Quy chuẩn QCVN 4-22:2011/BYT Chất nhũ hóa dùng làm phụ gia thực phẩm

1.1.

Phụ lục 1:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với mono- và di-glycerid của acid béo

1.2.

Phụ lục 2:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với ester của glycerol với acid lactic và acid béo

1.3.

Phụ lục 3 :

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với ester của glycerol với acid citric và acid béo

1.4.

Phụ lục 4:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với ester của glycerol với acid diacetyl tartric và acid béo

1.5.

Phụ lục 5:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với sucroglycerid

1.6.

Phụ lục 6:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với ester của polyglycerol với các acid béo

1.7.

Phụ lục 7:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với stearyl citrat

1.8.

Phụ lục 8:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với trikali ortho-phosphat

1.9.

Phụ lục 9:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với các muối amoni của acid phosphatidic

1.10.

Phụ lục 10:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với sucrose acetat isobutyrat

1.11.

Phụ lục 11:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với ester glycerol của nhựa cây

1.12.

Phụ lục 12:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với dinatri diphosphat

1.13.

Phụ lục 13:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với calci polyphosphat

1.14.

Phụ lục 14:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với các muối của acid myristic, palmitic và stearic (Ca, Na, K, NH₄)

1.15.

Phụ lục 15:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với ester của sucrose với các acid béo

1.16.

Phụ lục 16:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với dioctyl natri sulphosucinat

1.17.

Phụ lục 17:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với stearyl tartrat

1.18.

Phụ lục 18:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với sorbitan monostearat

1.19.

Phụ lục 19:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với sorbitan tristearat

1.20.

Phụ lục 20:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với sorbitan monolaurat

1.21.

Phụ lục 21:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với sorbitan monooleat

1.22.

Phụ lục 22:

Yêu cầukỹ thuật và phương pháp thử đối với sorbitan monopalmitat

PHỤ LỤC 1

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI MONO VÀ DIGLYCERID CỦA CÁC ACID BÉO

 1. Tên khác, chỉ số

Glyceryl monostearate, glyceryl monopalmitate, glyceryl monooleate; monostearin, monopalmitin, monoolein; GMS (đối với glyceryl monostearate);

INS 471

 2. Định nghĩa

Hỗn hợp các ester mono- và diglyceryl mạch dài  với các acid béo bão hòa và không bão hòa có trong chất béo thực phẩm; có chứa hàm lượng alpha-monoglycerid không thấp hơn 30% và cũng có thể có chứa các monoglycerid đồng phân; cũng như di- và triglycerid, glycerol tự do, các acid béo tự do, sản phẩm xà phòng hóa và nước; thường được sản xuất bằng cách thủy phân tách glyceryl của các chất béo và dầu thực phẩm, nhưng cũng có thể được sản xuất bằng cách este hóa các acid béo với glycerol có hoặc không qua chưng cất phân tử.

 Công thức cấu tạo

Trong đó –OCR là của acid béo

Khối lượng phân tử

Glyceryl monostearat: 358,6

Glyceryl distearat: 625,0

 3. Cảm quan

Chất béo rắn dạng sáp có màu trắng hoặc kem hoặc dạng lỏng sánh

 4. Chức năng

Chất nhũ hoá

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Không tan trong nước, tan trong ethanol, cloroform và benzen.

Hấp thụ hồng ngoại

Phải có phổ hồng ngoại đặc trưng của ester một phần của acid béo với polyol.

Acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của acid béo.

Glycerol

Phải có phản ứng đặc trưng của glycerol.

5.2. Độ tinh khiết

Nước

Không được quá 2,0 % (phương pháp Karl Fischer)

Chỉ số acid

Không được quá 6.

Glycerol tự do

Không được quá 7%

Xà phòng

Không được quá 6%, tính theo natri oleat.

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

6. Phương pháp thử

Độ tinh khiết

Xà phòng

Thêm 10 g mẫu thử vào hỗn hợp gồm 60 ml aceton và 0,15 ml dung dịch xanh bromophenol (0,5%) đã được trung hòa trước bằng acid hydrocloric 0,1N hoặc natri hydroxyd 0,1N. Làm ấm từ từ trên cách thủy cho đến khi dung dịch tan hoàn toàn, chuẩn độ bằng acid hydrocloric 0,1N cho đến khi màu xanh biến mất. Để yên dung dịch trong 20 phút, làm ấm cho đến khi cặn được hòa tan và màu xanh tái xuất hiện, tiếp tục chuẩn độ đến mất màu xanh.

Mỗi ml acid hydrocloric 0,1N tương đương với 0,0304 g C₁₈H₃₃O₂Na.

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

PHỤ LỤC 2

 YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI ESTER CỦA GLYCEROL VỚI ACID LACTIC VÀ ACID BÉO

 1. Tên khác, chỉ số

Lactic acid esters of mono- and diglycerides; lactoglycerides

INS 472b

 2. Định nghĩa

Là hỗn hợp các ester của glycerol với acid lactic và acid béo trong chất béo thực phẩm.

Sản phẩm thương mại có thể chỉ rõ hàm lượng monglycerid, acid lactic, chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, hàm lượng acid béo tự do, điểm đông đặc của các acid béo tự do, chỉ số iod, hàm lượng glycerol tự do và hàm lượng nước.

 Công thức cấu tạo

Trong đó R₁, R₂ và R₃ là của acid béo, acid lactic hoặc hydrogen (theo thành phần)

 3. Cảm quan

Chất rắn dạng sáp

 4. Chức năng

Chất nhũ hoá

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Không tan trong nước lạnh nhưng có thể phân tán trong nước nóng.

Acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của acid béo.

Acid lactic

Phải có phản ứng đặc trưng của acid lactic.

Glycerol

Phải có phản ứng đặc trưng của glycerol.

5.2. Độ tinh khiết

Các acid

Chỉ có acid béo và acid lactic.

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

6. Phương pháp thử

Độ tinh khiết

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

PHỤ LỤC 3

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI ESTER CỦA GLYCEROL VỚI ACID CITRIC VÀ ACID BÉO

1. Tên khác, chỉ số

Citric acid esters of mono- and di-glycerides, citroglycerides, CITREM;

INS 472c

2. Định nghĩa

Thu được nhờ quá trình ester hoá glycerol với acid citric và acid béo thực phẩm hoặc nhờ phản ứng của hỗn hợp mono và diglycerid của acid béo với acid citric; chế phẩm bao gồm các ester hỗn hợp của acid citric và các acid béo với glycerol; có thể chứa lượng nhỏ các acid béo tự do, glycerol tự do, acid citric tự do và mono – và diglycerid; có thể được trung hoà hoàn toàn hoặc một phần bằng NaOH hoặc KOH (như được công bố trên nhãn mác).

Công thức cấu tạo

Trong đó: ít nhất một trong R₁, R₂ hoặc R₃ là của acid citric, một là của acid béo và R còn lại có thể là của acid citric, acid béo hoặc hydrogen.

3. Cảm quan

Dạng dầu tới sáp, màu trắng đến trắng ngà

4. Chức năng

Chất ổn định, chất nhũ hoá, chất chống oxy hoá

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Không tan trong nước lạnh, có thể phân tán trong nước nóng; tan trong dầu và mỡ; không tan trong ethanol lạnh

Acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của acid béo .

Acid citric

Phải có phản ứng đặc trưng của acid citric.

Glycerol

Phải có phản ứng đặc trưng của glycerol.

5.2. Độ tinh khiết

Tro sulfat

Sản phẩm không được trung hoà : Không được quá 0,5%

Sản phẩm được trung hoà hoàn toàn hoặc một phần: Không được quá 10%

(Sử dụng 2 g mẫu thử, phương pháp I)

Glycerol tự do

Không được quá 4%

Glycerol tổng số

8 – 33% (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Acid citric tổng số

13 – 50% (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Acid béo tổng số

37 – 81% (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

6. Phương pháp thử

Độ tinh khiết

Glycerol tổng số

Cân chính xác 2 g mẫu và cho vào bình xà phòng hoá, thêm vào 50 ml dung dịch KOH 0,5 M trong ethanol, và đun sôi với sinh hàn ngược trong 30 phút. Thêm chính xác 99 ml (từ buret) chloroform và 25 ml acid acetic băng vào bình định mức dung tích 1 lít. Chuyển toàn lượng dịch trong bình xà phòng hoá vào bình định mức dung tích 1 lít, cho 3 lần 25 ml nước. Thêm vào 500 ml nước và lắc mạnh trong 1 phút. Pha đến thể tích 1 lít bằng nước, lắc đều và để yên cho tách thành các lớp.

Dùng pipet lấy 50 ml dung dịch acid acetic periodic TS vào trong các cốc dung tích 400 ml. Chuẩn bị 2 mẫu trắng bằng cách thêm 50 ml nước vào mỗi cốc. Dùng pipet lấy 50 ml dung dịch mẫu trong nước cho vào một trong các cốc chứa 50 ml acid acetic periodic TS, lắc nhẹ cho đều, đậy bằng tấm kính nhìn qua được và để yên trong 30 phút. Nhưng không được quá 1,5 giờ. Thêm 20 ml dung dịch KI 15%, lắc nhẹ cho đều và để yên ít nhất 1 phút nhưng không được quá 5 phút. Không được để dưới ánh sáng trực tiếp hoặc ánh sáng trắng. Bổ sung 100 ml nước và chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1 N. Sử dụng dụng máy khuấy để làm đều dung dịch. Tiếp tục chuẩn độ cho đến khi mất màu iod nâu trong dung dịch nước. Thêm 2 ml tinh bột TS và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi mất màu iod trong lớp chloroform được tách ra trong quá trình chuẩn độ và mất màu xanh của tinh bột iodo trong dung dịch nước.

Kết quả: Glycerol tổng số (%):

Trong đó:

B: Lượng dung dịch natri thiosulfat dùng để chuẩn độ mẫu trắng chứa 50 ml nước

S: Lượng dung dịch natri thiosulfat dùng để chuẩn độ mẫu thử

N: Nồng độ dung dịch natri thiosulfat 0,1 N

W: Khối lượng mẫu thử được lấy bằng pipet đem chuẩn độ và được tính theo công thức:

Trong đó: a: Khối lượng mẫu (g) đem xà phòng hóa

Acid citric tổng số

Nguyên tắc:

Mẫu được xà phòng hoá bằng dung dịch KOH trong alcol và các acid béo được tách ra bằng trích ly. Acid citric được chuyển thành các dẫn suất trimethylsilyl (TMS) và được phân tích bằng sắc ký khí lỏng.

Xà phòng hoá:

Cân chính xác 1 g mẫu cho vào bình đáy tròn, thêm 25 ml dung dịch KOH 0,5M trong ethanol và đun sôi với sinh hàn ngược trong 30 phút. Acid hoá hỗn hợp bằng HCl và cho bốc hơi bằng máy cô quay hoặc bằng phương pháp thích hợp khác.

Trích ly:

Chuyển toàn lượng mẫu trong bình vào một bình gạn, sử dụng không quá 50 ml nước và trích ly bằng 3 lần 50 ml heptan, loại bỏ phần dịch chiết heptan tách ra. Chuyển lớp dung dịch nước vào bình định mức dung tích 100 ml, trung hoà, pha tới thể tích 100 ml bằng nước và lắc đều.

Dẫn xuất hoá:

Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch pha được ở trên, 1 ml dung dịch acid tartric (1 mg/ml trong nước) cho vào bình đáy tròn có thể đậy nắp dung tích 10 ml và cô đến khô. Thêm 1 ml pyridin, 0,2 ml dung dịch trimethyl-chlorosilan (TMCS), 0,4 ml hexamethyl-disilazan (HMDS), 0,1 ml n-methyl-n-trimethylsilyl-trifluoroacetamid (MSTFA). Đậy nắp chặt và lắc cẩn thận để được dung dịch tan hoàn toàn. Gia nhiệt bình trong tủ sấy ở 60⁰C trong 1 giờ.

Sắc ký khí:

Bất kỳ sắc ký khí thích hợp có thể được dùng với detector ion hoá ngọn lửa và cột (thuỷ tinh, chiều dài 1,8 m và đường kính trong 2 mm), được nhồi bằng DC-200 10% trên chromosorb Q (80/100 mesh). Các điều kiện cho sắc ký khí: nhiệt độ lò cột 165⁰C, nhiệt độ buồng tiêm 240⁰C, nhiệt độ detector 240⁰C; tốc độ dòng khí mang nitrogen 24 ml/phút.

Cách tiến hành:

Bơm5 μlmẫu các dẫn xuất TMS. Thời gian lưu đối với acid tartric khoảng 12 phút và thời gian lưu tương đối của acid citric/acid tartric khoảng2,3.

Lặp lại cách tiến hành được mô tả ở trên trong phần Dẫn xuất hoá và Sắc ký khí sử dụng 1 ml dung dịch đối chứng acid citric (3 mg/ml trong nước) thay thế 1 ml dung dịch mẫu thử.

Tính kết quả:

Đo diện tích mỗi pic bằng phương pháp thích hợp.

Acid citric tổng (%) =

Trong đó:

A_CS: Diện tích pic của acid citric (dung dịch mẫu)

A_TS: Diện tích pic của acid tartric (dung dịch mẫu)

A_TR: Diện tích pic của acid tartric (dung dịch đối chứng)

A_CR: Diện tích pic của acid citric (dung dịch đối chứng)

W_CR: Khối lượng (g) của acid citric trong 1 ml dung dịch đối chứng

W: Khối lượng (g) của mẫu ester glycerol với acid citric và acid béo.

Acid béo tổng số

Cân chính xác 5 g mẫu cho vào bình đáy tròn dung tích 250 ml, thêm vào 50 ml dung dịch KOH 1 N trong ethanol, và đun sôi với ống sinh hàn ngược trên nồi cách thủy trong 1 giờ.

Chuyển toàn lượng dung dịch trong bình xà phòng hoá vào phễu chiết dung tích 1.000 ml, cho 3 lần 25 ml nước và thêm 5 giọt da cam methyl TS.

Thêm cẩn thận dung dịch HCl đậm đặc cho đến khi màu của dung dịch chuyển sang màu đỏ rõ rệt và lắc đều để tách các acid béo.

Trích ly các acid béo tách được bằng ba lần 100 ml dung môi diethyl ether. Hoà chung các phần tách được và rửa mỗi lần bằng 50 ml dung dịch NaCl 10% cho đến khi dung dịch NaCl được rửa trở nên trung tính.

Làm khô dung dịch ether bằng Na₂SO₄ khan. Sau đó cô bốc hơi trên cách thủy ether, để thêm 10 phút nữa trên cách thủy và cân phần cặn.

PHỤ LỤC 4

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI ESTER CỦA GLYCEROL VỚI ACID DIACETYL TARTRIC VÀ ACID BÉO

1. Tên khác, chỉ số

Diacetyltartric acid esters of mono- and diglycerides, DATEM;

INS 472e

Tartric, acetic and fatty acid esters of glycerol, mixed; Mixed acetic and tartric acid esters of mono and diglycerides of fatty acids;

INS 472f

2. Định nghĩa

Sản phẩm gồm hỗn hợp các ester của glycerol với acid mono, diacetyltartric và các acid béo thực phẩm. Nó được tổng hợp bằng phản ứng giữa anhydrid diacetyltartric và mono, diglycerid của acid béo có mặt acid acetic, hoặc bằng cách tương tác giữa anhydrid acetic và mono, diglycerid của acid béo có mặt acid tartric.

Do trao đổi nhóm acyl trong nội phân tử hoặc giữa các phân tử, cả hai phương pháp sản xuất đều tạo ra các thành phần chính như nhau, việc tạo ra các thành phần chính phụ thuộc vào tỷ lệ tương đối của các nguyên liệu cơ bản, vào nhiệt độ và thời gian phản ứng. Sản phẩm này có thể chứa một lượng nhỏ glycerol tự do, các acid béo tự do, acid tartric và acid acetic tự do. Sản phẩm thương mại có thể được quy định các chỉ tiêu kỹ thuật rõ hơn như chỉ số acid, hàm lượng acid tartric tổng số, hàm lượng acid acetic tự do, chỉ số xà phòng hoá, chỉ số iod, hàm lượng acid béo tự do, điểm đông đặc của acid béo tự do.

Công thức cấu tạo

Các thành phần chính là:

Trong đó:

1) Một hoặc hai nhóm R là của acid béo

2) Nhóm R khác là của hoặc

- acid diacetylat tartric

- acid monoacetylat tartric

- acid tartric

- acid acetic

- hydrogen

3. Cảm quan

Từ dạng lỏng, bột nhão đến dạng rắn giống sáp (vảy hoặc bột)

4. Chức năng

Chất nhũ hoá

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Phân tán trong nước nóng và nước lạnh, tan trong methanol và ethanol.

1, 2- diol

Phải có phản ứng đặc trưng của 1,2-diol.

Acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của acid béo

Acid acetic

Phải có phản ứng đặc trưng của acid acetic

Acid tartric

Phải có phản ứng đặc trưng của acid tartric

Glycerol

Phải có phản ứng đặc trưng của glycerol

5.2. Độ tinh khiết

Acid

Không phát hiện được các loại acid khác ngoài acid acetic, acid tartric và acid béo.

Tro sulfat

Không được quá 0,5% được xác định ở800 ±25ºC

Acid béo tự do

Không được quá 3% tính theo acid oleic

Acid acetic tổng số

Không được nhỏ hơn 8% và không được quá 32% sau khi thuỷ phân (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Acid tartric tổng số

Không được nhỏ hơn 10% và không được quá 40% sau khi xà phòng hoá (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Glycerol tổng số

Không được nhỏ hơn 11% và không được quá 28% sau khi xà phòng hoá (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Glycerol tự do

Không được quá 2,0%

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

1, 2- diol

Cho vài giọt chì acetat TS vào dung dịch có 500 mg mẫu trong 10 ml methanol. Chất kết tủa vón, màu trắng không tan được hình thành.

