Tiêu chuẩn TCVN 7607:2017 Phân tích dấu ấn sinh học phân tử trong thực phẩm

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 7607:2017

ISO 21572:2013

THỰC PHẨM - PHÂN TÍCH DẤU ẤN SINH HỌC PHÂN TỬ - PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN PROTEIN

Foodstuffs - Molecular biomarker analysis - Protein-based methods

Lời nói đầu

TCVN 7607:2017 thay thế TCVN 7607:2007;

TCVN 7607:2017 hoàn toàn tương đương ISO 21572:2013;

TCVN 7607:2017 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - PHÂN TÍCH DẤU ẤN SINH HỌC PHÂN TỬ - PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN PROTEIN

Foodstuffs - Molecular biomarker analysis - Protein-based methods

CẢNH BÁO - Cần tuân thủ tất cả các hướng dẫn được cung cấp bởi nhà sản xuất bộ kit thử/thuốc thử và các quy trình bảo đảm an toàn khác của phòng thử nghiệm chuẩn. Đọc kỹ và thực hiện theo các bảng dữ liệu an toàn đối với vật liệu (MSDS).

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn chung và các tiêu chí hiệu năng đối với các phương pháp phát hiện và/hoặc định lượng các protein đặc hiệu hoặc protein cần tìm có trong nền mẫu cụ thể.

Các hướng dẫn chung này đề cập đến các phương pháp dựa trên kháng thể có mặt. Các phương pháp khác được nêu trong Phụ lục A hoặc Phụ lục B cũng có thể phát hiện được các protein cần tìm. Các tiêu chí nêu trong tiêu chuẩn này thường được áp dụng.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 7608 (ISO 24276) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1  Các thuật ngữ chung

3.1.1

Mẫu (sample)

Tập hợp con của tổng thể gồm một hoặc nhiều đơn vị mẫu.

[TCVN 8244-2:2010, 1.2.17 (ISO 3534-2:2006, 1.2.17)].

3.1.2

Mẫu phòng thử nghiệm (laboratory sample)

Mẫu (3.1.1) được chuẩn bị để gửi đến phòng thử nghiệm cho mục đích kiểm tra hoặc thử nghiệm.

[TCVN 6900-2:2001, 3.1 (ISO 78-2:1999, 3.1)].

3.1.3

Mẫu thử (test sample)

Mẫu (3.1.1) được chuẩn bị để thử nghiệm hoặc phân tích, toàn bộ khối lượng hoặc một phần được sử dụng để phân tích hoặc thử nghiệm một lần.

[TCVN 8244-2:2010, 5.3.11 (ISO 3534-2:2006, 5.3.11)].

3.1.4

Phần mẫu thử (test portion)

Phần của mẫu thử (3.1.3) được sử dụng để thử hoặc phân tích đồng thời một lần.

[TCVN 8244-2:2010, 5.3.12 (ISO 3534-2:2006, 5.3.12)].

3.1.5

Nền mẫu (matrix)

Các sản phẩm cần phân tích, có thể có các thành phần hóa học và trạng thái vật lý khác nhau.

[TCVN 11134:2015, 3.1.4 (22174:2005, 3.1.4)].

3.1.6

Làm biến tính protein (denaturation of proteins)

Việc xử lý bằng hóa chất (sinh học) và/hoặc bằng phương pháp vật lý để phá hủy hoặc biến đổi các đặc tính về cấu trúc, chức năng, các đặc tính enzym hoặc các đặc tính kháng nguyên của protein cần tìm hoặc của chất phân tích.

3.2  Thuật ngữ liên quan đến kháng thể

3.2.1

Kháng thể (antibody)

Protein (globulin miễn dịch) tạo thành và được tế bào bạch huyết B (tế bào lympho) tiết ra trong phản ứng với các phân tử được coi là ngoại lai (kháng nguyên) và có khả năng liên kết với một kháng nguyên đặc hiệu (3.2.2).

3.2.2

Kháng nguyên (antigen)

Chất kích thích sản xuất ra các kháng thể (3.2.1) và phản ứng với chúng.

3.2.3

Dòng vô tính (clone)

Quần thể các tế bào giống hệt nhau có nguồn gốc từ một tế bào.

3.2.4

Phản ứng chéo (cross-reactivity)

Sự liên kết của kháng thể (3.2.1) với các chất không phải là chất phân tích ban đầu cần tìm.

3.2.5

Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody)

Kháng thể (3.2.1) được tạo ra từ dòng vô tính (3.2.3) lai đơn và được hướng vào một yếu tố quyết định kháng nguyên (3.2.2).

3.2.6

Kháng thể đa dòng (polyclonal antibody)

Hỗn hợp của các phân tử glubulin miễn dịch, được tiết ra để chống lại chất tạo miễn dịch, mỗi phân tử kháng thể nhận ra một trình tự epitop khác nhau.

[ISO 19001:2013, 3.11].

3.2.7

Tính đặc hiệu của kháng thể (specificity of an antibody)

Khả năng của một kháng thể (3.2.1) liên kết đặc hiệu với một yếu tố quyết định kháng nguyên (3.2.2) và không liên kết với các cấu trúc tương tự khác hoặc các kháng nguyên khác.

3.3  Thuật ngữ liên quan đến kỹ thuật

3.3.1

Chất cộng hợp (conjugate)

Chất được tạo ra bằng việc gắn kết hai hoặc nhiều chất với nhau bằng liên kết cộng hóa trị qua các nhóm hóa học.

VÍ DỤ: Các chất cộng hợp của các kháng thể có huỳnh quang (ví dụ, thực thể hóa học, là một phân tử hoặc một nhóm chất phát sáng phản ứng kích thích bằng hấp thụ ánh sáng tới), các chất đánh dấu phóng xạ, vàng hoặc các enzym thường được sử dụng trong các phép thử miễn dịch.

3.3.2

Quy trình western blotting protein/protein immunoblot (Western blotting protocol/protein immunoblot)

Chuyển một protein đến một bề mặt liên kết sau khi tách bằng điện di có thể quan sát được bằng nhiều phương pháp khác nhau

VÍ DỤ: Một kháng thể đã được đánh dấu phóng xạ đặc trưng hoặc bằng một kháng thể cộng hợp enzym tiếp theo là bổ sung một cơ chất enzym đặc thù để tạo thành sản phẩm phản ứng có màu.

