đến 30 ml hỗn dịch đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml vô khuẩn có nắp. Ủ ống trong bể ổn nhiệt ở 75 °C trong đúng 30 min, sau đó làm nguội xuống 45 °C. Chuyển 1,0 ml hỗn dịch này vào ống nghiệm vô khuẩn chứa 9 ml dung dịch pepton. Trộn kỹ bằng máy lắc xoáy, thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 0,5 x 10 ^-3 . Tiếp tục pha loãng như trên đến khi thu được hỗn dịch mẫu ở độ pha loãng cuối cùng dự kiến chửa khoảng 25 CFU/ml. Tiến hành thử nghiệm với hỗn dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng cuối. Cần trộn hỗn dịch mẫu với môi trường trong 10 đến 20 min sau bước chuẩn bị hỗn dịch mẫu.

Lưu ý: Có thể xử lý mẫu probiotic bằng quy trình khác với hướng dẫn trên nếu được chứng minh là phù hợp.

Tiến hành: Với mỗi nồng độ pha loãng, hút riêng biệt 1,0 ml hỗn dịch mẫu vào ba đĩa petri vô khuẩn kích thước 15 mm x 100 mm, được ghi nhãn thích hợp, sau đó đổ khoảng 15 đến 20 ml môi trường thạch BC cao nấm men glucose đã tan chảy và giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C vào mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa petri, sau đó xoay nhẹ các đĩa để trộn đều hỗn dịch mẫu vào môi trường thạch.

Chuẩn bị một đĩa mẫu trắng chỉ chứa môi trường thạch BC cao nấm men glucose và đĩa mẫu trắng thứ hai chứa 1,0 ml dung dịch pepton trộn với môi trường thạch BC cao nấm men glucose. Để yên các đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi thạch đông, lật ngược đĩa và ủ các đĩa ở ở 38 °C đến 42 °C trong 48 h. Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa mẫu và các đĩa mẫu trắng. Lựa chọn các đĩa có 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Chỉ đếm các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái như sau: khuẩn lạc trên bề mặt có đường kính từ 1 đến 5 mm, màu trắng đến kem, lồi, có bờ đều và bề mặt nhẵn; khuẩn lạc bên trong thạch có đường kính 0,5 đến 1 mm, giống các chấm nhỏ màu kem. Tính giá trị trung bình số lượng khuẩn lạc của các đĩa có cùng nồng độ pha loãng, sau đó tính số khuẩn lạc theo đơn vị CFU/g.

Tính số lượng vi sinh vật sống trong viên nang tính theo đơn vị CFU/viên.

Sự có mặt của bất kỳ khuẩn lạc nào không phù hợp với mô tả này cho thấy mẫu có thể bị tạp nhiễm và cần điều tra nguyên nhân. Dựa trên kết quả điều tra nguyên nhân, có thể loại bỏ kết quả hoặc tiến hành thử nghiệm lại. Cả hai đĩa trắng phải hoàn toàn không có bất kỳ loại khuẩn lạc nào. Trường hợp các đĩa trắng xuất hiện khuẩn lạc, toàn bộ quy trình phải được lặp lại, bao gồm cả việc chuẩn bị dung dịch pha loãng và môi trường phụ thuộc vào đĩa trắng nào bị tạp nhiễm.

Giới hạn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Bacillus coagulans GBI-30, 6086 không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Độ rã

Phải đạt quy định (Phụ lục 11.6).

Độ đồng đều khối lượng

Phải đạt quy định (Phụ lục 11.3).

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Tổng số nấm men

Dung dịch pepton: Chuẩn bị dung dịch pepton (TT) 0,1 % (kl/tt) và điều chỉnh pH 7,0 bằng dung dịch acid hydrocloric (TT). Tiệt khuẩn dung dịch trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường thạch nấm men (Yeast agar medium): Chuẩn bị môi trường có thành phần như bảng 4, hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 4 - Thành phần môi trường thạch nấm men Dicloran Glycerol 18% (DG -18)

Hòa các thành phần trên trong 800 ml nước trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng cho đến khi môi trường tan hoàn toàn. Thêm nước vào môi trường đến thể tích 1000 ml. Thêm 220 g glycerol (TT), sau đó tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường sau tiệt khuẩn có pH 5,6. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường và bảo quản ở 2 °C đến 8 °C.

Chuyển 25 g mẫu probiotic vào túi dập mẫu (stomacher) vô khuẩn. Thêm 225 ml dung dịch pepton vô khuẩn vào túi và trộn đều với tốc độ khoảng 150 đến 200 rpm trong 2 min, thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10 ^{- 1} . Có thể xử lý mẫu probiotic bằng quy trình khác với hướng dẫn trên nếu được chứng minh là phù hợp.

