Tiêu chuẩn TCVN I-1:2017/SĐ2:2025 Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

SỬA ĐỔI 2:2025 TCVN I-1:2017

BỘ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA VỀ THUỐC - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM THUỐC

Set of national standards for medicines - Part 1: General methods for quality control of medicines

Lời nói đầu

SỬA ĐỔI 2:2025 TCVN I-1:2017 do Hội đồng Dược điển Việt Nam biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỬA ĐỔI 2:2025 TCVN I-1:2017 thay thế 5 tiêu chuẩn trong bộ TCVN I-1:2017 như sau:

1. Phụ lục 1.26 Yêu cầu chung đối với chế phẩm Probiotic

2. Phụ lục 12.11 Xác định tạp chất lẫn trong dược liệu

3. Phụ lục 12.20 Phương pháp chế biến dược liệu

4. Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm vi sinh vật

5. Phụ lục 15.43 Kiểm tra công hiệu (in vivo) của vắc xin viêm gan B tái tổ hợp

Lời giới thiệu

Tiêu chuẩn quốc gia về thuốc là văn bản kỹ thuật về tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng thuốc.

Danh pháp, thuật ngữ trong Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc được viết theo quy định của Hội đồng Dược điển Việt Nam, Bộ Y tế. Các thuật ngữ dược phẩm được viết dựa trên nguyên tắc việt hoá tên chung quốc tế Latin (DCI Latin) một cách hợp lý nhằm giữ các ký tự cho sát với thuật ngữ quốc tế. Tên hợp chất hữu cơ được viết theo danh pháp do Hiệp hội quốc tế hóa học thuần túy và ứng dụng (I.U.P.A.C) quy định. Trong một số trường hợp cá biệt, các thuật ngữ tiếng Việt đã quen dùng đối với một số nguyên tố, hoá chất hay tên dược liệu vẫn tiếp tục sử dụng.

 

BỘ TIÊU CHUẨN QUỐC GIA VỀ THUỐC - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM THUỐC

Set of national standards for medicines - Part 1: General methods for quality control of medicines

1 Phạm vi áp dụng

Bộ tiêu chuẩn này quy định các phương pháp kiểm nghiệm thuốc; áp dụng để kiểm tra, đánh giá chất lượng thuốc thành phẩm, nguyên liệu làm thuốc, vắc xin và sinh phẩm y tế, dược liệu và thuốc từ dược liệu đăng ký lưu hành trong nước.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn có ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả sửa đổi bổ sung (nếu có).

TCVN I-1:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc; gồm Quy định chung và các phụ lục như sau:

Phụ lục 1: Từ phụ lục 1.1 đến phụ lục 1.24;

Phụ lục 2: Từ phụ lục 2.1 đến phụ lục 2.5;

Phụ lục 3: Từ phụ lục 3.1 đến phụ lục 3.6;

Phụ lục 4: Từ phụ lục 4.1 đến phụ lục 4.4;

Phụ lục 5: Từ phụ lục 5.1 đến phụ lục 5.7;

Phụ lục 6: Từ phụ lục 6.1 đến phụ lục 6.11;

Phụ lục 7: Từ phụ lục 7.1 đến phụ lục 7.11;

Phụ lục 8: Từ phụ lục 8.1 đến phụ lục 8.3;

Phụ lục 9: Từ phụ lục 9.1 đến phụ lục 9.10;

Phụ lục 10: Từ phụ lục 10.1 đến phụ lục 10.19;

Phụ lục 11: Từ phụ lục 11.1 đến phụ lục 11.8;

Phụ lục 12: Từ phụ lục 12.1 đến phụ lục 12.20;

Phụ lục 13: Từ phụ lục 13.1 đến phụ lục 13.10;

Phụ lục 14;

Phụ lục 15: Từ phụ lục 15.1 đến phụ lục 15.41;

Phụ lục 16: Từ phụ lục 16.1 đến phụ lục 16.2;

Phụ lục 17: Từ phụ lục 17.1 đến phụ lục 17.8;

Phụ lục 18.

TCVN II:2012, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thước - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc, gồm các phụ lục như sau: Phụ lục 1.25; phụ lục 4.5; phụ lục 6.12; phụ lục 12.21 và phụ lục 12.22.

TCVN III:2014, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc, gồm các phụ lục như sau: Phụ lục 15.42 và phụ lục 15.43.

TCVN IV:2015, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc, gồm phụ lục 10.20.

TCVN V:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc và chuyên mục, gồm các phụ lục như sau: Phụ lục 1.26; phụ lục 6.13; phụ lục 10.21; phụ lục 10.22; phụ lục 11.9; phụ lục 11.10; phụ lục 12.23; phụ lục 13.11; phụ lục 15.44; phụ lục 15.45; phụ lục 15.46 và phụ lục 15.47.

TCVN VI:2017, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phương pháp kiểm nghiệm thuốc và chuyên mục; gồm các phụ lục như sau: Phụ lục 1.27; phụ lục 4.6; phụ lục 4.7; phụ lục 4.8 và phụ lục 12.24. TCVN VIII:2022, Bộ tiêu chuẩn quốc gia về thuốc - Phần 1: Phụ lục 17 đồ đựng cấp 1 dùng cho chế phẩm dược; gồm các phụ lục như sau: 17.3.4; 17.9.8; 17.9.9; 17.9.10.

3 Chữ viết tắt

Tên hóa chất, thuốc thử in nghiêng kèm theo các chữ viết tắt sau đây trong ngoặc đơn biểu thị thuốc thử đó phải đạt yêu cầu quy định tại Phụ lục 2.

Chữ viết tắt	Ý nghĩa
CĐ	Chuẩn độ
TT	Thuốc thử
TT1,TT2, TT3,...	Thuốc thử 1, thuốc thử 2, thuốc thử 3,...
tt/tt	Thể tích/thể tích

 

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM THUỐC

PHỤ LỤC 1.26. YÊU CẦU CHUNG ĐỐI với CHẾ PHẨM PROBIOTIC

Chuyên luận này hướng dẫn phương pháp định tính, định lượng, thử Giới hạn nhiễm vi sinh vật và các yêu cầu kỹ thuật đối với chế phẩm Probiotic.

Chế phẩm Probiotic cần đạt các yêu cầu quy định khác trong chuyên luận chung về các dạng bào chế như viên nén, viên nang, viên nang mềm, bột thuốc hoặc gel nhai,...

Định nghĩa

Probiotic là những vi sinh vật sống, khi sử dụng với số lượng đủ lớn sẽ đem lại lợi ích cho sức khỏe của người sử dụng.

Probiotic thường được định tính đến cấp độ chủng (strain) vỉ các đặc tính của chủng là đặc trưng riêng của từng chủng.

Phương pháp sản xuất

Probiotic được sản xuất bằng phương pháp lên men trong các thiết bị chuyên dụng trong điều kiện nuôi cấy nghiêm ngặt. Môi trường lên men được điều chỉnh theo đặc tính của từng loài hoặc từng chủng vi sinh vật và thường chứa các chất dinh dưỡng như protein, carbohydrat, vltamin và khoáng chất. Chủng vi sinh vật được nhân lên và phát triển trong các điều kiện đã được thiết lập cẩn thận. Sau khi vi sinh vật phát triển, tiến hành thu lấy sinh khối, thường sử dụng phương pháp ly tâm. Có thể thêm vào sinh khối Probiotic các chất bảo vệ thích hợp, sinh khối được đông khô hoặc phun sấy lạnh để chuyển thành dạng bột. Nguyên liệu được sản xuất bằng cách trộn một hoặc nhiều sinh khối chủng vi sinh vật với chất độn, chất pha loãng phù hợp. Nguyên liệu tiếp tục được xử lý để sản xuất thành phẩm với các dạng bào chế khác nhau, ví dụ: viên nén, viên nang, viên nang mềm, bột hoặc gel,...

Định tính vi sinh vật

Các Probiotic (vi sinh vật sống) trong chuyên luận này được định tính đến cấp độ chi và loài hoặc đến cấp độ chủng theo yêu cầu của các chuyên luận riêng. Dựa trên các thông tin từ việc đánh giá mức độ an toàn và các nghiên cứu trên người mà việc quy định thành phẩm Probiotic phải được bào chế từ các chủng vi sinh vật trở nên phổ biến, do vậy việc định tính vi sinh vật đến cấp độ chủng là cần thiết để xác minh đúng tên chủng được ghi trên nhãn sản phẩm thương mại. Trong chuyên luận này, việc định tính đến cấp độ chủng các Probiotic được thực hiện bằng phản ứng chuỗi polymerase (kỹ thuật PCR) với mồi đặc hiệu được khuyến khích sử dụng. Quy trình định tính các chủng thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium bằng kỹ thuật PCR với các mồi đặc hiệu được trình bày ở dưới đây.

Định tính các chủng thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium bằng kỹ thuật PCR với các mồi đặc hiệu

Trừ khi có chỉ dẫn khác trong các chuyên luận riêng, tiến hành định tính theo quy trình chung sau đây. Các hóa chất, thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn sử dụng cho sinh học phân tử, xem mục “Hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử" và Phụ lục 2. Có thể sử dụng các hóa chất, thuốc thử dưới dạng thương phẩm có chất lượng phù hợp.

PCR master mix: Hỗn hợp gồm Taq DNA polymerase (62,5 U/mL), dung dịch đệm 2,5X [kali clorid 125 mM, tris-hydroclorid 75 mM pH 8,3, và magnesi (Mg+2) 4 mM], và 500 μM của mỗi deoxynucleotid (dNTP)1 hoặc các master mix thương mại tương đương.

Hỗn dịch mẫu: Chuẩn bị hỗn dịch mẫu Probiotic trong dung dịch đệm TE 1X (TT) có nồng độ 100 mg/ml (có thể sử dụng dung dịch đệm TAE 1X, dung dịch đệm TBE 1X nếu cần thiết).

Cặp mồi: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng chủng vi sinh vật theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng. Pha dung dịch mồi gốc có nồng độ 100 pM bằng dung dịch đệm, tiếp tục pha loãng đến nồng độ 25 μM bằng dung dịch đệm. Có thể bảo quản dung dịch mồi pha loãng có nồng độ 25 μM ở -20 °C.

Mẫu thử: Đối với mỗi cặp mồi đặc hiệu chuẩn bị dịch chứa 10 μL PCR master mix, 1 μL dung dịch mồi xuôi (25 μM), 1 μL dung dịch mồi ngược (25 μM) và 12 μL nước vô khuẩn, 1 μL hỗn dịch mẫu hoặc pha theo khuyến cáo của master mix thương mại khác được sử dụng.

Mẫu chứng âm: tương tự như thành phần của mẫu thử, thay 1 μL hỗn dịch mẫu bằng 1 μL nước vô khuẩn.

Mẫu chứng dương (nếu có): tương tự như thành phần của mẫu thử, thay hỗn dịch mẫu bằng 1 μL mẫu chuẩn tương ứng.

Tiến hành: tiến hành phản ứng PCR trên mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương với cùng máy tạo chu trình nhiệt thích hợp. Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, tiến hành phản ứng theo chu trình nhiệt như sau:

Chu trình nhiệt: Bước1: Ủ các mẫu ở 95 °C trong 7 min để tách chiết DNA; Bước 2: Ủ ở 95 °C trong 30 s; Bước 3: Ủ ở nhiệt độ theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng trong 30 s; Bước 4: Ủ ở 72 °C trong 30 s. Lặp lại các bước 2 đến bước 4 trong khoảng từ 30 đến 34 chu kỳ, ủ ở 72 °C trong 5 min và giữ ở 4 °C. Đối với các mẫu Probiotic khó tách chiết DNA cần nghiên cứu quy trình xử lý mẫu phù hợp. Điện di sản phẩm phản ứng PCR của mẫu thử, mẫu chứng dương, mẫu chứng âm. Có thể sử dụng hệ thống điện di tự động kèm bộ kit DNA (automated on-chip electrophoresis system) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sử dụng gel agarose có nồng độ phù hợp khoảng 1 % (kl/tt) trong dung dịch đệm TAE 1X (TT)/dung dịch đệm TBE 1X (TT). Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromid (TT) 0,5 mg/mL và rửa gel bằng nước.

Thận trọng: Ethidium bromid (TT) là một chất độc hại và có khả năng gây đột biến nên ở bước rửa gel bằng nước thì nước sau khi rửa phải thu hồi và xử lý theo hướng dẫn xử lý hóa chất độc hại. Sử dụng thiết bị bảo hộ cá nhân thích hợp (đeo găng tay nitril) khi tiếp xúc thuốc thử này. Có thể sử dụng thuốc nhuộm phù hợp khác.

Sử dụng thang chuẩn DNA phù hợp để xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại. Để thuận lợi cho việc so sánh kích thước các sản phẩm khuếch đại gen, nên đặt thang chuẩn ở làn đầu tiên và làn cuối cùng trên bản gel.

Kết quả phản ứng PCR mẫu chứng âm phải không có bất kỳ sản phẩm khuếch đại gen nào. Nếu mẫu chứng âm xuất hiện sản phẩm khuếch đại gen, tiến hành lại phản ứng PCR với mẫu thử, mẫu chứng âm và mẫu chứng dương (nếu có).

Tiêu chuẩn chấp nhận: Phải đạt quy định theo chuyên luận riêng.

Định lượng

Chuyên luận này đưa ra quy trình định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium. Các phương pháp thay thế, bao gồm cả các phương pháp tự động, có thể được sử dụng nếu được chứng minh là tương đương.

Định lượng các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium

Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, tiến hành định lượng các loài vi khuẩn trong chi Lactobacillus và Bifidobacterium theo quy trình sau:

Môi trường thạch MRS Lactobacilli: Chuẩn bị môi trường có công thức như sau hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn.

Thành phần	Khối lượng (g)
Proteose pepton	10,0
Cao thịt bò	10,0
Cao nấm men	5,0
Dextrose	20,0
Polysorbat 80	1,0
Amoni citrat	2,0
Natri acetat	5,0
Magnesi Sulfat	0,1
Mangan Sulfat	0,05
Dikali hydrophosphat	2,0
Thạch	15,0

Hòa các thành phần môi trường thạch MRS Lactobacilli trong 1 L nước trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng. Đun sôi trong không quá 1 min để môi trường hòa tan hoàn toàn, sau đó tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C - 8 °C.

Môi trường lỏng MRS Lactobacilli: Chuẩn bị môi trường có công thức như sau hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn.

Thành phần	Khối lượng (g)
Proteose pepton	10,0
Cao thịt bò	10,0
Cao nấm men	5,0
Dextrose	20,0
Polysorbat 80	1,0
Amoni citrat	2,0
Natri acetat	5,0
Magnesi Sulfat	0,1
Mangan Sulfat	0,05
Dikali hydrophosphat	2,0

Hòa các thành phần môi trường lỏng MRS Lactobacilli trong 1 L nước tinh khiết trong bình nón hoặc cốc có dung tích phù hợp. Đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy trên bếp nóng. Đun sôi trong không quá 1 min để môi trường hòa tan hoàn toàn, sau đó tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp. theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C - 8 °C.

Dung dịch pepton pha loãng: Chuẩn bị dung dịch pepton 0,1 % (kl/tt) và điều chỉnh đến pH 7,0 bằng dung dịch acid lactic (TT). Tiệt khuẩn dung dịch trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Hỗn dịch mẫu: Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, cân khoảng 11,0 g bột mẫu Probiotic vào túi polyetylen vô khuẩn (túi dập mẫu). Thêm 99 ml môi trường lỏng MRS Lactobacilli đã tiệt khuẩn vào túi (môi trường được để nguội đến nhiệt độ phòng). Trộn bằng máy lắc cơ học đến khi thu được hỗn dịch mẫu đồng nhất hoặc sử dụng máy dập mẫu (Stomacher) với tốc độ 230 rpm trong 30 s. Giữ hỗn dịch mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 min để phân tán mẫu Probiotic trong môi trường lỏng MRS Lactobacilli, sau đó trộn tiếp với tốc độ 230 rpm trong 30 s thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10^-1. Có thể xử lý mẫu Probiotic bằng quy trình khác với hướng dẫn trên nếu được chứng minh là phù hợp.

Trong điều kiện vô khuẩn, sử dụng các đầu pipet vô khuẩn có màng lọc, tiến hành pha loãng bằng cách lấy 1,0 ml hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10^-1 vào chai vô khuẩn chứa 99,0 ml dung dịch pepton pha loãng, thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10^-3. Tiếp tục pha loãng như trên đến khi thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng cuối cùng dự kiến chứa 25 đến 250 CFU/ml. Lắc đều các chai hỗn dịch mẫu pha loãng trước khi tiến hành thử nghiệm.