3.3.3

Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết enzym (ELISA - enzyme linked immunosorbent assay)

Phép thử trong ống nghiệm (in vitro) được sử dụng cho các mục đích định tính, bán định lượng hoặc định lượng kết hợp các kháng thể cộng hợp enzyme và cơ chất để tạo thành một sản phẩm phản ứng có màu.

3.3.4

Bộ kit thử (test kit)

Một bộ gồm các hóa chất, vật liệu và hướng dẫn sử dụng, được đóng gói chung và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất bộ kit thử.

3.3.5

Phép thử sắc ký miễn dịch dòng ngang (lateral flow immuno chromatographic assay)

Dải/thiết bị dòng ngang (lateral flow device/strip)

Phép thử định tính hoặc bán định lượng nhanh, đơn giản để phát hiện sự có mặt (hoặc không có mặt) của protein cần tìm trong mẫu chứa kháng thể (3.2.1) hoặc chất phân tích được phủ lên bề mặt rắn và nhúng vào chất lỏng thử nghiệm để đo protein cần tìm trong chất lỏng.

CHÚ THÍCH  Các mẫu thử nghiệm chảy dọc theo giá thể rắn thông qua mao quản. Sau khi mẫu chất lỏng đi vào dải thử nghiệm, gặp thuốc thử màu trộn với mẫu và đi qua giá thể gặp dòng hoặc vùng đã được xử lý trước bằng kháng thể hoặc kháng nguyên. Tùy thuộc vào chất phân tích có trong mẫu, thuốc thử màu có thể liên kết tại đường kiểm tra hoặc vùng thử. Các phép thử này có thể thực hiện như một phép thử cạnh tranh hoặc phép thử xen kẽ.

3.4  Thuật ngữ liên quan đến kiểm soát

3.4.1

Mẫu chuẩn (reference material)

Vật liệu, đồng nhất và các tính chất đặc thù của nó phải ổn định, được thiết lập để dùng cho mục đích sử dụng trong quá trình đo hoặc trong kiểm tra các đặc tính thông thường.

TCVN 6165 [ISO/IEC Guide 99].

3.4.2

Chuẩn đo (standard measurement)

Vật đo, phương tiện đo, mẫu chuẩn (3.4.1) hoặc hệ thống đo để định nghĩa, thể hiện, duy trì hoặc tái tạo một hay nhiều giá trị của đại lượng để dùng làm chuẩn hoặc để chuẩn bị các đặc tính đã biết được sử dụng để chuẩn hóa trong phép phân tích.

3.5  Thuật ngữ liên quan đến xác nhận hiệu lực

3.5.1

Độ chính xác (accuracy)

Mức độ gần nhau giữa kết quả thử nghiệm hoặc kết quả đo và giá trị quy chiếu được chấp nhận

CHÚ THÍCH 1  Khi áp dụng thuật ngữ “độ chính xác” cho một kết quả thử hoặc kết quả đo, bao gồm sự kết hợp của các thành phần ngẫu nhiên với sai số của hệ thống hoặc độ chệch (3.5.3).

CHÚ THÍCH 2  Khi áp dụng phương pháp thử, thuật ngữ độ chính xác nói đến sự kết hợp của độ đúng và độ chụm (3.5.2).

[TCVN 8244-2:2010, 3.3.1 (ISO 3534-2:2006, 3.3.1), đã cải biến - Chú thích 1 và 2 khác với gốc và do đó không có Chú thích 3]

3.5.2

Độ chụm (precision)

Mức độ gần nhau giữa các kết quả thử nghiệm độc lập/kết quả phép đo nhận được trong điều kiện quy định.

CHÚ THÍCH 1  Thước đo độ chụm thường được thể hiện trong các thuật ngữ của độ lệch chuẩn.

[TCVN 8244-2:2010, 3.3.4 (ISO 3534-2:2006, 3.3.4)]

3.5.3

Độ chệch (bias)

Chênh lệch giữa ước tính của kết quả thử hoặc kết quả đo so với kết quả thực.

CHÚ THÍCH 1  Độ chệch là sai số hệ thống tổng đối lập với sai số ngẫu nhiên. Có thể có một hoặc nhiều thành phần sai số hệ thống làm gia tăng độ chệch. Sai số hệ thống lớn hơn từ giá trị thực phản ánh độ chệch lớn hơn.

3.5.4

Độ nhạy (sensitivity)

Tỷ số giữa sự thay đổi số chỉ của hệ thống đo và sự thay đổi tương ứng trong giá trị của đại lượng được đo.

CHÚ THÍCH 1  Độ nhạy có thể phụ thuộc vào giá trị của đại lượng được đo. Độ nhạy thường là lượng nhỏ nhất hoặc nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có thể nhận biết được từ mẫu.

[TCVN 6165 (ISO/IEC 99)]

3.5.5

Tính chọn lọc (selectivity)

Phạm vi mà một phương pháp có thể xác định các chất phân tích đặc biệt trong một hỗn hợp hoặc nền mẫu mà không có sự can thiệp từ các thành phần khác có tác động tương tự.

CHÚ THÍCH 1  Tính chọn lọc là thuật ngữ trong hóa học phân tích biểu hiện phạm vi mà một phương pháp đặc biệt có thể xác định chất phân tích với sự có mặt của các thành phần khác. Tính chọn lọc có thể được phân loại.

[Pure Appl. Chem.]

3.5.6

Giới hạn phát hiện (LOD) (detection limit/limit of detection) (LOD)

Hàm lượng tối thiểu hoặc nồng độ tối thiểu của protein cần tìm trong một lượng nền mẫu xác định có thể phát hiện được trong các điều kiện thực nghiệm quy định trong phương pháp.

[TCVN 11134:2015 (ISO 22174: 2005, 3.1.8), sửa đổi - "LOD" đã được thêm vào và "của vi sinh vật đích" trở thành "của POI".]

3.5.7

Giới hạn định lượng (LOQ) (determination limit/limit of quantitation) (LOQ)

Hàm lượng tối thiểu hoặc nồng độ tối thiểu của protein cần tìm trong một lượng nền mẫu xác định có thể đo được với độ đảm bảo đo thích hợp trong các điều kiện thử nghiệm được quy định trong phương pháp này.

3.5.8

Khoảng áp dụng (khoảng định lượng/khoảng tuyến tính/khoảng biến động) (applicability range (range of quantification/linearity/dynamic range)

Giới hạn trên và giới hạn dưới của phép định lượng được biểu thị bằng một dãy mẫu chuẩn (hoặc độ pha loãng) với mức phù hợp của độ chụm và độ chính xác (3.5.1)..

