Tiêu chuẩn TCVN 8475:2010 Xác định omega-3 và omega-6 trong chất béo sữa

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8475:2010

ISO 23065:2009

CHẤT BÉO SỮA TỪ CÁC SẢN PHẨM SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 BẰNG SẮC KÝ KHÍ-LỎNG

Milk fat from enriched dairy products - Determination of omega-3 and omega-6 fatty acid content by gas-liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 8475:2010 hoàn toàn tương đương với ISO 23065:2009/IDF 211:2009;

TCVN 8475:2010 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tổ chức biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

CHẤT BÉO SỮA TỪ CÁC SẢN PHẨM SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO OMEGA-3 VÀ OMEGA-6 BẰNG SẮC KÝ KHÍ-LỎNG

Milk fat from enriched dairy products - Determination of omega-3 and omega-6 fatty acid content by gas-liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng axit béo omega-3 (w-3) và omega-6 (w - 6) trong chất béo sữa dạng khan được tách chiết từ các sản phẩm sữa có bổ sung hoặc được làm giàu một cách tự nhiên các thành phần này.

Quy trình quy định này cho phép đánh giá các axit béo w - 3 và w - 6 quan trọng nhất.

CHÚ THÍCH Các ký hiệu “omega-3”, “w-3 và “w3” là không đúng, nhưng trong sử dụng thông thường thì tương đương với “w - 3”. Điều này cũng đúng với “omega-6”, “w-6” và “w6”, tương đương với “w - 6”.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn khi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8103 (ISO 14156), Sữa và sản phẩm sữa – Phương pháp chiết lipit và các hợp chất hòa tan trong lipit

ISO 15884/IDF 182, Milk fat – Preparation of fatty acid methyl esters (Chất béo sữa – Chuẩn bị các metyl este của axit béo)

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1.

axit béo w - 3 (w - 3 fatty acid)

axit béo omega 3 (omega-3 fatty acid)

axit béo omega-3 [(omega-3 fatty acid (deprecated)]

axit béo w-3 [(w -3 fatty acid (deprecated)]

axit béo w3 [(w3 fatty acid (deprecated)]

axit không béo bão hòa đa có liên kết đôi đầu tiên ở vị trí cacbon thứ ba từ nhóm metyl cuối cùng.

3.2.

axit béo w - 6 (w - 6 fatty acid)

axit béo omega 6 (omega-6 fatty acid)

axit béo omega-6 [(omega-6 fatty acid (deprecated)]

axit béo w-6 [(w-6 fatty acid (deprecated)]

axit béo w6 [(w6 fatty acid (deprecated)]

axit không béo bão hòa đa có liên kết đôi đầu tiên ở vị trí cacbon thứ sáu từ nhóm metyl cuối cùng.

3.3.

hàm lượng axit béo w - 3 và w - 6 (w - 3 and w - 6 fatty acid content)

phần khối lượng của các chất xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Hàm lượng axit báo w - 3 và w - 6 được biểu thị bằng phần khối lượng tính bằng miligam trên 100 g chất béo của các axit béo được liệt kê trong Bảng 1.

Bảng 1 – Các thành phần của hàm lượng axit béo w - 3 và axit béo w - 6

4. Nguyên tắc

Chất chuẩn nội được bổ sung vào chất béo sữa dạng khan. Các metyl este của axit béo (FAME) được tạo thành do este hóa. Các FAME được tách ra và được xác định bằng sắc kí khí mao quản. Các axit béo w - 3 và w - 6 được định lượng dựa trên chất chuẩn nội.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

5.1. n-hexan [CH₃(CH₂)₄CH₃].

5.2. FAME C23:0 (tricosanoic), có độ tinh khiết 99 % phần khối lượng.

5.3. Dung dịch chuẩn FAME C23:0

Cân chính xác khoảng 25 mg C23:0 (5.2) cho vào bình định mức một vạch 25 ml (6.3). Pha loãng bằng n-hexan (5.1) đến vạch và trộn. Dung dịch chuẩn C23:0 có thể bền trong một tháng khi được bảo quản trong tủ lạnh.

