Tiêu chuẩn TCVN 7901:2008 Dùng que cấy vòng định lượng để định lượng vi sinh vật trong sữa

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 7901:2008

ISO 8553:2004

SỮA - ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - KỸ THUẬT SỬ DỤNG QUE CẤY VÒNG ĐỊNH LƯỢNG Ở 30⁰C

Milk - Enumeration of microorganisms - Plate-loop technique at 30⁰C

Lời nói đầu

TCVN 7901:2008 hoàn toàn tương đương với ISO 8553:2004;

TCVN 7901:2008 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố.

SỮA - ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT - KỸ THUẬT SỬ DỤNG QUE CẤY VÒNG ĐỊNH LƯỢNG Ở 30⁰C

Milk - Enumeration of microorganisms - Plate-loop technique at 30⁰C

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng vi sinh vật trong sữa nguyên liệu bằng kỹ thuật sử dụng que cấy vòng định lượng ở 30⁰C.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4884 (ISO 4833), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30⁰C.

TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và sản phẩm sữa. Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh.

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và tạo môi trường cấy - Phần 1: Các hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị môi trường cấy trong phòng thử nghiệm).

ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và tạo môi trường cấy - Phần 2: Các hướng dẫn thực hành về thử tính năng của môi trường cấy).

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Vi sinh vật (microorganisms)

Các vi khuẩn, nấm men, nấm mốc hình thành các khuẩn lạc có thể đếm được dưới các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này.

4. Nguyên tắc

4.1. Chuẩn bị đĩa thạch, sử dụng môi trường cấy quy định và một lượng xác định của mẫu thử được lấy bằng que cấy vòng đã hiệu chuẩn.

4.2. Ủ ẩm các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 30⁰C trong 72h.

4.3. Tính số lượng vi sinh vật trên mililit mẫu thử từ số lượng khuẩn lạc thu được trên đĩa (xem điều 10).

5. Dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử

5.1. Yêu cầu chung

Xem TCVN 6404 (ISO 7218) và ISO/TS 11133-1.

5.2. Dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6263 (ISO 8261).

5.3. Môi trường nuôi cấy - Thạch sữa đếm đĩa

5.3.1. Thành phần

5.3.2. Chuẩn bị

5.3.2.1. Chuẩn bị từ môi trường khô có bán sẵn

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, nhưng trong mọi trường hợp nên bổ sung bởi bột sữa gầy ngay cả khi nhà sản xuất cho rằng không cần thiết. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25⁰C, nếu cần.

5.3.2.2 Chuẩn bị từ các thành phần cơ bản khô

Hòa tan trong nước theo thứ tự sau: dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein bằng enzym, glucoza và cuối cùng là bột sữa gầy. Để hòa tan nên đun nóng nước. Thêm thạch và đun đến sôi trong khi vẫn khuấy cho đến khi thạch tan hết.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25⁰C, nếu cần.

5.3.2.3. Phân phối, khử trùng và bảo quản

Phân phối môi trường vào các ống nghiệm (6.8) với các lượng từ 12 ml đến 15 ml hoặc vào các bình cầu hoặc chai (6.9) có dung tích không quá 500 ml. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.11) ở 121⁰C.

Nếu môi trường được sử dụng ngay, thì làm nguội trên nồi cách thủy (6.6) đặt ở 44⁰C đến 47⁰C trước khi sử dụng.

Nếu không, bảo quản môi trường ở nơi tối ở 3⁰C ± 2⁰C không quá ba tháng dưới các điều kiện không làm thay đổi các thành phần và các đặc tính của môi trường. Trước khi kiểm tra vi sinh và để tránh chậm trễ khi rót môi trường, nên làm tan chảy hoàn toàn môi trường đã bảo quản, rồi làm nguội trên nồi cách thủy (6.6) ở nhiệt độ từ 44⁰C tới 47⁰C trước khi sử dụng (xem 9.2.4).

Về việc kiểm tra nhiệt độ của môi trường và các yêu cầu khác, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

5.3.3. Kiểm tra hiệu năng của việc đảm bảo chất lượng môi trường nuôi cấy

Kiểm tra hiệu năng của môi trường theo ISO/TS 11133-2.

5.4. Dung dịch tẩy trùng

Sử dụng dung dịch natri hypoclorit chứa từ 50 mg/l đến 100 mg/l clo hoạt tính hoặc hỗn hợp của etanol (96%) và axeton với tỉ lệ 1:1. Chuẩn bị mới dung dịch tẩy trùng mỗi ngày.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

6.1. Dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu đáp ứng được các yêu cầu tương tự. Dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần phải chịu được việc khử trùng nhiều lần và phải trơ về mặt hóa học.