3.5.9

Điều kiện lặp lại (repeatability conditions)

Điều kiện quan trắc tại đó các kết quả thử/đo độc lập (3.4.3) nhận được với cùng một phương pháp trên các cá thể thử/đo giống nhau (1.2.34), trong cùng một phòng thử nghiệm hoặc thiết bị đo, bởi cùng một người thao tác, sử dụng cùng một thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn.

CHÚ THÍCH 1  Điều kiện lặp lại bao gồm: cùng một quy trình đo hoặc thử; cùng một người thao tác; cùng một thiết bị đo/thử sử dụng trong cùng điều kiện; cùng một vị trí; lặp lại trong một khoảng thời gian ngắn

[TCVN 8244-2:2010, 3.3.6 (ISO 3534-2:2006, 3.3.6)]

3.3.10

Độ lặp lại (repeatability)

Độ chụm trong các điều kiện lặp lại (3.5.9).

[TCVN 8244-2:2010, 3.3.5 (ISO 3534-2:2006, 3.3.5)]

3.5.11

Giới hạn lặp lại (repeatability limit)

Giá trị mà chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm nhận được trong điều kiện lặp lại (3.5.9) nhỏ hơn hoặc bằng giá trị đó với xác suất bằng 95 %.

[TCVN 6910-1:2001, 3.16 (ISO 5725-1:1994, 3.16)]

3.5.12

Độ lệch chuẩn lặp lại (repeatability standard deviation)

Độ lệch chuẩn của các kết quả thử hoặc kết quả đo nhận được trong điều kiện lặp lại (3.5.9).

CHÚ THÍCH 1  Đây là thước đo sự phân tán của phân bố các kết quả thử hoặc đo trong điều kiện lặp lại.

CHÚ THÍCH 2  Tương tự, “phương sai lặp lại” và “hệ số biến động lặp lại” có thể được định nghĩa và sử dụng như là thước đo sự phân tán của các kết quả thử hoặc kết quả do trong điều kiện lặp lại.

[TCVN 8244-2:2010, 3.3.7 (ISO 3534-2:2006, 3.3.7)]

3.5.13

Điều kiện tái lập (reproducibility conditions)

Điều kiện quan trắc tại đó các kết quả thử/đo độc lập nhận được bởi cùng một phương pháp, trên các vật liệu thử/đo giống hệt nhau trong các phòng thử hoặc đo khác nhau, với những người thao tác khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau.

[TCVN 8244-2:2010, 3.3.11 (ISO 3534-2:2006, 3.3.11)]

3.5.14

Độ tái lập (reproducibility)

Độ chụm trong các điều kiện tái lập (3.5.13).

[TCVN 8244-2:2010, 3.3.10 (ISO 3534-2:2006, 3.3.11); TCVN 6900-2:2001, 3.13 (ISO 78-2:1999, 3.13)]

3.5.15

Giới hạn tái lập (reproducibility limit)

Giá trị mà độ lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm nhận được trong điều kiện tái lập nhỏ hơn hoặc bằng giá trị đó với xác suất bằng 95 %.

[TCVN 6910-1:2001, 3.20 (ISO 5725-1:1994, 3.20)]

3.5.16.

Độ lệch chuẩn tái lập (reproducibility standard deviation)

Độ lệch chuẩn của kết quả thử (3.4.1) hoặc kết quả đo (3.4.2) nhận được trong điều kiện tái lập (3.5.13)

CHÚ THÍCH 1  Đây là thước đo sự phân tán của các kết quả thử hoặc kết quả đo trong điều kiện tái lập.

CHÚ THÍCH 2  Tương tự, “phương sai tái lặp” và “hệ số biến động tái lập” có thể được định nghĩa và sử dụng như là thước đo sự phân tán của các kết quả thử hoặc kết quả đo trong điều kiện tái lập.

4  Nguyên tắc

Protein cần tìm được chiết bằng quy trình quy định cho từng nền mẫu cụ thể và sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện hoặc đo nồng độ của protein trong mẫu. Để phát hiện các protein đặc hiệu trong các thành phần, nguyên tắc cơ bản của phương pháp là:

- lấy mẫu đại diện của nền mẫu;

- tách protein;

- phát hiện và/hoặc định lượng protein cần tìm thu được từ nền mẫu đang được nghiên cứu.

5  Thuốc thử

Trong suốt quá trình phân tích chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử ion hoặc nước tinh lọc hoặc có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

Các loại thuốc thử khác, như các kháng thể, các chất cộng hợp, các cơ chất, các dung dịch dừng phản ứng và các dung dịch đệm là những đặc trưng của phương pháp. Cần tham khảo phương pháp đối với các loại thuốc thử đặc trưng liên quan như các protein chuẩn hoặc mẫu chuẩn, các kháng thể hoặc các bề mặt rắn đã phủ, các mẫu kiểm chứng và các mẫu thử.

Thuốc thử được quy định trong A.4.2, A.4.3, B.4.2 và B.4.3.

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ được quy định trong A.5 và B.5.

7  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, Phụ lục A và Phụ lục B cung cấp các hướng dẫn lấy mẫu theo các phương pháp có liên quan. Các bên liên quan nên thỏa thuận vấn đề này.

8  Cách tiến hành

8.1  Yêu cầu chung

Các điều kiện bảo quản và hạn sử dụng của các que thử hoặc dải thử, chất cộng hợp, cơ chất v.v... do nhà sản xuất quy định.

Sử dụng các dụng cụ phòng thử nghiệm thích hợp, có khả năng liên kết protein thấp (ví dụ: ống polypropylen) để ngăn ngừa hấp phụ protein trong suốt quá trình thử nghiệm.

Để sử dụng tiêu chuẩn này, cần tuân thủ các yêu cầu chung về đảm bảo chất lượng đối với các phòng thử nghiệm (ví dụ: liên quan đến hiệu chuẩn thiết bị, phép xác định kép, phép thử trắng, sử dụng mẫu chuẩn, dựng đường chuẩn v.v...). Cần làm sạch các dụng cụ tiếp xúc trực tiếp với mẫu để tránh nhiễm bẩn. Xem TCVN ISO/IEC 17025 (ISO/IEC 17025) để biết thêm thông tin.

8.2  Chuẩn bị dung dịch mẫu

Khi đã thu được mẫu đại diện, xem quy trình chuẩn bị mẫu cụ thể trong các Phụ lục.