5.4. FAME EPA C20:5 w - 3, có độ tinh khiết 99 % phần khối lượng.

5.5. Dung dịch chuẩn FAME C20:5 w - 3

Cân chính xác khoảng 10 mg C20:5 w - 3 (5.4) trong bình định mức một vạch 10 ml (6.3). Pha loãng bằng n-hexan (5.1) đến vạch và trộn.

5.6. FAME DHA C22:6 w - 3, có độ tinh khiết 99 % phần khối lượng.

5.7. Dung dịch chuyển FAME C22:6 w - 3

Cân chính xác khoảng 10 mg C22:6 w - 3 (5.6) trong bình định mức một vạch 10 ml (6.3). Pha loãng bằng n-hexan (5.1) đến vạch và trộn.

5.8. FAME LA C18:2 w - 6, có độ 99 % phần khối lượng.

5.9. Dung dịch chuẩn FAME C18:2 w - 6

Cân chính xác khoảng 10 mg C18:2 w - 6 (5.8) trong bình định mức một vạch 10 ml (6.3). Pha loãng bằng n-hexan (5.1) đến vạch và trộn.

5.10. Hỗn hợp đối chứng, gồm các metyl este của axit béo w - 3 và w - 6, để định tính dựa vào thời gian lưu.

Hỗn hợp đối chứng cần chứa các FAME của các axit được liêt kê trong Bảng 1 cùng với chất chuẩn nội C23:0 metyl este (5.2). Hỗn hợp này có thể thu được bằng cách trộn 1 ml của bốn dung dịch chuẩn (5.3, 5.5, 5.7 và 5.9) với 1 ml của ba dung dịch khác được chuẩn bị bằng cách cân a-linolenic, stearidonic và FAM DPA (độ tinh khiết ít nhất 80 % phần khối lượng) ở nồng độ tương tự n-hexan (1 mg/ml).

Do giá của một số các FAME w - 3 cao, nên có thể dùng các hỗn hợp có bán sẵn trên thị trường (kể cả các FAME khác) để thay thế hỗn hợp đối chứng. Nếu sử dụng hỗn hợp FAME chưa bão hòa đa có bán sẵn, thì cần tính đến nồng độ của chúng, chỉnh bằng n-hexan, nếu cần. Nếu không có sẵn, thì thêm một lượng thích hợp của dung dịch chuẩn FAME C23:0 (5.3).

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ cụ thể sau:

6.1. Cân phân tích, có khả năng đọc được đến 0,1 mg.

6.2. Tủ sấy, có khả năng duy trì được nhiệt độ ở 60 ^oC ± 2 ^oC.

6.3. Bình định mức một vạch, dung tích 10 ml, 25 ml và 50 ml, loại A được quy định trong TCVN 7153 (ISO 1042)⁽⁴⁾.

6.4. Pipet một vạch, dung tích 1 ml và 5 ml, loại A được quy định trong TCVN 7151 (ISO 648)^[1].

6.5. Pipet chia độ, dung tích 5 ml, loại A được quy định trong TCVN 7150 (ISO 835)^[3].

6.6. Ống nghiệm, dung tích 10 ml, có nắp vặn bằng polytetraflouroethylen có lớp lót.

6.7. Máy sắc kí khí-lỏng, có gắn detector ion hóa ngọn lửa và hệ thống bơm phân dòng mao quản hoặc bơm lên cột.

6.7.1. Khí mang, hydro hoặc heli có độ tinh khiết ít nhất là 99,999 % phần khối lượng.

6.7.2. Các loại khí khác, không được có chất nhiễm bẩn hữu cơ kể cả dạng vết (hàm lượng hydrocacbon nhỏ hơn 1 mg/kg), nitơ và hydro, độ tinh khiết ít nhất 99,995 % phần khối lượng và không khí tổng hợp.