Tiến hành: Trong điều kiện vô khuẩn, sử dụng 3 đầu pipet vô khuẩn có màng lọc, hút riêng biệt 1,0 ml hỗn dịch mẫu đã pha loãng vào ba đĩa petri vô khuẩn kích thước 15 mm x 100 mm, được ghi nhãn thích hợp, sau đó đổ khoảng 20 - 25 ml môi trường thạch MRS Lactobacilli có nhiệt độ khoảng 45 °C vào mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa petri sau khi đổ môi trường thạch, sau đó xoay nhẹ các đĩa để trộn đều hỗn dịch mẫu vào môi trường thạch. Lặp lại quy trình này với các hỗn dịch mẫu có độ pha loãng khác. Chuẩn bị một đĩa mẫu trắng chỉ chứa môi trường thạch MRS Lactobacilli và đĩa mẫu trắng thứ hai chứa 1,0 ml dung dịch pepton pha loãng trộn với môi trường thạch MRS Lactobacilli. Để yên các đĩa ở nhiệt độ phỏng trên một bề mặt bằng phẳng cho đến khi thạch đông, ủ các dĩa petri ở 36 °C đến 40 °C trong 3 ngày đến 5 ngày trong điều kiện kỵ khí. Sau thời gian ủ, đếm số lượng khuẩn lạc ở mỗi đĩa. Lựa chọn các dĩa có 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Tính giá trị trung bình số khuẩn lạc của 3 đĩa có cùng nồng độ pha loãng và từ đó tính số khuẩn lạc theo đơn vị CFU/g.

Giới hạn chấp nhận: Phải đạt quy định theo chuyên luận riêng.

Giới hạn nhiễm vi sinh vật

Mức độ tạp nhiễm vi sinh vật, vi sinh vật gây bệnh cần được quy định trong các chuyên luận riêng để đảm bảo chất lượng của chế phẩm Probiotic. Mức Giới hạn nhiễm vi sinh vật được quy định trong Bảng 1.26.1 và Bảng 1.26.2. Có thể sử dụng các quy trình thay thế, bao gồm cả các phương pháp tự động nếu đã được chứng minh là tương tương, có thể sử dụng các phương pháp thích hợp (ví dụ: pha loãng, dung dịch đệm hoặc màng lọc) để trung hòa các yếu tố ức chế, ví dụ như sản phẩm acid tự do của quá trình tăng sinh các vi sinh vật Probiotic có thể dẫn đến kết quả âm tính giả. cần tiến hành đánh giá sự phù hợp phương pháp thử Giới hạn nhiễm vi sinh vật. Cần đánh giá lại sự phù hợp của phương pháp khi thay đổi điều kiện thử nghiệm hoặc thay đổi công thức sản phẩm có thể ảnh hưởng đến kết quả của thử nghiệm.

Tổng số vi sinh vật tạp nhiễm

Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, phương pháp thử và giới hạn tổng số vi sinh vật tạp nhiễm trong nguyên liệu và thành phẩm Probiotic dùng đường uống được quy định trong Bảng 1.26.1.

Bảng 1.26.1 - Phương pháp thử và giới hạn tổng số vi sinh vật tạp nhiễm trong nguyên liệu và thành phẩm Probiotic dùng đường uống

Chế phẩm Probiotic	Chỉ tiêu tạp nhiễm	Phương pháp thử	Giới hạn chấp nhận (CFU/g hoặc ml)
Vi khuẩn không sinh bào tử	Vi khuẩn không sinh acid lactic	Xác định tổng số vi khuẩn không sinh acid lactic	≤ 5x 103
	Tổng số nấm	Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật - Phụ lục 13.6	≤ 102
Vi khuẩn sinh bào tử	Tổng số nấm	Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật - Phụ lục 13.6	≤ 102
Nấm	Tổng số vi sinh vật hiếu khí	Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật - Phụ lục 13.6	≤ 103

Vi sinh vật gây bệnh

Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, phương pháp thử và giới hạn vi sinh vật gây bệnh tạp nhiễm trong nguyên liệu và thành phẩm Probiotic dùng đường uống được quy định trong Bảng 1.26.2.

Bảng 1.26.2 - Phương pháp thử và giới hạn vi sinh vật gây bệnh tạp nhiễm trong nguyên liệu và thành phẩm Probiotic dùng đường uống

Chế phẩm Probiotic	Chỉ tiêu tạp nhiễm	Phương pháp thử	Tiêu chuẩn chấp nhận (CFU/g hoặc ml)
Vi khuẩn không sinh bào tử; Vi khuẩn sinh bào tử; Nấm	Escherichia coli	Phương pháp xác định vi sinh vật gây bệnh - Phụ lục 13.6	Không được có trong 10 g
	Salmonella	Phương pháp xác định vi sinh vật gây bệnh - Phụ lục 13.6	Không được có trong 10 g

Cần quy định thêm không được có Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus hoặc Pseudomonas aeruginosa nếu nguyên liệu hoặc thành phẩm Probiotic có nguy cơ tạp nhiễm các vi sinh vật này. Đối với các chế phẩm Probiotic dùng cho trẻ sơ sinh cần quy định thêm không được có Clostridium perfringens và Cronobacter sakazakii. Phương pháp phát hiện Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens và Cronobacter sakazakii phải là phương pháp tiêu chuẩn hoặc phương pháp đã được thẩm định.

Xác định tổng số vi khuẩn không sinh acidlactic

Môi trường nuôi cấy

Điều quan trọng của phương pháp này là không có mặt carbohydrat trong môi trường nuôi cấy.

Thành phần: Chuẩn bị môi trường có công thức như sau hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn.

Nếu sử dụng môi trường hoàn chỉnh khô thương phẩm: Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Điều chỉnh pH nếu cần để sau khi tiệt khuẩn pH là 7,5 ± 0,1 ở 25 °C.

Nếu chuẩn bị môi trường từ các thành phần khô riêng lẻ: Hòa tan các thành phần trong nước nóng, theo thứ tự: pepton từ casein, pepton từ gelatin, natri clorid. Thêm thạch và đun đến sôi, vừa đun vừa khuấy đến khi thạch tan hết hoặc đun cách thủy trong 30 min. Điều chỉnh pH nếu cần để sau khi tiệt khuẩn pH là 7,5 ± 0,1 ở 25 °C.

Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C - 8 °C.

Chuẩn bị hỗn dịch mẫu: Tiến hành chuẩn bị hỗn dịch mẫu theo Phụ lục 13.6, mục "Kiểm tra sự phù hợp phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử”, "Chuẩn bị mẫu thử” sử dụng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc dung dịch phù hợp để pha loãng.

Chuẩn bị các đĩa môi trường: Rót 12 ml đến 15 ml môi trường đã chuẩn bị vào các đĩa petri, để môi trường đông đặc. Làm khô các đĩa, tốt nhất là đậy nắp và úp ngược đĩa môi trường, ủ trong tủ ấm ở 50 °C trong 30 min.

Tiến hành: Dùng pipet vô khuẩn cho vào mỗi đĩa 0,1 ml hỗn dịch mẫu có độ pha loãng thích hợp, tiến hành 2 đĩa petri đối với mỗi nồng độ pha loãng. Dùng bộ dàn mẫu vô khuẩn để dàn nhanh dịch cấy một cách cẩn thận lên bề mặt đĩa, chú ý không chạm vào thành đĩa. Sử dụng riêng bộ dàn mẫu vô khuẩn cho mỗi đĩa. Đậy nắp, để yên các đĩa khoảng 15 min trên bàn để cho dịch cấy hấp thụ vào các đĩa. Lật úp đĩa và ủ ở 30 °C trong 72 ± 2 h.

Sau khi ủ, đếm số lượng khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc đặc trưng đối với vi sinh vật tạp nhiễm trong mỗi dĩa chứa không quá 150 khuẩn lạc. Không đếm các khuẩn lạc nhỏ vì chúng không điển hình cho các vi sinh vật tạp nhiễm.

Thông tin về nguồn gốc sự tạp nhiễm có thể thu được bằng cách kiểm tra khuẩn lạc có mặt. Điều này có thể rất giá trị do đó cần ghi lại các loại khuẩn lạc có mặt (ví dụ: nấm men, mốc, Bacillus sp ... thuần chủng hay hỗn tạp).

Tính kết quả

Giữ lại các dĩa có từ 10 đến 150 khuẩn lạc đặc trưng ở hai độ pha loãng liên tiếp.

Tính số lượng, N, vi sinh vật tạp nhiễm trên gam mẫu Probiotic, theo công thức sau:

N = c/[(n₁ + 0,1 x n₂) x V x d]

Trong đó

C: Tổng số khuẩn lạc đặc trưng đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại;

n₁: Số đĩa của độ pha loãng thứ nhất được giữ lại;

n₂: Số đĩa của độ pha loãng thứ hai được giữ lại;

d: Hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất;

V: Thể tích hỗn dịch mẫu ở độ pha loãng thứ nhất.

Biểu thị kết quả

Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa. Đối với chữ số thứ ba, làm tròn chữ số thứ ba này đến zero gần nhất. Nếu chữ số thứ ba này là 5 thì làm tròn đến số thấp hơn nếu chữ số thứ hai là chẵn và làm tròn đến số cao hơn nếu số thứ hai là số lẻ.

Ví dụ 234 thành 230

235 thành 240

225 thành 220

236 thành 240

Nếu chỉ có số đếm nhỏ hơn 10, thì báo cáo số lượng vi sinh vật trên mỗi gam là “ít hơn 10/(Vxd)" (trong đó d là giá trị tương ứng với độ pha loãng thấp nhất).

Kết quả được biểu thị bằng số từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa tương ứng của 10.

Ví dụ: Thể tích hỗn dịch mẫu cấy vào môi trường là 1 ml.

Ở độ pha loãng thử nhất (10^-2): 83 khuẩn lạc và 97 khuẩn lạc.

Ở độ pha loãng thứ hai (10^-3): 13 khuẩn lạc và 10 khuẩn lạc.

Tính kết quả theo công thức sau:

N = C/(n₁+ 0,1 x n₂) x V x d = (83+97+13+10)/(2 + 0,1 x 2)x1x10^-2 = 9227

Làm tròn kết quả đến hai chữ số có nghĩa là 9200 hoặc 9,2 x 10³ vi sinh vật tạp nhiễm trong một gam mẫu Probiotic.

Listeria

Môi trường tăng sinh Listeria (BLEB-Base): Chuẩn bị môi trường có công thức như sau hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn.

Tiệt khuẩn môi trường theo quy trình đã thẩm định. pH môi trường sau khi tiệt khuẩn là 7,3 ±0,1. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C -

8 °C.

Dung dịch chọn lọc: lọc vô khuẩn từng dung dịch sau đây trước khi sử dụng:

- Dung dịch acriflavin hydroclorid 0,5 % (kl/tt);

- Dung dịch natri acid nalidixic 0,5 % (kl/tt);

- Dung dịch cycloheximid 1,0 % trong ethanol 40 % (kl/tt).

Chuẩn bị mẫu thử:

Trong điều kiện vô khuẩn, chuẩn bị túi dập mẫu chứa 225 mL môi trường tăng sinh Listeria, 0,675 ml dung dịch acriflavin, 1,8 ml dung dịch muối natri acid nalidixic và 1,15 mL dung dịch cycloheximid. Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, thêm 25 g mẫu Probiotic và 2,5 ml dung dịch natri pyruvat 10 % (kl/tt) đã lọc vô khuẩn vào túi dập mẫu và trộn đều bằng máy stomacher trong 2 min. Sau khi trộn, ủ mẫu ở 29 °C đến 31 °C trong 4 h. Sau thời gian ủ, thêm 0,9 ml môi trường tăng sinh Listeria vào mẫu thử, tiếp tục ủ ở 29 °C đến 31 °C trong 44 h đến 46 h. Đun nóng mẫu thử ở trên ở 95 °C đến 100 °C trong 15 min, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Tiến hành thử nghiệm ngay sau khi chuẩn bị mẫu thử.

Tiến hành

Sử dụng các bộ sinh phẩm chuẩn đoán Listeria (kít định danh Listeria²) có chất lượng phù hợp, tiến hành thử nghiệm với mẫu chứng dương, mẫu chứng âm và mẫu thử theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nếu kết quả của mẫu thử dương tính, cần tiến hành thêm các kỹ thuật khác để khẳng định sự có mặt Listeria. Kết quả âm tính được báo cáo trên khối lượng mẫu đem thử (Ví dụ: Không phát hiện trong 25 g).

Có thể sử dụng các phương pháp khác để phát hiện Listeria nếu phương pháp được chứng minh là tương đương.

Coliform

Dung dịch pha loãng Butterfield: Hòa tan 34,0 g kali dihydrophosphat (TT) trong khoảng 500 ml nước cất. Điều chỉnh đến pH 7,2 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 N (TT), sau đó bổ sung nước đến 1 L (dung dịch gốc). Pha loãng 1,25 ml dung dịch gốc vừa đủ 1 L bằng nước (dung dịch pha loãng). Hấp tiệt khuẩn dung dịch pha loãng trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường lỏng Lauryl tryptose (LST): Chuẩn bị môi trường có thành phần như sau, hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn, pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hòa các thành phần trên trong 1 L nước (làm ấm nếu cần). Chia 10 ml của dung dịch này vào các ống nghiệm hoặc lọ riêng lẻ có kích thước 20 mm x 150 mm có nắp vặn, mỗi lọ hoặc ống nghiệm chứa một ống lên men (ống Durham) kích thước 10 mm x 75 mm đã úp ngược. Mức dung dịch trong ống hoặc lọ phải bao phủ các ống lên men đã úp ngược. Tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường sau tiệt khuẩn có pH 6,8 ±0,1. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C - 8 °C.

Môi trường lỏng xanh brilliant lactose mật (BGLB): Chuẩn bị môi trường có thành phần như sau hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn, pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hòa pepton và lactose trong 500 ml nước. Thêm 20 g mật bò khô đã hoà tan trong 200 ml nước. Trộn và thêm nước đến 975 ml. Điều chỉnh pH dung dịch đến 7,4. Thêm 13,3 ml dung dịch xanh brilliant (TT) 0,1 %, trộn đều sau đó thêm nước vừa đủ 1 L Lọc dung dịch qua vải cotton. Chia 10 ml của dung dịch này vào các ống nghiệm hoặc lọ riêng lẻ có kích thước 20 mm x 150 mm có nắp vặn, mỗi lọ hoặc ống nghiệm chứa một ống lên men (ống Durhan) kích thước 10 mm x 75 mm đã úp ngược. Mức dung dịch trong ống nghiệm hoặc lọ phải bao phủ các ống lên men đã úp ngược. Tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Môi trường sau tiệt khuẩn có pH 7,2 ± 0,1.

Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C - 8 °C.

Hỗn dịch mẫu: Chuyển 25 g mẫu Probiotic vào bình vô khuẩn của máy trộn tốc độ cao. Thêm 225 ml dung dịch pha loãng Butterfield vào bình, trộn đều trong 2 min, thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10^-1. Có thể xử lý mẫu bằng quy trình khác với hướng dẫn trên nếu được chứng minh là phù hợp với mẫu thử.

Chuyển 1,0 ml hỗn dịch trên vào ống chứa 9 ml dung dịch pha loãng Butterfield vô khuẩn, sau đó trộn kĩ bằng máy lắc xoáy thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10^-2. Tiếp tục pha loãng như trên để thu được hỗn dịch có độ pha loãng 10^-3.

Lưu ý: Tiến hành thử nghiệm coliform trong vòng 15 min sau khi chuẩn bị hỗn dịch mẫu.

Tiến hành: Đối với mỗi nồng độ pha loãng, hút riêng biệt 1,0 ml hỗn dịch mẫu vào 3 ống chứa môi trường lỏng LST vô khuẩn đã chuẩn bị (10 ml/ống), được ghi nhãn thích hợp. Chú ý nhỏ từ từ hỗn dịch mẫu vào thành ống môi trường, không chạm đầu tip pipet vào môi trường và tránh tạo bọt khí. Ủ các ống ở 35 °C. Kiểm tra sự sinh khí của các ống sau 24 h ủ, quan sát sự thay đổi môi trường trong ống lên men úp ngược hoặc sủi bọt khí khi lắc nhẹ ống. Ghi lại kết quả ở tất cả các ống, sau đó ủ thêm các ống không sinh khí trong 24 h và ghi lại kết quả sau 48 ± 2 h. Các ống sinh khí được xem là dương tính giả định với coliform.

Thực hiện phép thử khẳng định coliform trên các ống dương tính giả định (có sinh khí). Từ mỗi ống có sinh khí, cấy chuyển một vòng quai cấy sang ống chứa môi trường lỏng BGLB, không lấy lớp màng mỏng (nếu có).

Tính số lượng coliform lớn nhất có thể có trong 1 g mẫu dựa trên tỷ lệ ống chứa môi trường lỏng LST sinh khí đã được khẳng định lại trên ba độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng Bảng 1.26.3.