6.2. Độ tinh khiết

Acid acetic tổng số

Dụng cụ:

Lắp ráp bộ dụng cụ chưng cất Hortvet – Sellier cải tiến như hình vẽ sau, sử dụng ống Sellier có kích thước bên trong đủ lớn (khoảng 38-x 203 mm)  và bẫy chưng cất dung tích lớn.

Cách tiến hành:

Cân chính xác 4 g mẫu và cho vào ống bên trong của bộ dụng cụ và lắp ống vào bình ngoài có chứa khoảng 300 ml nước nóng vừa đun sôi. Thêm 10 ml acid perchloric 4 N[35 ml (60 g) acid perchloric 70% trong 100 ml nước] vào mẫu thử, và nối ống bên trong với sinh hàn làm mát bằng nước qua bẫy chưng cất. Chưng cất bằng cách gia nhiệt bình phía ngoài để sao cho thu được 100 ml dung dịch cất trong khoảng 20 - 25 phút. Tập hợp các phần dịch cất được 100 ml và thêm phenolphthalein TS vào mỗi phần, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,5 N. Tiếp tục chưng cất cho đến khi phần 100 ml dung dịch cất được cần không quá 0,5 ml dung dịch NaOH 0,5N để trung hoà. (Chú ý: không được chưng cất đến cạn khô). Tính khối lượng (mg) acid bay hơi trong mẫu theo công thức V x e, trong đó V là tổng thể tích (ml) của dung dịch NaOH 0,5N đã dùng để chuẩn độ và e là hệ số đương lượng 30,03.

Acid tartric tổng số

Đường chuẩn:

Chuyển 100 mg acid tartric tinh khiết được cân chính xác vào bình định mức dung tích 100 ml, hoà tan acid tartric trong 90 ml nước và thêm nước đến thể tích 100 ml, lắc đều. Lấy các phần 3, 4, 5 và 6 ml cho vào các cuvet riêng biệt phù hợp (kích thước 19 x 150 mm), thêm lượng nước thích hợp để được dung dịch thể tích 10 ml. Cho vào mỗi cuvet 4 ml dung dịch natri metavanadat 5% vừa mới pha, 1 ml acid acetic. (Chú ý: sử dụng các dung dịch này trong vòng 10 phút sau khi màu tăng lên). Chuẩn bị mẫu trắng giống như cách trên, sử dụng 10 ml nước thay thế dung dịch acid tartric. Đặt thiết bị ở vị trí bằng 0 đối với mẫu trắng và sau đó đo độ hấp thụ của 4 dung dịch acid tartric tại bước sóng 520 nm với máy quang phổ thích hợp hoặc máy so màu quang điện được trang bị kính lọc 520 nm. Từ số liệu thu được, xây dựng đường chuẩn trên hệ trục toạ độ vuông góc với trục tung biểu diễn độ hấp thụ, trục hoành biểu diễn lượng acid tartric tương ứng (mg).

Chuẩn bị mẫu thử:

Cân chính xác 4 g mẫu cho vào bình tam giác dung tích 250 ml, thêm vào 80 ml dung dịch KOH 0,5N và 0,5 ml phenolphthalein TS. Nối bình với một sinh hàn không khí có chiều dài ít nhất 65 cm, gia nhiệt hỗn hợp trên tấm nhiệt trong 2,5 giờ. Thêm vào hỗn hợp nóng khoảng 10% acid phosphoric cho đến khi hỗn hợp có phản ứng acid rõ với giấy chỉ thị đỏ Congo. Nối lại bình với sinh hàn không khí và gia nhiệt cho đến khi acid béo được hoá lỏng và trong. Làm nguội và sau đó chuyển hỗn hợp vào một bình gạn dung tích 250 ml với sự hỗ trợ của các phần nhỏ nước và chloroform. Chiết các acid béo được giải phóng ra bằng 3 lần 25 ml nước cất liên tiếp và cho phần nước rửa vào bình gạn có chứa lớp nước. Chuyển toàn bộ hỗn hợp trong bình gạn đầu vào cốc dung tích 250 ml, gia nhiệt trên nồi cách thủy để loại bỏ các vết của chloroform, lọc qua giấy lọc mịn đã được rửa acid vào bình định mức dung tích 500 ml, và cuối cùng pha tới thể tích 500 ml bằng nước cất (Dung dịch I). Dùng pipet lấy 25 ml dung dịch này cho vào bình định mức dung tích 100 ml và pha tới thể tích 100 ml bằng nước (Dung dịch II). Giữ phần còn lại của Dung dịch I để xác định glycerol tổng số.

Cách tiến hành:

Cho 10 ml Dung dịch II đã được chuẩn bị trong phần Chuẩn bị mẫu thử vào cuvet 19 x 150 mm và tiếp tục làm theo hướng dẫn trong phần Đường chuẩn, bắt đầu với “cho vào mỗi cuvet 4 ml dung dịch metavanadat 5%”. Từ đường chuẩn xác định khối lượng (mg) acid tartric trong lần pha loãng cuối cùng, sau đó nhân với 20 và chia kết quả cho khối lượng mẫu gốc để thu được % acid tartric.

Glycerol tổng số

Chuyển 5 ml Dung dịch I đã chuẩn bị trong phần xác định Acid tartric tổng số vào trong bình bình tàm giác có nắp thuỷ tinh dung tích 250 ml hoặc bình iod. Thêm vào bình 15 ml acid acetic băng và 25 ml dung dịch acid periodic, được chuẩn bị bằng cách hoà tan 2,7 g acid periodic (H₅IO₆) trong 50 ml nước, thêm 950 ml acid acetic băng và lắc mạnh; bảo quản dung dịch này tránh ánh sáng. Lắc đều hỗn hợp trong 1 hoặc 2 phút, để yên trong 15 phút, thêm 15 ml dung dịch KI 15% và 15 ml nước, lắc xoáy, để yên trong 1 phút và sau đó chuẩn độ iod được giải phóng ra bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, dùng tinh bột TS là chất chỉ thị. Thực hiện chuẩn độ mẫu trắng sử dụng nước thay thế mẫu thử. Thể tích thực là số ml dung dịch natri thiosulfat 0,1N dùng để chuẩn độ glycerol và acid tartric trong mẫu thử có 5 ml Dung dịch I. Từ % xác định được trong Phương pháp thử Acid tartric tính thể tích dung dịch natri thiosulfat 0,1N dùng để chuẩn độ acid tartric. Chênh lệch giữa thể tích thực và thể tích tính toán được dùng đối với acid tartric là số ml của dung dịch natri thiosulfat 0,1N đã tiêu thụ bởi glycerol trong mẫu. Một ml dung dịch natri thiosulfat 0,1N tương đương với 2,303 mg glycerol và 7,505 mg acid tartric.

Dụng cụ chưng cất Hortvet-Sellier cải tiến

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

PHỤ LỤC 5

 YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI SUCROGLYCERID

1. Tên khác, chỉ số

INS 474

2. Định nghĩa

Sucroglycerid thu được nhờ phản ứng giữa sucrose với chất béo hoặc dầu ăn có hoặc không có mặt của dung môi. Sản phẩm gồm có hỗn hợp mono- và di-ester của sucrose và acid béo kết hợp với mono-, di- và triglycerid từ chất béo hoặc dầu. Chỉ các dung môi sau đây có thể được sử dụng trong sản xuất: dimethyl formamid, cyclohexan, isobutanol, isopropanol và ethyl acetat.

3. Cảm quan

Không mùi, dạng mềm, dạng đặc, dạng bột có màu trắng đến trắng nhạt, hoặc dạng gel cứng.

4. Chức năng

Chất nhũ hoá

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Không tan trong nước lạnh, tan trong ethanol.

Acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của acid béo.

Đường

Phải có phản ứng đặc trưng của đường.

5.2. Độ tinh khiết

Tro sulfat

Không được quá 2%

Thử 2 g mẫu (Phương pháp I)

Chỉ số acid

Không được quá 6

Sucrose tự do

Không được quá 5% (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Dimethylformamid

Không được quá 1 mg/kg (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Cyclohexan và isobutanol

Không được quá 10 mg/kg, ở dạng đơn chất hoặc hợp chất (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Ethyl acetat và isopropanol

Không được quá 350 mg/kg, dạng đơn chất hoặc hợp chất

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

5.3. Hàm lượng

Không được nhỏ hơn 40% và không được lớn hơn 60% ester sucrose

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Acid béo

Cho 1 ml ethanol vào 0,1 g mẫu, làm ấm và hoà tan, thêm 5 ml dung dịch H₂SO₄ loãng TS, gia nhiệt trong nồi cách thủy trong 30 phút và làm nguội. Chất đặc màu trắng vàng hoặc dầu được hình thành, và được hoà tan khi thêm 3 ml diethyl ether.

Đường

Cho vào 2 ml lớp dung dịch nước tách ra từ chất đặc hoặc dầu trong phép thử acid béo, 1 ml anthron TS vào trong ống thử, cho chảy cẩn thận vào thành ống thử; bề mặt ranh giới giữa hai lớp chuyển thành màu xanh da trời hoặc xanh lá cây.

6.2. Độ tinh khiết

Sucrose tự do

Xác định bằng sắc ký khí lỏng (xem Quyển 4)

Hoá chất, thuốc thử:

- Dung dịch nội chuẩn: Dung dịch cholesterol trong chloroform 5 mg/ml hoặc tetracosan trong chloroform 10 mg/ml

- Pyridin (làm khô được qua rây phân tử)

- N, O- Bis-(trimethylsilyl)-acetamid (BSA)

- Trimethylchlorosilan (TMCS)

Cách tiến hành: Cân chính xác 20 – 50 mg mẫu cho vào bình silyl hóa, thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn, 1 ml pyridin, 0,5 ml N, O-bis (trimethylsilyl) acetamid (BSA) và 0,5 ml trimethylchlorosilan (TMCS). Đậy nắp bình và gia nhiệt ở 70⁰C trong 30 phút. Bơm 1ml vào thiết bị sắc ký khí lỏng.

Các điều kiện sắc ký:

Cột:

- Chiều dài 0,3 m

- Đường kính trong 4 mm

- Chất liệu: thuỷ tinh

- Được nhồi bằng dexil

Khí mang: nitrogen

Tốc độ dòng: 40 ml/phút

Detector: FID

Chương trình nhiệt độ: giữ ở 160⁰C trong 1 phút sau đó tăng đến 160 – 375⁰C với tốc độ 15⁰C/phút.

Đo các diện tích pic của sucrose và nội chuẩn. Hệ số đáp ứng (RF) được tính từ quá trình chạy sắc ký khí lỏng với các

dung dịch chuẩn sucrose chứa nội chuẩn.

Kết quả:

                                 mg nội chuẩn x diện tích pic sucrose

RF = -----------------------------------------------------

                                 Diện tích pic nội chuẩn x mg sucrose

và

               mg nội chuẩn x diện tích pic sucrose x 100

% sucrose tự do = ---------------------------------------------------------

              RF x diện tích nội chuẩn x mg mẫu

Dimethylformamid

Xác định bằng sắc ký khí lỏng

Hoá chất, thuốc thử:

- Dimethyl formamid

- Dimethylamin hydrochlorid

- Methanol

- Ethanol

- HCl

- NaOH

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch gốc dimethylaminhydroclorid  trong ethanol 4,47 mg/ml (tương đương với 4,0 mg/ml dimethyl formamid) và chuẩn bị một loạt các dung dịch chuẩn tương ứng với 4; 2 và 1mg/ml dimethylformamid bằng cách pha loãng dung dịch gốc với dung dịch NaOH 0,1% trong ethanol.

Chuẩn bị mẫu:

Bộ dụng cụ thuỷ phân được trình bày trong phần Phụ lục. Cân chính xác 40 g mẫu cho vào bình đáy tròn dung tích 1.000 ml. Thêm 500 ml dung dịch NaOH 5% trong methanol, và gắn bình vào bộ dụng cụ thuỷ phân. Đặt bình cất bình tam giác chứa 10 ml dung dịch HCl 1% trong methanol vào bộ dụng cụ thuỷ phân. Gia nhiệt bình đáy tròn và chưng cất với sinh hàn ngược có nước làm mát trong 1 giờ, sau đó cất lấy 50 ml dịch cất được thì dừng lại. Cô dịch cất được cho đến khô trong cách thủy sôi. Hoà tan phần cặn bằng một lượng nhỏ ethanol, thêm 2,5 ml dung dịch NaOH 5% trong ethanol và pha loãng đến thể tích 25 ml bằng ethanol để chuẩn bị một dung dịch mẫu.

Cách tiến hành:

Bơm 2ml dung dịch mẫu vào thiết bị sắc ký khí lỏng với các điều kiện dưới đây.

Đường chuẩn:

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách bơm 2ml  các dung dịch chuẩn vào thiết bị sắc ký khí.

Các điều kiện sắc ký:

Cột:

- Dài: 2m

- Đường kính trong: 2 mm

- Chất liệu: thuỷ tinh

- Cột nhồi: 10% amin 220 và KOH 10% trên nền chromosorb W yếu 80/100 đã được rửa acid yếu

- Luyện cột: Gia nhiệt tới 130⁰C qua đêm với tốc độ dòng nitrogen 5 ml/phút

Khí mang: nitrogen

Tốc độ dòng: 17 ml/phút

Detector: FID

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 198 ±5⁰C

- Cột: 60⁰C.

Tính kết quả:

Nồng độ dimethylformamid (C_DFA) tính theo công thức sau:

Trong đó:

C: Nồng độ dimethylformamid phát hiện được (mg/ml)

W: Khối lượng mẫu (g)

Cyclohexan và isobutanol

Xác định bằng sắc ký khí lỏng (xem Quyển 4) sử dụng các điều kiện sau:

Hoá chất, thuốc thử:

- Dimethylformamid (tinh khiết dùng cho GLC)

- Cyclohexan (dùng cho quang phổ UV)

- Isobutanol (dùng cho phân tích)

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch gốc cyclohexan và isobutanol trong dimethylformamid bằng cách dùng pipet lấy 130ml cyclohexan và 125ml isobutanol cho vào dimethylformamid và làm đầy đến thể tích 10 ml.

Từ dung dịch gốc trên pha một loạt các dung dịch chuẩn pha loãng có 5, 10 và 20 mg/kg cyclohexan và isobutanol. Vẽ đường đáp ứng bằng cách bơm 5ml các dung dịch chuẩn đã pha loãng vào thiết bị sắc ký khí với các điều kiện sau.

Chuẩn bị mẫu thử:

Cân 5 g mẫu chính xác đến 10 mg cho vào bình có nắp đậy thuỷ tinh, thêm vào 5 g dimethylformamid và làm ấm để hoà tan. Làm nguội và bơm 5ml vào thiết bị sắc ký khí với các điều kiện sau.

Cột:

- Dài: 3m

- Đường kính trong: 4,5 mm

- Chất liệu: thép không rỉ

- Chất nhồi: 20% carbowax 20 M trên Chromosorb G 60/80

Khí mang: heli (áp suất 1,6 bar)

Detector: ion hoá ngọn lửa

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 130⁰C

- Cột: 130⁰C

- Detector: 200⁰C

Xác định nồng độ cyclohexan và isobutanol trong dung dịch mẫu (50%) bằng cách so sánh với các dung dịch chuẩn và nhân nồng độ với 2 để chuyển các kết quả cho phù hợp với sucroglycerid gốc.

Isopropanol và ethyl acetat

Xác định bằng sắc ký khí (xem Quyển 4) có buồng lấy mẫu không gian hơi sử dụng các điều kiện sau:

Hoá chất, thuốc thử:

- Isopropanol

- Ethyl acetat

Dung dịch chuẩn:

Lấy 1 g mỗi loại isopropanol và ethyl acetat vào một bình định mức và thêm nước cho đến khi đạt thể tích 100 ml, và pha loãng dung dịch này để được các dung dịch có nồng độ 0,02 – 0,4 g/100 ml.

Nếu cần, chuẩn bị các dung dịch chuẩn chứa tới 7 g/100 ml isopropanol và ethyl acetat.

Cách tiến hành:

Cân 1 g chính xác đến 0,1 g bột mẫu cho vào lọ mẫu. Thêm 5ml nước vào lọ mẫu và nắp kín nhanh bằng septum. Để lọ mẫu vào thiết bị sắc ký khí đã đặt trước chương trình và bắt đầu phân tích theo các điều kiện đề cập dưới đây.

Đường chuẩn:

Lấy 1 g bột ester của sucrose với các acid béo, không chứa dung môi hoặc các dung môi tồn dư đã biết, cho vào lọ mẫu, thêm 5ml dung dịch chuẩn và đậy kín bằng septum. Để lọ mẫu vào thiết bị sắc ký khí đã đặt trước chương trình và bắt đầu phân tích theo các điều kiện đề cập dưới đây và vẽ được đường chuẩn của mỗi dung môi.

Cột:

- Dài: 30 m

- Đường kính trong: 0,53 mm

- Chất liệu: mao quản silica

- Fim mỏng: 100% methyl polysiloxan

- Luyện cột: Gia nhiệt tới 60⁰C trong 2 – 3 giờ với tốc độ khí nitrogen khoảng 10 ml/phút.

Khí mang: nitrogen

Tốc độ dòng: 5 ml/phút

Detector: ion hoá ngọn lửa

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 110⁰C

- Cột: 40⁰C.