6.7.3. Cột mao quản, có pha tĩnh tách được tốt các FAME.

Nên sử dụng các cột mao quản pha tĩnh polyetylen glycol có chiều dài 25 m, 30 m hoặc 60 m, đường kính trong 0,25 mm hoặc 0,32 mm và chiều dày màng phim 0,12 mm hoặc 0,25 mm. Các cột này được rửa giải các FAME trước, tiếp theo chiều dài mạch cacbon và sau đó là số lượng các liên kết đôi. Có thể sử dụng các pha phân cực lớn hơn, như pha tĩnh cyanosilicon, nhưng trong trường hợp này, cần chú ý đặc biệt khi nhận dạng pic, ngoài ra, với tính phân cực càng tăng thì việc tách giữa FAME 23:0 được dùng làm chất chuẩn nội và FAME C20:5 w - 3 thu được càng khó.

6.7.4. Điều kiện sắc kí khí: Nhiệt độ lò và tốc độ dòng khí mang phụ thuộc vào các cột được chọn và khí mang được chọn. Trong mọi trường hợp, các điều kiện được chọn phải tạo ra sự tách biệt giữa C18:4 w - 3 và C18:2 liên hợp axit linoleic (CLA) và giữa DPA (xem Hình A.1 và Hình A.2).

Xem Ví dụ 1 và Ví dụ 2 về các điều kiện.

VÍ DỤ 1: Sử dụng khí heli làm khí mang và các điều kiện lò đẳng nhiệt, các điều kiện được áp dụng cho việc tách tốt FAME w - 3 và w - 6 là:

Sắc đồ thu được trong các điều kiện sắc kí khí lỏng này được nêu trong Hình A.1.

VÍ DỤ 2: Sử dụng khí hydro làm khí mang và các điều kiện của lò được cài đặt chương trình, các điều kiện được áp dụng cho việc tách dùng FAME w - 3 và w - 6 là:

Sắc đồ thu được trong các điều kiện sắc kí khí lỏng này được nêu trong Hình A.2.

6.7.5. Detector ion hóa ngọn lửa, có thể được làm nóng đến nhiệt độ cao hơn 30 ^oC so với nhiệt độ cuối cùng của lò cột.

6.7.6. Bơm phân dòng, có thể được làm nóng đến nhiệt độ cao hơn 30 ^oC so với nhiệt độ cuối cùng của lò cột.

CHÚ THÍCH Cũng có thể sử dụng tốt hệ thống bơm lên cột cho phép phân tích này. Trong trường hợp này, tiến hành pha loãng thích hợp với n-hexan trước khi bơm (ví dụ: 1 ml dung dịch được chuẩn bị trong 9.2 với 9 ml n-hexan).

6.7.7. Xyranh bơm, dung tích 1 ml hoặc 5 ml.

6.7.8. Hệ thống tích phân, tốt nhất là được vi tính hóa.

7. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707)^[2].

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chất béo sữa dạng khan thu được theo TCVN 8103 (ISO 14156), chú ý để loại bỏ dung môi chiết càng triệt để càng tốt bằng cách làm nóng chất béo đến nhiệt độ không quá 60 ^oC để tránh phân hủy các axit béo không bão hòa đa.

9. Cách tiến hành

9.1. Dung dịch hiệu chuẩn để xác định hệ số phản ứng của LA, EPA và DHA

Dùng pipet (6.4) lấy 1 ml dung dịch chuẩn FAME EPA (5.4), 1 ml dung dịch chuẩn FAME DHA (5.6), 1 ml dung dịch chuẩn FAME LA (5.8) và 1 ml chất chuẩn nội FAME C23:0 (5.3) cho vào ống nghiệm (6.6.) và trộn.

9.2. Phần mẫu thử

Làm nóng chảy mẫu thử (Điều 8) ở 50 ^oC. Lắc mẫu nóng chảy trong 1 min để có được mẫu thử đồng nhất. Cân 100 mg mẫu đồng nhất, chính xác đến 1 mg, cho vào ống nghiệm (6.6).