Bảng 1.26.3- Số lượng coliform lớn nhất có thể có trong 1 g mẫu dựa trên tỷ lệ ống môi trường lỏng LST sinh khí đã được khẳng định lại trên ba độ pha loãng 10^-1,10^-2,10^-3

Số ống nghiệm có sự phát triển của coliform			Số lượng coliform lớn nhất có thể có trong 1 g	Số ống nghiệm có sự phát triển của coliform			Số lượng coliform lớn nhất có thể có trong 1 g
Độ pha loãng				Độ pha loãng
10-1	10-2	10-3		10-1	10-2	10-3
0	0	0	<3	2	0	0	9,1
0	0	1	3	2	0	1	14
0	0	2c	6	2	0	2	20
0	0	3c	9	2	0	3c	26
0	1	0	3	2	1	0	15
0	1	1	6,1	2	1	1	20
1	1	2c	9,2	2	1	2	27
0	1	3c	12	2	1	3c	34
0	2	0	6,2	2	2	0	21
0	2	1c	9,3	2	2	1	28
0	2	2c	12	2	2	2	35
0	2	3c	16	2	2	3c	42
0	3	0	9,4	2	3	0	29
0	3	1c	13	2	3	1	36
0	3	2c	16	2	3	2c	44
0	3	3c	19	2	3	3c	53
1	0	0	3,6	3	0	0	23
1	0	1	7,2	3	0	1	39
1	0	2	11	3	0	2	64
1	0	3c	15	3	0	3c	95
1	1	0	7,3	3	1	0	43
1	1	1	11	3	1	1	75
1	1	2c	15	3	1	2	120
1	1	3c	19	3	1	3	160
1	2	0	11	3	2	0	93
1	2	1	15	3	2	1	150
1	2	2c	20	3	2	2	210
1	2	3c	24	3	2	3	290
1	3	0	16	3	3	0	240
1	3	1c	20	3	3	1	460
1	3	2c	24	3	3	2	1100
1	3	3c	29	3	3	3	>1100

^c Rất hiếm khi xảy ra kết quả này trong thực tế, cho thấy có sự ảnh hưởng đến độ hồi phục và/hoặc xác định các khuẩn lạc nghi ngờ ở các độ pha loãng thấp hơn. Trong những trường hợp này, số lượng coliform lớn nhất có thể có trong 1 g trong bảng có thể thấp hơn nhiều so với giá trị thực.

Enterococci

Môi trường thạch muối mật Esculin: Chuẩn bị môi trường có công thức như sau hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn.

Hòa các thành phần trong lượng nước thích hợp, làm nóng hỗn hợp nếu cần. Tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. pH sau khi tiệt khuẩn là 6,6 ± 0,2. Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C - 8 °C.

Môi trường lỏng tim não: Chuẩn bị môi trường có công thức như sau hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn.

Hòa các thành phần trong lượng nước thích hợp, đun nóng môi trường đến sôi, vừa đun vừa khuấy. Đun sôi trong 1 min để môi trường tan hoàn toàn. Tiệt khuẩn môi trường trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. pH sau khi tiệt khuẩn là 7,4 ± 0,2.. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C - 8 °C.

Môi trường thạch KF Streptococcus: Chuẩn bị môi trường có công thức như sau hoặc sử dụng môi trường thương phẩm có sẵn.

Hòa các thành phần trong lượng nước thích hợp, đun nóng môi trường đến sôi, vừa đun vừa khuấy. Đun sôi trong 1 min để môi trường tan hoàn toàn. Để môi trường nguội khoảng 45 °C đến 50 °C. Trong điều kiện vô khuẩn, thêm 10 mL dung dịch Triphenyl tétrazolium clorid 1 % đã được lọc vô khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C Môi trường được giữ ổn nhiệt ở khoảng 45 °C trước khi sử dụng. Môi trường sau khi tiệt khuẩn nếu không sử dụng ngay có thể để nguội môi trường sau đó bảo quản 2 °C - 8 °C.

Dung dịch pepton loãng: Chuẩn bị dung dịch pepton 0,1 % (kl/tt) và điều chỉnh pH 7,0 bằng dung dịch acid lactic (TT). Tiệt khuẩn dung dịch trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Chuẩn bị hỗn dịch mẫu: Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, trong điều kiện vô khuẩn lấy 25 g (hoặc 25 ml) mẫu Probiotic cho vào 225 mL dung dịch pepton loãng trong túi dập mẫu hoặc chai thủy tinh vô khuẩn. Dùng máy dập mẫu (Stomacher) để phân tán đều mẫu Probiotic hoặc lắc đều nếu chứa mẫu trong chai thủy tinh thu được hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10^-1. Tiếp tục pha loãng mẫu 10 lần để thu được các hỗn dịch mẫu có độ pha loãng 10^-2, 10^-3,...

Tiến hành: Đối với mỗi hỗn dịch mẫu có độ pha loãng thích hợp, trong điều kiện vô khuẩn hút riêng rẽ 1,0 mL hỗn dịch mẫu vào 3 đĩa petri 15 mm x 100 mm vô khuẩn, thêm khoảng 15 ml môi trường thạch KF Streptococcus vào mỗi đĩa, trộn đều. Song song tiến hành một đĩa trắng chỉ chứa môi trường thạch KF Streptococcus và một đĩa trắng thứ hai chứa 1,0 ml dung dịch pepton loãng đã được trộn với môi trường thạch KF Streptococcus. Để yên các đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi thạch đông, sau đó ủ các đĩa ở 34 °C đến 36 °C trong 48 ± 2 h. Sau khi ủ, đếm các khuẩn lạc Enterococci giả định có màu đỏ và hồng.

Cần khẳng định lại các khuẩn lạc đặc trưng mọc trên đĩa môi trường thạch KF Streptococcus thuộc chi Entercocci cầu khuẩn Gram dương, xếp thành đôi hoặc chuỗi ngắn). Thực hiện các bước sau, để khẳng định. Với mỗi đĩa môi trường thạch KF Streptococcus, chọn ít nhất 3 khuẩn lạc đặc trưng và cấy riêng rẽ vào các ống môi trường lỏng tim não, ủ ở 35 °C trong 18 h đến 24 h. Với mỗi dĩa môi trường thạch KF Streptococcus, chọn ít nhất 3 khuẩn lạc đặc trưng và cấy riêng rẽ vào các ống chứa môi trường thạch muối mật Esculin, ủ ở 35 °C trong 18 đến 24 h. Sau khi ủ cả hai bộ ống, thêm vào mỗi ống 1 mL dung dịch hydrogen peroxyd 3 % (TT). Với các ống môi trường lỏng tim não, quan sát sự hình thành khí (có bọt khí tức là phản ứng catalase dương tinh). Tiếp tục quan sát các ống môi trường thạch muối mật Esculin. Phản ứng catalase âm tính khi môi trường thạch muối mật Esculin bị sẫm màu hoặc có màu đen, xác nhận sự có mặt của Enterococci.

Có thể sử dụng các phương pháp khác đã được thẩm định để xác định sự có mặt của Enterococci.

Bảo quản

Điều kiện vận chuyển và bảo quản phải phù hợp với từng chủng cụ thể. Trừ khi có quy định khác trong chuyên luận riêng, nguyên liệu Probiotic nên được bảo quản trong túi kín chắc chắn và giữ ở nhiệt độ không quá 4 °C. Các thành phẩm Probiotic nên được bảo quản trong đồ đựng kín, nơi khô ráo, thoáng mát.

Ghi nhãn

Đối với nguyên liệu Probiotic, phải ghi ký hiệu chủng trên nhãn, cần ghi tên chi, loài và chủng của các vi sinh vật trên nhãn nguyên liệu hoặc thành phẩm Probiotic. Trong trường hợp có cơ sở khoa học phù hợp, chẳng hạn như bằng chứng khoa học về lợi ích sức khỏe không phải do một chùng cụ thể, thì có thể ghi tên chi và loài trên nhãn thành phẩm Probiotic. Cần ghi rõ công thức tất cả các thành phần lợi khuẩn trong suốt thời hạn sử dụng của sản phẩm theo đơn vị CFU/g, CFU/đơn vị đóng gói, CFU/liều hoặc tương đương.

MỘT SỐ HÓA CHẤT, THUỐC THỬ SỬ DỤNG TRONG THỬ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ

Agarose

Polysacarld thành phần chứa 1,3-linked β-d-galactopyranose and 1,4-linked 3,6-anhydro-α-l- galactopyranose. Chất lượng phù hợp cho nghiên cứu sinh học phân tử.

Dung dịch đệm TAE 1X

Hỗn hợp các chất hòa tan trong nước với nồng độ như sau: Tris-hydroclorid (TT) 40 mM, acid acetic băng (TT) 1% và acid ethylendiamintetra-acetic (EDTA) (TT) 1 mM.

Dung dịch đệm TBE1X

Hỗn hợp các chất hòa tan trong nước với nồng độ như sau: Tris-base (TT) 100 mM, acid boric (TT) 100 mM và EDTA (TT) 20 mM.

Dung dịch đệm TE 1X

Hỗn hợp các chất hòa tan trong nước với nồng độ như sau: Tris-hydroclorid (TT) 10 mM, EDTA (TT) 1 mM.

Acid ethylendiamintetra-acetic (EDTA)

(Ethylenedinitrilo)tetra-acetic acid

C₁₀H₁₆N₂O₈ = 292,2

Bột kết tinh màu trắng hoặc hầu như trắng, rất dễ tan trong nước.

Nhiệt độ nóng chảy: Khoảng 250 °C kèm phân hủy.

Dinatri edetat

Dinatri ethylendiamintetra-acetat

C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂∙2H₂O = 372,24

Chất lượng phù hợp cho nghiên cứu sinh học phân tử.

Ethidium Bromid

C₂₁H₂₀N₃Br = 394,3

Bột màu tím đến tím đỏ.

Nước vô khuẩn

Nước tinh khiết vô khuẩn, không có nuclease, độ dẫn điện < 0.0556 μS/cm, phù hợp cho nghiên cứu sinh học phân tử.

Tris-hydroclorid

Tris(hydroxymethyl)aminomethan hydroclorid

C₄H₁₁NO₃∙HCl = 157,60

Tinh thể không màu, chất lượng phù hợp cho nghiên cứu sinh học phân tử.

Tris-base

Tris(hydroxymethyl)aminomethan

C₄H₁₁NO₃= 121,1

Bột kết tinh màu trắng hoặc hầu như trắng, chất lượng phù hợp cho nghiên cứu sinh học phân tử.

Chú thích

¹ 5 PRIME MasterMix Polymerase của VWR Scientific (www.vwr.com), AmpliTaq Gold DNA Polymerases của ThermoFisher Scientific (www.thermofisher.com) hoặc tương đương.

² Kit định danh Listeria của bioMérieux, Inc. (http://www.biomerieux. com) hoặc tương đương.

 

PHỤ LỤC 12.11 XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LẪN TRONG DƯỢC LIỆU

Tạp chất lẫn trong dược liệu bao gồm tất cả các thành phần ngoài quy định của dược liệu đó như: Đất, đá, rơm rạ, cây có khác, các bộ phận khác của cây không quy định làm dược liệu, dược liệu bị hư hỏng, dược liệu bị biến màu (quy định trong chuyên luận riêng), xác côn trùng,...

Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử nghiệm

Dược liệu khô

Lấy mẫu để kiểm tra theo hướng dẫn tại Phụ lục 12.1 và quy định hiện hành.

Chuẩn bị mẫu thử nghiệm: Trừ khi quy định trong chuyên luận riêng, cân một lượng mẫu để thử như sau:

Dược liệu thái thành phiến: 50 g.

Dược liệu chưa thái phiến (dược liệu thô):

- Hạt và quả rất nhỏ (như hạt mã đề): 10 g.

- Lá, hoa, quả, hạt và vỏ quả: 100-250 g.

- Rễ, thân rễ, vỏ (thân, cành, rễ), phần toàn thân trên mặt đất: 250 - 500 g,

Dược liệu tươi

- Mẫu thử nghiệm là toàn bộ lô.

- Nếu không thể thực hiện được trên toàn bộ lô thì thực hiện lấy mẫu kiểm tra theo hướng dẫn tại Phụ lục 12.1 và quy định hiện hành. Nếu mẫu kiểm tra trên 1 kg thì chuẩn bị mẫu thử nghiệm có khối lượng 500 - 1000 g.

Cách xác định

- Dàn mỏng lượng mẫu thử nghiệm đã cân thành một lớp mỏng, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp có độ phóng đại 6 lần (lens 6x), khi cần có thể dùng rây để phân tách tạp chất và dược liệu. Nếu tạp chất rất giống với dược liệu (thuốc), có thể phải làm các phản ứng định tính hóa học, phương pháp vật lý hoặc dùng kính hiển vi để phát hiện tạp chất. Tỷ lệ tạp chất được tính bao gồm cả các tạp chất được phát hiện bằng phương pháp này.

- Cắt các dược liệu có kích thước lớn như củ, thân rễ,... để kiểm tra sự có mặt của côn trùng, sâu mọt, mốc meo và đánh giá sự hư hỏng của dược liệu.

- Cân phần tạp chất và tính phần trăm (X) như sau:

X% = a/p x 100

Trong đó:

a là khối lượng tạp chất tính bằng gam.

p là khối lượng mẫu thử tính bằng gam.

 

PHỤ LỤC 12.20 PHƯƠNG PHÁP CHẾ BIẾN DƯỢC LIỆU

Trong đông y, các vị thuốc được dùng để uống thường qua khâu chế biến như sau:

Sơ chế (Chế biến sơ bộ): Nhằm loại bỏ các bộ phận không dùng làm thuốc (Rễ con, lõi, gốc, hạch,...) hoặc để ổn định dược liệu ngay từ đầu (phơi, sấy, xông diêm sinh,...). Như vậy, qua sơ chế, ta có nguyên liệu ban đầu được gọi là “thuốc sống", tuy nhiên phải đáp ứng được các yêu cầu nhất định về chất lượng đã đề ra.

Với các dược liệu có kích thước chưa phù hợp với việc sử dụng để sắc, chiết xuất, phối hợp để tạo thành thuốc thang... thì cần thực hiện một hoặc nhiều thao tác sau: loại tạp, ngâm, rửa, ủ, cắt đoạn, thái phiến, phơi, sấy để tạo thành dược liệu có kích thước phù hợp với mục đích sử dụng.

Phức chế (Chế biến hoàn chỉnh): Quá trình chế biến phức tạp hơn, nhằm giảm bớt độc tính, tác dụng không mong muốn hoặc thay đổi tính năng, tăng sự quy kinh thuốc, nhiều khi còn ảnh hưởng đến cấu trúc của hoạt chất và tác dụng của vị thuốc đem chế. Như vậy, qua phức chế ta thu được nguyên liệu mang ý nghĩa dược dụng và gọi là “thuốc chín”, đáp ứng được các yêu cầu trong điều trị.

Quá trình chế biến dược liệu cần theo lý luận của Y học cổ truyền, theo bản chất tự nhiên của mỗi dược liệu và theo yêu cầu về phân phối, bào chế và sử dụng thuốc trên lâm sàng.

Hình thái của dược liệu sau chế biến được mô tả trong dược điển là tham khảo hình thái của các vị thuốc được sử dụng trên thực tế. Hình thái của dược liệu sau chế biến được sử dụng trong sản xuất thuốc tại các nhà máy sẽ đáp ứng theo yêu cầu của mỗi quy trình sản xuất.

Làm sạch: Dược liệu được làm sạch theo yêu cầu tại chuyên luận riêng. Việc làm sạch bao gồm: Nhặt tách tạp chất, rây, sàng sảy, nghiền, đập, giũ,... và rửa.

Thái, cắt: Trừ dược liệu tươi hoặc dược liệu khô có thể chất mềm dẻo dễ cắt thì hầu hết các dược liệu sẽ được làm ẩm tới khi mềm rồi mới cắt. Các kỹ thuật làm mềm có thể dùng như: ngâm, rửa nhanh rồi ủ mềm, rửa, luộc và hấp hoặc sử dụng các thiết bị làm mềm thích hợp để làm mềm và thái, cắt dược liệu. Các dược liệu được xử lý riêng biệt về độ ẩm, nhiệt độ phù hợp với độ to nhỏ, cứng chắc của mỗi loại. Làm mềm bằng cách ngâm với một lượng nước thích hợp được ưa dùng hơn cả vì tránh được làm mất hoạt chất chính. Dược liệu sau khi thái phiến nên được làm khô ngay để đảm bảo chất lượng. Trừ khi có quy định trong chuyên luận riêng, các dược liệu sau khi thái (cắt) có kích thước như sau:

Phương pháp dùng nước

Trừ các quy định trong chuyên luận riêng, các yêu cầu và phương pháp chung như sau:

Rửa: Nhằm làm sạch dược liệu, loại bỏ tạp chất hoặc có thể để khử mùi hôi tanh của một số dược liệu (dùng rượu, nước sắc của một số dược liệu có tinh dầu,...). Nước dùng để rửa phải đạt tiêu chuẩn nước sạch, thời gian rửa phụ thuộc vào tính chất của các dược liệu.

Phương pháp được áp dụng với hầu hết dược liệu, đặc biệt các dược liệu là rễ, củ. Có thể sử dụng máy rửa dược liệu. Tuy nhiên, đối với dược liệu có cấu tạo mỏng manh hoặc có thành phần dễ tan trong nước, hoặc có các chất nhầy cần rửa nhanh. Dược liệu có cấu trúc rắn chắc, có mùi vị khó chịu có thể rửa kỹ. Các dược liệu dễ bị nát thì không rửa.

