Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 10713-1:2015 ISO 15788-1:1999 Dầu mỡ động vật và thực vật-Xác định các stigmastadiene trong dầu thực vật-Phần 1: Phương pháp sắc kí khí cột mao quản (phương pháp chuẩn)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10713-1:2015

ISO 15788-1:1999

DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH CÁC STIGMASTADIENE TRONG DẦU THỰC VẬT – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ CỘT MAO QUẢN (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)

Animal and vegetable fats and oils  – Determination of stigmastadienes in vegetable oils  – Part 1: Method using capillary-column gas chromatography (Reference method)

Lời nói đầu

TCVN 10713-1:2015 hoàn toàn tương đương với ISO 15788-1:1999;

TCVN 10713-1:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F2 Dầu mỡ động vật và thực vật biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;

Bộ tiêu chuẩn TCVN 10713 (ISO 15788) Dầu mỡ động vật và thực vật – Xác định các stigmastadiene trong dầu thực vật gồm có các phần sau:

- TCVN 10713-1:2015 (ISO 15788-1:1999), Phần 1: Phương pháp sắc kí khí cột mao quản (Phương pháp chuẩn);

- TCVN 17013-2:2015 (ISO 15788-2:2003), Phần 2: Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Lời giới thiệu

Một lượng hydrocarbon đáng kể được hình thành trong các loại dầu thực vật do xử lý nhiệt trong quá trình tinh luyện [1]. Trong số các hydrocarbon này, thì 3,5-stigmastadiene và hợp chất steroidal là có nhiều nhất trong tất cả các loại dầu thực vật tinh luyện vì nó có nguồn gốc từ b-sitosterol do mất nước [2]. 3,5- stigmastadiene được tạo thành cùng với một lượng nhỏ đồng phân 2,4 và cả hai cho một pic sắc kí khí dễ xác định khi phân đoạn hdrocarbon được phân tích trên cột phân cực thấp [3]. Vì vậy, tổng của cả hai đồng phân có thể dễ dàng định lượng bằng phân tích sắc kí khí phân đoạn hydrocarbon steroidal [2], [4].

Ví dụ, đối với dầu ôliu nguyên chất, các quá trình sản xuất dầu thông thường (ép hoặc ly tâm) không tạo ra các lượng stigmastadiene có thể đo được (nhỏ hơn 0,01 mg/kg). Trong khô dầu ôiliu thô, đã phát hiện một lượng nhỏ các stigmastadien (trong khoảng từ 0,2 mg/kg đến 3 mg/kg) do sử dụng nhiệt độ cao trong quá trình sấy khô dầu ôliu thô.

Trong quá trình tinh luyện, các stigmastadiene được hình thành trong tất cả các bước liên quan đến nhiệt độ cao, như quá trình tẩy trắng và khử mùi, nhưng trong bước đầu tiên sử dụng đất tẩy trắng bằng axit thì các stigmastadien được hình thành với lượng lớn hơn so với bước khử mùi [2]. Tùy thuộc vào các điều kiện áp dụng trong quá trình tinh luyện, các loại dầu thực vật tinh luyện thương phẩm cho nồng độ các stigmastadien dao động từ 1 mg/kg đến 120 mg/kg và vì vậy việc đánh giá các stigmastadien cho phép không chỉ xác định các loại dầu được xử lý nhiệt mà còn cho phép phát hiện một lượng nhỏ các loại dầu thực vật tinh luyện trong các loại dầu nguyên chất.

Phương pháp xác định các stigmastadien và các kết quả nghiên cứu cộng tác được thực hiện dưới sự bảo trợ của Hội đồng Dầu Ôliu quốc tế đã được chuyển cho Liên minh Quốc tề về Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng (IUPAC), Ủy ban về dầu, Chất béo và các Dẫn xuất. Hàm lượng các stigmastadiene được chấp nhận như là một tiêu chí nhận biết các loại dầu ô liu nguyên chất và các phương pháp phân tích này đã được chấp nhận làm phương pháp chuẩn quốc tế.

DẦU MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT – XÁC ĐỊNH CÁC STIGMASTADIENE TRONG DẦU THỰC VẬT – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ CỘT MAO QUẢN (PHƯƠNG PHÁP CHUẨN)

Animal and vegetable fats and oils – Determination of stigmastadienes in vegetable oils – Part 1: Method using capillary-column gas chromatography (Reference method)

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định các stigmastadiene trong các loại dầu thực vật nguyên chất có nồng độ các hydrocarbon thấp, đặc biệt trong dầu ôliu nguyên chất.