Nghiền mẫu theo quy định trong phương pháp trước khi lấy các phần mẫu thử, nếu cần. Bột/bột mì có thể có các đặc tính trương nở và có thể cần đến dung dịch chiết nhiều hơn nếu phương pháp của nhà sản xuất không nêu rõ thông tin này. Nếu mẫu chưa được sử dụng ngay, cần thực hiện quy trình bảo quản của phòng thử nghiệm (ví dụ: - 20 °C hoặc thấp hơn).

Các mẫu phòng thử nghiệm chứa hàm lượng chất béo cao có thể khó đồng nhất và có thể cần phải chiết một lượng mẫu thử lớn. Nếu thích hợp, có thể xem hướng dẫn trong Phụ lục A.

Cân một lượng thích hợp mẫu phân tích đại diện (như quy định trong Phụ lục tương ứng) để tạo phần mẫu thử để chiết. Cho dung dịch chiết vào và đồng hóa hoặc trộn.

8.3  Chiết

Sử dụng quy trình chiết thích hợp đối với nền mẫu. Chi tiết về các điều kiện thích hợp cho quy trình chiết/pha loãng phần mẫu thử, mẫu kiểm chứng và mẫu chuẩn được nêu trong Phụ lục A đối với ELISA và Phụ lục B đối với dải dòng ngang. Cần sử dụng các quy trình chiết thích hợp đối với nền mẫu. Mẫu đã chiết phải được sử dụng ngay hoặc được xử lý theo quy định trong quy trình bảo quản.

8.4  Chuẩn bị đường chuẩn, các mẫu kiểm chứng dương và mẫu chuẩn

Để dựng đường chuẩn, chuẩn bị các mẫu kiểm chứng dương và chất chuẩn trong Phụ lục A, nên sử dụng các mẫu chuẩn hoặc mẫu chuẩn đã được đánh giá phù hợp đối với nền mẫu. Đường chuẩn thường không yêu cầu cho việc áp dụng định tính như dải dòng ngang, tuy nhiên, các mẫu kiểm chứng dương và kiểm chứng âm có thể được chuẩn bị tùy theo người phân tích.

8.5  Quy trình phân tích

Để kiểm tra định lượng, chọn số giếng cần thiết (ví dụ trong ELISA) cho các phần mẫu thử cần phân tích, bao gồm cả mẫu trắng, các chất chuẩn đo và mỗi lần thêm, tối thiểu cần thực hiện hai lần song song, được pha loãng đúng cách để phân tích.

Để kiểm tra định tính hoặc kiểm tra bán định lượng, chọn số phép thử cần thiết (ví dụ: dải dòng ngang hoặc ELISA) cho các phần mẫu thử cần phân tích. Sự ổn định của các tín hiệu sau cùng có thể thay đổi. Đọc kết quả tại thời điểm được quy định trong các Phụ lục.

Tùy theo phương pháp được chọn, thực hiện các hướng dẫn của từng phương pháp phân tích mẫu, bao gồm cả mẫu trắng và các chất chuẩn đo (nếu cần). Để phản ứng xảy ra ở dải nhiệt độ và thời gian quy định. Nếu cần, kết thúc phản ứng theo phương pháp được mô tả trong các Phụ lục tương ứng. Ví dụ, nếu phương pháp ELISA yêu cầu thu thập dữ liệu trên máy quang phổ, thì thực hiện bước này. Trong trường hợp phép thử định tính, thường được giải thích bằng cách quan sát, thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit thử.

9  Diễn giải và biểu thị kết quả

9.1  Yêu cầu chung

Các thông số cần diễn giải thay đổi theo phép thử định tính, bán định lượng hoặc định lượng.

Đối với các phép thử định lượng, hệ số biến thiên (CV) của giá trị mật độ quang phát sinh từ các phép đo lặp lại của dung dịch mẫu thử, thường không vượt quá 15 %. Hệ số biến thiên của các nồng độ tính được từ các phép đo lặp lại dung dịch mẫu thử, thường không vượt quá 20 %.

Nếu giới hạn hệ số biến thiên bị vượt quá, cần lặp lại các phép phân tích trên dung dịch mẫu thử mới được chuẩn bị. Trong trường hợp này, để thiết lập hệ số biến thiên, cần tiến hành ít nhất ba phép xác định (ví dụ: các giá trị từ 3 giếng thử).

Các kết quả âm tính phải được báo cáo là “âm tính tại giới hạn phát hiện” và phải báo cáo lại giới hạn phát hiện.

Các kết quả dương tính thấp hơn giá trị giới hạn định lượng phải được báo cáo là “dương tính cao hơn giới hạn phát hiện nhưng thấp hơn giới hạn định lượng”. Các giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện này phải được nêu trong báo cáo.

9.2  Phân tích định lượng và bán định lượng

Các thông số sau đây phải được đánh giá: dữ liệu thô của dung dịch mẫu thử, mẫu thử trắng, mẫu chuẩn hoặc chuẩn đo và kiểm chứng âm, % hệ số biến thiên giữa các phép thử kép, % hệ số biến thiên của chất chuẩn và % hệ số biến thiên của các mẫu kiểm chứng.

Theo TCVN ISO/IEC 17025:2007 (ISO/IEC 17025:2005), 5.10.1 c), khi thích hợp độ không đảm bảo đo phải được nêu trong báo cáo.

Các kết quả định lượng không được báo cáo bằng phép ngoại suy trên điểm hiệu chuẩn cao nhất hoặc dưới điểm hiệu chuẩn thấp nhất.

9.3  Phân tích định tính

Đối với các phép thử định tính, bao gồm tất cả các ứng dụng, các thông số tương ứng được mô tả trong các Phụ lục. Giới hạn phát hiện luôn được nêu trong báo cáo và các kết quả âm phải được nêu trong báo cáo là “âm tính ở giới hạn phát hiện”.

Các kết quả dương tính cũng phải được báo cáo cả giới hạn phát hiện.

10  Các thông số đặc trưng có thể ảnh hưởng đến kết quả

10.1  Yêu cầu chung

Các tiêu chí hiệu năng được liệt kê trong phương pháp của Phụ lục A là một loạt các quy định về hiệu năng được thiết lập cho từng phương pháp trong quá trình xây dựng, đánh giá hiệu lực và sử dụng phương pháp. Các thông số có độ tin cậy và có sự ổn định cao phải được ước tính và được đánh giá cho từng phương pháp. Mỗi lần áp dụng phương pháp, dữ liệu thu được phải được đánh giá và so sánh với tiêu chí hiệu năng của phương pháp đã thiết lập.