Ngâm: Nhằm làm mềm dược liệu, giúp cho việc bào thái dễ dàng. Ngâm để loại muối bám vào dược liệu. Ngâm để giảm tính độc, ngâm để loại nhớt, ngứa. Nước để ngâm phải đạt tiêu chuẩn nước sạch, hoặc là các dung dịch muối vô cơ như: Natri clorid, magnesi clorid, natri Sulfat, calci hydroxyd, magnesi sulfat, phèn chua; hoặc nước sắc dược liệu như: Nước bồ kết, nước cam thảo, nước gạo, nước gừng,... Thời gian ngâm phụ thuộc vào bản chất, kích thước dược liệu và nhiệt độ của mùa, mùa hè ngâm nhanh hơn mùa đông. Dụng cụ để ngâm dược liệu là thạp sành, bể xi măng, chậu nhựa, thùng nhựa, không dùng các dụng cụ bằng kim loại như tôn, sắt,... Quá trình ngâm phải thường xuyên quấy đảo và thay nước nhiều lần.

Tẩm: Sử dụng một lượng phụ liệu (là dịch hoặc đã được chế biến thành dạng dịch) trộn đều với dược liệu đã thái phiến hoặc có kích thước thích hợp để làm ẩm vừa đủ. Nồng độ, lượng dịch cần tầm, thời gian tẩm, ủ thủy thuộc vào từng loại dược liệu. Sau khi tẩm, dược liệu được sao lại cho khô, thường sao vàng (có thể phơi hay sấy khô hoặc phơi âm can đến khô).

Ủ: Nhằm làm mềm, giúp cho việc bào thái dễ dàng; để tạo dáng ngay sau thu hái; để tạo điều kiện lên men cho một số dược liệu khi chế biến, ủ để làm thơm dược liệu, ủ để phụ liệu chế ngấm vào dược liệu. Thời gian ủ phụ thuộc vào mục đích đối với từng loại dược liệu, nói chung nằm trong khoảng 30 min đến 2 h hoặc lâu hơn (12 h đến 24 h). Có trường hợp thời gian ủ đến hàng tháng (Dương địa hoàng ủ thành Sinh địa) Trong quá trình ủ, có thể dùng vải sạch hoặc bao tải sạch thấm ẩm đậy lên mặt dụng cụ đựng thuốc.

Thủy phi: Là phương pháp tán, nghiền dược liệu trong nước với mục đích thu được bột mịn tinh khiết hơn dạng dược liệu ban đầu, tránh tác động của nhiệt tạo ra khi tán làm ảnh hưởng đến hoạt chất, tránh làm dược liệu bị phân hủy, sinh chất độc khi nghiền tán trực tiếp. Cho dược liệu vào dụng cụ tán là sành, sứ,...không dùng dụng cụ bằng kim loại như sắt, đồng, tôn,...đổ nước ngập dược liệu, thường lượng nước gấp 10 lần lượng thuốc. Sau khi tán kỹ, hớt bỏ bụi rác bên trên, gạn lấy lớp nước bột huyền phù sang một dụng cụ khác, phần còn lại tiếp tục làm như thế nhiều lần. Gộp tất cả nước bột, để lắng, gạn bỏ lớp nước, lấy cắn đem làm kiệt nước bằng máy hút ẩm hoặc phơi âm can hay sấy nhẹ đến khô nếu không ảnh hưởng đến hoạt chất. Đây là phương pháp chế thường được áp dụng cho dược liệu có bản chất khoáng vật, có độc tính cao như Chu sa - thần sa, Thạch quyết minh,...

Phương pháp dùng lửa (Hỏa chế)

Trừ các quy định trong chuyên luận riêng, các yêu cầu và phương pháp chung như sau:

Phương pháp sao

Dược liệu đem sao cần có sự phân chia đến kích thước thích hợp. Nếu là thuốc phiến thường có kích thước dài 3 cm đến 5 cm, dày 1 mm đến 3 mm, đồng thời phân ra to nhỏ khác nhau để khi sao đạt được sự đồng đều của thuốc và tránh cháy.

Sao không qua chất trung gian, không cho thêm phụ liệu (Thanh sao)

Vi sao: Nhằm diệt men, mốc hoặc làm khô và dậy mùi thơm đối với dược liệu có cấu tạo mỏng manh (hoa, lá,...), hoặc dược liệu chứa các chất thơm, tinh dầu,... Nhiệt độ sao nằm trong khoảng 50 °C đến 80 °C, sau khi làm nóng chảo, cho dược liệu vào, đảo đều đến khô hoặc có mùi thơm.

Sao vàng: Nhằm giảm bớt tính hàn, làm cho thuốc trở nên thơm, làm tăng quy kinh tỳ. Sau khi làm nóng chảo, cho dược liệu vào đảo đều, đến khi mặt ngoài của dược liệu chuyển màu vàng, nhiệt độ sao khoảng 100 °C đến 150 °C.

Sao vàng hạ thổ: Nhằm giảm bớt tính hàn của thuốc, đồng thời giảm bớt "hỏa độc” của thuốc để cân bằng âm dương, mặt khác làm giảm mùi khó chịu của thuốc. Sau khi sao thuốc tới vàng, nhân lúc còn nóng lấy ra đổ úp thuốc xuống nền đất đã quét sạch (nên trải miếng vải hoặc giấy mỏng rồi úp thuốc lên), đôi khi còn đào một hố sâu 10 cm, rộng 30 cm (nên trải giấy hoặc vải mỏng trước khi đổ thuốc). Dụng cụ sao úp trên thuốc. Thời gian hạ thổ thường từ 10 min đến 15 min.

Sao vàng xém cạnh: Nhằm khử các mùi vị khó chịu của thuốc, tăng tác dụng tiêu thực của vị thuốc. Sau khi nóng chảo, cho dược liệu vào, đảo đều cho đến khi mặt ngoài xém cạnh là vừa, màu ruột thuốc vẫn giữ nguyên. Nhiệt độ sao vào khoảng 170 °C đến 200 °C. Thường tiến hành với các vị thuốc chua, chát hoặc tanh lợm như Binh lang, Thần khúc, Hòe giác,...

Sao tồn tính (hắc sao): Nhằm tăng tác dụng tiêu thực, chỉ huyết của vị thuốc hoặc làm thay đổi tính năng của thuốc. Sau khi chảo nóng già, cho thuốc vào, đảo đều cho đến khi toàn bộ mặt ngoài bị đen đi, khi bò ra bên trong vẫn còn màu vàng. Nhiệt độ sao khoảng 200 °C.

Sao cháy (thán sao): Nhằm tăng tác dụng chỉ huyết của vị thuốc. Sau khi chảo nóng già, cho thuốc vào, đảo đều đến khi toàn bộ mặt ngoài của thuốc cháy đen (có mùi cháy) bên trong có màu nâu. So Với sao tồn tính thì mức độ cháy cao hơn. Nhiệt độ sao khoảng 200 °C đến 240 °C. Kể cả sao tồn tính và sao cháy, trước khi đổ thuốc ra thường phun vào một ít nước lạnh để trừ hỏa độc. Thường áp dụng với dược liệu cần có tác dụng chỉ huyết như Trắc bách diệp, Ngài diệp, Hoa hòe,...

Tẩm sao (Chích)

Sau khi tẩm với phụ liệu (là dịch hoặc đã được chế biến thành dạng dịch. Ví dụ: nước gừng, dấm, rượu,...) rồi đem sao, nhằm tăng sự quy kinh, tăng tác dụng của vị thuốc, giảm tác dụng phụ, thay đổi tính năng của thuốc

Tẩm rượu sao: Dùng sức nóng, tính thăng đề của rượu để dẫn thuốc lên thượng tiêu (tác dụng thăng đề), giảm bớt tính lạnh của vị thuốc, giảm bớt mùi vị khó chịu, tăng cường bổ can thận cho vị thuốc, tăng khả năng hòa tan hoạt chất của một số vị thuốc. Dùng rượu trắng được làm từ gạo, ngô, sắn,... Có hàm lượng ethanol 35 % đến 40 %, với lượng 10 % đến 20 % (tt/kl) so với dược liệu. Sau khi trộn đều với dược liệu đến khi đủ ẩm, ủ thuốc 30 min đến 1h, đem sao ở nhiệt độ sao vàng, khi có mùi thơm của rượu bốc lên là được hoặc khi dược liệu có màu như chỉ ra ở chuyên luận riêng.

Tẩm dấm sao (Thố chế): Nhằm tăng dẫn thuốc vào kinh can đởm, tăng cường tác dụng giảm đau, tiêu ứ huyết, giảm bớt mùi tanh của vị thuốc, làm xốp giòn vị thuốc giúp cho việc dễ tán, dễ chiết xuất. Tẩm dược liệu với lượng 10 % đến 20 % dấm ăn (tt/kl) sao cho dược liệu đủ ấm, ủ 30 min đến 2 h, rồi sao vàng so với dược liệu hoặc sao đến khi dược liệu có màu chỉ ra trong chuyên luận riêng.

Tẩm nước muối sao (Diêm chế): Nhằm dẫn thuốc vào kinh thận và hạ tiêu. Tẩm dược liệu với dung dịch muối ăn 5 %, với lượng 10 % đến 15 % (tt/kl) so với dược liệu. Sau khi tẩm đều, ủ 30 min đến 1 h, rồi sao vàng hoặc ủ rồi sấy trước khi sao vàng.

Tẩm mật sao (Mật chế): Dùng mật ong để chế thuốc. Nhằm tăng tác dụng dẫn thuốc vào kinh tỳ, tăng tác dụng bổ khí, nhuận phế và tăng tác dụng hoãn giải. Thường dùng mật ong dưới dạng mật luyện (mật ong đun sôi, lọc bỏ tạp, sáp,...cô đến thể tích nhất định), “Hòa lượng mật được quy định trong từng chuyên luận với nước sạch đã đun sôi để nguội tới khoảng 70 °C hoặc nước sôi (thường bằng khoảng 30 % lượng mật hoặc lượng tương đương), trộn đều vào dược liệu, ủ 1 h đến 6 h. Tiến hành sao nhỏ lửa, cho đến khi sở không dính tay; dược liệu có màu vàng, mùi thơm mật, vị ngọt. Cũng có thể sao dược liệu tới khi bên ngoài có màu vàng, cho mật vào, đảo đều, tới khi không dính tay. Một số dược liệu có yêu cầu dùng mật mía.

Tẩm nước gừng sao (Khương chế): Nhằm giảm bớt tính hàn, tăng sức phát tán, tăng khả năng tiêu thực, ôn trung. Tẩm dược liệu với dịch nước gừng tươi, với lượng 10 % đến 15 % (tt/kl) so với dược liệu, ủ 30 min đến 1 h, đem sao vàng, hoặc ủ rồi sấy trước khi sao vàng. Nước gừng tươi: gừng già tươi 100 g, rửa sạch, giã nhỏ, thêm nước sạch, vắt lấy dịch đủ 100 ml.

Tẩm hoàng thổ sao: Nhằm tăng tác dụng quy tỳ vị, giảm bớt tính háo của thuốc. Lấy hoàng thổ (đất sét vàng), đất lòng bếp (Phục long can) hoặc đất lòng lò gạch, nghiền mịn, cứ 100 g đất thêm 1 L nước đun sôi, quấy đều, gạn bỏ lớp trên, bỏ cặn, lấy lớp giữa. Cử 1 kg dược liệu tẩm với 400 ml nước hoàng thổ, trộn đều, ủ 2 h đến 3 h. Sao vàng hoặc phoi đến khô, chà sát rây bỏ hoàng thổ.

Có thể dùng đất (hoàng thổ) đã nghiền mịn sao trực tiếp với dược liệu để hoàng thổ thấm hút chất dầu từ dược liệu tiết ra, sao vàng cạnh là đạt hoặc có thể hòa bột đất (hoàng thổ) với nước tạo thể chật vừa sệt rồi tẩm vào dược liệu (bạch truật), sau đó cho lên chảo sao khô đến vàng cạnh là đạt.

Tẩm sữa: Dùng sữa người (Nhũ nhân chế), sữa dê tươi (Dương nhũ chế) hoặc sữa bò tươi. Nhằm tăng tính dưỡng huyết, bổ âm và giảm bớt tính háo của thuốc. Dùng sữa tươi với tỷ lệ 10 % đến 15 % (tt/kl) để tẩm vào dược liệu, ủ 30 min. Vi sao tới thơm.

Tẩm nước vo gạo (Mễ cam chế): Nhằm giảm tính háo của thuốc. Dùng nước vo gạo đặc, mới vo, với tỷ lệ 10 % đến 15 % (tt/kl), tẩm đều, ủ 4 h đến 6 h, sao vàng.

Tẩm đồng tiện: Nhằm tăng tác dụng hoạt huyết, tư âm giáng hỏa. Dùng nước tiểu trẻ em khoẻ mạnh, từ 5 đến 12 tuổi, nước tiểu mới đi, bỏ đoạn đầu đoạn cuối, với lượng từ 10 % đến 15 % (tt/kl). Sau khi tầm trộn đều, ủ 30 min đến 1 h. Sao vàng.

Tẩm nước đậu đen, nước cam thảo: Nhằm giảm bớt tính chát của thuốc (tẩm với nước đậu đen), tăng khả năng giải độc (tẩm với Cam thảo). Lấy nước sắc đậu đen (100 g cho 1 L dịch sắc), tẩm vào dược liệu với tỷ lệ 10 % đến 20 % (tt/kl). Cam thảo đem tán nhỏ, sắc lấy nước hoặc ngâm 24 h, lấy nước. Tẩm đều vào dược liệu, ủ cho ngấm khoảng 30 min. Sao khô (hoặc ủ 30 min, sấy khô rồi sao).

Sao qua chất trung gian

Sao cám: Nhằm làm thơm thuốc, tăng quy kinh tỳ (Hoài sơn, Ý dĩ, Thần khúc, Bạch truật); giảm bớt tính háo của thuốc. Thường dùng cám gạo, với tỷ lệ giữa cám và dược liệu khoảng 1/10 -1,5/10 (kl/kl). Đầu tiên cho cám vào chảo đã đun nóng già, quấy đều, tới khi cám bốc khói trắng, cho dược liệu vào, đảo đều; sao đến khi bề mặt thuốc có màu vàng hoặc thẫm màu hơn dược liệu trước khi sao; lấy ra, chà xát, sàng bỏ cám, để nguội.

Sao cách cát: Do nhiệt độ nâng cao, phá vỡ cấu trúc rắn của dược liệu, giúp cho việc bào chế (nghiền, sắc thuốc,...) thuận lợi, đồng thời giảm mùi khó chịu, hoặc giảm bớt tính độc của dược liệu. Nhiệt độ sao nằm trong khoảng 250 °C đến 300 °C. Cát phải được làm sạch (đã qua rửa nhiều lần bằng cách cho nước sạch vào, quấy nhiều lần, gạn bỏ lớp nước trên, đổ ra phơi khô, sấy khô), đun nóng già, cho dược liệu vào đảo đều, đến lúc mặt ngoài phồng nứt; hoặc phồng thơm, lấy ra sàng bỏ cát.

Sao cách bột hoạt thạch hay văn cáp (vỏ hàu): Nhằm khử mùi hôi tanh khó chịu của thuốc nhất là các dược liệu có nguồn gốc động vật, đồng thời giúp cho dễ sao (dược liệu không bị chảy dính vào nhau) và dễ tán các dược liệu có thể chất dẻo dính. Đun nóng già bột trung gian, cho dược liệu vào đảo đều đến khi phồng giòn, xốp, sàng lấy dược liệu.

Nướng (Ổi): Nhằm tăng tính ấm và tăng khả năng dẫn thuốc vào tỳ vị. Thường dùng các phụ liệu có thể chất dẻo dính như bột gạo nếp (thêm nước làm áo bọc thuốc) hoặc giấy bản ẩm hoặc đất sét bọc thuốc, vùi vào tro nóng hay nướng trên bếp than.

Đốt

Nhằm làm sạch các lông, rễ phụ, sau khi phơi khô dược liệu, có thể đốt trực tiếp hoặc cho dược liệu lên các dàn sắt để đốt. Cũng có thể dùng nhiệt của một dụng cụ như dùi sắt đã hơ nóng đỏ, rồi đốt các lông.

Đốt rượu

Nhằm làm thơm vị thuốc, đốt cháy các lông có trên vị thuốc. Thường dùng ethanol 90 % để đốt.

Nung

Làm cho vị thuốc trở nên giòn xốp, có lợi cho việc nghiền tán bột; do ở nhiệt độ cao từ 300 °C đến 700 °C có thể phá vỡ cấu trúc rắn chắc của thuốc, đôi khi có tác dụng giảm độc tính, hoặc biến tính của dược liệu. Thường tiến hành với các dược liệu có thể chất cứng rắn như Mẫu lệ, Long xỉ, Long cốt; hoặc tăng cường tính thu sáp của các vị thuốc như Phèn chua, Bằng sa,...

Nung trực tiếp: Đặt dược liệu tiếp xúc trực tiếp trong lò (nhiệt độ 800 °C đến 1000 °C), nung cho đỏ đều, lấy ra để nguội.