Phương pháp này có thể áp dụng cho tất cả các loại dầu thực vật cho dù các phương pháp đó chỉ đáng tin cậy khi hàm lượng các hydrocarbon từ 0,01 mg/kg đến 4,0 mg/kg. Phương pháp này thích hợp để phát hiện sự có mặt của dầu thực vật tinh tinh luyện (dầu ô liu, bã dầu ô liu, dầu hướng dương, dầu cọ v.v…) trong dầu ô liu nguyên chất, vì dầu tinh luyện chứa các stigmastadiene và các loại dầu thực vật chiết lạnh thì không chứa các stigmastadiene.

2. Nguyên tắc

Các chất không xà phòng hóa được phân lập. Phân đoạn hydrocacbon steroidal được tách bằng sắc kí cột trên silica gel và được phân tích bằng sắc kí khí mao quản.

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có các qui định khác.

3.1. Hexan, hoặc hỗn hợp của các alkan có điểm sôi từ 65 ^oC đến 70 ^oC, được chưng cất bằng tháp tinh chế.

Hexan phải được chưng cất lại để loại bỏ tạp chất.

3.2. Etanol, 96 % (phần thể tích).

3.3. Natri sulfat khan.

3.4. Dung dịch kali hydroxit trong ancol, nồng độ 50 g/500 ml.

Thêm 10 ml nước vào 50 g kali hydroxit, khuấy, rồi pha loãng đến 500 ml bằng etanol.

Dung dịch kali hydroxit trong ancol chuyển màu nâu khi để yên. Cần chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng và bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh sẫm màu có nắp đậy kín.

3.5. Silica gel 601), dùng cho sắc kí cột, cỡ 70 mesh đến 230 mesh.

Thông thường, có thể sử dụng silica gel trực tiếp từ vật chứa mà không cần xử lý. Tuy nhiên, một số mẻ silica có thể có hoạt tính thấp làm cho tách sắc kí kém, khi đó silica gel phải được xử lý bằng cách sau đây:

Hoạt hóa silica gel bằng cách nung ít nhất 4 h ở 550 ^oC. Sau khi nung, đặt silica gel vào bình hút ẩm để cho nguội sau đó chuyển silica gel vào bình có nắp đậy kín. Thêm 2 % nước và lắc cho đến khi silica gel hết vón cục và thành bột chảy tự do.

Nếu các mẻ silica gel cho sắc kí đồ có các pic gây nhiễu thì silica gel phải được xử lý như trên. Cách khác, nên sử dụng silica gel 60 ¹⁾ có độ tinh khiết cao.

3.6. 3,5-Cholestadiene2), độ tinh khiết 99 % (khối lượng), dung dịch gốc trong hexan, nồng độ 10 mg/50 ml.

3.7. 3,5-Cholestadiene, dung dịch chuẩn trong hexan, nồng độ 1 mg/50 ml, thu được bằng cách pha loãng dung dịch gốc (3.6).

CHÚ THÍCH Nếu bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 ^oC, thì các dung dịch (3.6) và (3.7) không bị giảm chất lượng trong ít nhất 4 tháng.

3.8. n-Nonacosan, dung dịch trong hexan, nồng độ khoảng 10 mg/100 ml.

3.9. 3,5-Stigmastadiene3) (24-ethylcholesta-3,5-diene), dung dịch trong hexan, nồng độ khoảng 10 mg/100 ml.

3.10. Khí mang, dùng cho sắc kí khi heli hoặc hydrô có độ tinh khiết 99,9990 % (khối lượng).

3.11. Các loại khí phụ trợ, dùng cho detector ion hóa ngọn lửa: hydro có độ tinh khiết 99,9990 % (khối lượng) và không khí sạch.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể sau đây:

4.1. Bình cầu, dung tích 250 ml, phù hợp để dùng với sinh hàn hồi lưu.

4.2. Phễu chiết, dung tích 500 ml.

4.3. Bình cầu đáy tròn, dung tích 100 ml.

4.4. Bộ cô quay.

4.5. Cột sắc kí thủy tinh, đường kính trong 1,5 cm, dài 50 cm, có khóa Teflon và nút bông thủy tinh hoặc đĩa thủy tinh thiêu kết ở đáy.

