Tiêu chuẩn TCVN 14442:2025 Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phát hiện và định lượng histamin trong thủy sản bằng HPLC

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14442:2025

ISO 19343:2017

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HISTAMIN TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỬ DỤNG DETECTOR UV

Microbiology of the food chain - Detection and quantification of histamine in fish and fishery products - HPLC method

Lời nói đầu

TCVN 14442:2025 hoàn toàn tương đương với ISO 19343:2017;

TCVN 14442:2025 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F11 Thủy sản và sản phẩm thủy sản biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Histamin ở cá là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm. Histamin có thể có mặt chủ yếu trong các loài thuộc họ Cá thu ngừ (Scombridae) và họ Cá trích (Clupeidae), các loài có chứa mức histidin tự do cao. Histamin được hình thành qua quá trình khử nhóm carboxyl của histidin bởi vi khuẩn sinh enzym histidin decarboxylase.

Histamin [2-(1 H-imidazol-5-yl)ethanamin] được xác định là phân tử nitơ cơ bản khối lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học. Việc tiêu thụ thực phẩm có chứa nồng độ đáng kể histamin có thể gây ra các triệu chứng tương tự như các triệu chứng liên quan đến dị ứng thực phẩm.

Tiêu chuẩn này được xây dựng nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu chuẩn hóa phương pháp phát hiện và định lượng histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản.[1]

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG HISTAMIN TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỬ DỤNG DETECTOR UV

Microbiology of the food chain - Detection and quantification of histamine in fish and fishery products - HPLC method

CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn này phải thành thạo với các thao tác thực hành phòng thử nghiệm thông thường. Tiêu chuẩn này không đề cập đến tất cả các vấn đề an toàn, nếu có, liên quan đến việc sử dụng tiêu chuẩn. Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác thực hành thích hợp liên quan đến sức khỏe và an toàn.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản (nước mắm, cá được làm chín bằng enzym trong nước muối, v.v...) dùng làm thực phẩm.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này không có thuật ngữ nào được định nghĩa.

4 Nguyên tắc

Phương pháp này cho phép tách histamin trong số các amin sinh học trong thủy sản và sản phẩm thủy sản. Mẫu thử được chiết bằng cách trộn với acid perchloric. Sử dụng dansyl chloride tạo dẫn xuất trước cột chloride. Các amin sinh học và các thành phần trong dung dịch được tách bằng HPLC với cột thích hợp và xác định bằng detector UV. Nồng độ khối lượng histamin được tính từ tỷ lệ diện tích pic của histamin và chất nội chuẩn bằng đường chuẩn.

5 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phù hợp với loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. Dung môi phải đạt chất lượng dùng cho phân tích HPLC, trừ khi có quy định khác.

5.1 Aceton, CH ₃ COCH ₃ .

5.2 Acetonitril, CH ₃ CN.

5.3 Toluen, C ₇ H ₈ .

5.4 Nước, dùng cho HPLC.

5.5 Nước, cất hoặc tương đương.

5.6 Khí nitơ.

5.7 Acid perchloric, c(HClO ₄ ) = 0,2 mol/L (được khuyến cáo).

Pha loãng 19,5 ml HClO ₄ 65 % hoặc 17,2 ml HClO ₄ 70 % bằng nước (5.5) đến 1 000 ml. Dung dịch này bền trong sáu tháng nếu được bảo quản ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C).

5.8 Dung dịch natri carbonat bão hòa, Na ₂ CO ₃ .

Hòa tan 110 g natri carbonat trong khoảng 150 ml nước (5.5). Dung dịch này dư và bền trong ba tháng nếu được bảo quản ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.

5.9 Dung dịch dansyl chloride, ρ(C ₁₂ H _{1 2} ClNO ₂ S) = 7,5 mg/ml.

Hòa tan 0,375 g dansyl chloride trong 50 ml aceton (5.1). Dung dịch này bền trong ba tuần nếu được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ < -18 °C.

5.10 Dung dịch L-prolin, ρ(C ₅ H ₉ NO ₂ ) = 100 mg/ml.

Hòa tan 1 g L-prolin trong 10 ml nước (5.5). Dung dịch này bền trong ba tuần nếu được bảo quản ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.

5.11 Dung dịch chuẩn gốc histamin, ρ(C ₅ H ₉ N ₃ ) = 12,5 mg/ml.

Hòa tan 1,034 g histamin dihydrochloride trong 50 ml nước (5.5). Dung dịch này bền trong một năm nếu được bảo quản ở nhiệt độ < -18 °C.

5.12 Dung dịch nội chuẩn (IS) gốc 1,7-diaminoheptan, ρ(C ₇ H ₁₈ N ₂ ) = 6,4 mg/ml (được khuyến cáo).

Hòa tan 0,320 g 1,7-diaminoheptan trong 50 ml nước (5.5). Dung dịch này bền trong ba tuần nếu được bảo quản ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.