Nung gián tiếp: Cho dược liệu vào nồi nung sạch, đậy nắp, trát kín bằng đất sét ẩm, Nhiệt độ nung thường trong khoảng 150 °C đến 200 °C. Có khi bọc dược liệu vào đất sét, rồi nung.

Sấy

Nhằm làm khô dược liệu, để chế biến, bảo quản trong quá trình phân phối, sử dụng. Tùy theo tính chất của dược liệu để điều chỉnh nhiệt độ sấy và phương pháp sấy cho thích hợp. Với các dược liệu chứa tinh dầu thì nhiệt độ sấy thường ở 50 °C, các dược liệu khác thường sấy ở 80 °C. Các phương pháp sấy thường được sử dụng như sấy khô trong tủ sấy ở áp suất thường, sấy trên bếp hoặc lò than, sấy bằng hồng ngoại,...

Phương pháp kết hợp nước-lửa

Trừ các quy định trong chuyên luận riêng, các yêu cầu và phương pháp chung như sau:

Chưng

Nhằm thay đổi tính năng, giảm bớt tác dụng phụ giúp cho việc điều trị tốt hơn. Cho dược liệu vào dụng cụ chưng thích hợp như âu sành, inox,...có thể thêm phụ liệu (Sa nhân, Gừng,...), đậy kín, đặt dụng cụ chưng này vào một dụng cụ lớn hơn, thêm nước vừa đủ để đun theo thời gian quy định cho mỗi dược liệu. Lấy dược liệu ra phơi hay sấy khô. Có trường hợp phải chưng, phơi nhiều lần (cửu chưng, cửu sái), cho đến lúc dược liệu mềm nhuận, đen bóng.

Đồ

Nhằm diệt men trong dược liệu để tránh thủy phân hoạt chất, để làm mềm cho dễ bào thái. Dược liệu được phân loại to nhỏ và xếp vào một dụng cụ thích hợp (chõ - xửng), loại to xếp dưới, loại nhỏ xếp trên. Nếu có phụ liệu thì xếp xen kẽ một lớp thuốc, một lớp phụ liệu, đậy chõ. Bắc chõ lên một nồi đáy, cho một lượng nước thích hợp vào nồi đáy sao cho khi sôi nước không tràn lên chõ (xửng) làm hỏng dược liệu nhưng vẫn đảm bảo đủ để tạo được hơi nước nóng làm mềm được dược liệu - thông thường lượng nước khoảng 1/2 dung tích nồi đáy hoặc mặt nước cách đáy chõ (xửng) khoảng 5-7 cm, trát kín chỗ vòng tiếp xúc bằng đất sét hay bột nhão của cám và lá khoai, rồi đồ trong khoảng thời gian quy định, đến lúc dược liệu chín mềm (Ngày nay có thể dùng các loại chõ inox).

Nấu

Nhằm làm mềm dược liệu, tăng tác dụng của thuốc, giảm tác dụng không mong muốn. Dược liệu được đun với nước hoặc với dịch phụ liệu. Cho dược liệu vào dụng cụ nấu có dung tích thích hợp, loại to xếp dưới, loại nhỏ xếp trên để dược liệu chín đều. Đáy dụng cụ có thể lót vỉ để tránh tiếp xúc dược liệu với đáy nồi nấu. Đổ nước sạch hay dịch phụ liệu ngập dược liệu 5 cm đến 10 cm. Đun sôi và duy trì theo thời gian quy định. Trong quá trình đun có thể gạn nước và thêm nước mới nhiều lần. Khi dược liệu chín đều, lấy ra thái mỏng, phơi hoặc sấy khô tới độ ẩm quy định.

Tôi

Nhằm làm giòn dược liệu, giúp cho việc nghiền, tán dễ dàng, đồng thời khử các mùi khó chịu của thuốc. Dược liệu được rang cách cát hoặc nung tới khi đạt yêu cầu, khi đổ ra còn đang nóng thì nhúng ngập nhanh vào nước hay vào một dung dịch phụ liệu như như dấm hoặc nước Hoàng liên,... Lấy ra phơi hoặc sấy khô.

Rán dầu

Nhằm làm giảm độc tính của dược liệu (đối với Mã tiền), làm cho dược liệu trở nên giòn, dễ tán nhỏ (đối với Xương báo). Thường rán bằng dầu lạc, dầu vừng. Đun sôi dầu, cho dược liệu vào rán cho đến khi có màu hơi vàng, dược liệu nổi lên, thể chất giòn, xốp. Vớt ra cho nhỏ hết dầu. Lượng dầu so với dược liệu thường có tỷ lệ khoảng 20 % đến 30 % (tt/kl).

 

PHỤ LỤC 13.6 THỬ GIỚI HẠN NHIỄM VI SINH VẬT

1. XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT

Giới thiệu

Phép thử sau đây cho phép xác định số lượng khuẩn ưa nhiệt trung bình và nấm có thể phát triển được trong điều kiện hiếu khí.

Phép thử nhằm đánh giá chế phẩm thử có đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng đã công bố về chỉ tiêu vi sinh hay không. Khi sử dụng phép thử cho mục đích này, cần tuân thủ theo chỉ dẫn dưới đây về số lượng mẫu đem thử, đánh giá kết quả.

Có thể sử dụng quy trình kiểm tra vi sinh khác, bao gồm các phương pháp tự động nếu chứng minh được tính tương đương của các phương pháp này với phương pháp ghi trong dược điển.

Quy định chung

Tiến hành phép thử trong điều kiện đảm bảo tránh được sự tạp nhiễm vi sinh vật bên ngoài vào mẫu thử. Các biện pháp phòng tránh tạp nhiễm phải không ảnh hưởng đến bất cứ loài vi sinh vật nào có thể phát hiện được trong mẫu thử.

Nếu mẫu thử có chứa chất ức chế vi sinh vật thì cần-phải loại bỏ hoặc trung hòa trước khi thử nghiệm. Khi sử dụng chất bất hoạt, cần chứng minh khả năng bất hoạt của chúng và đảm bảo chất bất hoạt đó không chứa độc tố với vi sinh vật. Khi sử dụng chất diện hoạt trong quá trình chuẩn bị mẫu thử, phải đảm bảo chất diện hoạt đó không chứa độc tố với vi sinh vật và chất diện hoạt phải tương thích với chất bất hoạt khác cùng được sử dụng.

Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật

Sử dụng phương pháp màng lọc hoặc phương pháp đĩa thạch. Phương pháp MPN (Most Probable Number) nói chung có độ chính xác thấp nhất trong số các phương pháp đếm vi sinh vật, tuy nhiên, với mẫu thử có số lượng vi sinh vật rất thấp thì đây lại là phương pháp phù hợp nhất.

Lựa chọn phương pháp thử dựa trên nhiều yếu tố như bản chất của mẫu thử và giới hạn vi sinh vật cho phép. Phương pháp được lựa chọn phải đảm bảo tiến hành trên lượng mẫu đủ để đánh giá được mẫu thử đáp ứng theo tiêu chuẩn, cần phải xác định sự phù hợp của phương pháp đã lựa chọn.

Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, mẫu chứng âm

Yêu cầu chung

Phải chứng minh phương pháp thử có khả năng phát hiện vi sinh vật khi có mặt mẫu thử.

Phải chứng minh sự phù hợp của phương pháp khi có sự thay đổi trong quá trình tiến hành thử nghiệm hoặc có sự thay đổi về chế phẩm làm ảnh hưởng đến kết quả của phép thử.

Chuẩn bị chủng vi sinh vật

Có thể sử dụng hỗn dịch chủng vi sinh vật ổn định đã được tiêu chuẩn hóa hoặc chuẩn bị như trình bày dưới đây. Kỹ thuật lưu giữ chủng gốc phải đảm bảo vi sinh vật được cấy truyền không quá 5 lần từ giống gốc ban đầu. Cấy các chủng vi sinh vật và nấm riêng rẽ theo Bảng 13.6.1.

Sử dụng dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0 hoặc dung dịch đệm phosphat pH 7,2 để pha hỗn dịch chủng vi sinh vật. Để pha hỗn dịch A. brasiliensis, thêm polysorbat 80 (TT) với tỷ lệ 0,05 % vào dung dịch đệm. Hỗn dịch được sử dụng trong vòng 2 h, nếu bảo quản ở 2 °C đến 8 °C thì có thể sử dụng trong vòng 24 h. Ngoài ra, đối với A. brasiliensis và B. subtilis, thay vì chuẩn bị và pha loãng hỗn dịch chủng dạng sinh dưỡng thì có thể sử dụng hỗn dịch bào tử ổn định. Hỗn dịch bào tử được bảo quản ở 2 °C đến 8 °C trong khoảng thời gian đã được thẩm định.

Mẫu chứng âm

Để đánh giá điều kiện thử nghiệm, tiến hành mẫu chứng âm bằng cách sử dụng dung dịch pha loãng thay cho mẫu thử. Mẫu chứng âm phải không được có vi sinh vật phát triển. Mẫu chứng âm cũng có thể được tiến hành cùng lúc với mẫu thử như mô tả trong phần Cách tiến hành, cần phải xem xét hệ thống kỹ lưỡng khi mẫu chứng âm không đạt.

Kiểm tra chất lượng môi trường

Tiến hành kiểm tra chất lượng đối với mỗi lô môi trường pha chế sẵn hoặc mỗi lô môi trường được pha chế từ môi trường khô hay từ các thành phần riêng lẻ.

Cấy riêng rẽ vào môi trường thạch casein đậu tương hay môi trường lỏng casein đậu tương một lượng nhỏ vi sinh vật (không quá 100 CFU) theo chỉ dẫn trong Bảng 13.6.1. cấy riêng rẽ vào môi trường thạch Sabouraud-dextrose một lượng nhỏ vi sinh vật (không quá 100 CFU) theo chỉ dẫn trong Bảng 13.6.1. Ủ môi trường theo điều kiện ghi trong Bảng 13.6.1.

Bảng 13.6.1 - Chuẩn bị và sử dụng chủng vi sinh vật

Vi sinh vật	Chuẩn bị chủng vi sinh vật	Kiểm tra chất lượng môi trường		Sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử
		Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí	Đếm tổng số nấm	Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí	Đếm tổng số nấm
Staphylococcus aureus ATCC 6538 NCIMB 9518 CIP4.83 NBRC 13276	Môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường lỏng casein đậu tương 30 °C - 35 °C 18 h - 24 h	Môi trường thạch casein đậu tương và môi trường lỏng casein đậu tương ≤100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 3 ngày	-	Môi trường thạch casein đậu tương/MPN môi trường lỏng casein đậu tương ≤ 100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 3 ngày	-
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82.118 NBRC 13275	Môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường lỏng casein đậu tương 30 °C - 35 °C 18 h - 24 h	Môi trường thạch casein đậu tương và môi trường lỏng casein đậu tương ≤100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 3 ngày	-	Môi trường thạch casein đậu tương/MPN môi trường lỏng casein đậu tương ≤ 100 CFU ≤30 °C - 35 °C ≤ 3 ngày	-
Bacillus subtllis ATCC 6633 NCIMB 8054 CIP 52.62 NBRC3134	Môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường lỏng casein đậu tương 30 °C - 35 °C 18 h -24h	Môi trường thạch casein đậu tương và môi trường lỏng casein đậu tương ≤100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 3 ngày	-	Môi trường thạch casein đậu tương/MPN môi trường lỏng casein đậu tương ≤100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 3 ngày	-
Candida albicans ATCC 10231 NCPF 3179 IP 48.72 NBRC 1594	Môi trường thạch Sabouraud-dextrose hoặc môi trường lỏng Sabouraud- dextrose 20 °C - 25 °C 2-3 ngày	Môi trường thạch casein đậu tương ≤100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 5 ngày	Môi trường thạch Sabouraud- dextrose ≤ 100 CFU 20 °C - 25 °C ≤ 5 ngày	Môi trường thạch casein đậu tương ≤ 100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 5 ngày MPN: không áp dụng	Môi trường thạch Sabouraud- . dextrose ≤ 100 CFU 20 °C - 25 °C ≤ 5 ngày
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 IMI 149007 IP 1431.83 NBRC 9455	Môi trường thạch Sabouraud-dextrose hoặc môi trường thạch khoai tây dextrose 20 °C - 25 °C 5-7 ngày, hoặc đến khi thu được bào tử	Môi trường thạch casein đậu tương ≤ 100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 5 ngày	Môi trường thạch Sabouraud- dextrose ≤100 CFU 20 °C - 25 °C ≤ 5 ngày	Môi trường thạch casein đậu tương ≤ 100 CFU 30 °C - 35 °C ≤ 5 ngày MPN: không áp dụng	Môi trường thạch Sabouraud-dextrose ≤ 100 CFU 20 °C -25 °C ≤ 5 ngày

Đối với môi trường thạch, số lượng vi sinh vật phát triển trên lô môi trường mới không được khác quá 2 lần so với số lượng tính được của hỗn dịch chủng đã được tiêu chuẩn hóa. Đối với chủng được pha chế khi dùng, sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường mới sẽ được so sánh với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.

Đối với môi trường lỏng, sự phát triển rõ ràng của vi sinh vật trên lô môi trường mới được so sánh với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.

Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử: Phương pháp chuẩn bị mẫu thử phụ thuộc vào tính chất vật lý của mẫu thử. Nếu không thể áp dụng cách nào trong các cách dưới đây, có thể sử dụng biện pháp khác để xử lý mẫu. Mẫu thử tan trong nước: Hòa tan hoặc pha loãng (thường pha loãng 10 lần) mẫu thử trong dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0, dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc môi trường lỏng casein đậu tương. Điều chỉnh đến pH 6 đến 8, nếu cần. Có thể pha loãng tiếp nếu cần bằng cùng dung dịch pha loãng.

Mẫu thử có bản chất không phải chất béo, không tan trong nước: Pha loãng mẫu thử (thường pha loãng 10 lần) trong dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0, dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc môi trường lỏng casein đậu tương, có thể thêm chất diện hoạt như polysorbat 80 (TT) với tỷ lệ 1 g/L để tăng khả năng thấm nước của mẫu thử. Điều chỉnh đến pH 6 đến 8, nếu cần. Có thể pha loãng tiếp nếu cần bằng cùng dung dịch pha loãng.

Mẫu thử có bản chất là chất béo: Hòa mẫu thử trong isopropyl myristat (TT) đã được tiệt khuẩn trước bằng cách lọc qua màng lọc hoặc trộn mẫu thử với lượng nhỏ nhất có thể polysorbat 80 (TT) vô khuẩn hoặc một chất diện hoạt khác không có tính ức chế, làm nóng nếu cần ở nhiệt độ không quá 40 °C, trong một số ít trường hợp có thể sử dụng nhiệt độ không quá 45 °C. Trộn cẩn thận và nếu cần có thể duy trì trong bể ổn nhiệt. Thêm vừa đủ lượng dung dịch pha loãng đã được làm ấm sẵn để thu được độ pha loãng 10 lần. Duy trì nhiệt độ trong thời gian ngắn nhất và trộn cẩn thận để thu được nhũ dịch. Có thể tiếp tục pha loãng theo cấp số 10, trong đó dung dịch pha loãng được bổ sung polysorbat 80 (TT) hoặc chất diện hoạt không có tính ức chế khác với nồng độ thích hợp.

Dung dịch hoặc chất rắn dưới dạng aerosol: Chuyển mẫu thử lên màng lọc trong điều kiện vô khuẩn hoặc chuyển sang bình chứa vô khuẩn để tiếp tục lấy mẫu. Có thể sử dụng toàn bộ lượng mẫu hoặc một số liều nhất định từ các đơn vị đóng gói đem thử.

Thuốc dán: Loại bỏ lớp bảo vệ bên ngoài và đặt miếng dán (mặt dính ngửa lên trên) vào bình vô khuẩn. Phủ lên bề mặt miếng dán một loại vật liệu xốp vô khuẩn, ví dụ tấm gạc vô khuẩn, để tránh cho các miếng dán dính vào nhau và cho vào miếng dán một lượng dung dịch pha loãng thích hợp có chứa chất bất hoạt như polysorbat 80 (TT) và/hoặc lecithin (TT). Lắc kỹ ít nhất 30 min.

Cấy chủng và pha loãng:

Thêm vào mẫu thử đã được xử lý như mô tả ở phần Chuẩn bị mẫu thử của mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử và thêm vào ống chứng dương (không có mẫu thử) một lượng hỗn dịch vi sinh vật có chứa không quá 100 CFU, Thể tích của hỗn dịch vi sinh vật không được vượt quá 1 % thể tích mẫu thử đã được pha loãng.

Để đánh giá độ phục hồi của vi sinh vật khi có mặt mẫu thử, tiến hành pha loãng mẫu thử ít nhất có thể. Nếu không thể pha loãng ít nhất do bản thân mẫu thử có tác dụng ức chế vi sinh vật hoặc mẫu thử khó tan trong nước, cần áp dụng các biện pháp phù hợp hơn. Nếu không thể loại bỏ được tác dụng ức chế vi sinh vật của mẫu thử, nên thêm hỗn dịch vi sinh vật vào mẫu thử sau khi đã trung hòa, pha loãng hoặc lọc mẫu thử.