Trước khi chuẩn bị FAME theo ISO 15884, dùng pipet (6.4) lấy 1 ml dung dịch chuẩn FAME C23:0 (5.3). Do đó, chỉ thêm 4 ml n-hexan thay vì 5 ml được quy định trong ISO 15884. Lượng chất chuẩn nội (FAME C23:0) là khoảng 1 % phần khối lượng của chất béo. Điều này rất hữu ích để định lượng các axit béo w - 3  và w - 6 trong khoảng từ 0,5 % đến 4 % phần khối lượng (ví dụ: các sản phẩm có bổ sung dầu cá).

Nếu nồng độ của một hoặc nhiều axit béo w - 3 và w - 6 cao hơn 4 % phần khối lượng (nghĩa là sản phẩm có bổ sung dầu lanh) thì nồng độ của FAME C23:0 sẽ phải tăng lên. Trong trường hợp này, việc bổ sung 5 ml n-hexan quy định trong ISO 15884 cần được thay thế bằng 5 ml FAME C23:0 (5.3).

Khi kết thúc quá trình metyl hóa, chuyển 2 ml phần nổi phía trên sang ống nghiệm (6.6), hoặc trực tiếp vào các lọ lấy mẫu tự động. Dung dịch này được dùng ngay để phân tích sắc kí khí hoặc có thể được bảo quản trong tủ lạnh đến 2 ngày.

9.3. Xác định chất lượng

Bơm 1 ml của hỗn hợp đối chứng (5.10) vào máy sắc kí khí. Ghi lại thời gian lưu của các pic có thể quy cho chất chuẩn nội C23:0, LA, a-LNA, axit stearidonic, EPA, DPA và DHA.

9.4. Định lượng

9.4.1. Tính hệ số phản ứng

9.4.1.1. Bơm vào máy sắc kí khí 1 ml dung dịch hiệu chuẩn (9.1). Xác định diện tích các pic được quy cho FAME C23:0, LA, EPA và DHA.

9.4.1.2. Tính hệ số phản ứng, f_rw, đối với FAME của LA, EPA và DHA, tương ứng, theo công thức (1):

                             (1)

Trong đó:

A_C23:0 là diện tích pic của FAME C23:0 (9.4.1.1);

A_w là diện tích pic của FAME của LA, EPA hoặc DHA (9.4.1.1);

m_C23:0 là khối lượng của FAME C23:0 trong dung dịch hiệu chuẩn (9.1), tính bằng miligam (mg);

m_w là khối lượng của FAME của LA, EPA hoặc DHA trong dung dịch hiệu chuẩn (9.1), tính bằng miligam (mg);

W_C23:0 là độ tinh khiết của FAME C23:0 (5.2), ví dụ: w_C23:0 = 0,99, tính bằng miligam trên miligam (mg/mg);

w_w là độ tinh khiết của FAME chuẩn của LA, EPA hoặc DHA (5.4, 5.6 hoặc 5.8), ví dụ: w_w = 0,99, tính bằng miligam trên miligam (mg/mg).

9.4.2. Xác định trên phần mẫu thử

Bơm 1 ml phần mẫu thử (9.2) vào máy sắc kí khí, áp dụng các điều kiện tương tự như đã sử dụng cho dung dịch hiệu chuẩn. Xác định diện tích pic được coi là FAME của dung dịch chuẩn nội C23:0, LA, a-LNA, axit stearidonic, EPA, DPA và DHA.

Lặp lại việc bơm các dung dịch hiệu chuẩn và tính f_rw (9.4.1.2).

9.5. Tính và biểu thị kết quả

9.5.1. Bằng cách sử dụng các kết quả của dung dịch chuẩn (9.1) được bơm trước và sau khi phân tích phần mẫu thử, tính hệ số phản ứng trung bình, nghĩa là, , đối với các FAME của LA, EPA và DHA, độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên giữa các giá trị. Phép xác định thành công cho các hệ số biến thiên nhỏ hơn 2.

CHÚ THÍCH Hệ số phản ứng tính được đối với EPA FAME cũng có thể áp dụng cho FAME của a-linolenic và axit stearidonic và hệ số phản ứng tính được đối với FAME DHA cũng áp dụng được cho FAME DPA.