Để chuẩn bị cột silica gel, rót hexan vào cột sắc kí đến độ sâu khoảng 5 cm và đổ đầy huyền phù silicagel trong hexan (15 g trong 40 ml) với sự hỗ trợ của các phần hexan. Để lắng và sau đó rung nhẹ. Thêm một lớp natri sulfat khan (3.3) có chiều cao đến khoảng 0,5 cm. Cuối cùng, tháo bỏ hexan dư.

4.6. Máy sắc kí khí, có detector ion hóa ngọn lửa, bơm chia dòng hoặc bơm lên cột và lò nung có bộ phận gia nhiệt cài đặt chương trình nhiệt độ chính xác đến ± 1 ^oC.

4.7. Cột mao quản silica nung chảy, dùng cho máy sắc kí khí (đường kính trong 0,25 mm hoặc 0,32 mm, dài 25 m) được phủ bằng pha phenylmetylsilicon 5 %. Độ dày màng 0,25 mm.

CHÚ THÍCH Có thể sử dụng các loại cột tương tự khác hoặc cột có độ phân cực thấp hơn.

4.8. Máy ghi hoặc máy tích phân, có thể tích phân được phần lõm xuống.

4.9. Microxyranh, dung tích từ 5 ml đến 10 ml, dùng cho máy sắc kí khí, có gắn kim tiêm.

4.10. Bộ gia nhiệt, hoặc bếp điện.

5. Cách tiến hành

5.1. Chuẩn bị chất không xà phòng hóa

5.1.1. Cân 20 g ± 0,1 g dầu cho vào bình cầu 250 ml (4.1). Thêm 1 ml dung dịch chuẩn nội 3,5- cholestandien (chứa 20 mg) và 75 ml kali hydroxit trong alcol (3.4). Lắp bộ sinh hàn hồi lưu và đun dung dịch sôi nhẹ trong 30 min. Lấy bình chứa mẫu ra khỏi nguồn nhiệt và để cho dung dịch hơi nguội (không để nguội hẳn hoặc không để mẫu bị lắng). Thêm 100 ml nước và chuyển dung dịch vào phễu chiết (4.2) với sự hỗ trợ của 100 ml hexan. Lắc mạnh hỗn hợp trong 30 s và để cho tách lớp.

Nếu tạo nhũ, không tách lớp nhanh được thì thêm một lượng nhỏ etanol.

5.1.2. Chuyển pha nước phía dưới vào phễu chiết thứ hai rồi chiết lại với 100 ml hexan. Khi phần lớn pha nước phía dưới chảy hết, rửa dịch chiết hexan (cho vào phễu chiết khác) ba lần, mỗi lần dùng 100 ml hỗn hợp etanol/nước [50 ml/100 ml (thể tích) cho đến khi nước rửa có pH trung tính.

5.1.3. Cho dung dịch hexan đi qua natri sulfat khan (50 g), rửa bằng 20 ml hexan và làm bay hơi trong máy cô quay ở 30 ^oC dưới áp suất giảm cho đến khi khô hết.

5.2. Tách phân đoạn hydrocarbon steroidal

5.2.1. Chuyển phần còn lại lên cột tách hai lần, mỗi lần dùng với 1 ml hexan. Cho mẫu chảy lên cột bằng cách để cho dung dịch chảy từng giọt lên trên natri sulfat và bắt đầu rửa giải sắc kí với hexan ở tốc độ dòng khoảng 1 ml/min. Loại bỏ từ 25 ml đến 30 ml dịch rửa giải đầu tiên, sau đó thu lấy 40 ml dịch rửa giải tiếp theo. Sau khi thu dịch rửa giải, chuyển phân đoạn này vào bình cầu đáy tròn 100 ml (4.3).

Phân đoạn đầu tiên chứa các hydrocarbon bão hòa [xem Hình 1a)] và phân đoạn thứ hai chứa các hydrocacbon steroidal. Khi rửa giải tiếp, sẽ cho các hydrocacbon không bão hòa và các hợp chất tương tự. Để tách tốt các hydrocacbon bão hòa và hydrocacbon steroidal, cần tối ưu hóa các phần thể tích. Để thực hiện điều này, thể tích của phân đoạn đầu tiên cần được chỉnh sao cho khi phân đoạn thứ hai được phân tích thì các pic đại diện cho các hydrocarbon bão hòa là thấp [xem Hình 1 c)]; nếu các pic này không xuất hiện cường độ pic chuẩn thấp, thì cần giảm thể tích. Tuy nhiên, việc tách hoàn toàn giữa các thành phần của phân đoạn thứ nhất và phân đoạn thứ hai là không cần thiết, vì không có sự chồng lấn của các pic trong quá trình phân tích GC nếu các điều kiện GC được điều chỉnh như trong 5.3.1.