Chuyển 1,0 ml hỗn dịch mẫu trên vào ống nghiệm vô khuẩn chứa 9 ml dung dịch pepton, trộn kỹ bằng máy lắc xoáy thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10 ^-2 . Tiến hành trộn môi trường với hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10 ^{- 1} và 10 ^-2 , thử nghiệm trong 10 đến 20 min sau bước chuẩn bị hỗn dịch mẫu.

Tiến hành: Với mỗi nồng độ pha loãng, hút riêng biệt 1,0 ml hỗn dịch mẫu vào 3 đĩa petri vô khuẩn kích thước 15 mm x 100 mm, được ghi nhãn thích hợp, sau đó đổ khoảng 20 đến 25 ml môi trường thạch nấm men đã tan chảy và giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C vào mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa petri, sau đó xoay nhẹ các đĩa để trộn đều hỗn dịch mẫu vào môi trường thạch. Chuẩn bị một đĩa mẫu trắng chỉ chứa môi trường thạch nấm men và đĩa mẫu trắng thứ hai chứa 1,0 ml dung dịch pepton trộn với môi trường thạch nấm men.

Để yên các đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi thạch đông, lật ngược đĩa và ủ các đĩa (trong tối) ở 25 °C trong 5 ngày. Đếm số lượng các khuẩn lạc nấm mọc trên đĩa. Nếu sau 5 ngày chưa xuất hiện khuẩn lạc, ủ tiếp các đĩa thêm 48 h và đếm số lượng khuẩn lạc. Trên môi trường thạch nấm men, khuẩn lạc nấm hình đĩa mọc riêng lẻ. Nếu số lượng khuẩn lạc lớn hơn 150 CFU, tiến hành thử nghiệm ở độ pha loãng cao hơn để thu được số đếm chính xác. Cả hai đĩa trắng không được có bất kì khuẩn lạc nào. Tính giá trị trung bình số lượng khuẩn lạc của các đĩa có cùng nồng độ pha loãng, sau đó tính số khuẩn lạc theo đơn vị CFU/g.

Nếu tất cả các đĩa ở cả hai độ pha loãng không có khuẩn lạc, báo cáo số lượng là < 10 CFU/g.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Tổng số nấm men không được quá 100 CFU/g.

Coliform

Không được quá 10 CFU/g (Phụ lục 1.26).

Vi sinh vật gây bệnh

Escherichia coli: Không được có trong 25 g (Phụ lục 13.6).

Salmonella sp.: Không được có trong 25 g (Phụ lục 13.6).

Staphylococcus aureus: Không được có trong 50 g (Phụ lục 13.6).

Bảo quản

Bảo quản trong đồ đựng kín, tránh ánh sáng và độ ẩm cao, để nơi khô ráo, thoáng mát.

Ghi nhãn

Phải ghi đầy đủ tên chi, loài và chủng kèm theo số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/viên.

Chú thích:

¹ Applied Biosystems PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent của Applied Biosystems (www.Appliedbiosystems.com) hoặc tương đương.

² New England Biolabs Phusion® High-Fidelity PCR master mix với đệm GC của hãng New England Biolabs (http://www.neb.com) hoặc tương đương.

 

BIFIDOBACTERIUM LONGUM SUBSP. INFANTIS

Bifidobacterium longum subsp. infantis

Định nghĩa

Bifidobacterium longum subsp. infantis là vi khuẩn kị khí, Gram dương, không sinh bào tử, sinh acid lactic, lên men dị hình hexose tùy ý. Chúng có hình dạng khác nhau như trực khuẩn hình que, đầu tròn, ngắn; trực khuẩn hình chùy; trực khuẩn hình que chia nhánh hình chữ Y. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau quá trình lên men trước khi tiến hành đông lạnh rồi đông khô. Các chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải chứa số lượng vi khuẩn sống Bifidobacterium longum subsp. infantis không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Chủng Bi-26: Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26 (ATCC SD-6720) là chủng vi khuẩn đặc trưng, thuần chủng, không sinh D-lactat thuộc loài Bifidobacterium longum subsp. infantis.

Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng cho chủng Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26.

Định tính

A. Định tính bằng kính hiển vi.

Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.

Tiêu chuẩn chấp nhận: trực khuẩn hình que, đầu tròn, ngắn; trực khuẩn hình chùy và trực khuẩn hình que chia nhánh hình chữ Y.