Khi có một giá trị (ví dụ, hệ số biến thiên của các phép xác định lặp lại) không thống nhất với các quy định kỹ thuật của phép thử, có nghĩa là kết quả thu được là không điển hình và cần đánh giá chặt chẽ hơn các dữ liệu. Danh mục các quy định kỹ thuật phải được thực hiện đầy đủ, các thông số riêng lẻ trong một số trường hợp nhất định có thể không đáp ứng các yêu cầu, nhưng số liệu có thể vẫn chấp nhận được. Tuy nhiên, nếu bất kỳ một tiêu chí nào không đáp ứng, thì cần được ghi lại và số liệu phải được đánh giá để xác định các kết quả cần được điều chỉnh, hoặc khi phải lặp lại trên một mẫu cụ thể hoặc một loạt mẫu. Các quyết định này cần được chuyên gia kỹ thuật điều chỉnh toàn bộ các tiêu chí.

10.2  Các xem xét đặc biệt

10.2.1  Tính chọn lọc

Tính chọn lọc đầy đủ của phép thử đối với một chất phân tích cụ thể, cần được chứng minh cho mỗi protein cần tìm hoặc chất phân tích (protein) đo được trong từng nền mẫu cần phân tích. Khi thích hợp, cần đánh giá phản ứng chéo đối với các chất tương tự (các protein có cấu trúc hoặc trình tự tương tự). Để kiểm tra sự không có mặt của protein cần tìm trong mẫu thì phân tích mẫu không chứa protein cần tìm và các mẫu chứa protein cần tìm ở các độ pha loãng thích hợp và so sánh.

Điều này thường được thực hiện trong quá trình xây dựng và đánh giá xác nhận phương pháp và không cần thực hiện trong quá trình phân tích mẫu thông thường mà trước đó đã được thực hiện để đánh giá hiệu lực phương pháp. Tính chọn lọc của các bộ kit thử, phương pháp ELISA hoặc thiết bị dòng ngang, cần được nhà sản xuất bộ kit thử cung cấp (ví dụ: được liệt kê trong các sản phẩm của nhà sản xuất thêm vào).

10.2.2  Hiệu quả chiết

Cần đánh giá cẩn thận ảnh hưởng của các thông số quá trình lên các mẫu phòng thử nghiệm.

Để có được độ nhạy cao nhất cho một phép thử miễn dịch, hiệu quả chiết phải càng cao càng tốt, đặc biệt là với phương pháp định lượng. Hiệu quả phân tích phụ thuộc vào nền mẫu. Cần xác định hiệu quả chiết và ghi chép đối với từng nền mẫu.

Quy trình chiết phải cho thấy có khả năng tái lập và phương pháp hiệu chuẩn (nếu áp dụng) phải được tính đến cho trường hợp chiết không hoàn toàn.

10.2.3  Ảnh hưởng của nền mẫu

Phạm vi áp dụng cần xác định chính xác và rõ ràng các nền mẫu có thể áp dụng cho một phép thử miễn dịch nhất định. Sử dụng mẫu chuẩn phù hợp với nền mẫu để so sánh trực tiếp giữa mẫu chuẩn và mẫu thử. Tuy nhiên, nếu mẫu cần phân tích so với mẫu chuẩn mà không cùng một nền mẫu thì phải đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu.

Ví dụ, chuẩn bị dịch chiết âm tính cho từng mẫu (nền mẫu) cần phân tích bằng phương pháp và dịch chiết đối chứng dương ở nồng độ đã biết. Chuẩn bị một dãy các dung dịch pha loãng kiểm chứng dương trong dịch chiết âm tính và so sánh đường đáp ứng liều tạo thành với đường chuẩn của phương pháp. Nếu hai đường này khác nhau tức là có ảnh hưởng của nền mẫu. Sử dụng nền mẫu gần giống nhất với các mẫu thực tế cần thử nghiệm. Đường cong pha loãng với kiểm chứng dương có nồng độ đã biết cũng được tham khảo. Hình dạng của đường chuẩn không được thay đổi do ảnh hưởng của nền mẫu.

10.3  Khả năng áp dụng của phép thử

10.3.1  Yêu cầu chung

Chế biến thực phẩm thường làm biến chất hoặc biến tính protein cần tìm, có thể dẫn đến thay đổi đáng kể về phản ứng miễn dịch. Phép thử miễn dịch cần được đánh giá về khả năng áp dụng với các protein cần tìm trong các sản phẩm chế biến.

10.3.2  Hiệu ứng Hook

Trong thiết bị dòng ngang dựa trên kháng thể và phép thử dạng tấm, hiệu ứng Hook (bão hòa) có thể dẫn đến kết quả âm tính giả. Cần chứng minh rằng dải nồng độ làm việc bao trùm nhu cầu thực tế của các mẫu thử nghiệm protein.

10.3.3  Trạng thái song song/tuyến tính

Đối với các phép phân tích định lượng, dải động học dự kiến của phép thử miễn dịch phải được nêu rõ trong phần phạm vi áp dụng cho tất cả các loại nền mẫu của phép phân tích. Mối tương quan của thiết bị với nồng độ protein cần tìm đã biết có thể không tuyến tính và được nhà sản xuất thiết lập với từng phương pháp thử miễn dịch định lượng. Protein cần tìm có thể tuyến tính trong một dải rất hẹp, nhưng trong hầu hết các trường hợp, phép thử miễn dịch cho thấy một mối quan hệ phức tạp hơn đã được mô tả trước đây như là một hàm bậc hai hoặc bốn tham số.

Cần có ít nhất bốn điểm hiệu chuẩn và nằm trong khoảng các giá trị phân tích.

10.3.4  Giới hạn phát hiện

Các kết quả không được diễn giải dưới mức giới hạn phát hiện. Trong trường hợp này, báo cáo kết quả phải nêu rõ theo phương pháp có thể áp dụng như mô tả trong 9.1 đến 9.3.

10.3.5  Các giới hạn định lượng

Phải nêu rõ giới hạn định lượng cho từng bộ hiệu chuẩn (hoặc độ pha loãng).

Nồng độ dự kiến của các dung dịch mẫu thử chưa biết phải được nội suy chứ không được ngoại suy.