6 Thiết bị, dụng cụ

6.1 Máy nghiền, ví dụ: máy xay, trộn.

6.2 Cân phân tích, độ chính xác đến 0,1 g và 0,001 g.

6.3 Máy đồng hóa cầm tay, có các thanh kim loại.

6.4 Máy ly tâm, được làm lạnh, có lực ly tâm là 8 000g.

6.5 Ống ly tâm, (bằng chất dẻo) có nắp đậy.

6.6 Pipet, dung tích từ 20 μl đến 200 μl và từ 100 μl đến 1 000 μl.

6.7 Ống nghiệm, (bằng thủy tinh chịu nhiệt) có nắp đậy.

6.8 Máy trộn Vortex.

6.9 Nồi cách thủy, có thể duy trì ở 60 °C ± 1 °C có nắp đậy tối màu hoặc tương đương.

6.10 Tủ lạnh, có thể duy trì ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C.

6.11 Tủ đông, có thể duy trì ở nhiệt độ <-18 °C.

6.12 Bộ bay hơi dòng khí nỉtơ.

6.13 Kim bơm, loại 20G, đường kính 0,9 mm, dùng một lần.

6.14 Bộ lọc, cỡ lỗ 0,2 μm dùng một lần [polytetrafluoroethylen (PTFE)/polypropylen (PP)].

6.15 Xyranh, dung tích 2 ml, dùng một lần.

6.16 Hệ thống LC, có bơm, bộ lấy mẫu tự động được làm lạnh, lò cột (25 °C ± 2 °C), detector UV bước sóng λ = 254 nm (UV).

6.17 Cột LC, Kromasil® ^[1] C18 cỡ hạt 5 μm, kích thước 100 Å (25 cm × 4,6 mm) hoặc tương đương.

6.18 Lọ lấy mẫu tự động bằng thủy tinh, dung tích 2 ml, có ống lồng (200 μl) và nắp đậy có đệm.

7 Cách tiến hành

7.1 Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu thử (thịt cá) bằng cách nghiền trong máy nghiền (6.1). Chuyển 5 g ± 0,1 g phần mẫu thử thịt cá đồng nhất vào ống ly tâm (6.5).

7.2 Chiết mẫu

Cho 10 ml acid perchloric (5.7) và 100 μl 1,7-diaminoheptan (5.12) vào 5 g mẫu thịt cá trong ống ly tâm và trộn bằng máy đồng hóa (6.3). Sau khi mẫu đồng nhất hoàn toàn, ly tâm bằng máy ly tâm (6.4) ở gia tốc 8 000g trong 5 min ở 4 °C.

7.3 Tạo dẫn xuất

Chuyển 100 μl phần nổi phía trên vào ống nghiệm (6.7), thêm 300 μl dung dịch natri carbonat (5.8) và 400 μl dung dịch dansyl chloride (5.9).

Trộn bằng máy trộn Vortex (6.8) và ủ trong nồi cách thủy (6.9) 60 °C ở nơi tối trong 5 min.

Làm nguội ống dưới vòi nước lạnh và thêm 100 μl dung dịch L-prolin (5.10).

Trộn bằng máy trộn Vortex (6.8) và đặt ống nghiệm ở nơi tối trong 15 min.

CHÚ THÍCH 1: Phần nổi phía trên có thể được bảo quản ở nhiệt độ < -18 °C trong một tuần.

7.4 Tinh sạch

Thêm 500 μl toluen (5.3) và trộn bằng máy trộn Vortex (6.8).

CHÚ THÍCH 1: có thể dừng thao tác tại bước này, bảo quản dung dịch mẫu ở nhiệt độ < -18 °C trong tối đa một tuần.

Chuyển hết pha hữu cơ nổi phía trên vào ống nghiệm mới (6.7) và làm khô trong tủ hút bằng dòng khí nitơ (6.12).

CHÚ THÍCH 2: Toluen trong pha hữu cơ chứa dẫn xuất histamin và không phải là pha “không hữu cơ” (chứa nước). Pha hữu cơ có thể dễ dàng thu hồi được bằng cách làm đông lạnh pha lỏng (nhiệt độ < -18 °C tối thiểu trong 30 min). Ngoài ra, việc đông lạnh có thể làm tăng chất lượng của pha hữu cơ phía trên.

Hòa lại ống đã được làm khô bằng 200 μl acetonitril (5.2)/nước (5.4) (tỷ lệ 60/40 phần thể tích) và trộn bằng máy trộn Vortex (6.8).