6.2. Dụng cụ cấy vòng

6.2.1. Các bộ phận cấu thành

Bộ dụng cụ hoàn chỉnh không có bán sẵn, nhưng có thể lắp ráp từ các bộ phận được liệt kê trong 6.2.1.1 đến 6.2.1.3. Cũng có thể sử dụng dụng cụ tự động.

6.2.1.1. Que cấy vòng cấy platin, được hiệu chuẩn đến 0,001 ml, được gắn vào kim tiêm Luer-lock. Uốn cong 30⁰ một đoạn từ 3 mm đến 4 mm tính từ vòng cấy, có đầu mở của vòng hướng về tâm.

CHÚ THÍCH: Các vòng cấy bằng platin thích hợp có bán sẵn từ Gerber Instruments K. Schneider & Co. AG, Thụy sỹ1)

Cách khác, sử dụng vòng platin, platin-rodi hoặc platin-iridi có đường kính từ 0,4 mm đến 0,5 mm, được gắn với que cấy dài từ 60mm đến 70 mm đã hiệu chuẩn đến 0,001 ml. Được uốn cong 30⁰ một đoạn từ 3mm đến 4mm tính từ vòng cấy. Đoạn cuối của que được thắt nút vài chỗ. Lắp đầu thắt nút của que vào kim tiêm Luer-lock, cỡ 13, cưa một đoạn từ 24mm đến 26mm từ điểm ống lót đưa vào ống bọc, đến điểm uốn là khoảng 12mm đến 14mm tính từ cuối ống lót.

Định kỳ hiệu chuẩn vòng và độ chính xác của quy trình bằng cách phân tích 25 mẫu kép bằng kỹ thuật đếm đĩa chuẩn [xem TCVN 4884 (ISO 4833)] và kỹ thuật sử dụng que cấy vòng định lượng.

Các mẫu cần cho các số đếm từ 10 đến 300 tùy thuộc vào số đếm của đĩa chuẩn (dung dịch pha loãng thập phân thứ ba). Các trung bình của số đếm thu được từ hai phương pháp không được khác quá ±10%.

6.2.1.2. Pipet liên tục, có dung tích 2ml, có nối Luer-lock (ví dụ xyranh tự điền đầy Socorex hoặc Cornwall¹⁾ có thể điều chỉnh để phân phối 1,0 ml.

6.2.1.3. Ống nối cao su silicon, đường kính trong 3,0 mm có đủ độ dài để đáp ứng được quá trình cấy, được gắn với xyranh và nối dài vào vật chứa dịch pha loãng có đậy nắp.

CHÚ THÍCH: Đoạn ống nối cao su silicon, thanh ấn và kim tiêm được cung cấp theo các phụ kiện chuẩn với các xyranh có bán sẵn.

6.2.2. Lắp ráp và thanh trùng dụng cụ cấy vòng

Gắn kim tiêm với vòng cấy platin (6.2.1.1) vào pipet liên tục (xyranh tự điền đầy) (6.2.1.2). Nối ống cao su silicon (6.2.1.3) vào van lấy của xyranh tự điền đầy. Kéo dài đầu cuối với thanh ấn đã gắn vào vật chứa dịch pha loãng (6.3).

Đổ dịch pha loãng thích hợp (5.2) vào vật chứa dịch pha loãng (6.3) đến 50% đến 80% dung tích vật chứa.

Khử trùng dụng cụ pipet đã lắp ráp 15 min trong nồi hấp áp lực (6.11) ở 121⁰C. Để nguội.

6.3. Dụng cụ chứa dịch pha loãng có nắp đậy, dung tích tối đa 1000ml (ví dụ: chai Schott-Duran có nắp vặn bằng polypropylen). Trên nắp phải có một lỗ nhỏ để lắp ống cao su silicon. Nên gắn ống nghiệm hoặc bộ phận thích hợp khác vào dụng cụ để giữ và bảo vệ vòng cấy trong quá trình khử trùng.

6.4. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 30⁰C ± 1⁰C.

6.5. Máy đo pH, có độ chính xác hiệu chuẩn ± 0,1 đơn vị pH ở 25⁰C.

6.6. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 44⁰C đến 47⁰C.