Kết quả không được ngoại suy dưới giới hạn định lượng hoặc trên điểm cao nhất hoặc dưới điểm thấp nhất của đường chuẩn.

11  Phương pháp khẳng định

Để thiết lập độ tin cậy của phép thử, các phương pháp khác như phương pháp western blotting protein, HPLC hoặc phân tích tính năng có thể được sử dụng để đó của mẫu phân tích đã biết nồng độ. Sau đó so sánh các kết quả của cả hai phương pháp định tính/định lượng. Việc này rất quan trọng đối với các phép thử miễn dịch do các kháng thể có thể phản ứng chéo với các chất phân tích khác có mặt trong nền mẫu.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết phòng thử nghiệm;

b) mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu phòng thử nghiệm;

c) viện dẫn tiêu chuẩn này và phương pháp đã sử dụng và nêu rõ đây là phương pháp định tính, định lượng hay bán định lượng;

d) giới hạn phát hiện;

e) giới hạn định lượng trên và dưới;

f) ngày tháng lấy mẫu và quy trình lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);

g) ngày nhận mẫu;

h) ngày bắt đầu phân tích và các tài liệu cần thiết khác;

i) lượng mẫu sử dụng;

j) lượng dung dịch mẫu thử;

k) kết quả và đơn vị dùng để báo cáo kết quả;

l) bất kỳ điểm đặc biệt nào trong khi thử nghiệm;

m) những hạn chế như phản ứng chéo hoặc tính chọn lọc của mỗi phương pháp;

n) bất kỳ thao tác nào không quy định trong phương pháp hoặc được coi là tùy ý mà có thể có ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Phát hiện protein bằng ELISA

A.1  Phương pháp ELISA

Các phương pháp ELISA đã được sử dụng thành công và thường dùng để phát hiện định tính hoặc định lượng các kháng nguyên, bao gồm các protein mới được biểu hiện trong thực vật có nguồn gốc công nghệ sinh học hiện đại. Các protein biểu hiện thường mang đặc tính nông học hoặc chất lượng, như chịu được thuốc diệt cỏ cụ thể (glyphosate, glufosinate) hoặc kháng côn trùng (ví dụ Cry-1Ab, Cry3Bb1, Cry 1F). Các protein được tạo ra từ các thực vật có nguồn gốc công nghệ sinh học có thể được phát hiện bằng các phương pháp dựa trên ELISA.

Hầu hết các phương pháp ELISA thương mại dùng cho công nghệ sinh học hiện đại đều có thể áp dụng được cho các mẫu được xử lý sơ bộ hoặc không xử lý và chế biến và do đó các protein cần tìm không bị biến tính. Việc gia nhiệt, hấp, sấy khô chỉ là một vài ví dụ về các quy trình mà thành phần thực phẩm phải chịu trong quá trình chế biến sẽ làm biến tính protein và do đó ảnh hưởng hoặc làm giảm đáng kể khả năng của các thuốc thử miễn dịch được sử dụng trong ELISAs để liên kết với các protein đặc hiệu trong trạng thái không tự nhiên. Cần báo cáo về tính chọn lọc của phương pháp, trong một số trường hợp nhất định các phương pháp ELISA cũng sẽ phản ứng với các protein tương tự được tạo ra ở các giống của cây trồng khác nhau có nguồn gốc sinh học, như Cry1Ab trong ngô Bt11.

Các phương pháp ELISA thường được sử dụng trong phép định tính và định lượng để kiểm tra. Giới hạn phát hiện (LOD) đối với bộ kit thử ELISA thường do nhà sản xuất bộ kit thử thiết lập để phù hợp với biểu hiện ở các giống biểu hiện thấp nhất. Kiểm tra phản ứng chéo với các protein đặc hiệu khác đối với thực vật có nguồn gốc công nghệ sinh học. Bộ kit thử ELISA có bán sẵn trên thị trường. Việc áp dụng cho các nền mẫu chứa protein khác (ví dụ không phải hạt), như lá, được xác định rõ bởi nhà sản xuất bộ kit thử trong các sản phẩm kèm theo trong bộ kit thử và cần được nhà sản xuất hỗ trợ dữ liệu đánh giá xác nhận phương pháp.

A.2  Phạm vi áp dụng

Phụ lục này đưa ra một ví dụ chung về quy trình sử dụng ELISA để xác định sự có mặt protein cần tìm và để định lượng lượng protein cần tìm có trong mẫu. Phương pháp này có thể áp dụng cho các mẫu ít hoặc không xử lý hoặc chế biến và do đó, protein cần tìm không bị biến tính. Ví dụ, nhiệt độ cao để chế biến các thành phần thực phẩm có thể ảnh hưởng đến khả năng phát hiện protein cần tìm. Mỗi nhà sản xuất phải cung cấp quy trình ELISA với bộ kit thử và quy định nền mẫu có thể áp dụng được phương pháp ELISA để kiểm tra cùng với các tiêu chí chấp nhận và không chấp nhận đã được thiết lập thông qua việc xây dựng và đánh giá xác nhận phương pháp.

A.3  Nguyên tắc

Phép thử hấp phụ miễn dịch liên kết enzym kẹp trực tiếp (ELISA) được sử dụng để phát hiện protein cần tìm như mô tả ở các Hình A.1 đến A.4:

Bề mặt của đĩa vi giếng được phủ bởi một kháng thể đơn dòng đặc hiệu

Hình A.1 - Bước 1

Khi mẫu thử được thêm vào, kháng thể liên kết với kháng nguyên. Các thành phần không liên kết của mẫu được rửa sạch

Hình A.2 - Bước 2

Sau khi rửa, kháng thể đa dòng đã liên kết cộng hóa trị (ví dụ) với peroxidase cải ngựa (horseradish peroxidase) (HRP) được thêm vào, kháng thể này liên kết đặc hiệu với vị trí kháng nguyên thứ hai trên protein cần tìm liên kết

Hình A.3 - Bước 3

Sau khi rửa, cơ chất màu tetramethylbenzidin (TMB) đặc hiệu đối với HRP được thêm vào. HRP tạo ra tín hiệu màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên trong dải tuyến tính. Thêm dung dịch dừng để kết thúc hiện màu. Cường độ màu tạo thành được đo ở bước sóng 450 nm

Hình A.4- Bước 4

A.4  Thuốc thử

A.4.1  Yêu cầu chung

Trong suốt quá trình phân tích, chỉ sử dụng các loại thuốc thử phân tích, nước cất hoặc nước đã khử ion, trừ khi có quy định khác.