- Detector: 110⁰C

Buồng không gian hơi:

- Lượng mẫu: 1 g ± 0,1 g + 5ml

- Nhiệt độ gia nhiệt mẫu: 80⁰C

- Thời gian gia nhiệt mẫu: 40 phút

- Nhiệt độ syringe: 85⁰C

- Thể tích mẫu dạng hơi: 0,4 ml

Kết quả: được tính theo công thức:

Trong đó:

C_i: Nồng độ dung môi i (mg/kg);

A_i: Diện tích pic dung môi i (mv.giây.);

Cf_i: Hệ số chuyển đổi dung môi i (độ dốc của đường chuẩn) (mg/mv.giây).

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

6.2. Định lượng

Xác định bằng sắc ký lỏng cao áp (xem Quyển 4) sử dụng các điều kiện sau:

Chuẩn bị mẫu:

Cân chính xác 250 mg mẫu cho vào bình định mức 50 ml. Pha tới thể tích 50 ml bằng tetrahydrofuran và lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,5mm.

Cách tiến hành:

Bơm 100ml mẫu vào thiết bị sắc ký lỏng cao áp đã ổn định trước.

Các điều kiện sắc ký:

Cột: Styren-divinylbenzen copolymer đối với sắc ký thẩm thấu qua gel (TSK-GEL G2000 (Supelco) hoặc tương đương)

Pha động: tetrahydrofuran dùng cho HPLC đã đuổi khí

Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút

Detector: RI (chỉ số khúc xạ)

Nhiệt độ:

- Cột: 38⁰C.

- Detector: 38⁰C

Ghi sắc ký đồ trong khoảng 90 phút.

Tính % ester sucrose trong mẫu:

% ester sucrose = 100 A/T

Trong đó:

A: Tổng các diện tích pic đối với 3 thành phần chính, mono-, di- và tri-ester, rửa giải lần lượt ở khoảng 65, 68 và 73 phút.

T: Tổng diện tích tất cả các pic rửa giải trong khoảng 90 phút

Phụ lục:

Bộ dụng cụ thuỷ phân:

                  a: Sinh hàn ngược

                  b: SInh hàn

                  c: Bình đáy tròn

                  d: Chậu nước

                  e: Bình tam giác

PHỤ LỤC 6

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI ESTER CỦA POLYGLYCEROL VỚI CÁC ACID BÉO

1. Tên khác, chỉ số

Polyglycerol fatty acid esters, glyceryl fatty acid esters;

INS 475

2. Định nghĩa

Là các ester một phần hỗn hợp được tạo thành bằng phản ứng glycerol đã polymer hóa với mỡ và dầu ăn, hoặc với acid béo; có thể chứa một lượng nhỏ mono-, di- và triglyceride, glycerol tự do và polyglycerol, acid béo tự do và muối natri của các acid béo; độ polymer hóa có thể thay đổi và được chỉ ra bằng một con số (thí dụ là tri-, 3), đó là số trung bình nhóm (gốc) glycerol tính cho 1 phân tử polyglycerol. Một polyglycerol nhất định bao gồm một sự phân bố các mảnh phân tử đặc trưng cho độ polymer hóa danh định của nó. Bằng cách thay đổi tỷ lệ cũng như bản chất các chất béo hoặc acid béo phản ứng với polyglycerol, người ta thu được một nhóm lớn và đa dạng các sản phẩm ester này;

Các sản phẩm ester thương mại còn được đặc trưng với 1 số chỉ tiêu khác như chỉ số xà phòng hóa, điểm đông đặc của acid béo tự do, chỉ số iod, chỉ số hydroxyl và hàm lượng tro.

 Công thức cấu tạo

Trong đó giá trị trung bình của n khoảng là 3 và mỗi R₁, R₂, R₃ có thể là của acid béo hoặc hydro.

3. Cảm quan

Dạng lỏng như dầu tới rất nhớt, có màu vàng sáng đến hổ phách; chất dẻo hoặc nhựa có màu vàng nhạt đến màu nâu; chất rắn hoặc chất sáp có màu vàng nhạt đến màu nâu.

4. Chức năng

Chất nhũ hoá

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Từ rất ưa nước tới rất ưa dầu, nhưng là một loại chất có xu hướng phân tán trong nước và hòa tan trong dung môi hữu cơ và các loại dầu.

Acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của acid béo.

Glycerol và polyglycerol

Phải có phản ứng đặc trưng của glycerol và polyglycerol.

5.2. Độ tinh khiết

Acid

Không phát hiện được acid nào ngoài acid béo.

Polyglycerol

Phần polyglycerol gồm có không nhỏ hơn 70% di-, tri-, tetraglycerol và phải có không quá 10% polyglycerol bằng hoặc cao hơn heptaglycerol.

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Glycerol và polyglycerol

Chấm 5 – 20ml lớp dung dịch nước thu được trong phép thử acid béo Phép thử định tính các nhóm chức dọc theo các chấm đối chứng glycerol trên giấy Whatman số 3 và triển khai sắc ký đi xuống trong 36 giờ với hệ dung môi isopropanol: nước (90:10 ). Vết glycerol di chuyển được 40 cm và tiếp sau là các polyglycerol được phát hiện lần lượt phía dưới sau glycerol khi giấy được phun hoặc permanganat trong aceton hoặc bạc nitrat trong amoniac.

6.2. Độ tinh khiết

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

PHỤ LỤC 7

 YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI STEARYL CITRAT

1. Tên khác, chỉ số

INS 484

ADI = 0 - 50 mg/kgthể trọng, được thiết lập tại kỳ họp lần thứ 17 của JECFA (1973).

2. Định nghĩa

Được tổng hợp bằng cách ester hóa acid citric với cồn stearylic thương mại, có thể chứa n-octadecanol và đến 50% n-hexadecanol và đạt được các yêu cầu dưới đây.

Chế phẩm thương mại có thể được phân loại theo chỉ số xà phòng hóa; hàm lượng và thành phần của cồn stearylic; chỉ số iod; chỉ số acid và hàm lượng acid citric.

Công thức cấu tạo

Thành phần gần đúng

Trong đó R₁, R₂ và R₃ lần lượt có thể là C₁₈H₃₇ (stearyl), C₁₆H₃₃ (palmityl) hoặc H

3. Mô tả

Hợp chất nhờn, màu kem.

4. Chức năng

Chất tạo phức kim loại, chất nhũ hóa.

5. Tính chất

5.1. Định tính

Độ tan

Không tan trong nước và trong ethanol lạnh, tan trong ethanol nóng.

Cồn stearylic

Phải có phản ứng đặc trưng của cồn stearylic.

Citrat 

Phải có phản ứng đặc trưng của citrat.

5.2. Độ tinh khiết

Các acid khắc và rượu khác

Không được có các acid khác ngoài acid citric và các rượu khác ngoài các rượu có mặt trong chế phẩm cồn stearylic thương mại.

Chất không tan trong cloroform

Không được quá 0,5% (mô tả trong phần Phương pháp thử).

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Cồn stearylic

Thủy phân 2 g mẫu thử bằng cách đun hồi lưu trong 1 giờ với 50 ml dung dịch natri hydroxyd (TS) thu được dung dịch nước. Làm mát và chiết với ether dầu hỏa. Lấy lớp ether dầu hỏa và cho bay hơi trên đĩa sứ hoặc thủy tinh. Phần không bay hơi phải có khoảng nóng chảy từ 43^o đến 58^o.

Citrat 

Lấy 5 ml dung dịch nước thu được trong phép thử cồn stearylic, thêm 1 ml dung dịch calci clorid (TS) và 3 giọt dung dịch xanh da trời bromothymol (TS), acid hóa nhẹ bằng dung dịch acid hydrocloric loãng (TS). Thêm dung dịch natri hydroxyd (TS) đến khi dung dịch chuyển thành màu xanh da trời sáng, sau đó đun sôi dung dịch trong 3 phút, lắc nhẹ trong khi đun. Trong dung dịch xuất hiện kết tủa trắng, kết tủa này không tan trong dung dịch natri hydroxyd (TS) nhưng tan trong dung dịch acid acetic (TS).

Lấy 10 ml dung dịch nước thu được trong phép thử cồn stearylic, thêm 1 ml dung dịch thủy ngân (II) sulfat (TS). Đun sôi hỗn hợp và thêm vài giọt dung dịch kali permanganat (TS). Trong dung dịch xuất hiện kết tủa trắng là muối thủy ngân của acid aceton dicarboxylic.

6.2. Độ tinh khiết

Chất không tan trong cloroform

Hòa tan khoảng 50g (cân chính xác đến mg) mẫu trong 400 ml cloroform. Lọc dung dịch qua phễu lọc thủy tinh xốp số 3 đã cân bì (chính xác đến mg). Giữ phễu lọc còn ấm, rửa phần không tan bằng cloroform, sau đó sấy khô tại 100^o.

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

PHỤ LỤC 8

 YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI TRIKALI ortho-PHOSPHAT

1. Tên khác, chỉ số

Tripotassium phosphate; Tribasic potassium phosphate; Potassium phosphate.

INS 340iii

MTDI=70mg/kg thể trọng tính theo Phospho từ các nguồn thực phẩm

2. Định nghĩa

Tên hóa học

Trikali phosphat; Trikali orthophosphat; Trikali monophosphat

Chỉ số C.A.S.

7778-53-2

Công thức hóa học

Dạng khan: K₃PO₄

Dạng hydrat: K₃PO₄.xH₂O

Khối lượng phân tử

212,27 (dạng khan)

3. Cảm quan

Dạng tinh thể hoặc hạt không màu hoặc màu trắng, không mùi; dạng hydrat gồm monohydrat và trihydrat

4. Chức năng

Đệm, chất nhũ hóa, chất tạo phức kim loại

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Dễ tan trong nước, không tan trong ethanol.

pH

11,5 - 12,5 (dung dịch 1/100).

Kali

Phải có phản ứng đặc trưng của kali.

Phosphat

Phải có phản ứng đặc trưng của phosphat.

ortho-phosphat

Phải có phản ứng đặc trưng của ortho-phosphat.

5.2. Độ tinh khiết

Giảm khối lượng khi nung

Dạng khan: Không được quá 3% (120^oC trong 2 giờ, sau đó 800⁰C trong 30 phút)

Dạng hydrat: Không được quá 23% (120^oC trong 2 giờ, sau đó 800^oC trong 30 phút)

Các chất không tan trong nước

Không được quá 0,2%.

Fluorid

Không được quá 10,0 mg/kg.

Arsen

Không được quá 3,0 mg/kg (thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4 - phương pháp II).

Chì

Không được quá 4,0 mg/kg.

5.3. Hàm lượngK₃PO₄

Không được thấp hơn 97,0% sau khi nung

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Kali

Thêm 1 thể tích dung dịch natri hydrogen tartrat bão hòa và 1 thể tích dung dịch ethanol vào dung dịch mẫu thử (1/100) và lắc. Trong dung dịch phải xuất hiện kết tủa tinh thể trắng.

Phosphat

Thêm 1ml dung dịch acid nitric và 5ml dung dịch nhôm molybdat (TS) vào 5ml dung dịch mẫu thử (1/100) và đun nóng. Trong dung dịch phải xuất hiện kết quả vàng nhạt.

ortho-phosphat

Hòa tan 0,1g mẫu thử trong 10ml nước cất, acid hóa nhẹ dung dịch bằng acid acetic loãng (TS) và thêm 1ml bạc nitrat (TS). Trong dung dịch phải xuất hiện kết tủa màu vàng

6.2. Độ tinh khiết

Fluorid

Cân 5 g mẫu thử cho vào một bình cầu cất 250 ml, thêm 25 ml nước, 50 ml acid percloric, 5 giọt dung dịch bạc nitrat (1 trong 2) và vài viên bi thủy tinh. Nối bình cầu với 1 sinh hàn có gắn nhiệt kế và một ống mao quản sục khí, đầu nhiệt kế và ống mao quản phải ngập trong dung dịch chứa trong bình. Gắn một phễu nhỏ giọt chứa nước hoặc bộ sinh hơi nước vào ống mao quản. Đặt bình trên tấm amiăng có lỗ sao cho 1/3 đáy bình tiếp xúc với ngọn lửa. Tiến hành cất đến khi nhiệt độ trong bình đạt 135^o. Thêm nước từ phễu vào bình hoặc cho hơi nước qua bình để duy trì nhiệt độ trong bình luôn đạt 135^o-140^o. Tiếp tục cất đến khi thu được 225-240 ml dịch cất sau đó pha loãng dịch cất thu được với nước đến đủ 250 ml, lắc đều. Lấy 50 ml dung dịch này cho vào một ống Nessler 100 ml. Trong một ống Nessler tương tự khác lấy 50 ml làm mẫu chứng. Thêm vào mỗi ống 0,1 ml dung dịch natri alizarinsulfonat (nồng độ 1/4000) đã lọc và 1 ml dung dịch hydroxylamin (nồng độ 1/4000) mới pha, lắc đều. Thêm từng giọt dung dịch natri hydroxyd 0,05 N vào ống chứa dịch cất, vừa thêm vừa khuấy, đến khi màu ống chứa dịch cất giống với màu ống chứng là màu hồng nhạt. Sau đó thêm vào mỗi ống ống chính xác 1 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 N và lắc đều. Sử dụng buret chia vạch 0,05 ml thêm từ từ vừa đủ dung dịch thori nitrat (nồng độ 1/4000) vào ống chứa dịch cất để sau khi lắc đều màu của dung dịch chuyển về màu hồng nhạt. Ghi thể tích dung dịch thori nitrat (nồng độ 1/4000) đã sử dụng, thêm chính xác lượng dung dịch thori nitrat (nồng độ 1/4000) như vậy vào ống chứng, lắc đều. Dùng buret thêm dung dịch natri fluorid (TS) (10 µg F / ml) vào ống chứng để cho màu hai ống giống nhau sau khi pha loãng về cùng thể tích. Lắc đều, để yên cho bọt khí thoát hết trước khi so màu. Kiểm tra điểm tương đương bằng cách thêm 1-2 giọt dung dịch natri fluorid (TS) vào ống chứng. Sự thay đổi màu rõ rệt sẽ xảy ra. Ghi lại thể tích dung dịch natri fluorid (TS) đã sử dụng.

Thể tích dung dịch natri fluorid (TS) sử dụng không được quá 1 ml.

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

6.3. Định lượng

Cân mẫu thử (chính xác đến mg), khối lượng tương đương với 8g K₃PO₄ khan, hòa tan vào trong 40 ml nước cất trong cốc 400ml. Thêm 100ml dung dịch acid hydrocloric 1N. Sục không khí đã khử carbon dioxyd vào dung dịch, chỉ sao cho bọt khí nhỏ, thời gian sục 30 phút để đuổi hết carbon dioxyd, đậy nhẹ cốc để tránh mất dung dịch trong khi sục. Rửa nắp và thành cốc bằng nước cất và cho điện cực của pH kế thích hợp vào dung dịch. Chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch natri hydroxyd 1N đến điểm uốn tại pH~4, sau đó tính thể tích (A) dung dịch acid hydrocloric 1N đã sử dụng. Bảo vệ dung dịch để tránh hấp thụ carbon dioxyd từ không khí và tiếp tục chuẩn độ với dung dịch natri hydroxyd 1N đến điểm uốn tại pH~8,8. Tính thể tích (B) dung dịch  natri hydroxyd 1N đã tiêu tốn trong chuẩn độ này.

Nếu (A)³2(B), mỗi ml natri hydroxyd 1N trong thể tích (B) tương đương với 212,3mg K₃PO_4.

Nếu (A) < 2(B), mỗi ml natri hydroxyd 1N trong hiệu thể tích (A)-(B) tương đương với 212,3mg K₃PO_4.

PHỤ LỤC 9

 YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI CÁC MUỐI AMONI CỦA ACID PHOSPHATIDIC

1. Tên khác, chỉ số

Ammonium phosphatides, Emulsifier YN, Mixed ammonium salts of phosphorylated glycerides;

INS 442

ADI = 0 -30 mg/kg thể trọng

2. Định nghĩa

Chếphẩm này chủ yếu gồm hỗn hợp các hợp chất amoni của các acid phosphatidic bắt nguồn từ chất béo ăn được (thường là dầu hạt cải hydrogen hóa một phần). Là một mono- hoặc diglycerid có thể được gắn phosphor. Tuy nhiên,  hai ester phosphor có thể liên kết với nhau ở dạng phosphatidyl phosphatid. Chế phẩm được sản xuất bằng cách phân hủy chất béo bằng glyceryl, sau đó phosphoryl hóa bằng phosphor pentoxyd, và trung tính hóa bằng  amoniac.

Chế phẩm thương mại có thể có quy định thêm những chi tiết cụ thể như hàm lượng nước, tạp chất không tan trong hexan, chất vô cơ không tan trong hexan, giá trị pH và hàm lượng triglycerid.

Công thức cấu tạo

(thành phần gần đúng)

Trongđó R có thể là một gốc mono- hoặc di-glycerid

3. Cảm quan

Chấtnửa rắn trơn nhờn.

4. Chức năng

Chất nhũ hóa

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Khôngtan trong nước, tan một phần trongethanol và aceton; tan trong chất béo.

Phosphat

Phải có phản ứng đặc trưng của phosphat.

Acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của acid béo.

Glyceryl

Phải có phản ứng đặc trưng của glyceryl.

5.2. Độ tinh khiết

Chì

Khôngđược quá 2,0 mg/kg.

5.3. Hàm lượng

Hàm lượng phosphor không được nhỏ hơn 3,0% và không lớn hơn 3,4% theo khối lượng; hàm lượng nitrogen amoni không được nhỏ hơn 1,2% và không lớn hơn 1,5%.