6.7. Dụng cụ đếm khuẩn lạc, ví dụ: gồm có nền phông đen được chiếu sáng, được gắn với thấu kính khuếch đại với độ phóng đại 1,5 lần và bộ đếm cơ hoặc đếm điện tử. Cách khác, có thể sử dụng thiết bị phân tích vi sinh tự động (máy phân tích hình ảnh).

6.8. Ống nghiệm, dung tích khoảng 20 ml, có nắp đậy thích hợp.

6.9. Bình cầu hoặc chai, có dung tích thích hợp nhưng không lớn hơn 500 ml, có nắp đậy thích hợp.

6.10. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đã khử trùng, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

6.11. Nồi hấp áp lực, có thể duy trì nhiệt độ ở 121⁰C ± 1⁰C.

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

8. Chuẩn bị

8.1. Chuẩn bị mẫu thử

8.1.1. Chuẩn bị mẫu thử tránh ánh sáng mặt trời và chú ý đảm bảo sự vô trùng thông thường khi cần.

8.1.2. Làm ấm các mẫu thử ở trạng thái lạnh từ 15⁰C đến 20⁰C trước khi thử nghiệm.

8.1.3. Lắc mạnh và kỹ các mẫu thử. Để trộn được kỹ thì các chai đựng mẫu không nên quá đầy (khoảng trống còn lại phía trên khoảng 10mm là đủ).

8.1.4. Để yên 5 min cho bọt tan hết rồi trộn lại bằng cách lật chiều chai đựng mẫu hai hoặc ba lần trước khi chuyển sang bước tiếp theo (9.2.1). Thời gian tính từ khi bắt đầu quá trình làm ấm (8.1.2) đến khi bắt đầu cấy (9.2.1) không được quá 20 min.

8.2. Chuẩn bị dụng cụ cấy vòng

8.2.1. Ấn nhanh miệng hút của xyranh của dụng cụ cấy vòng vô trùng (6.2.2) vài lần để mồi xyranh thủy tinh (được điều chỉnh để phân phối 1ml).

8.2.2. Trước khi bắt đầu chuyển để kiểm tra một loạt mẫu, nhấn chìm vòng cấy 30s trong dung dịch tẩy trùng (5.4). Hút loại bỏ ít nhất năm lần, mỗi lần 1 ml dịch pha loãng và sau đó lấy 1ml cho vào đĩa Petri vô trùng (6.10). Dán nhãn đĩa này là "Kiểm chứng dụng cụ vô trùng".

9. Cách tiến hành

9.1. Yêu cầu chung

Không thực hiện các thao tác quy định trong 9.2 trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời. Chú ý đảm bảo sự vô trùng thông thường khi cần.

9.2. Nuôi cấy và ủ

9.2.1. Nhúng vòng cấy vô trùng (xem 8.2.2) vào mẫu thử đã chuẩn bị (xem 8.1.4) đến đoạn uốn cong trên cán que (đoạn uốn thường được đánh dấu vạch chia và cũng cho phép lấy vòng ra theo hướng thẳng đứng). Đưa vòng cấy sang ngang trong mẫu sữa ở cùng độ sâu với khoảng cách ít nhất là 20 mm và rút từ từ với tốc độ khoảng 2 cm/s.

Tốc độ lấy vòng ra khỏi bề mặt sữa cần được kiểm soát cẩn thận vì điều này ảnh hưởng đến thể tích của phần mẫu thử. Việc lấy vòng ra quá chậm làm ít hơn 0,001 ml mẫu thử bám vào; lấy vòng ra quá mạnh sẽ làm nhiều hơn 0,001 ml mẫu thử bám vào. Cần sử dụng chai đựng mẫu miệng rộng và được rọi sáng để tạo thuận lợi cho quá trình thực hiện.

9.2.2. Nhấc nắp của đĩa Petri vô trùng (6.10). Nhúng vòng cấy và ấn pittông để lấy 1ml dịch pha loãng vô trùng chảy qua vòng đã nạp, như thế làm sạch lượng mẫu đã đong cho vào đĩa. Không ấn pittông quá nhanh sẽ không làm cho dịch pha loãng chảy qua cán và qua vòng.

CHÚ THÍCH: Thông thường, lượng sót lại trên vòng sau khi xả mẫu là không đáng kể. Tuy nhiên, có thể do mối hàn không tốt hoặc bề mặt kim loại không trơn như trong trường hợp vòng đã cũ, bị hư hỏng có thể làm cho việc tráng rửa không sạch.