Mọi sai lệch so với tiêu chí hiệu năng xác định chứng tỏ thuốc thử thiếu ổn định. Ví dụ không sử dụng các dung dịch đệm hoặc dung dịch cộng hợp bị vẩn đục.

Tất cả các bộ phận của bộ kit thử đều phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và không trái với hướng dẫn của nhà sản xuất. Các dung dịch bộ kit thử phải được bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tuy nhiên, nếu không có hướng dẫn bảo quản, dung dịch gốc cộng hợp (A.6.4.1) và dung dịch làm việc cộng hợp kháng thể (A.6.4.2) có thể được giữ ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C để pha loãng và bảo quản.

Dung dịch gốc cộng hợp kháng thể (A.6.6.1) và dung dịch làm việc cộng hợp kháng thể (A.6.6.2) phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C theo hướng dẫn pha loãng và bảo quản. Dung dịch đệm pha loãng để rửa phải được bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc quy trình chuẩn được thiết lập bởi phòng thử nghiệm.

A.4.2  Thuốc thử và vật liệu thử được cung cấp kèm bộ kit thử

A.4.2.1  Dung dịch đệm chiết.

A.4.2.2  Dung dịch đệm.

A.4.2.3  Hàng giếng đã phủ.

A.4.2.4  Kháng thể phát hiện cộng hợp.

A.4.2.5  Dung dịch đệm pha loãng cộng hợp.

A.4.2.6  Cơ chất màu.

A.4.2.7  Dung dịch dừng phản ứng.

A.4.2.8  Dung dịch đệm rửa đậm đặc.

A.4.2.9  Các chuẩn đối chứng dương và đối chứng âm phù hợp với nền mẫu.

A.4.3  Các hóa chất không đi kèm bộ kit thử

A.4.3.1  Cồn.

A.4.3.2  Chất tẩy rửa, dùng cho bể siêu âm (tùy chọn).

A.5  Thiết bị và dụng cụ

A.5.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể là:

A.5.2  Tủ lạnh, làm việc ở nhiệt độ khoảng 4 °C.

A.5.3  Ống ly tâm hình nón bằng polypropylen, có nắp đậy kín, ví dụ dung tích 15 ml.

A.5.4  Giấy bóng hoặc giấy nhôm (tùy chọn).

A.5.5  Băng dính, để cố định khay giếng trong quá trình rửa đĩa (tùy chọn).

A.5.6  Chai rửa, ví dụ dung tích 500 ml.

A.5.7  Micropipet chính xác, chia độ, ví dụ 20 μl đến 500 μl.

A.5.8  Máy trộn mẫu nhỏ.

A.5.9  Cân, có thể cân được chính xác đến 0,01 g.

A.5.10  Máy ly tâm, có thể tạo lực ly tâm tương đối (RCF) 5 000 x g.

A.5.11  Máy đọc đĩa vi giếng, có khả năng đọc độ hấp thụ ở 450 nm hoặc chiều dài bước sóng được quy định trong bộ kit thử.

A.5.12  Tủ ấm hoặc nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 °C (nếu cần).

A.5.13  Sàng kích thước lỗ 450 μm, hoặc tương đương (tùy chọn).

A.5.14  Sàng kích thước lỗ 150 μm (100 mesh), hoặc tương đương (tùy chọn).

A.5.15  Bộ pipet nhiều kênh, ví dụ dung tích từ 50 μl đến 300 μl (tùy chọn).

A.5.16  Dụng cụ đựng thuốc thử cho bộ pipet nhiều kênh (tùy chọn).

A.5.17  Máy rửa đĩa vi giếng tự động (tùy chọn).

A.5.18  Giá đựng ống nghiệm dùng cho ống ly tâm 15 ml (tùy chọn).

A.5.19  Bể siêu âm (tùy chọn).

A.6  Cách tiến hành

A.6.1  Cảnh báo và/hoặc phòng ngừa

Thực hiện tất cả các hướng dẫn được cung cấp bởi các nhà sản xuất bộ kit thử/thuốc thử và các quy trình an toàn phòng thử nghiệm chuẩn khác. Đọc và thực hiện bảng chỉ dẫn an toàn hóa chất (MSDS).

A.6.2  Hạn chế của quy trình

Đối với các mẫu thực phẩm đã qua xử lý nhiệt và các mẫu thực phẩm ở dạng hỗn hợp, phương pháp này sẽ không phù hợp, trừ khi được thiết kế đặc biệt với nền mẫu.

Bộ kit thử ELISA được thiết kế để có hiệu năng tối ưu ở nhiệt độ môi trường từ 15 °C đến 30 °C. Độ hấp thụ của mẫu chuẩn cao nhất phải lớn hơn 0,8 mật độ quang (OD) và không được nằm ngoài dải tuyến tính của máy đọc. Ở nhiệt độ cao hơn 30 °C, thì giá trị OD sẽ tăng nhanh hơn, nên có thể cần giảm thời gian ủ cơ chất, ở nhiệt độ thấp (nhỏ hơn 15 °C) thì thời gian ủ cơ chất cần phải tăng lên.

A.6.3  Lấy mẫu

A.6.3.1  Chuẩn bị mẫu

Lấy mẫu thử đồng nhất từ mẫu phòng thử nghiệm, mẫu kép.

Đối với ngũ cốc nguyên hạt, lượng mẫu thử nghiệm sẽ ảnh hưởng đến giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp, nên lấy 2 000 g, trộn lẫn rồi nghiền nhỏ cho tới khi lọt qua sàng. Để phân tích định lượng thì kích cỡ của hạt nghiền phải nhỏ hơn 150 μm và phân tích định tính phải nhỏ hơn 450 μm. Khi sàng bột phải cẩn thận để tránh nhiễm bẩn. Ngoài ra, cần chú ý không làm mẫu bị nóng quá. Hoạt động của máy trộn bao gồm việc trộn và nghiền mẫu. Từ mẫu đã nghiền, lấy khoảng 100 g và cho qua sàng có cỡ lỗ 450 μm (A.5.13). Ít nhất 90 % lượng mẫu này phải lọt qua sàng cỡ lỗ 450 μm. Để phân tích định tính, có thể dùng trực tiếp mẫu này, để phân tích định lượng thì phải sàng tiếp qua sàng cỡ lỗ 150 μm (A.5.14). Mẫu đã lọt qua sàng 450 μm thì được coi là đồng nhất. Vì vậy, chỉ cần sàng đủ lượng mẫu lọt qua cỡ lỗ 150 μm để phân tích.