CHÚ THÍCH Thông thường, không cần tối ưu hóa thể tích phân đoạn thứ hai vì vẫn có thể tách tốt với các thành phần khác. Tuy nhiên, sự có mặt của pic rộng với thời gian lưu thấp hơn khoảng 1,5 min so với thời gian lưu của chất chuẩn là do hydrocarbon không bão hòa và điều này làm cho tách kém.

5.2.2. Làm bay hơi phân đoạn thứ hai trong bộ cô quay ở 30 ^oC trong điều kiện áp suất giảm cho đến khi khô và hòa tan ngay phần cặn trong 0,2 ml hexan. Giữ dung dịch này trong tủ lạnh cho đến khi phân tích.

Phần cặn còn lại từ các bước 5.1.3 và 5.2.2 không được để khô hoặc để ở nhiệt độ phòng. Ngay sau khi thu được phần cặn, thêm dung môi và bảo quản các dung dịch này trong tủ lạnh.

5.3. Sắc kí khí

5.3.1. Các điều kiện làm việc đối với bơm chia dòng

Các điều kiện này phải như sau:

– nhiệt độ bơm: 300 ^oC;

– nhiệt độ detector: 320 ^oC;

– máy tích phân: các thông số tích phân phải cố định sao cho đánh giá đúng các diện tích; nên tích phân phần lõm xuống.

– độ nhạy: tối thiểu khoảng 16 lần;

– lượng dung dịch được bơm, 1 ml;

– nhiệt độ chương trình lò: ban đầu, 235 ^oC trong 6 min, sau đó tăng với tốc độ 2 ^oC/min đến 285 ^oC;

– bơm có bộ chia dòng 1:5;

– khí mang: khí heli hoặc hydro ở áp suất khoảng 120 kPa và 85 kPa, tương ứng.

Các điều kiện này có thể được điều chỉnh phù hợp với các đặc tính của các thiết bị sắc kí khí và cột để cho sắc kí đồ đáp ứng các yêu cầu sau đây:

– pic của chất chuẩn nội trong vòng khoảng 5 min của thời gian nêu trong 5.3.2.

– pic của chất chuẩn nội phải ít nhất 80 % trên toàn bộ thang đo.

Hệ thống sắc kí khí phải được kiểm tra bằng cách bơm hỗn hợp dung dịch gốc 3,5-cholestadiene (3.6) và dung dịch n-nonacosan (3.8). Pic 3,5-cholestadiene phải xuất hiện trước pic của n-nonacosan [Hình 1c)]. Nếu không, thì có thể thực hiện hai thao tác: giảm nhiệt độ lò và/hoặc sử dụng cột phân cực thấp hơn.

5.3.2. Nhận biết pic

Nếu sử dụng heli làm khí mang, thì pic của chất chuẩn nội xuất hiện ở khoảng 19 min và pic của stigmastadiene ở thời gian lưu tương đối 1,29 [xem Hình 1b)]. Nếu sử dụng khí hydro, thì pic của chất chuẩn nội xuất hiện ở khoảng 13 min và pic của các stigmastadiene ở thời gian lưu tương đối 1,35. Chuẩn đối chứng đối với pic của các stigmastadiene có thể thu được bằng cách phân tích dung dịch 3,5-stigmastadiene (3.9).

CHÚ THÍCH Nếu không có sẵn 3,5-stigmastadiene (24-ethyl-cholesta-3,5-diene) thì chuẩn đối chứng sắc ký đối với các stigmastadiene có thể thu được bằng cách phân tích từ 1 g đến 2 g dầu thực vật tinh luyện. Các stigmastadiene cho pic rõ ràng và dễ nhận biết.