Thay vòng đã bị hỏng. Chú ý sau mỗi dãy 20 phép thử mẫu cần khử trùng vòng trong dung dịch tẩy rửa (5.4). Không khử trùng vòng trên ngọn lửa vì sẽ giảm đáng kể thời hạn sử dụng của vòng. Trước khi tiến hành tiếp cần hút xả ít nhất năm lần, mỗi lần 1 ml dung dịch tẩy rửa.

9.2.3. Ngay sau mỗi dãy mẫu thử và trước khi rửa hoặc khử trùng vòng, nên hút nhả 1 ml chất đệm vô trùng cho vào đĩa Petri. Ghi nhãn đĩa này là "Kiểm chứng việc tráng rửa". Trong quá trình ủ (9.2.6) không được có nhiều hơn hai khuẩn lạc phát triển trên đĩa thạch. Ngoài ra, chỉ rót môi trường thạch (5.3) vào một đĩa Petri vô trùng. Dán nhãn là "Thạch kiểm chứng".

9.2.4. Cho từ 10 ml đến 12 ml môi trường đã tan chảy (xem 5.3.2.3) ở nhiệt độ từ 44⁰C đến 47⁰C vào mỗi đĩa đã cấy. Thời gian tính từ khi hút nhả vòng đến khi rót môi trường vào các đĩa không được quá 15min.

9.2.5. Sau khi rót xong, trộn ngay bằng cách xoay đĩa đủ để thu được các khuẩn lạc phân tán đều sau khi ủ. Để môi trường đông đặc bằng cách để các đĩa Petri trên mặt phẳng nằm ngang, mát.

9.2.6. Lập úp các đĩa đã chuẩn bị. Đặt vào tủ ấm (6.4) ở 30⁰C trong 72 h ± 3 h. Không chồng cao quá sáu đĩa. Để các chồng đĩa tách riêng và để cách xa thành và nóc tủ ấm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]

9.3. Đếm khuẩn lạc

9.3.1. Đếm các khuẩn lạc trên các đĩa sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (6.7). Kiểm tra các khuẩn lạc dưới ánh sáng dịu. Đếm chính xác các khuẩn lạc.

9.3.2. Đếm bằng mắt thường các khuẩn lạc mọc lan. Các khuẩn lạc mọc lan được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu có ít hơn một nửa đĩa mọc quá dày bởi khuẩn lạc mọc lan, thì đếm các khuẩn lạc trên phần đĩa không bị ảnh hưởng và nhân số đếm được với 2 để có được số lượng khuẩn lạc trên toàn bộ đĩa. Nếu có nhiều hơn một nửa đĩa có các khuẩn lạc mọc lan thì loại bỏ đĩa đó không đếm.

9.3.3. Về nguyên tắc, chỉ sử dụng các đĩa có số đếm từ 10 đến 300 để ghi lại kết quả.

10. Tính toán và biểu thị kết quả

Nhân số đếm trên một đĩa với 1000 để thu được số đếm plate-loop (PLC) trên mililit mẫu thử. Nếu số đếm ít hơn 10, thì báo cáo kết quả PLC là "ít hơn 10 000 trên mililit". Nếu số đếm vượt quá 300, thì báo cáo kết quả là "PLC ước tính trên mililit". Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

11. Độ chụm

11.1. Yêu cầu chung

Đối với thông tin về các giới hạn tin cậy đối với việc ước tính các số lượng nhỏ vi sinh vật, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

CHÚ THÍCH: Không có số liệu chi tiết về độ chụm thu được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm. Các con số đưa ra là kết quả thực nghiệm.

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập, riêng lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, tiến hành trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được lớn hơn 50% ở mức 100 000 vi sinh vật trên mililit (nghĩa là kết quả cao hơn không được vượt quá 50% kết quả thấp hơn).

CHÚ THÍCH: Kinh nghiệm cho thấy rằng độ lặp lại ở mức 100 000 vi sinh vật trên mililit là khoảng 50%. Với số lượng vi sinh giảm thì số liệu độ lặp lại tăng, nghĩa là trở nên kém dần.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) các kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] THOMSON, D.I., DONNELLY, C.B. and Black, L.A. A plate loop method for determining viable counts of raw milk. J.Milk Food Technol., 23, 1960, pp. 167-171.

[3] LUCK, H. and LATEGAN, B. Evaluation of the manual plate loop method for determining the total bacteria count of refrigerated milk. S.Afr. J. Dairy Techno., 15, 1983, pp. 15-18.