B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic.

Nước vô khuẩn, dung dịch đệm TE 1X, dung dịch đệm TAE 1X: Xem phụ lục 1.26, mục “Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử”.

Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotics trong dung dịch đệm TE 1X (TT) có nồng độ 100mg/ml.

Cặp mồi 1: Mồi xuôi (5’-3') GTCACGATGTCTCCTTTGATATCAGCATG và mồi ngược (5'-3) CCTTTTGCGTCTCCCCCG. Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 μM bằng dung dịch đệm TE 1X (TT), tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 μM bằng dung dịch đệm TE 1X (TT), bảo quản ở -20 °C.

Cặp mồi 2: Mồi xuôi (5’-3’) TCGCCGACATGCGAGACGAA và mồi ngược (5’-3 ^’ ) TCCAGGCTCAGCGTGCGA. Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 μM bằng dung dịch đệm TE 1X (TT), tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 μM bằng dung dịch đệm TE 1X (TT), bảo quản ở -20 °C.

Mẫu thử. Đối với mỗi cặp mồi đặc hiệu, chuẩn bị dịch chứa 12 μL PCR master mix ¹ , 1 μL dung dịch mồi xuôi (25 μM), 1 μL dung dịch mồi ngược (25 μM), 10 μL nước vô khuẩn và 1 μL hỗn dịch mẫu hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng âm: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL hỗn dịch mẫu bằng 1 μL nước vô khuẩn.

Mẫu chứng dương: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL hỗn dịch mẫu bằng 1 μL dung dịch DNA của chủng đối chiếu Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26 hoặc thay thế cặp mồi đặc hiệu cho chủng đối chiếu bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bifidobacterium longum subsp. Infantis.

Tiến hành: Tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương bằng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp. Tiến hành phản ứng theo chu trình nhiệt ghi trong Bảng 1. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Bifidobacterium longum subsp. infantis Bi-26 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bifidobacterium longum subsp. infantis thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.

Bảng 1 - Chu trình nhiệt

Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm kít DNA (automated on-chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose 2 % (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL và rửa gel bằng nước, có thể sử dụng thuốc nhuộm phù hợp khác.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.

Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận. Trong trường hợp mẫu chứng dương sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố. Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại gen nào. Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, cần tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.

Tiêu chuẩn chấp nhận:

Cặp mồi 1: Mẫu thử phải có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 105 cặp base.

Cặp mồi 2: Mẫu thử phải có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 181 cặp base.

Định lượng

Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium ngoại trừ một số thay đổi sau.

Môi trường thạch MRS Lactobacilli: Chuẩn bị môi trường có công thức chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26 và thêm 1 ml dung dịch vô khuẩn cystein hydroclorid (TT) 5 % (kl/tt) vào 100 ml môi trường ngay trước khi sử dụng.

Dung dịch đệm pepton: Thành phần như trong Bảng 2 hoặc có thể sử dụng dung dịch thương phẩm có sẵn.

Bảng 2 - Dung dịch đệm pepton

Hòa các thành phần trên trong 1 L nước trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng. Đun sôi trong không quá 1 min để hóa chất hòa tan hoàn toàn và có thể phân phối môi trường vào các bình có thể tích phù hợp. Tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường và bảo quản ở 2 °C đến 8 °C. Nên để dung dịch đệm đến nhiệt độ phòng trước khi dùng.

Chuẩn bị hỗn dịch mẫu: Tiến hành theo chỉ dẫn trong phụ lục 1.26, thay thế môi trường lỏng MRS Lactobacilli bằng dung dịch đệm pepton.

Giới hạn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Bifidobacterium longum subsp. infantis không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Tổng số nấm: Không quá 10 ² CFU/g (Phụ lục 13.6).

Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không quá 5 x 10 ³ CFU/g (Phụ lục 1.26).

Vi sinh vật gây bệnh:

Escherichia coli: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).

Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).

Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).

Bảo quản

Bảo quản trong bao bì có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.

Ghi nhãn

Phải ghi đầy đủ tên chi, loài và chủng kèm theo số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc đơn vị tương đương.

Chú thích

¹ AmpliTaq Gold 360 Master Mix của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.