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Phosphat

Nung 1 g mẫu thử với 2 g natri carbonat khan. Để nguội và hòa tan cắn trong 5 ml nước và 5 ml acid nitric. Thêm 5 ml amoni molybdat (TS) và đun tới sôi. Xuất hiện kết tủa màu vàng.

Acid béo

Đun hồi lưu 1 g chế phẩm thử trong 1 giờ với 25 ml  kali hydroxyd 0,5 N trong ethanol. Amoniac bay ra từ phía đầu của ống sinh hàn hồi lưu, nhận ra bằng mùi của nó và phản ứng trên giấy quì đỏ ẩm. Làm lạnh cắn tới 0^oC, tủa xà phòng kali tạo thành.

6.2. Độ tinh khiết

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

6.3. Định lượng

Phosphor

Phương pháp quang phổ hấp thụ

Thuốc thử và dung dịch làm việc

Acid sulfuric: tỷ trọng tương đối 1,84

Acid nitric: tỷ trọng tương đối 1,42

Acid perchloric: 60%, tỷ trọng tương đối 1,54

Dung dịch vanadat-molybdat: Hòa tan riêng trong nước 20 g amoni molybdat và 1 g amoni vanadat. Trộn hai dung dịch, thêm 140 ml acid nitric đặc và pha loãng tới 1000 ml bằng nước. Lắc đều.

Dung dịchphosphat chuẩn: Dung dịch gốc: Hòa tan 3,8346 g kali dihydro phosphat, đã làm khô ở 110ºC, vào trong nước và pha loãng tới 1000 ml; 1 ml dung dịch này = 2,0 mg P₂O₅.

Dung dịch chuẩn làm việc phosphat: Chuyển 50,0 ml dung dịch phosphat chuẩn (1ml = 2,0 mg P₂O₅) vào bình định mức 500 ml và pha loãng tới vạch bằng nước và lắc đều. 1 ml dung dịch chuẩn làm việc phosphat = 0,2 mg P₂O₅.

Tiến hành

Cân chính xác 1,5 tới 1,6 g mẫu thử vào một bát thủy tinh nhỏ và cho vào trong bình Kjeldahl 300-ml chứa  5 ml acid sulfuric và 10 ml acid nitric. Đun nóng bình, đầu tiên đun nhẹ và lắc liên tục, sau đó đun mạnh hơn trên ngọn lửa trần. Thêm nhiều lần tại các thời điểm khác nhau mỗi lần một lượng acid nitric, làm nguội bình trước khi thêm, và tiếp tục đun tới khi thu được dịch phân hủy trong và có màu vàng kim. Để nguội, thêm 5 ml acid percloric 60% và tiếp tục oxy hóa tới khi tạo thành khói acid trắng trong bình. Lại làm nguội và thêm 5 ml nước và tiếp tục đun tới khi hết khói trắng bay lên. Để nguội, pha loãng cẩn thận bằng nước, lại để nguội và chuyển toàn lượng sang bình định mức 500-ml. Pha loãng tới vạch bằng nước và lắc đều (Dung dịch thử).

Làm một mẫu trắng phân hủy đúng theo cách như trên nhưng không cho mẫu thử và sử dụng cùng thể tích acid như đã dùng để vô cơ hóa ướt mẫu thử (Dung dịch trắng phân hủy).

Cho vào các bình định mức 100-ml riêng, thêm từ buret:

(a) 25,0 ml dung dịch chuẩn làm việc phosphat (= 5,0 mg P₂O₅),

(b) 30,0 ml dung dịch chuẩn làm việc phosphat (= 6,0 mg P₂O₅),

(c) 25 ml dung dịch thử chứa từ 5 đến 6 mg P₂O₅

Cho vào mỗi bình chứa phosphor chuẩn, (a) và (b), một lượng dung dịch trắng phân hủy có cùng thể tích như dung dịch cho vào (c), để bù đối với vết phosphor có thể có do thuốc thử phân hủy acid mà nó có thể có trong dung dịch thử.

Cho vào mỗi bình 25 ml thuốc thử vanadat-molybdat, lắc đều, pha loãng bằng nước tới gần 100 ml, lắc đều, điều chỉnh nhiệt độ của dung dịch tới 20ºC, pha loãng tới vạch bằng nước và lắc đều.

Sau 10 phút, đo độ hấp thụ của cả dung dịch 6 mg P₂O₅ và dung dịch thử, mẫu trắng là dung dịch chứa 5 mg chất chuẩn. Dùng cốc đo 1 cm và đo ở bước sóng 420 nm, hoặc kính lọc Ilford 604 nếu dùng máy so màu quang điện.

Tính toán

Trong đó:

A_t = hiệu độ hấp thụ giữa chuẩn 5 mg và dung dịch thử

A_{6 mg} = hiệu độ hấp thụ giữa chuẩn 6 mg và 5 mg

m = khối lượng mẫu thử (g)

Xác định nitrogen amoni

Thiết bị cất kéo hơi nước

Thiết bị gồm một bình 2-L đậy nút cao su, lắp xuyên qua nút có một ống thủy tinh khoảng 7,5 cm, được lắp sao cho đầu dưới của ống gần sát đáy bình, và một đoạn ống hình chữ L ngắn hơn lắp sao cho ống chĩa ngang khoảng 6 mm bên dưới bề mặt của nút, để hoạt động như ống ra của luồng hơi nước. Bình được thêm nước cất đã acid hóa nhẹ bằng acid sulfuric loãng (TS) tới khoảng 2/3 thể tích bình và vài mảnh thủy tinh xốp để tránh trào khi hỗn hợp trong bình sôi mạnh. Bình này dùng làm nguồn cung cấp hơi nước. Có thể lắp một vòi vào bình nếu muốn dễ dàng bổ sung nước vào bình giữa các lần xác định.

Ống ra của hơi được nối qua một bẫy ngưng tới đầu vào của đầu cất hơi, nối vào một bình cầu đáy tròn cổ ngắn 1-L cổ bình cỡ B34. Đầu cất phải sao cho ống đầu vào của hơi gần chạm đáy bình 1-L và đầu ra phải nối với  hai bẫy tránh bắn, một gần đỉnh của bình 1-L và cái kia gần đỉnh của một sinh hàn thẳng đứng, nối cỡ B19, nối với đầu cất. Sinh hàn thẳng phải lắp với ống đầu ra kéo dài, chạm tới đáy của một bình nón 500-ml.

Thuốc thử

Dung dịch acid boric 2% (kl/tt) trong nước

Dung dịch natri hydroxyd 40% (kl/tt) trong nước

Acid hydrocloric 0,02 N

Hỗn hợp chỉ thị: Trộn 5,0 ml dung dịch xanh lục bromocresol 0,1% (kl/tt) trong alcol và 2,0 ml dung dịch đỏ methyl 0,1% (kl/tt) trong alcol và pha loãng tới 30 ml bằng alcol 95%.

Dịch silicon 200/50 MS

Tiến hành

Lắp và cho hơi nước đi qua thiết bị. Cân chính xác khoảng 0,2 g mẫu thử muối amoni của acid phosphatidic trung tính vào trong một lọ thủy tinh nhỏ (đường kính khoảng 18 mm, sâu khoảng 12 mm). Chuyển lọ và mẫu thử đã cân vào bình cất và thêm khoảng 250 ml nước cất. Nối đầu cất và bẫy chống bắn với bình cất và sinh hàn đứng, lắp sinh hàn sao cho đầu ra ngập dưới bề mặt của 10 ml acid boric 2% và 1 ml hỗn hợp chỉ thị đựng trong bình nón 500-ml.

Thêm vào bình cất qua phễu gắn bằng một ống cao su gắn vào ống dẫn hơi nước vào, 75 ml natri hydroxyd 40%, và rửa vào trong bằng nước cất. Bỏ phễu và nối ống vào của hơi với nguồn cung cấp hơi. (Có thể cho natri hydroxyd vào bình qua phễu có khóa, lắp với bình cất nếu muốn và rửa phía trong bằng nước cất. Nếu làm như vậy phải duy trì một lớp chất lỏng trên phễu trong suốt quá trình thêm và cất). Cất kéo mạnh bằng hơi nước hỗn hợp trong bình cất và thu lấy 200 ml dịch cất vào trong acid boric. Trong quá trình cất khuấy nhẹ bình cất nếu cần, để tránh mẫu thử bị lắng đọng xung quanh bề mặt phía trên của bình. Khi đã thu đủ lượng dịch cất theo yêu cầu, hạ thấp bình hứng, ngừng cung cấp hơi nước và rửa phía trong của sinh hàn và bên ngoài đầu phía dưới với một lượng nhỏ nước cất, gộp dịch rửa vào bình hứng. 

Chuẩn độ hỗn hợp trong bình hứng bằng acid hydrocloric 0,02 N. Làm ít nhất một mẫu trắng tiến hành theo cùng cách nhưng không có mẫu thử.

Trong quá trình cất có thể có bọt xuất hiện của hỗn hợp trong bình cất. Nếu có, thêm 2 giọt dịch silicon vào bình cất tại thời điểm cho mẫu thử; và một lượng tương tự được cho vào mẫu trắng.

Tính toán

Mỗi ml HCl 0,02 N = 0,2802 mg nitrogen.

Trong đó

V_t = thể tích dung dịch HCl 0,02 N dùng chuẩn độ mẫu thử (ml)

V_o = thể tích dung dịch HCl 0,02 N dùng chuẩn độ mẫu trắng (ml)

m_t = khối lượng mẫu thử (mg).

PHỤ LỤC 10

 YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI SUCROSE ACETAT ISOBUTYRAT

1. Tên khác, chỉ số

SAIB

INS 444

2. Định nghĩa

Hỗn hợp được tạo thành bằng cách este hóa sucrose thực phẩm với anhydrid acetic và anhydrid isobutyric và chưng cất. Hỗn hợp bao gồm tất cả các este với tỷ lệ phân tử của acetat và isobutyrat là khoảng 2:6

Tên hóa học

Sucrose diacetat hexaisobutyrat

Chỉ số C.A.S

137204-24-1; 27216-37-1; 126-13-6

Công thức hóa học

C₄₀H₆₂O₁₉ đối với sucrose diacetat hexaisobutyrat

Công thức cấu tạo

Trong đó

R₁ = -CH₂OCOCH₃

R₂ = -CH₂OCOCH(CH₃)₂, hoặc -OCOCH(CH₃)₂ 

Khối lượng phân tử

832 – 856

C₄₀H₆₂O₁₉ = 846,9

3. Cảm quan

Dạng lỏng màu vàng nhạt, không cặn và có mùi nhẹ

4. Chức năng

Chất nhũ hóa, chất điều chỉnh độ đậm đặc, chất tạo đục đối với đồ uống không cồn

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Khôngtan trong nước, tan trong hầu hết dung môi hữu cơ.

Chỉ số khúc xạ

n (40, D): 1,4492 – 1,4504

Khối lượng riêng

d (25, 25): 1,141 – 1,151

Hấp thụ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại của mẫu thử phân tán trong kali bromid tương ứng với phổ hồng ngoại chuẩn trong Phụ lục.

5.2. Độ tinh khiết

Chỉ số acid

Khôngđược quá 0,2 (sử dụng 50 g mẫu thử).

Chỉ số xà phòng hóa

Giữa 524 và 540 (sử dụng 1 g mẫu thử)

Triacetin

Không được quá 0,1%.

Chì

Không được quá 2 mg/kg.

5.3. Hàm lượngC₄₀H₆₂O₁₉

Không được nhỏ hơn 98,8% và không được quá 101,9%.

6. Phương pháp thử

6.1. Độ tinh khiết

Triacetin

Sử dụng phương pháp sắc kí khí như sau:

Dụng cụ, thiết bị:

Máy sắc ký khí được trang bị detector ion hóa ngọn lửa

Cột: thép không rỉ, dài 1,5 m, đường kính trong là 3,2 mm.

Chuẩn bị mẫu:

Pha loãng mẫu thử bằng cách cho thêm một thể tích carbon disulfid tương đương.

Điều kiện:

Pha tĩnh: SE-30, 3%

Pha rắn: Chromosorb AW-DMCS, 80-100 mesh

Khí mang: Heli

Tốc độ khí: 20 ml/min

Nhiệt độ

- Cột: Chương trình nhiệt độ: ngay sau khi bơm mẫu, nhiệt độ  cột tăng từ 100⁰ (lên đến 300⁰C, tốc độ tăng 10⁰C/phút. 

- Nhiệt độ buồng bơm: 300⁰C

  Thể tích bơm mẫu: 1 µl

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

6.2. Định lượng

Sử dụng chỉ số xà phòng hóa, tính % C₄₀H₆₂O₁₉ theo công thức:

 Trong đó

SV = chỉ số xà phòng hóa

Phổ hồng ngoại

Sucrose acetat isobutyrat

PHỤ LỤC 11

 YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI ESTER CỦA GLYCEROL VỚI NHỰA CÂY

1. Tên khác, chỉ số

Ester gum;

INS 445

2. Định nghĩa

Ester phức hợp của triglycerol và diglycerol với các acid từ nhựa gỗ thông thu được nhờ quá trình trích ly gốc cây thông lâu năm bằng dung môi sau đó được tinh chế trong hệ dung môi lỏng-lỏng. Loại trừ khỏi các yêu cầu kỹ thuật này là các dẫn xuất của gum nhựa, dịch tiết ra từ cây thông sống, nhựa dầu thông cao và sản phẩm phụ của quá trình sản xuất bột giấy. Sản phẩm cuối cùng gồm có 90% acid nhựa và 10% chất trung tính (chất không acid). Phần acid nhựa là một phức hợp của các đồng phân acid monocarboxylic diterpenoid có công thức thực nghiệm điển hình là C₂₀H₃₀O₂, trong đó thành phần chính là acid abietic. Glycerol ester của nhựa gỗ thông được tinh chế bằng phương pháp bốc hơi nước hoặc chưng cất ngược dòng.

Mã số C.A.S.

8050-30-4

3. Cảm quan

Chất rắn màu vàng đến màu hổ phách nhạt

4. Chức năng

Thành phần base trong kẹo cao su, chất nhũ hoá, chất ổn định, chất độn, chất điều chỉnh hương liệu trong đồ uống

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Không tan trong nước, tan trong aceton

Hấp thụ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại của lớp mỏng mẫu được đặt trên tấm kali bromid tương ứng với phổ hồng ngoại điển hình dưới đây

Alcol nhựa và glycerol nhựa

Phải có phản ứng đặc trưng của alcol nhựa và glycerol nhựa.

5.2. Độ tinh khiết

Không có mặt nhựa dầu cao (Lưu huỳnh)

Đạt yêu cầu (mô tả trong phần phương pháp thử).

Tỷ trọng

d (20, 25) : Không được nhỏ hơn 0,935 khi xác định trong dung dịch 50% trong d-limonen (97%, điểm sôi 175,5 - 176,0⁰C, d (20, 4) : 0,84)

Điểm nóng chảy

82 – 90⁰C (mô trả trong phần Phương pháp thử)

Chỉ số acid

3 – 9

Chỉ số hydroxyl

15 – 45 (mô trả trong phần Phương pháp thử )

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Alcol nhựa và glycerol nhựa

Các nhóm ester phức tạp trong ester của glycerol nhựa gỗ thông được khử bằng phản ứng với một hydrid kim loại (natri bis (2-methoxy-ethoxy) nhôm dihydrid) trong dung dịch toluen để tạo thành một hỗn hợp của alcol nhựa và glycerol nhựa. Chất khử dư sau đó được thuỷ phân bằng dung dịch acid tạo thành hai pha. Sắc ký khí của pha toluen tạo ra một sắc ký đồ của alcol nhựa cấu thành ester nhựa gỗ thông và có thể phân biệt với các ester gum và ester nhựa dầu cao. Nhựa gỗ có thể phân biệt được với nhựa dầu cao dựa vào tỷ lệ của abietyl và dehydroabietyl alcol: trong nhựa gỗ abietyl chiếm ưu thế, trong khi nhựa dầu cao, dehydroabietyl chiếm ưu thế.  Nhựa gỗ có thể phân biệt được với gum rosin dựa vào tỷ lệ của isopimaryl và palustryl alcol: trong nhựa gỗ isopimaryl chiếm ưu thế, trong khi gum rosin, palustryl chiếm ưu thế. Sắc ký của pha trung tính trong nước trên cột khác kiểm tra sự xuất hiện của glycerol.

Thiết bị, dụng cụ:

- Sắc ký khí được trang bị detector ion hoá ngọn lửa

- Cột sắc ký I:Column I: DB-1 methyl silicon (ngoại quan và liên kết chéo), cột mao quản dài 15 m, đường kính trong 0,53 mm, dày 1,5μm, dải nhiệt độ 60 - 300/320⁰C (Ví dụ: J & W Scientific Inc,. Cat. No. 125-1012). Có đường dẫn bơm hơi nhanh, trực tiếp.

- Cột sắc ký II: : DB-Wax polyethyleneglycol (ngoại quan và liên kết chéo), cột mao quản dài 15 m, đường kính trong 0,53 mm, dày 1,0μm, dải nhiệt độ 20 - 230⁰C (Ví dụ: J & W Scientific Inc,. Cat. No. 125-7012).

- Bộ ghi: 0 – 1V

- Syringe:1μl

- Pipet: 3,0 ml; 5,0 ml

- Bình tam giác: 25 ml

- Lọ: 17 ml

- Cân phân tích: cân chính xác đến 0,001 g

- Ống li tâm có vạch định mức: 15 ml

- Máy li tâm: có thể đạt tốc độ 3.200 vòng/phút

- Thanh khuấy: được bao bằng Teflon, kích thước 1 inch

- Máy khuấy từ

Hoá chất, thuốc thử:

- Toluen tinh khiết

- Natri Vitride ^TM [ natri bis (2-methoxyethoxy) nhôm dihydrid, thường xấp xỉ 70% trong toluen (khoảng 3,5 mol/l)] (Tập đoàn hoá chấtFluka ., Hauppage, NY,Mỹ). Lấy 10 ml cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Pha đến thể tích 100 ml bằng toluen và lắc đều.