Pic của các stigmastadiene là pic sắc kí đơn lẻ thu được từ hỗn hợp của 3,5-stigmastadiene và một lượng nhỏ đồng phân 2,4. Tuy nhiên, nếu cột có độ phân cực lớn và có độ phân giải cao, thì đồng phân 2,4 có thể xuất hiện là một pic nhỏ đứng trước và gần với pic của 3,5-stigmastadiene (Hình 2). Để đảm bảo rằng cả hai stigmastadiene cũng được rửa giải như một pic, thì nên thay cột bằng một cột khác phân cực kém hơn hoặc có đường kính trong rộng hơn.

a) Phân đoạn thứ nhất (30 ml) từ dầu nguyên chất, có thêm chuẩn.

b) Phân đoạn thứ hai (40 ml) từ dầu ô liu chứa các stigmastadiene hàm lượng 0,10 mg/kg.

c) Phân đoạn thứ hai (40 ml) chứa tỷ lệ nhỏ phân đoạn thứ nhất.

Hình 1 – Sắc kí đồ thu được từ các mẫu dầu ôliu được phân tích trên cột mao quản silica nung chảy (đường kính trong 0,25 mm, dài 25 m) được phủ phenylmetylsilicon 5 %, độ dày màng 0,25 mm

Hình 2 – Sắc ký đồ thu được từ mẫu dầu ôliu tinh luyện được phân tích trên cột DB-5 hiển thị đồng phân của 3,5-stigmastadiene

6. Tính kết quả

Hàm lượng các stigmastadiene, w, tính bằng miligam trên kilôgam, xác định được theo công thức:

Trong đó

A_s là diện tích của pic các stigmastadiene (nếu pic bị tách thì lấy tổng các diện tích của các đồng phân 3,5 và 2,4);

A_c là diện tích của chất chuẩn nội (3,5-cholestadiene);

m_c là khối lượng chất chuẩn (3,5- cholestadiene) được thêm vào, tính bằng microgam (mg);

m_o là khối lượng của dầu được lấy, tính bằng gam (g).

Hệ số đáp ứng của chất chuẩn nội 3,5- cholestadiene liên quan đến hệ số đáp ứng của các stigmastadiene là bằng 1.

Báo cáo kết quả đến hai chữ số thập phân.

7. Độ chụm

7.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các nền mẫu khác với các dải nồng độ và các nền mẫu đã nêu.

7.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử, tiến hành trên cùng một vật liệu thử, thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người phân tích, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị, r, được tính theo công thức.

r = 0,20

trong đó  là trung bình hàm lượng các stigmastadiene trong dải từ 0,10 mg/kg đến 1,0 mg/kg.

7.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, vượt quá giới hạn tái lập, R, được tính từ công thức sau đây:

R = 0,41

trong đó  là hàm lượng các stigmastadiene trong dải từ 0,10 mg/kg đến 1,0 mg/kg.

7.4. Độ nhạy

Độ nhạy của phương pháp được chứng minh bởi các giá trị thấp đối với r và R được nghiên cứu ở các nồng độ thấp. Giới hạn phát hiện là 0,01 mg/kg.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ít nhất bao gồm các thông tin sau đây:

– mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

– kết quả thử nghiệm thu được; hoặc

– nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Một phép thử cộng tác quốc tế gồm 10 phòng thử nghiệm đã tiến hành trên ba mẫu dầu nguyên chất:

– mẫu 1: dầu nguyên chất tinh khiết, có hàm lượng các stigmastadiene thấp;

– mẫu 2: dầu nguyên chất tinh khiết đã bổ sung dầu thực vật tinh luyện, với hàm lượng các stigmastadiene trung bình;

– mẫu 3: dầu nguyên chất tinh khiết đã bổ sung dầu thực vật tinh luyện, với hàm lượng các stigmastadiene cao.

Phép thử thực hiện trên dầu vào năm 1993 do Liên minh Quốc tề về Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng (IUPAC) công nhận và các kết quả thu được được phân tích thống kê theo ISO 5725 4) cho dữ liệu về độ chụm trong Bảng A.1.

Bảng A.1 – Tổng kết các kết quả thống kê năm 1993

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] L ANZON A., ALBI T., CERT A. and GRACIAN J., J. Am. Oil Chem, Soc., 71, 285 (1994).

[2] ERT A., LAMZON A., CARELLI A.A., ALBI T. and AMELOTTIG., Food Chem., 49, 287 (1994).

[3] G ROB K. and BRONZ M., Riv. Ital. Sostanze grasse, 71. 291 (1994).

[4] L ANZONA., CERT A. and ALBI T., Grasas y Aceites, 40, 385 (1989).

[5] ISO 5725:1986, Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests

[6] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung

[7] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.