 

BIFIDOBACTERIUM LONGUM SUBSP. LONGUM

Bifidobacterium longum subsp. longum

Định nghĩa

Bifidobacterium longum subsp. longum là vi khuẩn kị khí, Gram dương, không sinh bào tử, sinh aicd lactic, lên men dị hình hexose tùy ý. Chúng có hình dạng khác nhau như trực khuẩn hình que, đầu tròn, ngắn; trực khuẩn hình chùy; trực khuẩn hình que, chia nhánh hình chữ Y. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau quá trình lên men trước khi tiến hành đông lạnh rồi đông khô. Các chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải chứa số lượng vi khuẩn sống Bifidobacterium longum subsp. longum không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Chủng BI-05: là chủng vi khuẩn đặc trưng, thuần chủng thuộc loài Bifidobacterium longum subsp. longum.

Ghi chú: Chuyên luận này chỉ áp dụng với chủng Bifidobacterium longum subsp. longum Bi-05.

Định tính

A. Định tính bằng kính hiển vi.

Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.

Tiêu chuẩn chấp nhận: trực khuẩn hình que, đầu tròn, ngắn; trực khuẩn hình chùy và trực khuẩn hình que, chia nhánh hình chữ Y.

B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic

Nước vô khuẩn, dung dịch đệm TE 1X, dung dịch đệm TAE 1X: Xem phụ lục 1.26, mục “Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử”.

Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotic trong dung dịch đệm TE 1X (TT) có nồng độ 100 mg/ml.

Cặp mồi: Mồi xuôi (5'-3') ATCACCGCAATCGTTGGAATAGC và mồi ngược (5'-3') TTGCAACCACCACTAGAATCTGC. Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 μM bằng dung dịch đệm TE 1X (TT), tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 μM bằng dung dịch đệm TE 1X (TT), bảo quản ở -20°C.

Mẫu thử. Chuẩn bị dịch chứa 12,5 μL PCR master mix ¹ , 1 μL dung dịch mồi xuôi (25 μM), 1 μL dung dịch mồi ngược (25 μM), 9 μL nước vô khuẩn và 1 μL hỗn dịch mẫu hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng âm: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL hỗn dịch mẫu bằng 1 μL nước vô khuẩn.

Mẫu chứng dương: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL hỗn dịch mẫu bằng 1 μL dung dịch DNA của chủng đối chiếu Bifidobacterium longum subsp. longum Bi-05 hoặc thay thế cặp mồi đặc hiệu cho chủng đối chiếu bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bifidobacterium longum subsp. longum.

Tiến hành: Tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương bằng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp. Tiến hành phản ứng theo chu trình nhiệt như sau: Bước 1: Ủ ở 95 °C trong 5 min; Bước 2: ủ ở 95 °C trong 30 s; Bước 3: ủ ở 57 °C trong 30 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 1 min. Lặp lại các bước 2 - 4 trong 34 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Bifidobacterium longum subsp. longum Bi-05 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Bifidobacterium longum subsp. longum thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.

Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm kít DNA (automated on-chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose 2 % (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL và rửa gel bằng nước. Có thể sử dụng thuốc nhuộm phù hợp khác.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.

Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận. Trong trường hợp mẫu chứng dương sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại gen nào. Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, cần tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Mẫu thử phải có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 164 cặp base.

Định lượng

Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium ngoại trừ thay đổi sau.

Môi trường thạch MRS Lactobacilli: Chuẩn bị môi trường có công thức chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26 và thêm 1 ml dung dịch vô khuẩn cystein hydroclorid (TT) 5 % (kl/tt) vào 100 ml môi trường ngay trước khi sử dụng.

Giới hạn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Bifidobacterium longum subsp. longum không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Tổng số nấm: Không quá 10 ² CFU/g (Phụ lục 13.6).

Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không quá 5 x 10 ³ CFU/g (Phụ lục 1.26).

Vi sinh vật gây bệnh:

Escherichia coli: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).

Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).

Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).

Bảo quản

Bảo quản trong đồ đựng có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.

Ghi nhãn

Phải ghi đầy đủ tên chi, loài và chủng kèm theo số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc đơn vị tương đương.

Chú thích

¹ AmpliTaq Gold 360 Master Mix của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.

 

LACTICASEIBACILLUS CASEI

Lacticaseibacillus casei

Định nghĩa

Lacticaseibacillus casei (trước đây gọi là Lactobacillus casei) là vi khuẩn sinh acid lactic, Gram dương, hình que, không sinh bào tử, vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy ý, lên men đồng hình. Tế bào không di động, thường thẳng và đứng thành cặp hoặc chuỗi có độ dài khác nhau. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau khi lên men trước khi đông lạnh rồi đông khô sản phẩm đó. Các chất độn hay tá dược pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành có số lượng vi khuẩn sống Lacticaseibacillus casei không được ít hơn 100% so với lượng ghi trên nhãn.