Trung hòa/loại bỏ tác dụng của chất ức chế:

So sánh số lượng vi sinh vật hồi phục sau khi pha loãng như mô tả trong phần Cấy chủng và pha loãng và ủ như quy định trong phần Hồi phục vi sinh vật khi có mặt mẫu thử với số lượng vi sinh vật hồi phục của ống chứng dương.

Nếu có sự ức chế vi sinh vật phát triển (số lượng vi sinh vật giảm quá 2 lần), thì phải thay đổi quy trình đếm số lượng vi sinh vật để khẳng định tính có giá trị của thử nghiệm. Sự thay đổi này có thể là: (1) tăng thể tích dung dịch pha loãng hoặc môi trường nuôi cấy, (2) phối hợp chất trung hòa đặc hiệu hoặc chất trung hòa phổ biến trong dung dịch pha loãng, (3) áp dụng phương pháp màng lọc, (4) phối hợp các biện pháp nêu trên.

Chất trung hòa:

Một số chất được dùng để trung hòa tác dụng của chất ức chế vi sinh vật (Bảng 13.6.2) được thêm vào dung dịch pha loãng hoặc môi trường nuôi cấy trước khi hấp tiệt khuẩn. Trước khi sử dụng, phải tiến hành một mẫu trắng có chất trung hòa, không có mẫu thử để khẳng định hoạt tính của chất trung hòa và khẳng định chất trung hòa không có độc tính đối với vi sinh vật.

Bảng 13.6.2- Một số chất trung hòa thông dụng

Chất ức chế	Chất/phương pháp trung hòa
Glutaraldehyd, dẫn chất thủy ngân	Natri hydrosulfit (Natri bisulfit)
Dẫn chất phenol, alcohol, các aldehyd, sorbat	Pha loãng
Các aldehyd	Glycin
Dẫn chất amoni bậc 4, parahydroxybenzoat (các paraben), bis-biguanid	Lecithin
Dân chất amoni bậc 4, iod, các paraben	Polysorbat
Dẫn chất thủy ngân	Thioglycolat
Dân chất thủy ngân, các halogen, các aldehyd	Thiosulfat
EDTA (edetat)	ion Mg2+ hoặc ion Ca2+

Nếu không tìm được phương pháp trung hòa phù hợp, có thể thấy việc không phân lập được vi sinh vật đã cấy vào mẫu thử cho thấy bản chất mẫu thử có tác dụng ức chế. Điều này cho thấy mẫu thử sẽ không có khả năng bị tạp nhiễm các vi sinh vật đã thử. Tuy nhiên, rất có thể mẫu thử chỉ ức chế một số vi sinh vật đã thử mà không ức chế vi sinh vật ngoài danh mục các vi sinh vật đã thử. Khi đó, tiến hành thử nghiệm với độ pha loãng cao nhất tương thích với sự phát triển vi sinh vật và phù hợp với giới hạn nhiễm vi sinh vật cho phép của mẫu thử.

Hồi phục vi sinh vật khi có mặt mẫu thử: Đối với mỗi vi sinh vật được liệt kê trong Bảng 13.6.1, tiến hành các thí nghiệm riêng rẽ. Chỉ đếm vi sinh vật được cho vào mẫu thử.

• Phương pháp màng lọc:

Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ lọc không quá 0,45 μm. Bản chất màng lọc được lựa chọn sao cho khả năng lưu giữ vi sinh vật không bị ảnh hưởng bởi các thành phần của mẫu thử. Đối với mỗi loại vi sinh vật được ghi trong Bảng 13.6.1, sử dụng một màng lọc riêng.

Chuyển một lượng phù hợp mẫu thử (thường là lượng tương đương với 1 g hoặc 1 ml mẫu thử, hoặc lượng mẫu nhỏ hơn nếu dự đoán chứa nhiều vi sinh vật) đã được xử lý theo phần Chuẩn bị mẫu thử, Cấy chủng và pha loãng, Trung hòa/loại bỏ tác dụng của chất ức chế lên màng lọc, lọc ngay và rửa màng lọc với thể tích thích hợp của dung dịch pha loãng.

Để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí, chuyển màng lọc lên bề mặt đĩa môi trường thạch casein đậu tương. Để đếm tổng số nấm, chuyển màng lọc lên bề mặt đĩa môi trường thạch Sabouraud-dextrose. Ủ các đĩa môi trường theo điều kiện ghi ở Bảng 13.6.1. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc.

• Phương pháp đĩa thạch:

Với mỗi loại môi trường, tiến hành trên ít nhất 2 đĩa petri và tính kết quả trung bình.

Phương pháp cấy trộn: Sử dụng đĩa petri đường kính 9 cm, thêm vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử đã được xử lý theo phần Chuẩn bị mẫu thử, cấy chủng và pha loãng, Trung hòa/loại bỏ tác dụng của chất ức chế và 15 ml đến 20 ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch Sabouraud- dextrose, cả hai môi trường có nhiệt độ không quá 45 °C. Nếu sử dụng đĩa petri có đường kính lớn hơn, thể tích môi trường phải tăng lên cho phù hợp. Đối với mỗi loại vi sinh vật được ghi trong Bảng 13.6.1, sử dụng ít nhất 2 đĩa petri. Ủ các đĩa môi trường theo điều kiện ghi ở Bảng 13.6.1. Tính trung bình số lượng khuẩn lạc đếm được đối với mỗi loại môi trường và từ đó tính ra số lượng vi sinh vật trong dịch cấy ban đầu.

Phương pháp cấy trải bề mặt: Sử dụng đĩa petri đường kính 9 cm, thêm vào mỗi đĩa 15 ml đến 20 ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch Sabouraud- dextrose ở nhiệt độ khoảng 45 °C và để môi trường đông. Nếu sử dụng đĩa petri có đường kính lớn hơn, thể tích môi trường phải tăng lên cho phù hợp. Làm khô đĩa, ví dụ trong buồng thổi khí sạch (laminar air flow) hoặc tủ ấm.

Đối với mỗi loại vi sinh vật được ghi trong Bảng 13.6.1, sử dụng ít nhất 2 đĩa petri. Trải lên bề mặt đĩa môi trường thể tích không dưới 0,1 ml mẫu thử đã được xử lý theo phần Chuẩn bị mẫu thử, cấy chủng và pha loãng, Trung hòa/loại bỏ tác dụng của chất ức chế. Ủ và đếm số lượng khuẩn lạc giống mục Phương pháp cấy trộn.

• Phương pháp MPN (Most Probable Number):

Phương pháp MPN có độ chính xác và độ đủng kém hơn so với phương pháp màng lọc hoặc phương pháp dĩa thạch. Kết quả đếm tổng số nấm bằng phương pháp MPN càng cho sai số nhiều hơn. Chính vì vậy, phương pháp MPN chỉ được sử dụng khi không thể áp dụng phương pháp nào khác. Nếu sử dụng phương pháp MPN, cần tuân thủ các bước sau.

Chuẩn bị ít nhất 3 nồng độ pha loãng 10 lần của mẫu thử đã được xử lý như phần Chuẩn bị mẫu thử, Cấy chủng và pha loãng, Trung hòa/loại bỏ tác dụng của chất ức chế. Đối với mỗi độ pha loãng, cấy 1 g hoặc 1 ml vào 3 ống nghiệm có chứa 9 ml đến 10 ml môi trường lỏng casein đậu tương. Nếu cần, có thể thêm chất diện hoạt {ví dụ: polysorbat 80 (TT)} hoặc các chất bất hoạt phù hợp khác vào môi trường. Như vậy, có tất cả 9 ống nghiệm cho 3 mức nồng độ pha loãng của mẫu thử.

Ủ tất cả các ống nghiệm trên ở 30 °C đến 35 °C trong không quá 3 ngày. Nếu không thể đọc kết quả chính xác do bản chất mẫu thử gây khó khăn cho việc quan sát sự phát triển của vi sinh vật thì cấy chuyển sang môi trường lỏng casein đậu tương hoặc môi trường thạch casein đậu tương, ủ tiếp ở nhiệt độ như trên trong 1 ngày đến 2 ngày, sau đó đọc kết quả. Xác định chỉ số MPN trong 1 g hoặc 1 ml mẫu thử theo Bảng 13.6.3.

Kết quả và đánh giá

Khi đánh giá sự phù hợp của phương pháp màng lọc hoặc phương pháp đĩa thạch, giá trị trung bình đếm được của các vi sinh vật thử phải không được khác quá 2 lần so với kết quả của ống chứng dương không chứa mẫu thử thu được theo phần cấy chủng và pha loãng. Khi đánh giá sự phù hợp của phương pháp MPN, giá trị MPN phải nằm trong khoảng tin cậy 95 % của kết quả thu được của ống chứng dương. Nếu các yêu cầu trên không đáp ứng đối với một hoặc nhiều loại vi sinh vật đem thử ở tất cả phương pháp thừ thì lựa chọn phương pháp và điều kiện thử nào có đáp ứng gần nhất yêu cầu trên.

Cách tiến hành

Lượng mẫu thử dùng cho thử nghiệm

Trừ khi có chỉ dẫn riêng, lấy 10 g hoặc 10 ml mẫu thử để tiến hành thử nghiệm trong điều kiện đảm bảo như đã đề cập ở trên. Đối với thuốc khí dung chứa dung dịch hoặc chất rắn, tiến hành thử trên 10 đơn vị đóng gói. Đối với thuốc dán, tiến hành thừ trên 10 miếng dán.

Lượng mẫu thử nghiệm có thể giảm xuống tùy theo lượng dược chất chính được đưa vào chế phẩm trong các trường hợp sau: Khối lượng dược chất chính không quá 1 mg trong 1 đơn vị (1 viên nén, 1 nang, 1 ống hoặc lọ thuốc tiêm,...) hoặc khối lượng dược chất chính trong 1 g hoặc 1 ml mẫu thử (đối với dạng chế phẩm đa liều) nhỏ hơn 1 mg. Trong những trường hợp này, lượng mẫu thử nghiệm phải không được nhỏ hơn lượng mẫu có trong 10 đơn vị đóng gói hoặc 10 g hoặc 10 ml mẫu thử.

Đối với mẫu thử là nguyên liệu nhưng có khối lượng rất hạn chế hoặc cỡ lô quá nhỏ (dưới 1000 ml hoặc 1000 g), lượng mẫu thử nghiệm bằng 1 % cỡ lô, một số trường hợp lượng mẫu thử có thể nhỏ hơn và phải có quy định cụ thể.

Đối với mẫu thử mà tổng số đơn vị trong một lô dưới 200 (ví dụ mẫu thử nghiệm lâm sàng), có thể tiến hành thử nghiệm trên 2 đơn vị, trường hợp cỡ lô nhỏ hơn 100 đơn vị, có thể tiến hành thử nghiệm trên 1 đơn vị.

Lấy mẫu nguyên liệu hoặc mẫu thử một cách ngẫu nhiên. Để thu được đủ lượng mẫu theo yêu cầu, có thể phải trộn đều mẫu thử lấy từ các đơn vị đóng gói khác nhau.

Tiến hành

Phương pháp màng lọc:

Sử dụng dụng cụ lọc được thiết kế phù hợp, cho phép có thể chuyển màng lọc vào môi trường nuôi cấy. Sử dụng phương pháp phù hợp theo mục Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, mẫu chứng âm để chuẩn bị mẫu thử, và chuyển lượng mẫu thích hợp lên 2 màng lọc và tiến hành lọc ngay. Rửa màng lọc bằng quy trình phù hợp.

Để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí, chuyển một màng lọc lên bề mặt môi trường thạch casein đậu tương. Để đếm tổng số nấm, chuyển một màng lọc lên bề mặt môi trường thạch Sabouraud-dextrose. Ủ đĩa chứa môi trường thạch casein đậu tương ở 30 °C đến 35 °C trong 3 ngày đến 5 ngày và ủ đĩa chứa môi trường thạch Sabouraud-dextrose ở 20 °C đến 25 °C trong 5 ngày đến 7 ngày. Tính số CFU (Colony Forming Unit) trong 1 g hoặc 1 ml mẫu thử.

Khi thử nghiệm với thuốc dán, lọc riêng rẽ 10 % thể tích mẫu thử được chuẩn bị theo phần Chuẩn bị mẫu thử của mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử trên 2 màng lọc vô khuẩn. Chuyển một màng lọc lên bề mặt môi trường thạch casein đậu tương để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí và chuyển màng lọc còn lại lên bề mặt môi trường thạch Sabouraud-dextrose để đếm tổng số nấm;

Phương pháp đĩa thạch:

a) Phương pháp cấy trộn:

Sử dụng phương pháp phù hợp theo mục Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, mẫu chứng âm để chuẩn bị mẫu thử. Tiến hành với ít nhất 2 đĩa petri cho mỗi loại môi trường ở mỗi nồng độ pha loãng, ủ đĩa chứa môi trường thạch casein đậu tương ở 30 °C đến 35 °C trong 3 ngày đến 5 ngày và ủ đĩa chứa môi trường thạch Sabouraud-dextrose ở 20 °C đến 25 °C trong 5 ngày đến 7 ngày. Chọn các đĩa của một nồng độ pha loãng nhất định mà tại nồng độ pha loãng đó, số khuẩn lạc thu được là cao nhất và nhỏ hơn 250 đối với đĩa đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí và nhỏ hơn 50 đối với đĩa đếm tổng số nấm. Từ đó tính giá trị trung bình đối với mỗi loại môi trường và tính số CFU trong 1 g hoặc 1 ml mẫu thử.

Bảng 13.6.3- Số lượng vi sinh vật lớn nhất có thể có trong chế phẩm

Số ống nghiệm có sự phát triển của vi sinh vật			Số lượng vi sinh vật lớn nhất có thể có trong 1 g hoặc 1 ml	Độ tin cậy 95 %'
Số g hoặc ml mẫu thử cho mỗi ống
0,1	0,01	0,001
0	0	0	<3	0 - 9,4
0	0	1	3	0,1 - 9,5
0	1	0	3	0,1 - 10
0	1	1	6,1	1,2 - 17
0	2	0	6,2	1,2 - 17
0	3	0	9,4	3,5 - 35
1	0	0	3,6	0,2 - 17
1	0	1	7,2	1,2 - 17
1	0	2	11	4 - 35
1	1	0	7,4	1,3 - 20
1	1	1	11	4 - 35
1	2	0	11	4 - 35
1	2	1	15	5 - 38
1	3	0	16	5 - 38
2	0	0	9,2	1,5-35
2	0	1	14	4 - 35
2	0	2	20	5 - 38
2	1	0	15	4 - 38
2	1	1	20	5 - 38
2	1	2	27	9 - 94
2	2	0	21	5-40
2	2	1	28	9-94
2	2	2	35	9-94
2	3	0	29	9-94
2	3	1	36	9-94
3	0	0	23	5-94
3	0	1	38	9-104
3	0	2	64	16-181
3	1	0	43	9-181
3	1	1	75	17-199
3	1	2	120	30 - 360
3	1	3	160	30 - 380
3	2	0	93	18-360
3	2	1	150	30 - 380
3	2	2	210	30 - 400
3	2	3	290	90 - 990
3	3	0	240	40 - 990
3	3	1	460	90-1980
3	3	2	1100	200 - 4000
3	3	3	>1100

b) Phương pháp cấy trải bề mặt:

Sử dụng phương pháp phù hợp theo mục Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, mẫu chứng âm để chuẩn bị mẫu thử. Tiến hành với ít nhất 2 dĩa petri cho mỗi loại môi trường ở mỗi nồng độ pha loãng. Điều kiện ủ và cách tính kết quả giống phương pháp cấy trộn.

Phương pháp MPN:

Sử dụng phương pháp phù hợp theo mục Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, mẫu chứng âm để chuẩn bị mẫu thử. Ủ tất cả các ống nghiệm ở 30 °C đến 35 °C trong 3 ngày đến 5 ngày. Có thể cấy chuyển nếu cần theo quy trình phù hợp. Tại mỗi nồng độ pha loãng, ghi lại số lượng ống nghiệm có vi sinh vật phát triển. Xác định số lượng vi sinh vật trong 1 g hoặc 1 ml mẫu thử theo Bảng 13.6.3.

Đánh giá kết quả

Tổng số vi sinh vật hiếu khí được coi là số khuẩn lạc đếm được trên môi trường thạch casein đậu tương. Khuẩn lạc nấm phát hiện được trên môi trường này cũng được coi là một phần của tổng số vi sinh vật hiếu khí. Tổng số nấm được coi là số khuẩn lạc đếm được trên môi trường thạch Sabouraud-dextrose. Khí tổng số nấm vượt quá giới hạn chấp nhận của mẫu thử do vi khuẩn mọc trên môi trường này, có thể sử dụng môi trường thạch Sabouraud-dextrose có bổ sung kháng sinh (ví dụ cloramphenicol). Số lượng vi sinh vật đếm được bằng phương pháp MPN được coi là tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nếu không thấy có khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10 CFU trong 1 g hoặc 1 ml.

Dựa vào giới hạn nhiễm vi sinh vật cho phép, có thể đánh giá như sau:

10¹ CFU: Số lượng tối đa được chấp nhận = 20;

10² CFU: Số lượng tối đa được chấp nhận = 200;

10³ CFU: Số lượng tối đa được chấp nhận = 2000 và cứ tiếp tục như vậy.