Lọc dung dịch (6.13, 6.14 và 6.15) vào lọ lấy mẫu tự động bằng thủy tinh (6.18) và đặt vào bộ lấy mẫu tự động (6.16).

7.5 Điều kiện LC

Có thể sử dụng các hệ thống HPLC và UHPLC. Các thông số chỉ thị phụ thuộc vào thiết bị và cột được nêu trong Phụ lục A.

7.6 Dãy mẫu chuẩn

Các mẫu chuẩn cần được chuẩn bị bằng cách thêm các thể tích dung dịch chuẩn gốc histamin (5.11) vào các mẫu đồng nhất được chuẩn bị theo 7.1 từ nền mẫu không chứa histamin.

Cho các thể tích dung dịch gốc histamin được quy định trong Bảng 1 vào mẫu thử không chứa histamin, tiến hành bước chiết (7.2) và tạo dẫn xuất (7.3), tinh sạch (7.4) và LC (7.5).

Để tránh ảnh hưởng nền mẫu và độ chệch, dựng đường chuẩn trên cùng một nền mẫu (không chứa histamin) như mẫu thử được phân tích.

Bảng 1 - Ví dụ về việc chuẩn bị các mẫu chuẩn

8 Tính kết quả

8.1 Đường chuẩn

Dựng đường chuẩn tuyến tính, sử dụng các mẫu chuẩn histamin (7.6), chất nội chuẩn và Công thức (1):

Trong đó:

C _HS là nồng độ khối lượng của histamin trong mẫu chuẩn, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg);

A _HS là diện tích pic của chất chuẩn histamin;

A _IS là diện tích pic của chất nội chuẩn.

8.2 Định lượng histamin

Tính nồng độ histamin trong mẫu thử bằng Công thức (2) (phương trình hồi quy):

Trong đó:

Khối lượng, m, thường tương ứng với 5 g nhưng nếu nồng độ mẫu nằm ngoài dãy mẫu chuẩn thì tiến hành phép phân tích mới với phần mẫu thử nhỏ hơn để nồng độ mẫu nằm trong dải tuyến tính đại diện của mẫu thử.

CHÚ THÍCH: Nếu nền mẫu phức tạp hoặc khó tìm được nền mẫu không chứa histamin (ví dụ: bột cá, nước mắm, v.v...) thì có thể thực hiện phương pháp thêm chuẩn trực tiếp.

9 Độ chụm

9.1 Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Các kết quả của nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để xác định độ chụm của phương pháp được tóm tắt trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các loại thực phẩm khác với các dải nồng độ và các loại thực phẩm nêu trong Phụ lục B.

9.2 Giới hạn lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ hoặc tỷ lệ giữa hai kết quả thử nghiệm cao hơn so với thấp hơn trên thang đo chuẩn, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r. Các giá trị độ lặp lại của phép thử cộng tác được nêu trong Bảng 2.

9.3 Giới hạn tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R. Các giá trị độ tái lập đối với thử nghiệm cộng tác được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Các giá trị trung bình, giới hạn lặp lại (r) và giới hạn tái lập (R) của histamin trong thử nghiệm cộng tác

Phụ lục A

(tham khảo)

Khuyến cáo đối với việc tách bằng HPLC

A.1 Điều kiện LC

Có thể sử dụng các hệ thống HPLC và UHPLC. Các thông số được đưa ra trong điều này là các ví dụ và chỉ thị vì chúng phụ thuộc vào thiết bị và cột được sử dụng. Thực hiện theo các hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thể tích bơm: 20 μl

Cột: C18 hoặc tương đương

Nhiệt độ lò cột: 25 °C ± 2 °C

Nhiệt độ khay: 5 °C ± 2 °C

Pha động: 1 ml/min

Pha rửa giải: acetonitril/nước

A.2 Thứ tự bơm mẫu

Mẫu được bơm theo thứ tự sau:

- acetonitril tinh khiết (kiểm tra nhiễu);

- các mẫu chuẩn hiệu chuẩn;

- các mẫu thử;

- tiếp tục các mẫu kiểm tra xác nhận hiệu chuẩn (CCV) (cùng nồng độ của đường chuẩn một nồng độ);

- acetonitril tinh khiết (rửa cột).

A.3 Thời gian rửa giải

Xem Bảng A.1.