Chủng Lc-11: Lacticaseibacillus casei Lc-11 (ATCC SD- 5213) là chủng Lacticaseibacillus casei đặc hiệu, thuần chủng, sản phẩm lên men có 5 % D-lactat, 95 % L-lactat.

Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng với chủng Lacticaseibacillus casei Lc-11.

Định tính

A. Định tính bằng kính hiển vi.

Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.

Tiêu chuẩn chấp nhận: trực khuẩn hình que, thẳng, đứng thành cặp hoặc chuỗi có độ dài khác nhau.

B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic.

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong kỹ thuật PCR phải đạt chất lượng quy định trong Phụ lục 1.26.

Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotic trong dung dịch đệm TE 1X (TT) có nồng độ 100 mg/ml

Cặp mồi: Mồi xuôi (5’-3’) TGCCCATTAGCATACTGGACC và mồi ngược (5’-3’) ACCCGAGCCTTTGCCAA. Pha loãng mồi bằng dung dịch đệm đến nồng độ 100 μM, tiếp tục pha loãng bằng dung dịch đệm đến nồng độ 25 μM, bảo quản ở -20 °C.

Mẫu thử: Chuẩn bị dung dịch chứa 12 μL PCR master mix ¹ , 1 μL dung dịch mồi xuôi (25 μM), 1 μL dung dịch mồi ngược (25 μM) và 10 μL nước vô khuẩn, 1 μL mẫu thử hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng âm: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 μL nước vô khuẩn.

Mẫu chứng dương: Tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 μL khuôn DNA của chủng chuẩn Lacticaseibacillus casei Lc-11 hoặc thay thế cặp mồi đặc hiệu cho chủng Lacticaseibacillus casei Lc-11 bằng cặp mồi đặc trưng cho loài Lacticaseibacillus casei.

Tiến hành: Tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương với cùng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp. Tiến hành phản ứng theo chu trình nhiệt Bước 1: Ủ ở 95 °C trong 7 min; Bước 2: ủ ở 95 °C trong 30 s; Bước 3: ủ ở 57 °C trong 30 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 1 min. Lặp lại các bước 2-4 trong 34 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Lacticaseibacillus casei Lc-11 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lacticaseibacillus casei thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.

Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm bộ kít DNA (automated on-chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose (TT) 2 % (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL và tiếp tục rửa gel bằng nước.

Có thể sử dụng thuốc nhuộm gel phù hợp khác.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải được thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại.

Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của các băng điện di DNA được khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận nếu sử dụng khuôn DNA của chủng chuẩn. Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài, kết quả phản ứng PCR phải có sản phẩm khuếch đại tương ứng với cặp mồi theo các tài liệu đã công bố.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào. Nếu kết quả không như mong đợi, tiến hành lại phản ứng PCR với các mẫu thử, mẫu chứng âm, mẫu chứng dương.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Mẫu thử phải có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 176 cặp base.

Định lượng

Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Lacticaseibacillus casei.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn Lacticaseibacillus casei Lc-11 không được ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn. Số lượng vi khuẩn được ghi theo đơn vị CFU/g.

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Tổng số nấm: Không quá 10 ² CFU/g (Phụ lục 13.6).

Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không quá 5 x 10 ³ CFU/g (Phụ lục 1.26).

Vi sinh vật gây bệnh:

Escherichia coli. Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).

Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).

Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).

Bảo quản

Bảo quản trong đồ đựng có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.

Ghi nhãn

Phải ghi tên chi, loài, chủng và số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc CFU/liều hoặc tương đương trên nhãn sản phẩm.

¹ AmpliTaq Gold 360 Master Mix của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.

 

LACTICASEIBACILLUS PARACASEl

Lacticaseibacillus paracasei

Định nghĩa

Lacticaseibacillus paracasei (trước đây gọi là Lactobacillus paracasei) là vi khuẩn sinh acid lactic, Gram dương, hình que, không sinh bào tử, vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy ý, lên men đồng hình. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau quá trình lên men, trước khi đông lạnh rồi đông khô. Các chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành có số lượng vi khuẩn sống Lacticaseibacillus paracasei không được ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Chủng LPC-37: Lacticaseibacillus paracasei LPC-37 (ATCC SD5275) là chủng Lacticaseibacillus paracasei đặc hiệu, thuần chủng, không sinh D-lactat.

Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng cho chủng Lacticaseibacillus paracasei LPC-37

Định tính

A. Định tính bằng kính hiển vi.

Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.

Tiêu chuẩn chấp nhận: trực khuẩn hình que.

B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong kỹ thuật PCR phải đạt chất lượng quy định trong Phụ lục 1.26.

Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotic trong dung dịch đệm TE 1X (TT) có nồng độ 100 mg/ml.

Cặp mồi: Mồi xuôi (5’ - 3’) GTTTGTGGCGGCGTAACTTC và mồi ngược (5' - 3') GGTGATCCTGAACGCGGTT. Pha loãng mồi bằng dung dịch đệm đến nồng độ 100 μM, tiếp tục pha loãng bằng dung dịch đệm đến nồng độ 25 μM, bảo quản ở -20 °C.

Mẫu thử. Chuẩn bị dung dịch chứa 10 μL PCR master mix ¹ , 1 μL dung dịch mồi xuôi (25 μM), 1 μL dung dịch mồi ngược (25 μM) và 12 μL nước vô khuẩn, 1 μL mẫu thử hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng âm: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 μL nước vô khuẩn.

Mẫu chứng dương: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 μL khuôn DNA của chủng chuẩn Lacticaseibacillus paracasei LPC-37 hoặc hoặc thay thế cặp mồi đặc hiệu cho chủng chuẩn Lacticaseibacillus paracasei LPC-37 bằng cặp mồi đặc trưng cho loài Lacticaseibacillus paracasei.

Tiến hành: Tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương với cùng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp. Tiến hành phản ứng theo chu trình nhiệt Bước 1: Ủ ở 95 °C trong 7 min; Bước 2: ủ ở 95 °C trong 30 s; Bước 3: ủ ở 57 °C trong 30 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 30 s. Lặp lại các bước 2 - 4 trong 34 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Lacticaseibacillus paracasei LPC-37 bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lacticaseibacillus paracasei thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.

Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm bộ kít DNA (automated on-chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose (TT) 2 % (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL và tiếp tục rửa gel bằng nước.

Có thể sử dụng thuốc nhuộm gel phù hợp khác.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải được thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại.

Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với cặp base đặc hiệu như ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận nếu sử dụng khuôn DNA của chủng chuẩn. Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài, kết quả phản ứng PCR phải có sản phẩm khuếch đại tương ứng với cặp mồi theo các tài liệu đã công bố.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào. Nếu kết quả không như mong đợi, tiến hành lại phản ứng PCR với các mẫu thử, mẫu chứng âm, mẫu chứng dương.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Mẫu thử phải có sản phẩm khuếch đại gen có kích thước khoảng 273 bp.

Định lượng

Tiến hành theo chỉ dẫn trong chuyên luận 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Lacticaseibacillus paracasei không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn. Số lượng vi khuẩn được ghi theo đơn vị CFU/g.

Giới hạn nhiễm vi sinh vật (Phụ lục 13.6)

Tổng số nấm: Không quá 10 ² CFU/g (Phụ lục 13.6).

Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không được quá 5 x 10 ³ CFU/g (Phụ lục 1.26).

Vi sinh vật gây bệnh:

Escherichia coli: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).

Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).

Staphylococus aureus: Không được có trong 1 g (Phụ lục 13.6).

Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).

Enterococci: Không được có quá 10 ² CFU/g (Phụ lục 1.26).

Coliforms: Không được có quá 10 CFU/g (Phụ lục 1.26).

Bảo quản

Bảo quản trong đồ đựng có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.

Ghi nhãn

Phải ghi tên chi, loài và chủng và số lượng vi khuẩn dưới dạng CFU/g hoặc CFU/liều hoặc đơn vị tương đương.

¹ AmpliTaq Gold 360 Master Mix của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.

 

LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

Lactobacillus acidophilus

Định nghĩa

Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn sinh acid lactic, không di động, không sinh bào tử, lên men đồng hình, trực khuẩn Gram dương hình que, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau khi lên men trước khi đông lạnh rồi đông khô. Các chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải chứa số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus acidophilus không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn. Chủng La-14: Lactobacillus acidophilus La-14 (mã hóa chủng theo ATCC là SD5212) là chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus đặc trưng, thuần chủng, sản phẩm lên men có 60 % L-lactat và 40 % D- lactat.

Chủng NCFM: Lactobacillus acidophilus NCFM (mã hóa chủng theo ATCC là SD5221) là chủng vi khuẩn Lactobacilus acidophilus đặc trưng, thuần chủng, sản phẩm lên men có 66 % L-lactat và 34 % D-lactat.

Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng cho chủng Lactobacillus acidophilus La-14 và Lactobacillus acidophilus NCFM.

Định tính

A. Định tính bằng kính hiển vi.

Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.

Tiêu chuẩn chấp nhận:

Chủng La-14: Trực khuẩn hình que.