Các dung dịch và môi trường nuôi cấy được liệt kê trong mục Dung dịch pha loãng và môi trường.

2. XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT GÂY BỆNH

Giới thiệu

Phép thử sau đây cho phép xác định sự không hiện diện hoặc hiện diện với số lượng hạn chế của một số vi sinh vật gây bệnh trong mẫu thử dưới những điều kiện đã quy định.

Phép thử nhằm đánh giá chế phẩm thử có đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng đã công bố về chỉ tiêu vi sinh vật hay không. Khi sử dụng phép thử cho mục đích này, cần tuân thủ theo chỉ dẫn phía dưới về số lượng mẫu đem thử, đánh giá kết quả.

Có thể sử dụng quy trình xác định vi sinh vật khác, bao gồm cả các phương pháp tự động, khi chứng minh được tính tương đương của chúng với phương pháp ghi trong dược điển.

Quy định chung

Chuẩn bị mẫu thử theo mô tả ở phần Chuẩn bị mẫu thử. Nếu mẫu thử có chứa chất ức chế vi sinh vật, cần loại bỏ hoặc trung hòa chất ức chế như mô tả trong phần Trung hòa/loại bỏ tác dụng của chất ức chế.

Khi sử dụng chất diện hoạt trong quá trình chuẩn bị mẫu thử, phải đảm bảo chất diện hoạt đó không chứa độc tố với vi sinh vật và chất diện hoạt phải tương thích với chất bất hoạt khác cùng được sử dụng như mô tả trong phần Trung hòa/loại bỏ tác dụng của chất ức chế.

Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp, mẫu chứng âm

Phải chứng minh phương pháp thử có khả năng phát hiện vi sinh vật khi có mặt mẫu thử.

Phải chứng minh sự phù hợp của phương pháp khi có sự thay đổi trong quá trình tiến hành thí nghiệm hoặc có sự thay đổi về chế phẩm làm ảnh hưởng đến kết quả của phép thử.

Chuẩn bị chủng vi sinh vật

Có thể sử dụng hỗn dịch chủng vi sinh vật ổn định đã được tiêu chuẩn hóa hoặc chuẩn bị như trình bày dưới đây. Kỹ thuật lưu giữ chủng gốc phải đảm bảo vi sinh vật được cấy truyền không quá 5 lần từ giống gốc ban đầu.

Chủng vi sinh vật hiếu khí:

Cấy chủng vi sinh vật thử nghiệm riêng rẽ trên môi trường lồng casein đậu tương hoặc môi trường thạch casein đậu tương và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h. Cấy chủng Candida albicans riêng rẽ trên môi trường thạch Sabouraud-dextrose hoặc môi trường lỏng Sabouraud- dextrose và ủ ở 20 °C đến 25 °C trong 2 ngày đến 3 ngày.

Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 hoặc NBRC 13276.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 hoặc NBRC 13275.

Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, hoặc NBRC 3972.

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 hoặc có thể thay thế bằng Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony NBRC 100797, NCTC 6017, hoặc CIP 80.39.

Candida albicans ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 hoặc NBRC 1594.

Sử dụng dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0 hoặc dung dịch đệm phosphat pH 7,2 để pha hỗn dịch chủng vi sinh vật. Hỗn dịch được sử dụng trong vòng 2 h, nếu bảo quản ở 2 °C đến 8 °C thì có thể sử dụng trong vòng 24 h.

Clostridia:

Sử dụng chủng Clostridium sporogenes ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) hoặc ATCC 19404 (NCTC 532 hoặc CIP 79.03). Cấy chủng Clostridium sporogenes trên môi trường tăng sinh cho Clostridia và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 30 °C đến 35 °C trong 24 h đến 48 h. Ngoài ra, thay vì chuẩn bị chủng C. sporogenes dạng sinh dưỡng như ở trên, có thể sử dụng hỗn dịch bào tử ổn định. Hỗn dịch bào tử được bảo quản ở 2 °C đến 8 °C trong khoảng thời gian đã được thẩm định.

Mẫu chứng âm

Để đánh giá điều kiện thử nghiệm, tiến hành mẫu chứng âm bằng cách sử dụng dung dịch pha loãng thay cho mẫu thử. Mẫu chứng âm phải không được có sự phát triển của vi sinh vật. Mẫu chứng âm cũng có thể được tiến hành cùng lúc với mẫu thử như mô tả trong mục Cách tiến hành, cần phải xem xét hệ thống kỹ lưỡng khi mẫu chứng âm không đạt.

Kiểm tra chất lượng môi trường

Tiến hành kiểm tra chất lượng đối với mỗi lô môi trường pha chế sẵn hoặc mỗi lô môi trường được pha chế từ môi trường khô hay từ các thành phần riêng lẻ.

Kiểm tra chất lượng môi trường theo chỉ dẫn trong Bảng 13.6.4.

Thử nghiệm kiểm tra khả năng kích thích sự phát triển vi sinh vật của môi trường lỏng:

Cấy vào môi trường lỏng một lượng nhỏ vi sinh vật phù hợp (không quá 100 CFU). Ủ ở nhiệt độ xác định trong thời gian không-lâu hơn khoảng thời gian ngắn nhất mà phép thử quy định. Vi sinh vật phát triển tốt, rõ ràng trên lô môi trường mới khi so sánh với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.

Bảng 13.6.4 - Kiểm tra chất lượng môi trường

	Môi trường	Tính chất	Chủng thử nghiệm
Vi khuẩn Gram âm dung nạp mật	Môi trường lỏng tăng sinh Enterobacteria- Mossel	Kích thích sự phát triển	E. coli P. aeruginosa
		ức chế sự phát triển	S. aureus
	Môi trường thạch muối mật tím đỏ	Kích thích sự phát triển và đặc hiệu	E. coli P. aeruginosa
Escherichia coli	Môi trường lỏng MacConkey	Kích thích sự phát triển	E. coli
		Ức chế sự phát triển	S. aureus
	Môi trường thạch MacConkey	Kích thích sự phát triển và đặc hiệu	E. coli
Salmonella	Môi trường lỏng tăng sinh Salmonella Rappaport Vassiliadis Môi trường thạch xylose, lysin, deoxycholat	Kích thích sự phát triển	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium hoặc Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony
		Ức chế sự phát triển	S. aureus
		Kích thích sự phát triển và đặc hiệu	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhlmurium hoặc Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony
Pseudomonas aeruginosa	Môi trường thạch Cetrimid	Kích thích sự phát triển	P. aeruginosa
		Ức chế sự phát triển	E coli
Staphylococcus aureus	Môi trường thạch muối Mannitol	Kích thích sự phát triển và đặc hiệu	S. aureus
		Ức chế sự phát triển	E. coli
Clostridia	Môi trường tăng sinh cho Clostridia	Kích thích sự phát triển	C. sporogenes
	Môi trường thạch Columbia	Kích thích sự phát triển	C. sporogenes
Candida albicans	Môi trường lỏng Sabouraud-dextrose	Kích thích sự phát triển	C. albicans
	Môi trường thạch Sabouraud-dextrose	Kích thích sự phát triển và đặc hiệu	C. albicans

Thử nghiệm kiểm tra khả năng kích thích sự phát triển vi sinh vật của môi trường đặc:

Dùng kĩ thuật cấy trải bề mặt, cấy vào mỗi đĩa môi trường đặc một lượng nhỏ vi sinh vật phù hợp (không quá 100 CFU). Ủ ở nhiệt độ xác định trong thời gian không lâu hơn khoảng thời gian ngắn nhất mà phép thử quy định. So sánh sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường mới với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.

Thử nghiệm kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi sinh vật của môi trường lỏng và đặc:

Cấy vào môi trường loại vi sinh vật phù hợp với lượng ít nhất là 100 CFU. Ủ ở nhiệt độ xác định trong thời gian không ít hơn khoảng thời gian dài nhất mà phép thử quy định. Vi sinh vật phải không phát triển trên môi trường.

Thử nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu của môi trường:

Dùng kĩ thuật cấy trải bề mặt, cấy vào mỗi đĩa môi trường một lượng nhỏ vi sinh vật phù hợp (không quá 100 CFU). Ủ ở nhiệt độ xác định trong thời gian mà phép thừ quy định. So sánh hình thái khuẩn lạc và phản ứng đặc hiệu của vi sinh vật trên lô môi trường mới với hình thái khuẩn lạc và phản ứng đặc hiệu của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.

Sự phù hợp của phương pháp thử

Đối với mỗi mẫu thử, tiến hành chuẩn bị mẫu thử như mô tả trong mục Cách tiến hành. Cấy chủng vi sinh vật chứng vào môi trường nuôi cấy tại thời điểm trộn mẫu thử vào môi trường. Cấy các chủng vi sinh vật một cách riêng rẽ. Số lượng vi sinh vật được cấy vào mẫu thử với lượng không quá 100 CFU. Tiến hành thử nghiệm như mô tả trong mục Cách tiến hành và ủ trong thời gian ngắn nhất mà phép thử quy định. Vi sinh vật gây bệnh được phát hiện bằng các phản ứng đặc hiệu được mô tả trong mục Cách tiến hành.

Nếu bản chất mẫu thử có tính ức chế vi sinh vật, cần thay đổi quy trình thử cho phù hợp (xem phần Trung hòa/loại bỏ tác dụng của chất ức chế).

Với mẫu thử có tính ức chế vi sinh vật nhưng phương pháp đã thử không thể trung hòa hoạt tính ức chế này được thì mẫu thử được coi là không bị nhiễm các vi sinh vật đã được thử nghiệm.

Cách tiến hành

Vi khuẩn Gram âm dung nạp mật

Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ.

Lấy không dưới 1 g hoặc 1 ml mẫu thử, pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử chỉ khác là dùng môi trường lỏng casein đậu tương thay cho dung dịch pha loãng, trộn đều và ủ ở 20 °C đến 25 °C trong một thời gian thích hợp để phục hồi lại vi khuẩn mà không làm tăng số lượng vi khuẩn (thường từ 2 h đến không quá 5h)

Phát hiện vi khuẩn:

Trừ khi có chỉ dẫn riêng, chuyển một thể tích tương đương với 1 g hoặc 1 ml mẫu thử được chuẩn bị ở phần Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ vào 100 ml môi trường lỏng tăng sinh Enterobacteria-Mossel. Ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 24 h đến 48 h. Cấy chuyển lên môi trường thạch muối mật tím đỏ. Ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h.

Mẫu thử không có vi khuẩn Gram âm dung nạp mật nếu không thấy khuẩn lạc mọc trên môi trường.

Đánh giá số lượng:

Phân lập và cấy chuyển: Cấy lượng mẫu thử đã được chuẩn bị theo phần Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ tương ứng chứa 0,1 g; 0,01 g và 0,001 g hoặc 0,1 ml; 0,01 ml và 0,001 ml vào thể tích thích hợp môi trường lỏng tăng sinh Enterobacteria-Mossel. ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 24 h đến 48 h. Cấy chuyển từ mỗi ống môi trường trên sang môi trường thạch muối mật tím đỏ. Ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h.

Đánh giá kết quả: Khuẩn lạc mọc trên môi trường chứng tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dương tính và lượng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định số lượng vi khuẩn theo Bảng 13.6.5.

Bảng 13.6.5 - Đánh giá kết quả

Kết quả đối với mỗi lượng chế phẩm			Số khuẩn có thể có trong 1 gam hoặc 1 ml chế phẩm
0,1 g hoặc 0,1 ml	0,01 g hoặc 0,01 ml	0,001 g hoặc 0,001 ml
+	+	+	>103
+	+	-	<103 và >102
+	-	-	< 102 và> 10
-	-	-	< 10

Escherichia coli

Phát hiện vi khuẩn:

Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:

Lấy không dưới 1 g hoặc 1 ml, pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử. cấy 10 ml hoặc một lượng tương ứng với 1 g hoặc 1 ml mẫu thử vào một thể tích phù hợp môi trường lỏng casein đậu tương, trộn đều và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h.

Phân lập và cấy chuyển:

Lắc bình môi trường lỏng casein đậu tương, cấy chuyển 1 ml môi trường lỏng casein đậu tương sang 100 ml môi trường lỏng MacConkey và ủ ở 42 °C đến 44 °C trong 24 h đến 48 h. Tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch MacConkey và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 72 h.

Đánh giá kết quả:

Khuẩn lạc mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có E. coli. Tiếp tục xác định bằng nhiều bằng nhiều phản ứng sinh hóa hoặc phương pháp định danh khác.

Mẫu thử không có E. coli nếu không có khuẩn lạc mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa, phương pháp định danh để xác định E. coli có kết quả âm tính.

Đánh giá số lượng:

Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:

Lấy không dưới 1 g hoặc 1 ml, pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử. Cấy lượng mẫu thử tương ứng chứa 0,1 g; 0,01 g và 0,001 g hoặc 0,1 ml; 0,01 ml và 0,001 ml vào thể tích thích hợp môi trường lỏng casein đậu tương, lắc đều và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h.

Phân lập và cấy chuyển:

Lắc bình môi trường lỏng casein đậu tương, cấy chuyển 1 ml môi trường lỏng casein đậu tương sang 100 ml môi trường lỏng MacConkey và ủ ở 42 °C đến 44 °C trong 24 h đến 48 h. Tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch MacConkey và ủ ở 30 °C đến-35 °C trong 18 h đến 72 h.

Đánh giá kết quả:

Khuẩn lạc mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có E. coli. Tiếp tục xác định bằng nhiều bằng nhiều phản ứng sinh hóa hoặc phương pháp định danh khác.

Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dương tính và lượng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định số lượng vi khuẩn theo Bảng 13.6.5.

Salmonella

Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:

Lấy lượng mẫu thử đã xử lý như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử tương ứng với 10 g hoặc 10 ml mẫu thử và cấy vào một thể tích phù hợp môi trường lỏng casein đậu tương, trộn đều và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h.

Phân lập và cấy chuyển:

Cấy chuyển 0,1 ml môi trường lỏng casein đậu tương sang 10 ml môi trường tăng sinh Salmonella Rappaport Vassiliadis và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h. Tiếp tục cấy chuyển sang dĩa môi trường thạch xylose, lysin, deoxycholat và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 48 h.

Đánh giá kết quả:

Khuẩn lạc màu đỏ, có hoặc không có trung tâm màu đen mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có Salmonella. Tiếp tục xác định bằng nhiều bằng nhiều phản ứng sinh hóa hoặc phương pháp định danh khác.

Mẫu thử không có Salmonella nếu không có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả ở trên mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa, phương pháp định danh để xác định Salmonella có kết quả âm tính.

Pseudomonas aeruginosa

Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:

Lấy không dưới 1 g hoặc 1 ml mẫu thử, pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử. Cấy 10 ml hoặc 1 lượng tương ứng với 1 g hoặc 1 ml mẫu thử vào một thể tích phù hợp môi trường lỏng casein đậu tương, trộn đều. Đối với thuốc dán, lọc một lượng mẫu thử tương đương với 1 miếng dán như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử của mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử qua màng lọc vô khuẩn và cấy vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương. Ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h.

Phân lập và cấy chuyển:

Cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch cetrimid và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 72 h.

Đánh giá kết quả:

Khuẩn lạc mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có P. aeruginosa. Tiếp tục xác định bằng nhiều bằng nhiều phản ứng sinh hóa hoặc phương pháp định danh khác.

Mẫu thử không có P. aeruginosa nếu không có khuẩn lạc mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa, phương pháp định danh để xác định P. aeruginosa có kết quả âm tính.

Staphylococcus aureus

Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:

Lấy không dưới 1 g hoặc 1 ml mẫu thử, pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử. Cấy 10 ml hoặc 1 lượng tương ứng với 1 g hoặc 1 ml mẫu thử vào một thể tích phù hợp môi trường lỏng casein đậu tương, trộn đều. Đối với thuốc dán, lọc một lượng mẫu thử tương đương với 1 miếng dán như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử qua màng lọc vô khuẩn và cấy vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 24 h.

Phân lập và cấy chuyển:

Cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch muối manitol và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 h đến 72 h.

Đánh giá kết quả:

Khuẩn lạc màu vàng hoặc trắng có vòng màu vàng bao quanh mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có S. aureus. Tiếp tục xác định bằng nhiều bằng nhiều phản ứng sinh hóa hoặc phương pháp định danh khác.

Mẫu thử không có S. aureus nếu không có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả ở trên mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa, phương pháp định danh để xác định S. aureus có kết quả âm tính.

Clostridia

Chuẩn bị mẫu thử và sốc nhiệt:

Chuẩn bị tối thiểu 20 ml mẫu thử được pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử tương ứng với không dưới 2 g hoặc 2 ml mẫu thử. Chia mẫu thử thành 2 phần, mỗi phần ít nhất 10 ml. Một phần đun nóng tới 80 °C trong 10 min rồi làm lạnh ngay. Phần còn lại không được đun nóng.