- Dung dịch thuỷ phân: Thêm từ từ 50 ml dung dịch H₂SO₄ đậm đặc, tinh khiết vào 200 ml nước cất đồng thời khuấy trong chậu nước đá.Làm nguội tới nhiệt độ phòng.

- Dung dịch phenolphthalein: 1% trong ethanol.

- Dung dịch NaOH: Hoà tan 16 g NaOH trong 70 – 80 ml nước cất và làm nguội tới nhiệt độ phòng. Pha tới 100 ml bằng nước cất và lắc đều. Để trong bình polyethylen.

- 1, 4- Butandiol: 99%

- Glycerol: 99%

- Dung dịch nội chuẩn: Cân 0,1 g 1, 4- butandiol cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Pha tới thể tích 100 ml bằng nước cất và lắc đều.

- Dung dịch glycerol: Cân 0,1 g 1, 4- butandiol và 0,1 g glycerol cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Pha tới thể tích 100 ml bằng nước cất và lắc đều.

Điều kiện chạy sắc ký khí:

I (alcol nhựa)

Nhiệt độ:

- Cột: 190⁰C, đẳng nhiệt

- Đầu vào: 250⁰C

- Detector: 250⁰C

Tốc độ dòng:

- Khí mang (He): 30 ml/phút tại 63 psi

- H₂: 30 ml/phút

- Không khí: 240 ml/phút

II (glycerol)

Nhiệt độ:

- Cột: đặt theo chương trình, 120 – 200⁰C với tốc độ 6⁰C/phút

- Đầu vào: 250⁰C

- Detector: 250⁰C

Tốc độ dòng:

- Khí mang (He): 30 ml/phút tại 63 psi

- H₂: 30 ml/phút

- Không khí: 240 ml/phút

Cách tiến hành I (đối với nhựa):

Cân 250 – 300 mg mẫu cho vào bình tam giác dung tích 25 ml có thanh khuấy từ. Dùng pipet lấy 5,0 ml toluen cho vào bình và khuấy từ cho đến khi mẫu được hoà tan. Lấy 5,0 ml Natri Vitride^TM cho vào bình, đậy nắp bình và khuấy trong 30 phút. Mở nắp ra đồng thời khuấy, dùng pipet lấy 3,0 ml dung dịch thuỷ phân cho vào bình. Tiếp tục khuấy trong 3 phút. Chuyển hỗn hợp trong bình vào ống li tâm, đậy nắp và lắc đều. Cho thoát khí và li tâm với tốc độ 2.800 – 3.200 vòng/phút trong 5 phút. Bơm 0,5μl lớp trên vào thiết bị sắc ký khí với các điều kiện kỹ thuật đã đặt và ghi sắc ký đồ. So sánh với các sắc ký đồ được biểu thị phía dưới để xác nhận thứ tự thời gian lưu của các alcol nhựa.

Cách tiến hành II (đối với glycerol)

Dung pipet hoặc syringe hypodermic, loại bỏ lớp toluen và một phần dung dịch nước và để lại khoảng 2 ml dung dịch nước trong ống li tâm. Thêm 1 giọt dung dịch phenolphthalein và trung hoà bằng dung dịch NaOH. Các muối nhôm sẽ kết tủa. Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch nội chuẩn cho vào ống, pha đến 15 ml bằng nước cất, đậy nắp, lắc và li tâm với tốc độ 2.800 – 3.200 vòng/phút trong 5 phút. Bơm 1μl dịch trong trên bề mặt vào thiết bị sắc ký khí với các điều kiện kỹ thuật đã đặt và ghi sắc ký đồ.Bơm 1μl dung dịch glycerol và ghi sắc ký đồ. Đo các thời gian lưu của bất kỳ các pic so với 1,4- butandiol. So sánh các thời gian lưu với thời gian lưu của glycerol.

6.2. Độ tinh khiết

Không có nhựa dầu cao (Lưu huỳnh)

Khi các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh được gia nhiệt với sự có mặt của natri format, lưu huỳnh chuyển hoá thành hydrogen sulfid được phát hiện bằng cách sử dụng giấy chì acetat. Phép thử dương tính cho thấy việc sử dụng nhựa dầu cao thay cho nhựa gỗ.

Thiết bị, dụng cụ:

- Ống thử: loại tiêu chuẩn, kích thước 10 x 70 mm, làm bằng thuỷ tinh chịu nhiệt.

- Đèn Bunsen: Thường dùng cỡ nhỏ dạng ngọn lửa nhỏ

Hoá chất, thuốc thử:

- Dung dịch natri format: Hoà tan 20 g natri format tinh khiết (NaOOCH) trong 100 ml nước cất.

- Giấy thử chì acetat: dạng thương mại có sẵn của hầu hết các nhà cung cấp hoá chất

Cách tiến hành:

Cân 40 – 50 mg mẫu cho vào ống thử và thêm 1 -2 giọt dung dịch natri format 20% (khối lượng/thể tích). Để dải giấy thử chì acetat trên miệng ống thử. Gia nhiệt ống thử bằng ngọn lửa cho đến khi khói được hình thành và tiếp xúc với giấy thử. Tiếp tục gia nhiệt trong 2 – 5 phút. Không được có đốm đen của chì sulfid hình thành, nếu có đốm đen thì chứng tỏ sự có mặt của các hợp chất chứa lưu huỳnh. (Giới hạn phát hiện: 50 mg/kg lưu huỳnh).

Điểm nóng chảy

Điểm nóng chảy được định nghĩa là nhiệt độ tại đó một đĩa mẫu được giữ bên trong một chiếc nhẫn nằm ngang giảm xuống một khoảng 25,4 mm dưới trọng lượng của một cầu thép khi mẫu được gia nhiệt với tốc độ qui định trong chậu cách thủy hoặc cách glycerol.

Thiết bị:

Thiết bị được minh hoạ trong Hình 1 và Hình 2 gồm có các bộ phận được mô tả trong các phần dưới đây.

Chiếc nhẫn: được làm bằng đồng thau phù hợp với kích thước trình bày trong Hình 1a. Nếu cần, vòng có thể được gắn bằng cách hàn hoặc cách khác thuận tiện với một dây đồng thau loại 13 B&S (đường kính 0,06 – 0,08 inch hoặc 1,52 – 2,03 mm) được trình bày ở Hình 2a.

Quả cầu: thường dùng quả cầu được làm bằng thép có đường kính 3/8 inch (9,53 mm), khối lượng 3,45 – 3,55 g.

Hướng dẫn chỉnh tâm quả cầu: Hướng dẫn chỉnh tâm quả cầu được làm đồng thau và có hình dạng, kích thước chung được minh họa trong Hình 1c, có thể được sử dụng nếu muốn.

Dụng cụ chứa:

Sử dụng bình thuỷ tinh chịu nhiệt như cốc Griffin dạng lùn dung tích 800 ml, đường kính không được nhỏ hơn 3,34 inch (8,5 cm) và chiều sâu tính từ đáy đến phần loe ra không được nhỏ hơn 5 inch (12,7 cm).

Dụng cụ giữ chiếc nhẫn và nhiệt kế:

Bất kỳ dụng cụ hữu hiệu nào phù hợp với các yêu cầu sau dùng để giữ vòng và nhiệt kế đều có thể được sử dụng: (1) Vòng nhẫn có thể được giữ ở vị trí nằm ngang; (2) khi sử dụng thiết bị mô tả trong Hình 1d, đáy của vòng tròn nằm trên và cách tấm nằm ngang phía dưới 1 inch (25,4 mm), bề mặt đáy của tấm nằm ngang cách ít nhất 0,5 inch (13 mm) và không được quá 0,75 inch (18 mm) so với đáy của dụng cụ chứa ở bên trên, chiều sâu của dịch lỏng trong dụng cụ chứa không được nhỏ hơn 4,0 inch (10,2 cm); (3) khi sử dụng thiết bị đưa ra ở Hình 1e, đáy của vòng tròn cách 1 inch (25,4 mm) so với đáy của dụng cụ chứa ở phía trên, với điểm dưới cùng của thanh nghỉ đặt trên đáy của dụng cụ chứa và chiều sâu của dịch lỏng trong dụng cụ chứa không được nhỏ hơn 4,0 inch (10,2 cm) như mô tả ở Hình 1 a, b và c; (4) trong cả hai dụng cụ, nhiệt kế được treo lên sao cho khoảng cách từ đáy của bầu nhiệt kế đến đáy của chiếc nhẫn khoảng 0,5 inch (13 mm) nhưng không được chạm vào nhẫn.

Nhiệt kế thuỷ ngân:

Phụ thuộc vào điểm nóng chảy của mẫu, sử dụng hoặc nhiệt kế ASTM  15C (-2 đến 80⁰C) đối với loại có điểm nóng chảy thấp  hoặc nhiệt kế ASTM 16C (30 - 200⁰C) đối với loại có điểm nóng chảy cao .

Máy khuấy:

Sử dụng máy khuấy thích hợp với tốc độ 500 – 700 vòng/phút. Để đảm bảo phân tán nhiệt đều trong môi trường nóng, hướng của trục quay nên đẩy dịch lỏng lên phía trên.(Xem Hình 2d ).

Chuẩn bị mẫu:

Lấy mẫu đại diện gồm các mảnh vừa mới bị vỡ có bề mặt chưa bị oxy hoá. Nạo lớp trên bề mặt mẫu để thu các mảnh vỡ ngay trước khi sử dụng, tránh bao gồm các bột mịn hoặc bụi. Lượng mẫu lấy thường ít nhất gấp đôi lượng cần để đủ cho số chiếc nhẫn yêu cầu nhưng không được nhỏ hơn 40 g. Ngay sau đó làm nóng chảy mẫu trong dụng cụ chứa sạch, sử dụng tủ sấy, tấm gia nhiệt hoặc cách cát hoặc cách dầu để ngăn quá nhiệt cục bộ. Tránh hình thành bọt khí trong mẫu nóng chảy, không được gia nhiệt trên nhiệt độ cần thiết để đổ mẫu dễ dàng mà không bao gồm bọt khí. Thời gian tính từ lúc bắt đầu gia nhiệt cho đến lúc đổ mẫu không quá 15 phút. Ngay trước khi đổ đầy các chiếc nhẫn, gia nhiệt mẫu trước đến nhiệt độ tại đó mẫu được rót. Trong khi rót, các vòng tròn được giữ trên tấm đồng thau. Rót mẫu vào các vòng tròn để thừa cho nguội. Làm nguội ít nhất 30 phút và sau đó cắt bỏ phần mẫu thừa bằng dao đã hơ nóng hoặc dao bay. Sử dụng dụng cụ chứa sạch và một mẫu mới nếu phép thử được lặp lại.

Cách tiến hành:

Mẫu có điểm nóng chảy trên 80⁰C: Rót glycerol vào bình thuỷ tinh tới độ sâu không được nhỏ hơn 4 inch (10,2 cm) và không được quá 4,25 inch (10,8 cm). Nhiệt độ ban đầu của chậu là 32⁰C. Đối với nhựa thông (gồm cả nhựa gỗ), glycerol cần được làm nguội đến nhiệt độ không được nhỏ hơn 45⁰C dưới điểm nóng chảy dự đoán trước nhưng không được thấp hơn 35⁰C. Vị trí trục của trục khuấy gần thành sau của dụng cụ chứa, với các lưỡi dao không chạm vào thành và phần dưới của cánh dao cách đỉnh của vòng 0,75 in (18 mm). Trừ khi có hướng dẫn chỉnh tâm cầu được sử dụng, làm lõm nhẹ ở trung tâm của mẫu bằng cách nhấn quả cầu hoặc một que tròn đã được hơ nóng dùng cho mẫu cứng, vào mẫu tại thời điểm này.Treo vòng tròn có chứa các mẫu trong chậu glycerol để bề mặt dưới của vòng tròn đầy cách bề mặt của tấm ngang thấp hơn là 1,0 inch (25,4 mm) (xem Hình 1d), ít nhất 0,5 inch (13 mm) và không quá 0,75 inch (18 mm) ở trên so với đáy của bình thuỷ tinh, hoặc 1,0 inch (25,4 mm) trên so với đáy của dụng cụ chứa (xem Hình 2e). Đặt quả cầu trong glycerol nhưng không được đặt lên trên mẫu thử. Treo nhiệt kế ASTM 16C trong glycerol sao cho đáy bầu của nhiệt kế cách đáy chiếc nhẫn khoảng 0,5 inch (13 mm) nhưng không được chạm vào chiếc nhẫn. Duy trì nhiệt độ ban đầu của glycerol trong 15 phút và sau đó dùng kẹp thích hợp để đặt quả cầu vào trung tâm bề mặt trên của mẫu trong chiếc nhẫn. Bắt đầu khuấy và tiếp tục khuấy với tốc độ 500 – 700 vòng/phút cho đến khi hoàn tất việc xác định. Gia nhiệt theo tốc độ tăng nhiệt độ của glycerol 5⁰C/phút, tránh ảnh hưởng của cặn bằng cách sử dụng các tấm chắn nếu cần thiết.

[Chú ý: Tốc độ tăng nhiệt sẽ không đổi và sẽ không được tính theo giá trị trung bình trong toàn bộ quá trình thử. Loại bỏ tất cả các phép thử trong đó tốc độ tăng nhiệt vượt quá± 0.5ºC cho bất kỳ quá trình nào sau 3 phút đầu].

Ghi lại điểm nóng chảy, chính là nhiệt độ trên nhiệt kế tại đó mẫu chạm vào tấm nằm ngang phía dưới (xem Hình 1d) hoặc đáy của dụng cụ chứa (xem Hình 2e). Không hiệu chỉnh thân nhiệt kế.

Mẫu có điểm nóng chảy dưới 80⁰C: thực hiện theo cách tiến hành trên, ngoại trừ sử dụng nhiệt kế ASTM 15C và sử dụng nước vừa đun sôi được làm mát tới 5⁰C tạo môi trường nhiệt. Đối với nhựa thông (gồm cả nhựa gỗ), sử dụng nước được làm nguội đến nhiệt độ không được nhỏ hơn 45⁰C dưới điểm nóng chảy dự đoán trước nhưng không được thấp hơn 5⁰C.

Chỉ số hydroxyl

Chỉ số hydroxyl được định nghĩa là số mg KOH dùng để trung hoà carbamat sulfonyl có khả năng kết hợp với các nhóm hydroxyl trong 1 g mẫu. Các nhóm hydroxyl trong hợp chất hữu cơ phản ứng nhanh với p – toluensulfonyl isocyanat dư (p - TSI) trong dung môi trơ để tạo thành carbamat sulfonyl. Sau phản ứng của thuốc thử dư với nước tạo thành p – toluensulfonamid, carbamat sulfonyl có tính acid được chuẩn độ bằng trực quan hoặc thiết bị chuẩn độ bằng dung dịch KOH trong methanol, phát triển điểm tương đương bằng đo thế hoặc bằng chỉ thị màu. Các hiệu chỉnh được thực hiện đối với mẫu trắng và sự có mặt của bất kỳ các hợp chất có tính acid.

Thiết bị, dụng cụ:

- Thiết bị chuẩn độ tự động: sử dụng thang đo pH 0 – 14, đặt ở tốc độ 4 (khoảng 2 ml/phút) và một buret 20 ml.

- Điện cực thuỷ tinh

- Điện cực calomel

- Bình tam giác: dung tích 250 ml có khớp nối thuỷ tinh hình tròn

- Sinh hàn Allihn: dài 300 mm có khớp nối thuỷ tinh hình tròn khớp với bình tam giác.

Hoá chất, thuốc thử:

- Acid benzoic, đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc

- Methanol, tinh khiết, dạng khan

- Toluen, tinh khiết, đã sấy khô qua rây phân tử 3Å

- KOH 0,1 N pha trong methanol: Hoà tan 7 g KOH trong 1 lít methanol.

Chuẩn hoá bằng cách cân chính xác đến 0,0001 g, khoảng 0,12 g acid benzoic vào cốc dung tích 150 ml. Cho thanh khuấy từ và 80 ml hỗn hợp toluen/methanol theo tỷ lệ 1/1. Khuấy đều dung dịch trong khi chuẩn độ với dung dịch KOH trong methanol. Dung dịch KOH cần phải cho xuống dưới bề mặt của dung dịch, cách xa điện cực. Tính toán nồng độ dung dich KOH trong methanol dựa theo phương trình tính toán được biểu thị dưới đây.

- Tetrahydrofuran (THF): sấy qua đêm và cho qua rây phân tử 3Å

- p-Toluenesulfonyl isocyanat (p-TSI)

- Dung dịch p-Toluenesulfonyl isocyanat: khoảng 0,22 M hoặc 4,5 mEq/20 ml dung dịch. Dùng pipet lấy 15 ml p-Toluenesulfonyl isocyanat (p-TSI)  cho vào 500 mltetrahydrofuran (THF) khô và lắc đều.

Chú ý:

Vì isocyanat có bản chất rất độc nên khi chuẩn bị và sử dụng dung dịch isocyanat phải được tiến hành trong tủ hốt. Cần phải đeo găng tay khi cầm vào isocyanat và dung dịch của isocyanat để tránh tiếp xúc với da.

- Dung dịch chỉ thị bromocresol đỏ tía: cho 0,1 g bromocresol đỏ tía vào 18,5 ml dung dịch NaOH 0,1 N và pha tới thể tích 250 ml bằng nước cất.