Chủng La NCFM: Trực khuẩn hình que, xếp thành chuỗi ngắn.

B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic.

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong kỹ thuật PCR phải đạt chất lượng quy định trong Phụ lục 1.26.

Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotic trong dung dịch đệm TE 1X (TT) có nồng độ 100 mg/ml.

Mồi đặc hiệu: xem Bảng 1.

Bảng 1 - Mồi đặc hiệu và tiêu chuẩn chấp nhận tương ứng

^* : Phải đáp ứng tiêu chuẩn chấp nhận đối với mỗi cặp mồi để đạt yêu cầu định tính đến mức chủng (strain).

Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 μM bằng dung dịch đệm, tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 μM bằng dung dịch đệm, bảo quản ở -20 °C.

Mẫu thử. Chuẩn bị dung dịch chứa 10 μL PCR master mix ¹ , 1 μL dung dịch mồi xuôi (25 μM), 1 μL dung dịch mồi ngược (25 μM), 12 μL nước vô khuẩn và 1 μL hỗn dịch mẫu hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng âm: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 μL nước vô khuẩn.

Mẫu chứng dương: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 μL khuôn DNA của chủng chuẩn Lactobacillus acidophilus La-14/NCFM hoặc thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng chuẩn bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus acidophilus.

Tiến hành: Đối với mỗi cặp mồi, tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương trên cùng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp ở Bảng 2. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Lactobacillus acidophilus La-14/NCFM bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus acidophilus thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.

Bảng 2 - Chu trình nhiệt

Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm bộ kít DNA (automated on - chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose (TT) 2 % (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch Ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL hoặc thuốc nhuộm gel phù hợp khác và rửa gel bằng nước.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước của các sản phẩm khuếch đại, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên gel.

Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như được quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận. Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus acidophilus làm chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào. Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Xem Bảng 1.

Định lượng

Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus acidophilus không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn. Số lượng vi khuẩn được ghi theo đơn vị CFU/g.

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Tổng số nấm: Không quá 10 ² CFU/g (Phụ lục 13.6).

Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không quá 5 x 10 ³ CFU/g (Phụ lục 1.26).

Vi sinh vật gây bệnh:

Escherichia coli: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).

Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).

Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).

Bảo quản

Bảo quản trong đồ đựng có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.

Ghi nhãn

Phải ghi tên chi, loài, chủng và số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc đơn vị tương đương trên nhãn.

¹ AmpliTaq Gold 360 Master Mix của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.

 

LACTOBACILLUS RHAMNOSUS

Lactobacillus rhamnosus

Định nghĩa

Lactobacillus rhamnosus là trực khuẩn gram dương, lên men dị hình, không sinh bào tử. Tế bào hình que hai đầu vuông, không di động đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi.

Lactobacillus rhamnosus không thủy phân được Arginin. Có thể thêm các chất bảo vệ lạnh phù hợp vào sinh khối thu được sau khi lên men, trước khi tiến hành đông lạnh rồi đông khô. Các chất độn hay chất pha loãng phù hợp có thể được thêm vào công thức sản phẩm. Sản phẩm tạo thành phải chứa số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus rhamnosus không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn.

Chủng HN001: Chủng HN001 là chủng vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus đặc trưng, thuần chủng, có plasmid, không sinh D-lactat.

Chủng GG: chủng GG là chủng vi khuẩn Lactobacillus rhamnosus đặc trưng, thuần chủng, không có plasmid, không sinh D-lactat.

Lưu ý: Chuyên luận này chỉ áp dụng cho chủng Lactobacillus rhamnosus HN001 và Lactobacillus rhamnosus GG.

Định tính

A. Định tính bằng kính hiển vi.

Tiến hành như chỉ dẫn trong mục Định lượng và nhuộm soi dưới kính hiển vi.

Tiêu chuẩn chấp nhận:

Chủng HN001: Trực khuẩn hình que có độ dài khác nhau, thường xếp thành chuỗi ngắn.

Chủng GG: Trực khuẩn nhỏ hình que, có kích thước đồng nhất, xếp thành chuỗi.

B. Định tính bằng phương pháp phân tích dựa trên chuỗi acid nucleic

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong kỹ thuật PCR phải đạt chất lượng quy định trong Phụ lục 1.26.

Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu probiotics trong dung dịch đệm TE 1X (TT) có nồng độ 100 mg/ml.

Mồi đặc hiệu: xem Bảng 1.

Bảng 1 - Cặp mồi đặc hiệu và tiêu chuẩn chấp nhận tương ứng

^* : Phải đáp ứng tiêu chuẩn chấp nhận đối với mỗi cặp mồi để đạt yêu cầu định tính đến mức chủng (strain).

Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 μM bằng dung dịch đệm, tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 μM bằng dung dịch đệm, bảo quản ở -20 °C.

Mẫu thử. Chuẩn bị dung dịch chứa 12,5 μL PCR master mix ¹ , 1 μL dung dịch mồi xuôi (25 μM), 1 μL dung dịch mồi ngược (25 μM), 9,5 μL nước vô khuẩn và 1 μL hỗn dịch mẫu hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng âm: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 μL nước vô khuẩn Mẫu chứng dương. tương tự như thành phần của mẫu thử, thay mẫu thử bằng 1 μL khuôn DNA của chủng chuẩn Lactobacillus rhamnosus HN001/GG hoặc thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng chuẩn bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus rhamnosus.

Tiến hành: Tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương tương ứng trên cùng một máy tạo chu trình nhiệt thích hợp. Tiến hành phản.ứng theo chu trình nhiệt như sau: Bước 1: Ủ ở 95 °C trong 10 min; Bước 2: ủ ở 95 °C trong 30 s; Bước 3: ủ ở 57 °C trong 30 s; Bước 4: ủ ở 72 °C trong 1 min. Lặp lại các bước 2 - 4 trong 34 chu kỳ. Ủ tiếp ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. Trong trường hợp mẫu chứng dương là mẫu thử được thay cặp mồi đặc hiệu cho chủng Lactobacillus rhamnosus HN001/GG bằng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus rhamnosus thì có thể chạy riêng mẫu chứng dương với chu trình nhiệt phù hợp với cặp mồi được chọn. Chu trình nhiệt trong nhân bản DNA có thể được thực hiện theo quy trình của master mix hoặc theo yêu cầu của enzym sử dụng.

Phân tích sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm bằng hệ thống điện di tự động kèm bộ kít DNA (automated on - chip electrophoresis system). Tiến hành điện di theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, có thể tiến hành phương pháp điện di gel. Sử dụng gel agarose (TT) 2 % (kt/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/ml hoặc thuốc nhuộm gel phù hợp khác và rửa gel bằng nước.

Có thể sử dụng thuốc nhuộm phù hợp khác.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến, nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thang chuẩn DNA có kích thước phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại thu được. Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước của các sản phẩm khuếch đại, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên gel.

Nếu sử dụng DNA của chủng đối chiếu làm mẫu chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như được quy định ở mục Tiêu chuẩn chấp nhận. Nếu sử dụng cặp mồi đặc hiệu chung cho loài Lactobacillus rhamnosus làm chứng dương, kết quả phản ứng PCR mẫu chứng dương phải có sản phẩm khuếch đại với số cặp base đặc hiệu như trong các tài liệu đã công bố.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào. Nếu kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm và/hoặc mẫu chứng dương không như mong muốn, tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Xem Bảng 1.

Định lượng

Tiến hành theo chỉ dẫn trong Phụ lục 1.26, mục Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus rhamnosus không ít hơn 100 % so với lượng ghi trên nhãn. Số lượng vi khuẩn được ghi theo đơn vị CFU/g.

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Tổng số nấm: Không quá 10 ² CFU/g (Phụ lục 13.6).

Tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic: Không quá 5 x 10 ³ CFU/g (Phụ lục 1.26).

Vi sinh vật gây bệnh:

Escherichia coli: Không được có trong 10 g (Phụ lục 13.6).

Salmonella sp.: Không được có trong 40 g (Phụ lục 13.6).

Listeria: Không được có trong 25 g (Phụ lục 1.26).

Bảo quản

Bảo quản trong đồ đựng có chất liệu phù hợp, kín, bền chắc, không quá 4 °C.

Ghi nhãn

Phải ghi tên chi, loài, chủng và số lượng vi khuẩn theo đơn vị CFU/g hoặc theo đơn vị tương đương trên nhãn.

¹ AmpliTaq Gold 360 Master Mix (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.

 

MỤC LỤC

Lời nói đầu

Lời giới thiệu

1 Phạm vi áp dụng

2 Tài liệu viện dẫn

3 Chữ viết tắt

Vắc xin và sinh phẩm y tế

Vắc xin sởi và rubella (vắc xin MR)

Bacillus clausii

Bacillus coagulans

Nang Bacillus coagulans

Bifidobacterium longum subsp. Infantis

Bifidobacterium longum subsp. Longum

Lacticaseibacillus casei

Lacticaseibacillus paracasei

Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus rhamnosus