Phân lập và cấy chuyển:

Cấy 10 ml hoặc lượng tương đương với 1 g hoặc 1 ml mẫu thử của cả 2 phần trên vào thể tích phù hợp môi trường tăng sinh cho Clostridia. Ủ cả hai mẫu ở điều kiện kỵ khí ở 30 °C đến 35 °C trong 48 h. Sau khi ủ, từ mỗi bình cấy chuyển sang môi trường thạch Columbia và tiếp tục ủ ở điều kiện kỵ khí ở 30 °C đến 35 °C trong 48 h đến 72 h.

Đánh giá kết quả:

Sự phát triển của trực khuẩn trong điều kiện kỵ khí (có hoặc không có bào tử) trên môi trường, phản ứng catalase âm tính cho thấy mẫu thử có thể có Clostridia. Tiếp tục xác định bằng nhiều bằng nhiều phản ứng sinh hóa hoặc phương pháp định danh khác.

Mẫu thử không có Clostridia nếu không có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả ở trên mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa, phương pháp định danh để xác định Clostridia có kết quả âm tính.

Candida albicans

Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:

Chuẩn bị mẫu thử như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử, cấy 10 ml hoặc một lượng tương ứng với 1 g hoặc 1 ml vào 100 ml môi trường lòng Sabouraud- dextrose, trộn đều và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 3 ngày đến 5 ngày.

Phân lập và cấy chuyển:

Cấy chuyển sang môi trường thạch Sabouraud-dextrose và ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 24 h đến 48 h.

Đánh giá kết quả:

khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có C. albicans. Tiếp tục xác định bằng nhiều phản ứng sinh hóa hoặc phương pháp định danh khác.

Mẫu thử không có C. albicans nếu không có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả ở trên mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa, phương pháp định danh để xác định C. albicans có kết quả âm tính.

3. DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ MÔI TRƯỜNG

Các dung dịch và môi trường nuôi cấy được chuẩn bị theo cách dưới đây. Có thể sử dụng môi trường khác khi chứng minh được sự phù hợp của chúng.

Dung dịch đệm gốc

Cân 34 g kali dihydrophosphat (TT) và cho vào bình định mức 1000 ml, thêm 500 ml nước, điều chỉnh pH 7,2 ± 0,2 bằng natri hydroxyd (TT). Thêm nước tới vạch, trộn đều. Phân chia vào các bình, tiệt khuẩn, bảo quản ở 2 °C đến 8 °C.

Dung dịch đệm phosphat pH 7,2

Pha loãng dung dịch đệm gốc với nước theo tỷ lệ 1 : 800 (tt/tt) và tiệt khuẩn.

Dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0

Kali dihydrophosphat	3,6 g
Dinatri hydrophosphat dihydrat	7,2 g tương ứng với 0,067 M phosphat
Natri clorid	4,3 g
Pepton (từ thịt hoặc casein)	1,0g
Nước tinh khiết	1000 ml

Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định

Môi trường lỏng casein đậu tương
Casein thủy phân bởi pancreatin	17,0 g
Bột đậu tương thủy phân bởi papain	3,0 g
Natri clorid	5,0 g
Dikali hydrophosphat	2,5 g
Glucose monohydrat	2,5 g
Nước tinh khiết	1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,3 ± 0,2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường thạch casein đậu tương
Casein thủy phân bởi pancreatin	15,0 g
Bột đậu tương thủy phân bởi papain	5,0 g
Natri clorid	5,0 g
Thạch	15,0 g
Nước tinh khiết	1000 ml
Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,3 ± 0,2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.
Môi trường thạch Sabouraud-dextrose
Dextrose	40,0 g
Casein thủy phân bởi pancreatin	5,0 g
Pepton từ mô động vật	5,0 g
Thạch	15,0 g
Nước tinh khiết	1000 ml
Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 5,6 ± 0,2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường thạch khoai tây dextrose

Dịch chiết từ khoai tây	200,0 g
Dextrose	20,0 g
Thạch	15,0 g
Nước tinh khiết	1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 5,6 ± 0,2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường lỏng Sabouraud-dextrose

Dextrose	20,0 g
Casein thủy phân bởi pancreatin	5,0 g
Pepton từ mô động vật	5,0 g
Nước tinh khiết	1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 5,6 ± 0 2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường lỏng tăng sinh Enterobacieria-Mossel

Genlatin thủy phân bởi pancreatin	10,0 g
Glucose monohydrat	5,0 g
Mật bò khô	20,0 g
Kali dihydrophosphat	2,0 g
Dinatri hydrophosphat dihydrat	8,0 g
Xanh brilliant	15 mg
Nước tinh khiết	1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,2 ± 0,2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn bằng nhiệt ở 100 °C trong 30 min và làm lạnh ngay.

Môi trường thạch muối mật tím đỏ
Cao nấm men	3,0 g
Gelatin thủy phân bởi pancreatin	7,0 g
Muối mật	1,5 g
Natri clorid	5,0 g
Glucose monohydrat	10,0 g
Thạch	15,0 g
Đỏ trung tính	30 mg
Tím tinh thể	2 mg
Nước tinh khiết	1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,4 ± 0,2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn bằng cách đun sôi, không được hấp trong nồi hấp.

Môi trường lỏng MacConkey
Gelatin thủy phân bởi pancreatin	20,0 g
Lactose monohydrat	10,0 g
Mật bò khô	5,0 g
Tía bromocresol	10 mg
Nước tinh khiết	1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,3 ± 0,2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường thạch MacConkey

Gelatin thủy phân bởi pancreatin	17,0 g
Pepton (thịt và casein)	3,0 g
Lactose monohydrat	10,0 g
Natri clorid	5,0 g
Muối mật	1,5 g
Thạch	13,5 g
Đỏ trung tính	30,0 mg
Tím tinh thể	1,0 mg
Nước tinh khiết	1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,1 ± 0,2 ở 25 °C. Đun sôi 1 min, sau đó hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường lỏng tăng sinh Salmonella Rappaport Vassiliadis
Pepton đậu tương	4,5 g
Magnesi clorid hexahydrat	29,0g
Natri clorid	8,0 g
Dikali phosphat	0,4 g
Kali dihydrophosphat	0,6 g
Xanh malachit	0,036 g
Nước tinh khiết	1000 ml

Hòa tan, đun nóng nhẹ. Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định với nhiệt độ không quá 115 °C. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 5,2 ± 0,2 ở 25 °C.

Môi trường thạch xylose, lysin, desoxycholat
Xylose	3,5 g
L-Lysin	5,0 g
Lactose monohydrat	7,5 g
Sucrose	7,5 g
Natri clorid	5,0 g
Cao nấm men	3,0 g
Đỏ phenol	80 mg
Thạch	13,5 g
Natri desoxycholat	2,5 g
Natri thiosulfat	6,8 g
Sắt amoni citrat	0.8 g
Nước tinh khiết	1000 ml

Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,4 ± 0,2 ở 25 °C. Đun sôi, để nguội đến 50 °C thì rót môi trường vào đĩa Petri. Không được hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp.

Môi trường thạch cetrimid
Gelatin thủy phân bởi pancreatin	20,0 g
Magnesi clorld	1.4 g
Dikali sulfat	10,0 g
Cetrimid	0,3 g
Thạch	13,6 g
Nước tinh khiết	1000 ml
Glycerol	10 ml

Đun sôi trong 1 min, khuấy đều. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,2 ± 0,2 ở 25 °C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường thạch muối manitol

Casein thủy phân bởi pancreatin	5,0 g
Pepton từ mô động vật	5,0 g
Cao thịt bò	1,0 g
D-Manitol	10,0 g
Natri clorid	75,0 g
Thạch	15,0 g
Đỏ phenol	0,025 g
Nước tinh khiết	1000 ml

Đun sôi trong 1 min, lắc đều. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,4 ± 0,2 ở 25 °C. Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường tăng sinh cho Clostridia

Cao thịt bò	10,0 g
Pepton	10,0 g
Cao nấm men	3,0 g
Tinh bột dễ tan	1,0 g
Glucose monohydrat	5,0 g
Cystein hydroclorid	0,5 g
Natri clorid	5,0 g
Natri acetat	3,0 g
Thạch	0,5 g
Nước tinh khiết	1000 ml

Làm ẩm thạch, hòa tan các thành phần bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 6,8 ± 0,2 ở 25 °C. Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định.

Môi trường thạch Columbia

Casein thủy phân bởi pancreatin	10,0 g
Pepton từ thịt	5,0 g
Tim thủy phân bởi pancreatin	3,0 g
Cao nấm men	5,0 g
Tinh bột ngô	1,0 g
Natri clorid	5,0 g
Thạch	10,0 g đến 15,0 g
Nước tinh khiết	1000 ml

Làm ẩm thạch, hòa tan bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,3 ± 0,2 ở 25 °C. Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Để nguội tới 45 °C đến 50 °C, nếu cần, thêm 20 mg gentamycin base và rót vào đĩa Petri.

4. YÊU CẦU GIỚI HẠN NHIỄM VI SINH VẬT

Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng thì giới hạn nhiễm vi sinh vật cho các loại thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất được ghi trong Bảng 13.6.6.

Bảng 13.6.6 - Yêu cầu giới hạn nhiễm vi sinh vật

Loại chế phẩm	Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g hoặc CFU/ml)	Tổng số nấm (CFU/g hoặc CFU/ml)	Vi sinh vật gây bệnh
Thuốc dùng điều trị bỏng và các vết loét sâu	Không có vi sinh vật trong 1 g (ml)
Nguyên liệu hóa dược	103	102	-
Thành phẩm hóa dược dùng để uống (dạng khô: viên nén, nang... hoặc dạng dung dịch dầu)	103	102	Không có Escherichia coli trong 1 g (ml)
Thành phẩm hóa dược dùng để uống (dạng nước: siro, dung dịch...)	102	101	Không có Escherichia coli trong 1 g (ml)
Thuốc dùng theo đường trực tràng	103	102	-
Thuốc dùng theo đường niêm mạc miệng, lợi, răng, da, mũi, tai	102	101	Không có Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa trong 1 g (ml)
Thuốc dùng theo đường âm đạo	102	101	Không có Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans trong 1 g (ml)
Thuốc dán (áp dụng cho 1 miếng dán)	102	101	Không có Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa trong 1 miếng dán
Thuốc hít (bao gồm cả dạng khí dung)	102	101	Không có Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, vi khuẩn Gram âm dung nạp mật trong 1 g (ml)
Thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên (động, thực vật, khoáng chất); Cao dược liệu dùng để sản xuất thuốc uống	104*	102*	Không quá 102 CFU vi khuẩn Gram âm dung nạp mật trong 1 g (ml) Không có Salmonella trong 10 g (ml) Không có Escherichia coli, Staphylococcus aureus trong 1 g (ml)
Thuốc thang, thuốc bột,... để ngâm rượu hoặc xử lý bằng nước nóng (không sôi) trước khi dùng. Cao dược liệu dùng để sản xuất thuốc uống mà quá trình chiết (Ví dụ ngâm hoặc ngâm nhỏ giọt trong nước...) không làm giảm số lượng vi sinh vật đạt được mức * ở trên	105 Số lượng tối đa được chấp nhận: 5 x 105	104 Số lượng tối đa được chấp nhận: 5 x 104	Không quả 104 CFU vi khuẩn Gram âm dung nạp mật trong 1 g (ml) Không có Salmonella trong 25 g (ml) Không có Escherichia coli trong 1 g (ml)
Thuốc thang, trà... được xử lý bằng nước sôi trước khi dùng.	107 Số lượng tối đa được chấp nhận: 5 x 107	105 Số lượng tối đa được chấp nhận: 5 x 105	Không quá 103 CFU Escherichia coli trong 1 g (ml) Không có Salmonella trong 25 g (mi)

 

PHỤ LỤC 15.43 KIỂM TRA CÔNG HIỆU (IN VIVO) CỦA VẮC XIN VIÊM GAN B TÁI TỔ HỢP

Nguyên lý thử nghiệm: Công hiệu in vivo vắc xin viêm gan B tái tổ hợp được xác định qua số chuột tạo đáp ứng miễn dịch bảo vệ (kháng thể kháng HBsAg) sau khi tiêm vắc xin bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán HBsAg. Tính kết quả công hiệu tương quan theo chương trình Probit Analysis (WHO) thông qua số chuột tạo đáp ứng miễn dịch trên tổng số chuột gây miễn dịch ở từng độ pha.

Nguyên vật liệu

Chuột nhắt trắng đạt yêu cầu 4 đến 6 tuần tuổi, cân nặng tối thiểu 16 g, vận chuyển và chăm sóc trong điều kiện cách ly. Dùng 12-15 con/độ pha.

Vắc xin viêm gan B tái tổ hợp chuẩn quốc gia hoặc mẫu chuẩn nội bộ nhà sản xuất.

Vắc xin viêm gan B tái tổ hợp mẫu thử.

Bộ sinh phẩm chuẩn đoán HBsAg 96 giếng.

Tiến hành

Dung dịch pha loãng: Hoà tan nhôm hydroxyd (Sigma hoặc Merck hoặc hãng tương đương) trong dung dịch natri clorid 0,9 % theo tỷ lệ từ 1/4 -1/5 (tỷ lệ này có thể thay đổi theo từng loạt vắc xin). Hấp tiệt trùng dung dịch đã pha ở 121 °C trong 30 min. Bảo quản ở 4 °C.

Pha loãng của vắc xin:

Tiến hành trong hốt vô trùng.

Vắc xin mẫu thử và vắc xin mẫu chuẩn (hàm lượng khoảng 20 μg kháng nguyên/ml) được pha loãng bậc 2 bằng Dung dịch pha loãng thành các độ pha phù hợp (tính theo tỷ lệ giữa thể tích vắc xin nguyên mẫu trên tổng thể tích của vắc xin nguyên mẫu và thể tích dung dịch pha loãng), ví dụ như bảng 15.43, Tùy từng loại vắc xin viêm gan B tái tổ hợp, độ pha có thể thay đổi để tạo được đường chuẩn phù hợp.

Bảng 15.43 - Pha loãng của vắc xin (ví dụ)

Mẫu vắc xin (ml)	Dung dịch pha loãng (ml)	Tỷ lệ pha loãng (độ pha)	HBsAg (μg/ml)
10 (vắc xin nguyên mẫu)	30	1/4	5
20 (vắc xin 1/4)	20	1/8	2,5
20 (vắc xin 1/8)	20	1/16	1,25
20 (vắc xin 1/16)	20	1/32	0,0625
20 (vắc xin 1/32)	20	1/64	0,0312
20 (vắc xin 1/64)	20	1/128	0,0156

Gây nhiễm trên động vật:

Với mỗi độ pha của vắc xin gây nhiễm trên ít nhất 12 chuột nhắt (1 ml/con) bằng đường tiêm ổ bụng (phúc mạc). Sau khi tiêm theo dõi trong vòng 28 - 35 ngày (tùy vắc xin).

Lấy máu: Lấy máu riêng từng chuột vào ống eppendort, dán nhãn ghi số lô và độ pha. Để máu ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 2 h, sau đó để ở 4 °C trong 2 h hoặc qua đêm.

Ly tâm, tách huyết thanh: Ly tâm các tuýp eppendorf đựng máu tốc độ 4000 rpm trong 10 min ở 4 °C. Cẩn thận tách hết phần huyết thanh trong sang một ống eppendorf khác (không được làm lẫn huyết thanh giữa các ống khác nhau). Nếu chưa tiến hành định lượng kháng thể kháng HBsAg ngay thì bảo quản các mẫu huyết thanh ở -20 °C.

Định lượng kháng thể kháng HbsAg bằng phương pháp ELISA, sử dụng bộ sinh phẩm chuẩn đoán của BIO-RAD hoặc Dia.pro hoặc bộ sinh phẩm chẩn đoán phù hợp khác.

Tính kết quả:

Tính giá trị ngưỡng (OD_{Cut off}) để xác định số chuột dương tính trong từng độ pha của cả vắc xin mẫu thử và vắc xin mẫu chuẩn, số chuột dương tính ở mỗi độ pha của mẫu tương đương số chuột tạo được đáp ứng miễn dịch. Tính kết quả công hiệu tương quan theo chương trình Probit Analysis (WHO) thông qua số chuột dương tính trên tổng số chuột gây miễn dịch ở từng độ pha.

Thử nghiệm có giá trị nếu:

ED₅₀ cho cả hai vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử phải nằm trong khoảng các liều đã tiêm.

Các giới hạn 95 % độ tin cậy của công hiệu được xác định cho mỗi vắc xin trong thử nghiệm phải nằm trong khoảng 33 - 300 %.

Tiêu chuẩn chấp nhận: Theo quy định trong chuyên luận riêng.

 

Mục lục

Lời nói đầu

Lời giới thiệu

1  Phạm vi áp dụng

2  Tài liệu viện dẫn

3  Chữ viết tắt

Phương pháp kiểm nghiệm thuốc

Phụ lục 1.26 Yêu cầu chung đối với chế phẩm Probiotic

Phụ lục 12.11 Xác định tạp chất lẫn trong dược liệu

Phụ lục 12.20 Phương pháp chế biến dược liệu

Phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm vi sinh vật

Phụ lục 15.43 Kiểm tra công hiệu (in vivo) của vắc xin viêm gan B tái tổ hợp