Cách tiến hành:

Cân 1 - 1,5 g mẫu chính xác đến 0,0001 g cho vào bình tam giác khô dung tích 250 ml được nối với khớp nối thuỷ tinh hình tròn. Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch THF khô cho vào bình và hoà tan mẫu. Dùng pipet lấy 20 ml dung dịch p – TSI cho vào bình và lắc đều. Cho vài hạt đá bọt, nối với sinh hàn và để bình trên tấm gia nhiệt. Gia nhiệt đến khi sôi với sinh hàn ngược trong 10 phút. Trong quá trình chưng cất bổ sung thêm nước thích hợp qua sinh hàn:

Mẫu trắng

Mẫu thử

Chuẩn độ với chỉ thị màu

2

2

Chuẩn độ bằng đo thế

1

1

Lấy bình và sinh hàn ra khỏi tấm gia nhiệt và để nguội tới nhiệt độ phòng. Rửa sinh hàn bằng 5 ml THF. Tháo sinh hàn ra khỏi bình và chuyển toàn bộ phần dịch trong bình vào cốc dung tích 150 ml với sự trợ giúp của 50 ml THF. Cho thanh khuấy từ và nhúng các điện cực vào hoặc thêm 20 giọt dung dịch chỉ thị. Vừa khuấy vừa chuẩn độ bằng thiết bị chuẩn độ đo thế hoặc chuẩn độ với chỉ thị màu trực quan với dung dịch KOH trong methanol. Dung dịch KOH cần phải cho xuống dưới bề mặt của dung dịch cách xa điện cực. Xác định thể tích dung dịch KOH đã dùng để chuẩn độ mẫu thử và chuẩn độ mẫu trắng được thực hiện qua tất cả các bước tiến hành trên.

Tính kết quả:

Nồng độ của dung dịch KOH trong methanol (N):

Trong đó:

W: Khối lượng acid benzoic

122,1: Đương lượng của acid benzoic

KOH: Số ml dung dịch KOH trong methanol dùng để chuẩn

Chỉ số hydroxyl trong mẫu:

Trong đó:

A: Số ml dung dịch KOH dùng để chuẩn độ mẫu thử

B: Số ml dung dịch KOH dùng để chuẩn độ mẫu trắng

N: Nồng độ dung dịch KOH trong alcol

56,1: Số mg KOH/mEq

AV: Chỉ số acid

Asen

Chuẩn bị dung dịch mẫu như sau: Cân chính xác 1 g mẫu và cho vào bình Kjeldahl, đặt đầu mút ống của bình trong quả bầu bốc hơi được gắn với máy hút nước, thêm 5 ml dung dịch H₂SO₄ và 4 ml dung dịch hydrogen peroxyd 30% và phá mẫu trên ngọn lửa nhỏ. Tiếp tục thêm 2 ml peroxyd trong 2 lần, để phản ứng lắng cặn giữa hai lần thêm cho đến khi tất cả chất hữu cơ bị phá huỷ, khói của acid H₂SO₄ bốc ra mạnh và dung dịch trở lên không màu. Duy trì các điều kiện ôxy hoá tại tất cả các thời điểm trong quá trình phá mẫu bằng cách bổ sung peroxyd mỗi khi hỗn hợp chuyển màu nâu hoặc tối màu. (Lượng peroxyd cần để phá hoàn toàn mẫu sẽ thay đổi nhưng trong một số trường hợp mức tối đa có thể là 200 ml, điều này phụ thuộc vào trạng thái tự nhiên của mẫu). Làm nguội, chú ý thêm 10 ml nước, lại cho bốc hơi đến khi tạo thành khói mạnh và làm nguội. Chuyển dung dịch tới bình tạo arsin, rửa bình Kjeldahl và quả bầu bằng nước, thêm nước rửa vào bình và pha tới 35 ml bằng nước. Dung dịch này phải đáp ứng được các yêu cầu của Giới hạn thử arsenic.

Chì

Cân chính xác 5 g mẫu và cho vào đĩa sứ hoặc bát sứ, đun trên tấm gia nhiệt cho đến khi than hoá hoàn toàn, sau đó gia nhiệt trong lò nung ở 480⁰C 8 giờ hoặc qua đêm, để nguội. Thêm cẩn thận 5 ml acid nitric, làm bay hơi đến khô trên tấm gia nhiệt, sau đó nung trong lò nung ở 480⁰C trong 15 phút, và làm nguội. Trích ly tro trong 10 ml nước trong 2 lần, lọc mỗi phần dịch chiết vào một bình gạn. Lọc qua bất kỳ chất không tan trên dụng cụ lọc bằng 6 ml dung dịch amoni citrat TS, 2 ml hydroxylamin hydrochlorid TS và 5 ml nước, thêm nước rửa đã được lọc vào bình gạn. Tiếp tục theo hướng dẫn trong phần Cách tiến hành trong thử Giới hạn, bắt đầu với “Thêm 2 giọt phenol đỏ TS .... vào bình gạn”, sử dụng10 μgion chì (Pb) trong mẫu đối chứng.

Phổ hồng ngoại

Glycerol của nhựa gỗ thông

Sắc ký khí của các alcol nhựa thông

Thiết bị, dụng cụ - Điểm nóng chảy

Hình 1

Hình 2

PHỤ LỤC 12

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI DINATRI DIPHOSPHAT

1. Tên khác, chỉ số

Disodium pyrophosphate; Disodium dihydrogen diphosphate; acid sodium pyrophosphate.

INS 450i

MTDI=70mg/kg thể trọng tính cho Phospho từ các nguồn thực phẩm

2. Định nghĩa

Tên hóa học

Disodium dihydrogen diphosphate; Disodium dihydrogen pyrophosphate

Chỉ số C.A.S.

7758-16-9

Công thức hóa học

Dạng khan: Na₂H₂P₂O₇

Khối lượng phân tử

221,94

3. Cảm quan

Dạng tinh thể hoặc hạt màu trắng.

4. Chức năng

Chất nhũ hóa, đệm, chất tạo phức kim loại, chất tạo xốp

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Tan trong nước.

pH

3,7-5,0 (dung dịch 1/100).

Natri

Phải có phản ứng đặc trưng của natri.

Phosphat

Phải có phản ứng đặc trưng của phosphat.

5.2. Độ tinh khiết

Giảm khối lượng khi sấy khô

Không được quá 0,5% (105^oC trong 4 giờ)

Các chất không tan trong nước

Không được quá 1%.

Fluorid

Không được quá 10,0 mg/kg

Arsen

Không được quá 3,0 mg/kg

Chì

Không được quá 4,0 mg/kg

5.3. Hàm lượngNa₂H₂P₂O₇

Dạng khan, hemihydrat và monohydrat: không thấp hơn 97,0% tính theo chế phẩm khan.

Dạng dodecahydrat: không thấp hơn 92,0% tính theo chế phẩm sau khi nung.

6. Phương pháp thử

6.1. Độ tinh khiết

Các chất không tan trong nước

Hòa tan 10 g mẫu thử trong 100 ml nước nóng. Lọc qua một chén lọc đã cân bì. Rửa cặn không tan trên chén lọc bằng nước nóng. Sấy khô tại (105^oC trong 2 giờ). Để nguội và cân.

6.2. Định lượng

Cân 400mg (chính xác đến mg) mẫu thử đã được sấy khô trước tại (105^oC trong 4 giờ), hòa tan trong 100 ml nước trong cốc 400 ml. Chỉnh pH dung dịch về 3,8 bằng dung dịch acid hydrocloric loãng (TS) hoặc dung dịch natri hydroxyd (TS), dùng pH kế để xác định pH dung dịch. Sau đó thêm 50 ml dung dịch kẽm sulfat (125 g ZnSO₄.7H₂O hòa tan trong nước, pha loãng đến đủ 1000ml, lọc và chỉnh pH về 3,8), để yên trong khoảng 2 phút. Chuẩn độ acid được giải phóngbằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N đến khi pH dung dịch lại trở về 3,8. Sau mỗi lần thêm natri hydroxyd gần đến điểm tương đương, cần để một thời gian để nếu có kết tủa kẽm hydroxyd thì kết tủa có thể tan hết.

Mỗi ml natri hydroxyd 0,1 N tương đương với 11,10mg Na₂H₂P₂O_7.

PHỤ LỤC 13

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI CALCI POLYPHOSPHAT

1. Tên khác, chỉ số

INS 452iv

MTDI=70mg/kg thể trọng tính cho phospho từ các nguồn thực phẩm

2. Định nghĩa

Hỗn hợp dị thể của các muối calci của acid polyphosphoric có công thức chung là H_n+2P_nO_n+1.

3. Cảm quan

Tinh thể hoặc bột không mùi, không màu.

4. Chức năng

Chất nhũ hóa, Chất giữ ẩm, chất tạo phức kim loại, chất tạo kết cấu.

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Thường không tan hoàn toàn trong nước, tan trong môi trường acid.

Phosphat

Phải có phản ứng đặc trưng của phosphat.

Calci

Phải có phản ứng đặc trưng của calci (Dịch thử chuẩn bị như trong phần thử phosphat)

5.2. Độ tinh khiết

Giảm khối lượng khi nung

Không được quá 2%. Sấy tại 105^o trong 4 gờ sau đó nung tại 550^o trong 30 phút.

Phosphat vòng

Không được quá 8% tính theo hàm lượng P₂O₅.

Fluorid

Không được quá 10,0 mg/kg.

Arsen

Không được quá 3,0 mg/kg.

Chì

Không được quá 4,0 mg/kg.

5.3. Hàm lượngP₂O₅

Không được thấp hơn 50,0% và không được quá 71,0% P₂O₅ tính theo chế phẩm sau khi nung.

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Phosphat

Cân 0,5g mẫu, trộn với 10ml acid nitric và 50ml nước. Đun sôi trong 30 phút và làm mát.Dung dịch này được sử dụng làm dịch thử.

6.2. Độ tinh khiết

Arsen

- Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4 - phương pháp II,.

- Hòa tan 1 g mẫu thử trong 15 ml dung dịch acid hydrocloric loãng (TS), thêm 20 ml nước, dung dịch này được sử dụng làm dịch thử).

Chì

  - Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

6.3. Định lượng

Cân khoảng 300 mg mẫu thử, chính xác đến mg, hòa tan trong 15 ml acid nitric và 30 ml nước cất. Đun sôi trong khoảng 30 phút, pha loãng với nước đến 100 ml. Đun nóng đến 60^oC, thêm lượng dư dung dịch amoni molybdat (TS) và đun ở 50^oC trong 30 phút. Lọc và rửa kết tủa bằng acid nitric loãng (dung dịch 1/36), tiếp theo bằng dung dịch kali nitrat (1/100) đến khi dịch rửa không còn acid với quỳ tím. Hòa tan kết tủa trong 50 ml dung dịch natri hydroxyd 1N, thêm dung dịch phenolphtalein (TS) và chuẩn độ lượng natri hydroxyd dư bằng acid sulfuric 1N.

Mỗi ml dung dịch natri hydroxyd 1 N tương đương với 3,086mg P₂O₅.

PHỤ LỤC 14

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI CÁC MUỐI CỦA CÁC ACID BÉO

1. Tên khác, chỉ số

Salts of fatty acids

INS 470

ADI “không giới hạn”

2. Định nghĩa

Các sản phẩm này chứa muối calci, kali và natri của các acid myristic, oleic, palmitic, stearic hoặc hỗn hợp các acid này thu được từ mỡ và dầu ăn. Sản phẩm thương mại còn được phân loại dựa trên:

{C}-    Chỉ số xà phòng hóa;

{C}-    Điểm đông đặc của các acid béo thu được từ mẫu thử;

{C}-    Chỉ số iod;

{C}-    Cặn còn lại sau khi nung bao gồm cả hàm lượng các cation;

-   Độ ẩm.  

3. Cảm quan

Tinh thể rắn hoặc nửa rắn, bóng, màu trắng hoặc vàng nhạt, hoặc bột màu trắng hoặc trắng vàng.

4. Chức năng

Chất chống đông vón, Chất nhũ hóa.

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Các muối kali và natri tan trong nước và ethanol, các muối calci không tan trong nước, ethanol và ether.

Cation

Phải có phản ứng đặc trưng của cation.

Thành phần acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của thành phần acid béo

5.2. Độ tinh khiết

Các acid béo tự do

Không được quá 3%

Các chất không xà phòng hóa

Không được quá 2 %.

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

5.3. Hàm lượng

Không thấp hơn 95 % tổng các muối acid béo, tính theo khối lượng khô.

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Cation

Đun nóng 1 g mẫu thử với hỗn hợp gồm 25 ml nước và 5 ml acid hydrocloric. Các acid béo tạo thành lớp nổi trên bề mặt thành một lớp rắn hoặc dầu, tan trong hexan. Sau khi làm nguội, gạn lấy lớp nước và cho bay hơi đến khô. Hòa tan chất rắn còn lại trong nước và thử các cation thích hợp.  

Thành phần acid béo

Sử dụng phương pháp định lượng để định tính riêng các acid béo có trong thành phần của mẫu. Các acid béo chiếm lượng lớn nhất phải phù hợp với các acid được đưa ra trên nhãn sản phẩm.

6.2. Độ tinh khiết

Các acid béo tự do

Xác định các acid béo tự do theo hướng dẫn trong phần Phương pháp xác định Acid béo tự do. Tính hàm lượng acid béo tự do, sử dụng hệ số tương đương (e)  tương đương với 1/10 khối lượng phân tử của muối.

Các chất không xà phòng hóa 

Các chất không xà phòng hóa là toàn bộ lượng sản phẩm có mặt trong các chất béo sau khi được xà phòng hóa với các hydroxyd kim loại kiềm và chiết bằng một dung môi nhất định, vẫn không bay hơi trong các điều kiện xác định của phép thử. 

Các chất này bao gồm các lipid có nguồn gốc tự nhiên như các sterol, các rượu no mạch dài hơn, các phẩm màu và các hydrocarbon cũng như bất kỳ một tạp chất không bay hơi nào ở 103⁰C có mặt trong sản phẩm.

 Cân khoảng 5 g mẫu thử (chính xác đến 0,01g) đã được trộn đều vào bình cầu đáy tròn 250 ml. Thêm 50 ml dung dịch kali hydroxyd ~ 0,5 N và thêm một ít đá bọt. Gắn bình vào sinh hàn hồi lưu, đun sôi nhẹ trong 1 giờ. Ngừng đun. Thêm 100 ml nước cất qua đầu sinh hàn và lắc.

Sau khi làm mát, chuyển dung dịch vào phễu tách. Tráng rửa bình và đá bọt vài lần bằng diethyl ether (dùng khoảng 100 ml) và đổ dịch rửa vào phễu tách. Đóng nút và lắc mạnh trong 1 phút, đều đặn xả áp suất bằng cách lật ngược phễu tách và mở khóa vòi.

Để yên phễu tách cho đến khi 2 pha hòan toàn tách lớp. Sau đó rút lấy càng triệt để càng tốt dung dịch xà phòng vào phễu tách thứ 2.

 Chiết dung dịch xà phòng trong ethanol thêm hai lần nữa, mỗi lần với 100 ml diethyl ether theo cách trên. Gộp 3 dịch chiết ether vào 1 phễu tách có sẵn 40 ml nước.

  Nhẹ nhàng quay tròn phễu tách chứa dịch chiết và 40 ml nước. Nếu lắc quá mạnh trong giai đoạn này, nhũ tương có thể hình thành. Để hỗn hợp tách lớp hoàn toàn và rút bỏ lớp nước ở dưới. Rửa lớp ether hai lần nữa với 40 ml nước, lắc đều và loại bỏ lớp nước ở dưới sau khi hỗn hợp đã phân lớp. Với mỗi dung dịch rửa rút ra đến khi chỉ còn khoảng 2 ml, sau đó quay tròn phễu tách quanh trục, đợi vài phút, rút bỏ phần tách ra, đóng khóa vòi khi ether bắt đầu chảy qua lỗ của khóa vòi.

Rửa dung dịch ether nhiều lần bằng 40 ml dung dịch kali hydroxyd, 40 ml nước, rửa thêm một lần bằng 40 ml dung dịch kali hydroxyd, sau đó rửa ít nhất 2 lần nữa bằng 40 ml nước. Liên tục rửa bằng nước cho đến khi dung dịch hết màu hồng khi thử bằng chỉ thị là dung dịch phenophthalein.      

 Chuyển toàn lượng từng ít một dung dịch ether qua cuống của phễu tách vào bình cầu khô và đã cân bì khối lượng chính xác đến 0,0001 g.

 Làm bay hơi dung môi bằng cách cất trong bể cách thủy. Thêm 5 ml aceton và loại bỏ hoàn toàn dung môi bay hơi băng cách thổi không khí nhẹ, nghiêng bình cầu khi quay trong bể cách thủy.

Sấy khô phần cặn còn lại ở nhiệt độ 103±2°C trong 15 phút, đặt bình cầu theo phương gần như nằm ngang. Làm nguội trong bình hút ẩm và cân (chính xác đến 0,0001 g). Lặp lại quá trình sấy trong mỗi 15 phút liên tiếp cho đến khi chênh lệch giữa 2 lần cân liên tiếp nhỏ hơn 0,0015g.

Chú ý: Nếu không thu được khối lượng không đổi sau 3 lần sấy khô, các chất không xà phòng hóa có thể đã bị nhiễm bẩn.