9.5.2. Tính phần khối lượng của từng axit béo w - 3  và w - 6 trong phần mẫu thử, w_i, bằng miligam trên 100 g chất béo, theo công thức (2):

                          (2)

Trong đó:

A_C23:0 là diện tích pic của FAME C23:0 (9.4.2);

A_i là diện tích pic của từng FAME w - 3  và w - 6 trong phần mẫu thử (9.4.2);

là hệ số phản ứng trung bình của từng FAME w - 3  và w - 6 (9.5.1)

m_s là khối lượng của phần mẫu thử (9.2), tính bằng miligam (mg);

m_C23:0 là khối lượng của dung dịch chuẩn FAME C23:0 trong phần mẫu thử (9.2), tính bằng miligam (mg);

w_C23:0 là độ tinh khiết của FAME chuẩn C23:0 (5.2), ví dụ: w_23:0 = 0,99, tính bằng miligam trên miligam (mg/mg);

9.6. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả chính xác đến một chữ số thập phân.

10. Độ chụm

Các chi tiết của các phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp phù hợp với TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) và TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2: 1994) được nêu trong Phụ lục B.

Các giá trị về giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập được biểu thị ở mức xác xuất 95 % và có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền đã nêu.

10.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn 4,3 % giá trị trung bình đối với các hàm lượng axit béo w - 3  và w - 6 trong khoảng từ 200 mg/100 g chất béo đến 9 000 mg/100 chất béo.

10.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các nhà phân tích khác nhau sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn 25,3 % giá trị trung bình đối với hàm lượng axit béo w - 3  và w - 6  trong khoảng từ 200 mg/100 mg đến 9 000 mg/100 g chất béo.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại, nêu kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Các ví dụ về phép phân tích sắc kí khí lỏng

CHÚ DẪN

Hình A.1 – Ví dụ 1 về sắc phổ khí lỏng của các FAME, bao gồm cả tầm nhìn mở rộng của w - 3, w - 6  và vùng phân giải pic của CLA thu được dưới các điều kiện trong 6.7.4

CHÚ DẪN

Hình A.2 – Ví dụ 2 về sắc phổ khí lỏng của các FAME, bao gồm cả tầm nhìn mở rộng của w - 3, w - 6 và vùng phân giải pic của CLA thu được dưới các điều kiện trong 6.7.4

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Phép thử liên phòng thử nghiệm

Sáu mẫu chất béo dạng khan (ba cặp mẫu mù) có chứa ba phần khối lượng của dầu cá là 8 %, 10 %, 12 % và sáu mẫu chất béo dạng khan (lặp lại ba cặp mẫu mù) có chứa ba phần khối lượng của dầu lanh là 8 %, 12 % và 16 % được chuẩn bị và được phân phối cho 17 phòng thử nghiệm tham gia. Phép thử này được CRA - FLC Istituto Sperimentale Lattiero Caseario (IT) tổ chức thực hiện và đánh giá.

Các kết quả được đánh giá thống kê dựa trên phần khối lượng, tính bằng miligam trên 100 g chất béo độc lập với từng loại axit, từ đó đã phát hiện được tám mức khác nhau.

Các kết quả thu được đã được phân tích thống kê theo TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994)^[6] cho các dữ liệu về độ chụm như trong Bảng B.1.

CHÚ THÍCH Các kết quả chi tiết của nghiên cứu thí điểm và nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được nêu trong [7].

Bảng B.1 – Kết quả thử nghiệm liên phòng

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Pipet một mức

[2] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Lấy mẫu

[3] TCVN 7150 (ISO 835), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Pipet chia độ

[4] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức

[5] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[6] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[7] CONTARINI, G. Determination of omega-3 and omega-6 fatty acid content by gas-liquid chromatography in milk fat from enriched products – Interlaboratory collaborative studies. Bull, Int. Dairy Fed. 2008, (428), pp. 1-17.