Bảng A.1 - Ví dụ về thời gian rửa giải đối với cột Kromasil ^{® [2]} C18 cỡ hạt 5 μm kích thước 100 Å (25 cm × 4,6 mm)

A.4 Sắc ký đồ

Xem Hình A.1

CHÚ DẪN:

Hình A.1 - Ví dụ về sắc ký đồ được thực hiện ở cá ngừ có các amin sinh học (putrescin, cadaverin, histamin, tyramin, spermidin và spermin) ở mức nồng độ 100 mg/kg và chất nội chuẩn (5.12)

Phụ lục B

(tham khảo)

Đặc tính hiệu năng của phương pháp

B.1 Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm quốc tế do Phòng thử nghiệm an toàn thực phẩm ANSES (Boulogne- sur-Mer, Pháp) trong khuôn khổ của CEN Mandate M381 tổ chức thực hiện. Nghiên cứu này bao gồm 9 phòng thử nghiệm từ 7 quốc gia tham gia và tiến hành thử nghiệm trên cá ngừ, cá trích và cá thu. Mỗi loài được thử nghiệm ở ba mức thêm chuẩn. Nghiên cứu được tổ chức vào năm 2013 theo TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994). Các mẫu được gửi đến trong hộp chứa sau khi khử trùng. Đường chuẩn được tính trên cá ngừ không chứa histamin. ^{[2] , [3], [4], [5]}

B.1.1 Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trên cá ngừ vây vàng (Thunnus albacares)

Các kết quả được nêu trong Bảng B.1. Không có dữ liệu nào bị loại ra.

Bảng B.1 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng đối với cá ngừ vây vàng

B.1.2 Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trên cá trích Đại Tây Dương (Clupea harengus)

Các kết quả được nêu trong Bảng B.2. Không có dữ liệu nào bị loại ra.

Để tránh ảnh hưởng nền mẫu và độ chệch nêu trên, dựng đường chuẩn trên cùng một nền mẫu như mẫu thử được phân tích.

Bảng B.2 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng đối với cá trích Đại Tây Dương

B.1.3 Nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trên cá thu Đại Tây Dương (Scomber scombrus)

Kết quả được nêu trong Bảng B.3. Không có dữ liệu nào bị loại ra.

Để tránh ảnh hưởng nền mẫu và độ chệch nêu trên, dựng đường chuẩn trên cùng một nền mẫu như mẫu thử được phân tích.

Bảng B.3 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng đối với cá thu Đại Tây Dương

B.2 Dữ liệu về độ chụm

B.2.1 Nghiên cứu hiệu năng ở nồng độ 400 mg/kg đối với các nền mẫu khác nhau

Nghiên cứu được thực hiện bởi Anses (Pháp). Kết quả được nêu trong Bảng B.4.

Bảng B.4 - Xác định độ thu hồi đối với cá ngừ, cá thu và nước mắm

B.2.2 Nghiên cứu hiệu năng liên phòng thử nghiệm

Nghiên cứu được thực hiện bởi Anses (Pháp). Bảng sơ đồ profile độ chính xác được nêu trong Hình B.1.

Profile độ chính xác

CHÚ DẪN:

Hình B.1 - Profile độ chính xác

B.2.3 Nghiên cứu tính ổn định của histamin trong cá thu Đại Tây Dương (Scomber scombrus)

Nghiên cứu được thực hiện bởi Viện Sức khỏe và An toàn Thực phẩm Liên bang Bavaria (Đức) và cho thấy độ thu hồi histamin tốt trong cá thu với đường chuẩn cá thu, xem kết quả trong Bảng B.5.

Bảng B.5 - Kết quả xử lý khác nhau đối với độ ổn định histamin

B.2.4 So sánh với tạo dẫn xuất sau cột

Nghiên cứu được thực hiện bởi Viện Sức khỏe và An toàn Thực phẩm Liên bang Bavaria (Đức), xem Tài liệu tham khảo [6].

Điều quan trọng là phải ước tính tiêu chí hiệu năng trong quá trình xây dựng phương pháp vì chúng phụ thuộc vào thiết bị được sử dụng. Các giới hạn phát hiện và định lượng phải tuân theo giới hạn của các tiêu chí quy định về histamin trong thực phẩm. Có thể sử dụng phương pháp tạo dẫn xuất trước cột hoặc sau cột nhưng chuẩn bị mẫu thử phải tuân theo 7.1.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Commission Regulation (EC) No 2037/2005 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs

[2] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[3] NF V03-110:2010, Analysis of agri-food stuffs - Protocol of characterization for the validation of a quantitative method of analysis by construction of an accuracy profile

[4] MALLE P., VALLE M., BOUQUELET S. Assay of biogenic amines involved in fish decomposition. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1996, 79 pp. 43-49

[5] DUFLOS G., DERVIN C., MALLE P., BOUQUELET S. Relevance of matrix effect in determination of biogenic amines in Plaice and Whiting. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1999, 82 (5) pp. 1097-1101

[6] L10.00/5 “Untersuchung von Lebensmitteln - Bestimmung des Gehaltes an biogenen Aminen in Fisch und Fischerzeugnissen Hochdruckfliissigkeitschromatographische Bestimmung Referenzverfahren” Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §64-LFBG, Beuth Verlag GmbH Berlin, Nov. 1999.