Sau khi đã cân, hòa tan phần cặn trong 4 ml diethyl ether, thêm 20 ml ethanol đã được trung hòa (dung dịch có màu hồng khi thêm chỉ thị là dung dịch phenolphthalein(TS). Chuẩn độ bằng dung dịch kali hydroxyd trong ethanol 0,1 N đã chuẩn hóa (pha dung dịch kali hydroxyd trong ethanol có nồng độ gần đúng 1 N bằng cách hòa tan 60 g kali hydroxyd trong 50 ml nước và pha loãng thành 1 L bằng ethanol; pha loãng dung dịch này 1:10 bằng ethanol) đến khi dung dịch có màu phớt hồng.

 Hiệu chuẩn khối lượng cặn còn lại bằng cách trừ đi hàm lượng acid tự do. Tính hàm lượng chất không xà phòng hóa, theo % (kl/kl) bằng công thức sau:

trong đó:

m = khối lượng (g), của phần mẫu thử,

m₁ = khối lượng (g), của cặn còn lại.

V = thể tích dung dịch kali hydroxyd đã chuẩn hóa nồng độ dùng để chuẩn độ. 

T = Nồng độ chính xác của dung dịch kali hydroxyd dùng để chuẩn độ.

Chì

  - Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

6.2. Định lượng

Nguyên tắc:

Xà phòng hóa các muối và ester hóa các acid béo bằng methanol, có mặt bo trifluorid, methanol kiềm. Tiến hành sắc kí lỏng khí các ester methyl của acid béo.

Phần  A - Chuẩn bị các ester methyl của acid béo 

Thiết bị

- Bình đáy tròn cổ nhám 50 và 100 ml.

- Sinh hàn hồi lưu, chiều dài hiệu dụng 20 to 30 cm, có khớp nối nhám tương thích với bình cầu.

- Các phễu tách 250 ml.

- Đường ống vào dẫn khí nitrogen.

- Ống nghiệm có nút thủy tinh nhám.

- Pipet chia độ, có thể tích ít nhất là 10 ml, có gắn quả bóp cao su, hoặc pipet tự động. 

Thuốc thử

- Heptan, dùng cho sắc kí (Chú ý 2 và 4)

- Dầu nhẹ đã được cất  lại (nhiệt độ sôi từ 40-60°), chỉ số brom < 1, không có cặn, hoặc hexan (Chú ý 2) 

- Natri sulfat khan

- Dung dịch Natri hydroxyd trong methanol ~ 0.5 N: Hòa tan 2g natri hydroxyd trong 100 ml methanol chứa không quá 0.5% (kl/kl) nước. Nếu giữ dung dịch tương đối lâu có thể tạo thành một lượng nhỏ kết tủa màu trắng của natri. Điều này không ảnh hưởng đến kết quả điều chế methyl ester.

- Dung dịch bo trifluorid trong methanol, 12 đến 25% (kl/kl) . Chế phẩm thương mại sẵn có là dung dịch 14 và 50% (chú ý 2)

Cảnh báo: Bo trifluorid độc. Vì vậy thử nghiệm viên không nên pha dung dịch bo trifluorid trong methanol từ methanol và boron trifluorid. (chú ý 3). 

- Dung dịch bão hòa natri clorid trong nước.

- Methyl đỏ, dung dịch 1 g/l trong ethanol 60% (tt/tt)

- Nitrogen, có hàm lượng oxy < 5 mg/kg

 Tiến hành

Do bo trifluorid độc, các thí nghiệm sau tốt nhất nên tiến hành trong tủ hút. Các dụng cụ thủy tinh phải được rửa bằng nước ngay sau khi sử dụng. 

Sấy khô mẫu ở nhiệt độ 105°C đến khối lượng không đổi, cứ 2 giờ thì kiểm tra khối lượng 1 lần. Cân khỏang 350mg (chính xác đến mg) mẫu đã sấy khô. Có thể lấy lượng mẫu lớn hoặc nhỏ hơn 350 mg, tuy nhiên, thể tích của bình cầu và lượng thuốc thử sử dụng phải phù hợp với số liệu trong bảng sau:

Thêm 2 đến 5 ml heptan (chú ý 4) (lượng chính xác không ảnh hưởng đến phản ứng) qua đầu trên của sinh hàn vào hỗn hợp đang sôi và tiếp tục đun sôi trong 1 phút.

Ngắt nguồn nhiệt, lấy sinh hàn ra. Thêm lượng nhỏ dung dịch natri clorid bão hòa và lắc nhẹ bình bằng cách quay tròn bình vài lần.

Thêm dung dịch natri clorid bão hòa vào bình cầu sao cho mức chất lỏng ngang cổ bình. Để yên cho hỗn hợp tách lớp và chuyển khoảng 1 ml lớp trên (lớp heptan) vào ống nghiệm cổ nhám và thêm vào một lượng nhỏ natri sulfat khan để loại hết nước. Nếu lượng mẫu lấy là 350 mg, dung dịch này chứa khoảng 7-17% methyl ester và có thể bơm trực tiếp vào cột sắc kí khí-lỏng. Nếu không thì pha loãng dung dịch bằng heptan để đạt được nồng độ methyl ester là 5-10% (chú ý 5).

Để thu hồi toàn bộ lượng ester khô, chuyển dung dịch muối và lớp heptan vào phễu tách. Tách riêng các lớp. Chiết phần dung dịch muối 2 lần bằng 50 ml dầu nhẹ. Gộp dịch chiết dầu nhẹ thu được vào phần dung dịch heptan, rửa bằng 20 ml nước đến khi hết acid (thử bằng chỉ thị đỏ methyl). Làm khô bằng natri sulfat khan, lọc và cho bay hơi dung môi trong bể cách thủy và thổi khí nitrogen (chú ý 6 và 7). Với các mẫu có khối lượng nhỏ hơn 500 mg phải giảm thể tích dung môi và nước sử dụng theo tỷ lệ tương ứng.

Bên cạnh phương pháp trên còn có một số phương pháp khác không sử dụng đến bo trifluorid. Nhìn chung có thể thay các thuốc thử methyl hóa, dung dịch natri hydroxyd 0,5N trong methanol và dung dịch bo trifluorid 12-25 %, trong methanol bằng các chất sau:  

 - Kali hydroxyd 1 N trong methanol, (phản ứng với chất béo khi có mặt lượng dư methanol có hàm lượng nước nhỏ);

- Dung dịch natri methylat (điều chế bằng cách hòa tan 1 g natri kim loại trong 100 ml methanol  có hàm lượng nước nhỏ).

 Chú ý

1. Nếu các chất không xà phòng hóa gây cản trở, pha loãng dung dịch xà phòng hóa với nước và loại bỏ các chất không xà phòng hóa bằng cách chiết với diethyl ether hoặc hexan. Acid hóa dung dịch nước xà phòng và tách lấy các acid béo. Điều chế các methyl ester từ các acid béo theo hướng dẫn.

2. Khi đo sắc kí khí lỏng của các methyl ester, một số thuốc thử, đặc biệt là bo trifluorid trong methanol có thể tạo nên các peak ngẫu nhiên trên sắc đồ (trong vùng các ester có mạch C₂₀-C₂₂ nếu dùng bo trifluorid trong methanol). Do vậy cần phải kiểm tra lại mỗi đợt thuốc thử mới bằng cách điều chế các methyl ester của acid oleic tinh khiết, và đo sắc kí. Nếu xuất hiện peak ngẫu nhiên, phải bỏ không dùng thuốc thử. Các thuốc thử khác nhau không được phép cho peak gây nhiễu đến các peak của các methyl ester của các acid béo trong quá trình chạy sắc kí.

Dung dịch bo trifluorid trong methanol phải được bảo quản trong tủ lạnh.

 3. Nếu bắt buộc phải điều chế dung dịch bo trifluorid từ bo trifluorid khí, nên dùng phương pháp sau: Cân khối lượng của bình cầu 2 L chứa 1 L methanol. Làm lạnh trong bể đá. Vẫn giữ nguyên bình trong bể đá, sục khí  BF₃ từ chai khí (cylinder) qua ống dẫn thủy tinh vào dung dịch methanol cho đến khi hấp thụ được 125 g BF₃. Tiến hành thí nghiệm trong tủ hút. Phải cho BF₃  chạy qua ống thủy tinh trước khi đặt ống vào và rút ống ra khỏi methanol để tránh trường hợp chất lỏng bị hút vào hệ thống van của chai khí. Không được cho khí chạy nhanh quá để có hơi khí trắng ra khỏi bình. Thuốc thử pha theo cách này bền trong 2 năm.  

4. Nếu các acid béo chứa 20 hoặc nhiều hơn 20 nguyên tử carbon không có mặt, nên thay heptan bằng hexan (hỗn hợp của các đồng phân C₇ tinh khiết có thể được kiểm tra bằng sắc kí khí lỏng)

5.  Nếu không có đủ lượng mẫu như yêu cầu, có thể lấy 10 mg, thậm chí ít hơn, miễn là lượng thuốc thử và kích cỡ của các dụng cụ thủy tinh được giảm theo tỷ lệ tương ứng. 

 6. Các dung dịch methyl ester nên được phân tích càng sớm càng tốt. Nếu cần, bảo quản dung dịch heptan chứa các methyl ester trong môi trường khí trơ trong tủ lạnh. Nếu cần phải bảo quản trong thời gian dài, nên bảo vệ các methyl ester khỏi sự oxy hóa bằng cách thêm vào dung dịch các chất chống oxy hóa ở nồng độ không ảnh hưởng đến kết quả phân tích, ví dụ như 0,05 g/L EHT (2,6-di-tertbutyl-4-methyl phenol).

Trong trường hợp cần thiết, có thể bảo quản các methyl ester khô sạch dung môi trong khí trơ trong tủ lạnh trong 24 giờ, hoặc có thể bảo quản lâu hơn nếu giữ đông lạnh sâu trong ống kín trong chân không.

7. Một phần các methyl ester dễ bay hơi nhất có thể bị mất nếu thời gian bay hơi dung môi kéo dài, hoặc nếu dòng khí nitrogen quá mạnh,

Để đo phổ hồng ngoại, phải loại bỏ dung môi càng triệt để càng tốt.

Để đo sắc kí khí lỏng, loại bỏ hoàn toàn dung môi.

Phần B - Sắc kí khí lỏng của các ester methyl acid béo

Thiết bị

Thiết bị thông thường dùng cho sắc kí khí lỏng, dùng cột nhồi và detector ion hóa ngọn lửa (chú ý 1). Bất kỳ một thiết bị nào cho hiệu quả và độ phân giải cao với chất béo cần xác định đều phù hợp.

Sắc kí khí lỏng

Hệ thống bơm mẫu: Hệ thống bơm mẫu phải có không gian chết nhỏ nhất có thể. Nếu được, phải nâng được nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cột từ 20 đến 50°C.

Lò: Lò phải cung cấp cho cột nhiệt độ ít nhất là 220^o và phải duy trì được nhiệt độ cần thiết  trong khoảng±1°C.

Nếu dùng chương trình đặt nhiệt độ, nên dùng thiết bị có cột đôi.

Cột nhồi: 

- Cột: Cột phải được làm từ lọai vật liệu trơ với chất cần phân tích: thủy tinh hoặc nếu không thì dùng thép không rỉ (chú ý 2). Chiều dài: 1 đến 3 m, nên dùng cột tương đối ngắn nếu có các acid mach dài (C₂₀₊). Để xác định các acid béo C₄ và C₆, nên dùng cột 2 m; đường kính trong từ 2 đến 4 mm.

Nhồi cột

- Chất mang: Diatomid rửa acid và đã được silan hóa, hoặc các chất mang trơ phù hợp khác có khoảng  biến thiên đường kính hẹp (25mm) trong khoảng đường kính cỡ hạt từ 125-200 µm, cỡ hạt trung bình phải tương quan với đường kính trong và chiều dài cột.

- Pha tĩnh: Dạng polyester của một chất lỏng phân cực (ví dụ diethylen glycol polysuccinat, butandiol polysuccinat, ethylen glycol polyadipat ...) hoặc bất kỳ chất lỏng nào khác (ví dụ cyanosilicon ...)  thỏa mãn các điều kiện dưới đây. Pha tĩnh phải chiếm 5 đến 20 % khối lượng nhồi. Có thể dùng một pha tĩnh không phân cực, tùy theo từng phép tách cụ thể.

- Luyện cột mới chế tạo: Tách cột ra khỏi detector. Nếu có thể, từ từ nung lò đến 185°C và dẫn dòng khí trơ qua cột với tốc độ 20-60 ml/phút trong ít nhất là 16 giờ tại nhiệt độ này, và thêm 2 giờ nữa tại 195°C.

Detector: Các vận hành dưới đây tương ứng với detector ion hóa ngọn lửa (chú ý 1) 

Syring: Syring, có dung tích tối đa là 10 µl, chia độ đến 0.1 µl.

 Máy ghi:

Nếu sử dụng đường ghi để tính thành phần hỗn hợp phân tích, phải dùng một máy ghi điện tử có độ chính xác cao. Máy ghi phải tương thích với thiết bị đo. Các đặc trưng của máy ghi phải như sau:

 - Tốc độ đáp ứng dưới 1,5 giây, tốt nhất là dưới 1 giây (tốc độ đáp ứng là thời gian cần để bút ghi chạy từ 0 đến 90 % theo 100 % tín hiệu)

- Độ rộng của giấy: tối thiểu là 25 cm

- Tốc độ giấy: 25-100 cm/giờ.

 Bộ tích phân Integrator hoặc máy tính (tùy chọn)

Có thể tính một cách nhanh và chính xác nếu dùng bộ tích phân điện tử hoặc máy tính. Trong trường hợp này phải tạo được tín hiệu tuyến tính với độ nhạy phù hợp, và phần hiệu chỉnh cho sự lệch đường nền phải thỏa đáng. 

 Hóa chất

- Khí mang: Khí trơ (nitrogen, heli, argon ...) khô, và chứa ít hơn 10 mg/kg oxy.

- Khí phụ trợ: Hydrogen (tinh khiết tối thiểu 99.9%) không có các tạp chất hữu cơ, không khí hoặc oxygen.

- Các chất chuẩn so sánh: Hỗn hợp của các methyl ester, hoặc các methyl ester của một chất dầu đã biết trước thành phần, tốt nhất là tương tự với chất béo cần phân tích.

Tiến hành

 Điều kiện thử

Xác định các điều kiện vận hành tối ưu: Các giá trị cho trong bảng 1 và 2 cho dưới đây về nguyên tắc có thể cho các kết quả mong muốn:

Bảng 1

Đường kính trong của cột            Khí mang cung cấp

2 mm                                         15-25 ml/phút

3 mm                                          20-40 ml/ phút 

4 mm                                          40-60 ml/ phút 

Bảng 2

Nồng độ của pha tĩnh                              Nhiệt độ

5%                                                         175^o  

10%                                                       180^o 

15%                                                       180^o 

20%                                                       185^o 

 Nếu được, injector phải ở nhiệt độ khoảng 200^oC và detector phải ở nhiệt độ bằng hoặc cao hơn nhiệt độ cột.

Về nguyên tắc dòng khí hydrogen cung cấp cho detector ion hóa ngọn lửa phải có tốc độ bằng một nửa tốc độ khí mang, và tốc độ khí oxygen phải bằng khoảng 5 đến 10 lần tốc độ khí hydrogen.

 Xác định hiệu suất và độ phân giải (tùy chọn)

Tiến hành phân tích mẫu chuẩn methyl stearat. Lựa chọn cỡ mẫu, nhiệt độ cột tách và tốc độ khí mang sao cho peak của methyl stearat xuất hiện 15 phút sau peak dung môi và cao khoảng 3/4 tín hiệu toàn thang.

-  Phân tích:

Dùng mẫu kiểm tra là 0,1 đến 2 µl dung dịch heptan của  methyl esters, pha theo hưóng dẫn trong phần A. Trong trường hợp không có các ester trong dung dịch, chuẩn bị dung dịch có nồng độ khoảng 10% trong heptan và bơm 0,1 đến 1 µl dung dịch này.

Các điều kiện tiến hành được cho dưới đây. Tuy nhiên, có thể làm việc với nhiệt độ cột thấp hơn nếu xác định các acid có mạch carbon dưới C₁₂ hoặc ở nhiệt độ cao hơn nếu xác định các acid béo trên C₂₀.

Đôi khi có thể sử dụng chương trình đặt nhiệt độ cho cả 2 trường hợp trên. Nếu mẫu có chứa các methyl ester của các acid béo dưới C₁₂,  phải bơm mẫu ở nhiệt độ 100°C (hoặc ở nhiệt độ từ 50 - 60°C nếu có acid butyric) và ngay lập tức tăng nhiệt độ với tốc độ tăng nhiệt từ 4 - 8°C/phút cho đến nhiệt độ tối ưu. Trong một số trường hợp có thể gộp cả 2 qui trình lại: sau khi tăng nhiệt, tiếp tục rửa giải tại nhiệt độ không đổi cho đến khi tất cả các hợp phần được rửa giải ra. Nếu thiết bị không vận hành với chương trình nhiệt độ, làm việc tại 2 nhiệt độ cố định trong khoảng từ 100 đến 195°C.

Biểu thị kết quả 

 Phân tích định tính

 Phân tích hỗn hợp chất chuẩn so sánh có thành phần đã biết trong các điều kiện sử dụng để đo mẫu thử. Đo khoảng cách lưu (hoặc thời gian lưu) cho các ester béo tương ứng. Dùng giấy bán logarit, vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của logarit khoảng cách lưu (hoặc thời gian lưu) vào số nguyên tử carbon của các acid; trong điều kiện đẳng nhiệt đồ thị của các ester mạch thẳng có cùng độ không bão hòa (no) phải là các đường thẳng. gần như song song với nhau.

Nhận dạng các peak của mẫu thử từ các đồ thị này, nếu cần thì dùng phép nội suy. Phải tránh các điều kiện đo làm xuất hiện các “peak bị che phủ (masked peaks)”, có nghĩa là độ phân giải không đủ lớn để tách được 2 hợp phần.

 Phân tích định lượng

Xác định thành phần

Trừ các trường hợp đặc biệt, sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích, có nghĩa là giả thiết rằng toàn bộ các hợp phần đều được biểu diễn trên sắc đồ, sao cho tổng diện tích các peak biểu diễn 100 % các hợp phần (tổng rửa giải).

Bằng một qui trình chuẩn hóa phù hợp (dùng hỗn hợp chuẩn so sánh hoặc dùng chất chuẩn nội), xác định tổng khối lượng của các acid béo trong mẫu khô. Tính hàm lượng muối của các acid béo với các cation đặc trưng trong mẫu. Tổng hàm lượng Muối Acid Béo không được lớn hơn 95% khối lượng mẫu khô. Ngoài ra, nếu có các chỉ tiêu cho hàm lượng của mỗi acid béo ghi trên nhãn sản phẩm, mẫu  phải thỏa mãn được các chỉ tiêu này.

Chú ý

1. Có thể sự dụng máy sắc kí khí - lỏng dùng thiết bị đo độ dẫn nhiệt của khí (catharometer) (làm việc trên nguyên tắc đo sự thay đổi độ dẫn nhiệt). Các điều kiện đo khi đó được thay đổi như sau:

 Cột

- chiều dài: 2 đến 4 m

- đường kính trong: 4 mm

- chất mang: đường kính hạt trong khoảng 160 đến 200 µm

- pha tĩnh: 15 đến 25%

Khí mang: heli, nếu không thì dùng hydrogen, có hàm lượng oxygen càng nhỏ càng tốt. Không dùng khí phụ trợ

- Tốc độ khí: thường trong khoảng từ 60 đến 80 ml/phút

Nhiệt độ

Injector: cao hơn từ 40^o đến  60^oC so với nhiệt độ cột

Cột: 180^o to 200^oC

 Phân tích định lượng: phải hiệu chỉnh theo các hệ số thu được khi phân tích hỗn hợp so sánh của các ester có thành phần đã biết trong cùng điều kiện đo với mẫu thử.

2. Nếu trong mẫu có các thành phần chứa nhiều hơn 3 nối đôi, chúng có thể bị phân hủy trên cột thép không rỉ.  

PHỤ LỤC 15

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI ESTER CỦA SUCROSE VỚI CÁC ACID BÉO

1. Tên khác, chỉ số

Sucrose fatty acid esters;

INS 473

2. Định nghĩa

Mono, di, tri ester của sucrose với các acid béo thực phẩm, được điều chế từ sucrose và methyl, ethyl ester của các acid béo thực phẩm bằng cách ester hoá với sự có mặt của chất xúc tác, hoặc tách từ sucroglycerid. Chỉ các dung môi sau có thể được sử dụng để sản xuất:  dimethylformamid, dimethyl sulfoxid, ethyl acetat, isopropanol, propylen glycol, isobutanol và methyl ethyl keton.

3. Cảm quan

Dạng gel cứng, dạng chất đặc mềm hoặc dạng bột có màu trắng đến trắng hơi xám

4. Chức năng

Chất nhũ hoá

5. Yêu cầu kỹ thuật

5.1. Định tính

Độ tan

Ít tan trong nước, tan trong ethanol.

Acid béo

Phải có phản ứng đặc trưng của acid béo.

Đường

Phải có phản ứng đặc trưng của đường.

5.2. Độ tinh khiết

Tro sulfat

Không được quá 2%

Thử 1 g mẫu (Phương pháp I)

Chỉ số acid

Không được quá 6

Sucrose tự do

Không được quá 5% (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Dimethylformamid

Không được quá 1,0 mg/kg (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Dimethyl sulfoxid

Không được quá 2,0 mg/kg (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Ethyl acetat, isopropanol và propylen glycol

Không được quá 350,0 mg/kg, dạng đơn chất hoặc hợp chất (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Isobutanol

Không được quá 10,0 mg/kg (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Methanol

Không được quá 10,0 mg/kg (mô tả trong phần Phương pháp thử)

Methyl ethyl keton

Không được quá 10,0 mg/kg (mô tả trong phần Phương pháp thử

Chì

Không được quá 2,0 mg/kg.

5.3. Hàm lượng

Không được nhỏ hơn 80,0% ester sucrose

6. Phương pháp thử

6.1. Định tính

Acid béo

Cho 1 ml ethanol vào 0,1 g mẫu, làm ấm và hoà tan, thêm 5 ml dung dịch H₂SO₄ loãng TS, gia nhiệt trong cách thủy trong 30 phút và làm nguội. Chất đặc hoặc dầu màu trắng vàng được hình thành, không có mùi của acid isobutyric và được hoà tan khi thêm 3 ml diethyl ether. Sử dụng lớp dung dịch nước tách khỏi từ diethyl ether cho Phép thử đường.

Đường

Cho vào 2 ml lớp dung dịch nước tách khỏi  diethyl ether trong phép thử acid béo, 1 ml anthron TS vào trong ống thử, cho cẩn thận theo thành ống nghiệm; bề mặt ranh giới giữa hai lớp chuyển thành màu xanh da trời hoặc xanh lá cây.

6.2. Độ tinh khiết

Sucrose tự do

Xác định bằng sắc ký khí lỏng (Quyển 4)

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch gốc chứa 5 mg/ml sucrose trongN, N- dimethylformamid. Chuẩn bị một loạt các dung dịch chuẩn chứa 0,5; 1,25 và 2,5 mg/ml sucrose bằng cách pha loãng dung dịch gốc với pyridin.

Dung dịch nội chuẩn:

Cân chính xác 0,25 g octacosan cho vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm vào 25 ml tetrahydrofuran để hoà tan octacosan, và định mức đến thể tích 50 ml bằng pyridin.

Các điều kiện sắc ký:

Cột:2% Dexsil 300GC trên Uniport HP 80/100 mesh (ít phân cực, 2,1 m x 3.2 mm đường kính trong) hoặc tương đương

Khí mang: nitrogen

Detector: FID

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 280⁰C

- Cột: giữ ở 160⁰C trong 1 phút sau đó tăng từ 160 đến 300⁰C với tốc độ 15⁰C/phút, giữ trong 60 phút ở 300⁰C.

- Detector: 320⁰C

Thời gian lưu lần lượt của sucrose và octacosan đo được với các điều kiện trên xấp xỉ 8,2 và 9,8 phút.

Cách tiến hành: Cân chính xác 20 – 50 mg mẫu cho vào ống li tâm, thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn, 1 ml pyridin, 0,4 ml N, O-bis (trimethylsilyl) acetamid (BSA) và 0,2 ml trimethylchlorosilan (TMCS). Sau khi đậy nắp ống, lắc và để yên trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bơm 1ml vào thiết bị sắc ký khí lỏng.

Đường chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch chuẩn silylat theo cách tiến hành như nhau sử dụng 1 ml mỗi loại dung dịch chuẩn thay thế mẫu và pyridin. Vẽ đường chuẩn trên đồ thị lượng sucrose (mg) trong 1 ml dung dịch chuẩn (biểu thị trên trục X) so với tỷ lệ diện tích pic của sucrose/nội chuẩn (biểu thị trên trục Y).

Đo diện tích pic đối với sucrose và nội chuẩn. Tính tỷ lệ diện tích các pic của chúng, và tính được hàm lượng sucrose trong mẫu dựa vào đường chuẩn.

                          Lượng sucrose phát hiện được (mg)

% sucrose = ----------------------------------------------------- x 100

                                 Khối lượng mẫu (mg)

Dimethylformamid

Xác định bằng sắc ký khí lỏng

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch gốc chứa 1 mg/ml dimethylformamid trong tetrahydrofuran. Chuẩn bị một loạt các dung dịch chuẩn chứa 0,05; 0,1 và 0,2mg/ml dimethylformamid bằng cách pha loãng dung dịch gốc với tetrahydrofuran.

Các điều kiện sắc ký:

Cột: polyethylen glycol (dài 30 m x 0,32 mm đường kính trong với độ dày lớp phim mỏng 0,5mm)

Khí mang: heli

Áp suất: 150 kPa (áp suất không đổi)

Detector: detector nitrogen phosphor (NPD)[(tên khác: Detector nhiệt ion ngọn lửa (FTD)]

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 180⁰C

- Cột: giữ ở 40⁰C trong 2 phút sau đó tăng từ 40 đến 160⁰C với tốc độ 20⁰C/phút, giữ trong 2 phút ở 160⁰C.

- Detector: 325⁰C

Phương pháp tiêm mẫu: Tiêm không chia dòng 1,0ml mẫu bằng bơm tự động, sau đó bắt đầu làm sạch sau 1 phút.

Thời gian lưu của dimethylformamid đo được với các điều kiện trên xấp xỉ 6,4 phút.

Cách tiến hành:

Cân chính xác 2 g mẫu cho vào bình định mức dung tích 20 ml, thêm vào 10 ml tetrahydrofuran để hoà tan mẫu, thêm tetrahydrofuran vào bình đến thể tích 20 ml và lắc đều dung dịch. Bơm 1,0ml dung dịch mẫu vào thiết bị sắc ký.

Đường chuẩn:

Chuẩn bị hàng ngày bằng cách bơm 1,0ml mỗi dung dịch chuẩn vào thiết bị sắc ký.

Tính nồng độ dimethylformamid (C_DFA) theo công thức sau:

Trong đó:

C: Nồng độ dimethylformamid phát hiện được (mg/ml)

W: Khối lượng mẫu (g)

Lưu ý: Detector nitrogen phosphor không nhạy với các thành phần không chứa N hoặc P. Vì thế, cột mao quản có thể tắc với các hợp chất bay hơi thấp, mặc dù đường nền của sắc ký ổn định. Do đó, cột phải được luyện thường xuyên. Luyện qua đêm (dòng khí mang theo hướng ngược ở 180⁰C ) được thực hiện sau khoảng mỗi đợt 15 mẫu.

Dimethyl sulfoxid

Xác định bằng sắc ký khí lỏng

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch gốc 0,25 mg/ml dimethyl sulfoxid trong tetrahydrofuran. Chuẩn bị một loạt các dung dịch chuẩn chứa 0,5; 1 và 5mg/ml dimethyl sulfoxid bằng cách pha loãng dung dịch gốc với tetrahydrofuran.

Các điều kiện sắc ký:

Cột: 10% PEG 20M và 3% KOH trên Gas Chrom Z (chiều dài 2 m x 3 mm đường kính trong). Tăng nhiệt độ lò tới 180⁰C với tốc độ 10⁰C/phút và để ổn định 24 – 48 giờ với điều kiện tốc độ dòng khí nitrogen 30 – 40 ml/phút để luyện cột.

Khí mang: nitrogen

Tốc độ dòng: 50 ml/phút

Detector: detector trắc quang ngọn lửa (sử dụng bộ lọc lưu huỳnh 394 nm)

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 210⁰C

- Cột: 160⁰C.

Thời gian lưu của dimethyl sulfoxid đo được với các điều kiện trên xấp xỉ 3,4 phút.

Cách tiến hành:

Cân chính xác 5 g mẫu cho vào bình định mức dung tích 25 ml, thêm vào 10 ml tetrahydrofuran để hoà tan mẫu, thêm tetrahydrofuran vào bình đến thể tích 20 ml và lắc đều dung dịch. Bơm 3ml dung dịch mẫu vào thiết bị sắc ký.

Đường chuẩn:

Chuẩn bị hàng ngày bằng cách bơm 3ml mỗi dung dịch chuẩn vào thiết bị sắc ký.

Tính nồng độ dimethyl sulfoxid (C_DMSO) theo công thức sau:

Trong đó:

C: Nồng độ dimethyl sulfoxid phát hiện được (mg/ml)

W: Khối lượng mẫu (g)

Propylen glycol

Xác định bằng sắc ký khí lỏng

Dung dịch nội chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch 500mg/ml của ethylen glycol trong pyridin

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch 50mg/ml của propylen glycol trong pyridin

Các điều kiện sắc ký:

Cột: Polydimethylsiloxan (chiều dài 30 m x 0,32 mm đường kính trong với độ dày lớp phim mỏng 0,25mm)

Khí mang: heli

Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút (dòng không đổi)

Detector: FID

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 230⁰C

- Cột: giữ ở 60⁰C trong 5 phút sau đó tăng từ 60 đến 250⁰C với tốc độ 20⁰C/phút, giữ trong 5 phút ở 250⁰C.

- Detector: 250⁰C

Thời gian lưu lần lượt của dẫn xuất ethylen glycol và dẫn xuất propylen glycol xấp xỉ 7,7 phút và 7,9 phút.

Cách tiến hành:

Cân chính xác 1 g mẫu cho vào bình định mức dung tích 10 ml, thêm vào 100ml dung dịch nội chuẩn. Hoà tan và định mức đến thể tích 10 ml bằng pyridin. Lấy 0,5 ml dung dịch mẫu cho vào ống li tâm, và thêm 0,25 ml 1,1,1,3,3,3 – hexamethyldisilazan (HMDS) và 0,1 ml trimethylchlorosilan

(TMCS). Sau khi đậy chặt nắp ống, lắc mạnh, để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó li tâm. Bơm 1ml dung dịch nổi trên mặt ống sau li tâm vào thiết bị sắc ký.

Đường chuẩn:

Tiến hành sắc ký như trên, trong đó dùng 0,05; 0,2; 0,5 và 1ml dung dịch chuẩn thay thế cho dung dịch mẫu thử.

Tính nồng độ propylen glycol (C_PG) theo công thức sau:

Trong đó:

C: Nồng độ propylen glycol phát hiện được (mg/ml)

W: Khối lượng mẫu (g)

Lưu ý: Nhất thiết phải làm sạch cổng bơm mẫu và luyện cột ở 300⁰C sau mỗi đợt 20 mẫu phân tích, bởi cột bị nhiễm bẩn.

Methanol, isopropanol, isobutanol, ethyl acetat và methyl ethyl keton

Xác định bằng sắc ký khí có buồng lấy mẫu không gian hơi.

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch chuẩn A chứa 4.000 mg/l mỗi loại methanol, isopropanol, isobutanol, ethyl acetat và methyl ethyl keton bằng cách cân chính xác 0,2 g mỗi dung môi và cho vào bình định mức dung tích 50 ml chứa khoảng 20 ml nước, sau đó thêm nước vào đến thể tích 50 ml. Chuẩn bị các dung dịch chứa 2.000 mg/l (dung dịch chuẩn B) và 1.000 mg/l (dung dịch chuẩn C) bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn A.

Cách tiến hành:

Cân chính xác 4 g mẫu cho vào 4 lọ (mỗi lọ 1 g mẫu). Cho 5ml nước vào lọ thứ nhất, cho lần lượt vào lọ thứ hai, thứ ba, thứ bốn dung dịch chuẩn A, B và C; đậy nhanh septum. (Nồng độ của mỗi dung môi sau khi thêm 5ml dung dịch chuẩn A, B, C vào 1 g mẫu tương đương lần lượt bằng 20, 10 và 5 mg/kg mẫu). Để lọ mẫu trong buồng lấy mẫu không gian hơi và phân tích với các điều kiện sau:

Cột: 100% Polydimethylsiloxan (chiều dài 30 m x 0,53 mm đường kính trong với độ dày màng phim mỏng 1,5mm), ví dụ: DB – 1 được sản xuất bởi Công ty TNHH J & W)

Khí mang: nitrogen

Tốc độ dòng: 3,5 ml/phút

Detector: FID

Nhiệt độ:

- Buồng bơm mẫu: 110⁰C

- Cột: 40⁰C.

- Detector: 110⁰C

Buồng lấy mẫu không gian hơi:

- Nhiệt độ cách nhiệt mẫu: 80⁰C

- Thời kỳ cách nhiệt mẫu: 40 phút

- Nhiệt độ syringe: 85⁰C

- Bơm mẫu dạng khí: 1,0 ml

Kết quả:

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa lượng thêm vào với diện tích pic đối với mỗi dung môi sử dụng các kết quả phân tích. Mối tương quan phải tuyến tính (R² > 0,99). Ngoại suy và xác định x phần bị chặn, w_i, và tính nồng độ dung môi C_i (mg/kg) trong mẫu:

Trong đó:

w_i: Phần bị chặn của đường thẳng tương quan sử dụng phương pháp thêm chuẩn (mg)

W: Khối lượng mẫu (g)

Chì

- Thử theo JECFA monograph 1 - Vol.4.

- Xác định bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

6.3. Định lượng

Xác định bằng HPLC sử dụng các điều kiện sau:

Cách tiến hành:

Cân chính xác 250 mg mẫu và cho vào bình định mức dung tích 50 ml. Pha tới thể tích 50 ml bằng tetrahydrofuran và lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,5mm. Bơm 100ml mẫu vào thiết bị sắc ký đã ổn định trước.

Các điều kiện sắc ký:

Cột: Styren-divinylbenzen copolymer đối với sắc ký thẩm thấu qua gel (TSK-GEL G2000 (Tosoh) hoặc tương đương)

Pha động: tetrahydrofuran dùng cho HPLC đã bài khí

Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút

Detector: RI

Nhiệt độ:

- Cột: 38⁰C.

- Detector: 38⁰C

Ghi sắc ký đồ trong khoảng 90 phút.

Tính % ester sucrose trong mẫu:

% ester sucrose = 100 A/T

Trong đó:

A: Tổng các diện tích pic đối với 3 thành phần chính, mono-, di- và tri-ester, rửa giải lần lượt ở khoảng 65, 68 và 73 phút.

T: Tổng diện tích tất cả các pic rửa giải trong khoảng 90 phút

PHỤ LỤC 16