Quy trình này là điển hình đối với loại ngũ cốc lớn, như ngô hoặc đậu nành. Một số mẫu có thể bao gồm các chất được xử lý đông lạnh hoặc đã được đồng hóa.

A.6.3.2  Các biện pháp tránh nhiễm bẩn khi chuẩn bị mẫu

A.6.3.2.1  Yêu cầu chung

Hệ thống thử bằng ELISA là một kỹ thuật rất nhạy có thể phát hiện một lượng rất nhỏ protein cần tìm. Vì vậy, theo kinh nghiệm thì tất cả các thiết bị dùng để xử lý mẫu phải được làm sạch sau mỗi mẻ mẫu. Các quy trình gợi ý sau đây bao gồm bước đầu tiên là làm sạch vật lý tối đa các mẫu dạng hạt. Bước thứ hai, rửa bằng cồn, để biến tính và tẩy sạch mọi protein còn dính lại trên thiết bị.

Quy trình này là điển hình đối với máy nghiền trộn mà không thể rửa như thông thường.

A.6.3.2.2  Làm sạch máy nghiền hoặc máy trộn

Làm sạch bằng bàn chải mềm.

Tráng rửa bằng cồn (cồn được phun bằng máy phun hoặc phun thủ công). Nên tráng rửa hoặc phun bằng cồn 2 lần. Sau đó tráng kỹ bằng nước.

Nếu cần dùng lại ngay thì để khô tự nhiên hoặc làm khô bằng máy sấy tóc.

Rửa bàn chải định kỳ và ngâm vào dung dịch cồn (A.4.3.1). Làm khô bàn chải trước mỗi lần sử dụng. Lau bàn chải bằng vải mềm hoặc khăn phòng thử nghiệm.

A.6.3.2.3  Làm sạch sàng

Sàng dễ bị bết lại do bột đậu tương. Đập nhẹ sàng lên mặt bàn tay cho bong các phần dính.

Chải sàng bằng bàn chải sạch và mềm. Ngâm sàng vào cồn ít nhất 5 min rồi tráng kỹ bằng nước. Nếu cần dùng lại ngay thì để khô tự nhiên hoặc làm khô bằng máy sấy tóc.

Phương pháp làm khô khác là có thể dùng bể siêu âm bằng không khí hoặc rửa sàng bằng nước nóng và chất tẩy rửa.

Rửa bàn chải định kỳ và ngâm trong dung dịch cồn (A.4.3.1). Làm khô trước mỗi lần sử dụng. Lau khô bằng vải mềm hoặc khăn lau phòng thử nghiệm.

A.6.3.2.4  Làm sạch nơi làm việc

Không để bụi làm nhiễm bẩn nơi làm việc. Không để bụi của quá trình chế biến làm nhiễm bẩn thiết bị dùng cho quá trình chế biến tiếp theo. Đề đạt hiệu quả tối ưu, nên tiến hành phân tích ở một phòng riêng cách biệt với nơi nghiền và chuẩn bị mẫu để tránh bị ô nhiễm bụi.

A.6.4  Chuẩn bị dung dịch cộng hợp kháng thể

A.6.4.1  Dung dịch gốc cộng hợp kháng thể

Chuẩn bị dung dịch cộng hợp kháng thể như được nêu trong hướng dẫn bộ kit thử (A.4.2.4).

Bảo quản dung dịch gốc cộng hợp kháng thể ở 2 °C đến 8 °C không lâu hơn hạn sử dụng của bộ kit thử, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.6.4.2  Dung dịch làm việc cộng hợp kháng thể

Cho dung dịch gốc cộng hợp (A.6.4.1) vào dung dịch đệm pha loãng cộng hợp (A.4.2.5) theo phương pháp được sử dụng.

Bảo quản dung dịch làm việc cộng hợp kháng thể ở 2 °C đến 8 °C không lâu hơn hạn sử dụng của bộ kit thử.

A.6.5  Chuẩn bị dung dịch đệm rửa

Chuẩn bị dung dịch đệm rửa theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc quy trình thực hành chuẩn phòng thử nghiệm.

A.6.6  Tiến hành phân tích

Để tất cả các thuốc thử đạt tới nhiệt độ phòng.

Lấy các hàng giếng đã phủ (A.4.2.3) và giá đỡ hoặc tấm ELISA ra khỏi bao gói. Sau mỗi lần lấy một số lượng cần thiết ra cần đóng kín bao gói. Mười đến mười hai giếng là đủ đối với các mẫu chuẩn và mẫu thử trắng. Mỗi đĩa phải có các mẫu chuẩn và các chất kiểm chứng của nó. Quy trình được tóm tắt trong A.7.

A.6.7  Tiến hành thử nghiệm

A.6.7.1  Chiết phần mẫu thử và mẫu chuẩn

Các phần mẫu thử và các mẫu chuẩn âm tính và dương tính được chiết hai lần trong cùng điều kiện.

VÍ DỤ Quy trình đặc trưng được diễn giải như sau.

Cân khoảng 0,5 g ± 0,01 g từng loại mẫu chuẩn và phần mẫu thử cho vào các ống ly tâm polypropylen 15 ml riêng biệt. Tiến hành cân từng mẫu chuẩn theo nồng độ tăng dần. Sau đó, cân phần mẫu thử. Để tránh nhiễm bẩn, lau đĩa cân bằng vải thấm cồn (A.4.3.1) rồi để khô hoặc sử dụng đĩa cân dùng một lần cho mỗi lần cân.

Thêm dung dịch đệm chiết (A.4.2.1) vào mỗi ống ly tâm.

Trộn phần mẫu thử hoặc mẫu chuẩn với dung dịch đệm chiết bằng cách lắc mạnh và trộn (vortex) cho đến khi hỗn hợp đồng nhất.

Bột đã tách chất béo và protein đã loại bỏ lacto cần thời gian trộn lâu hơn, đôi khi phải nhiều hơn 15 min. Bột nguyên chất béo dễ đồng hóa hơn (không đến 5 min).

Ly tâm các hỗn hợp ở khoảng 5 000 g trong 15 min, tốt nhất là ở 4 °C.

Cẩn thận lấy ra khoảng 1 ml phần nổi phía trên của mỗi dung dịch mẫu và dịch chiết của chuẩn đối chứng và cho từng loại vào các ống ly tâm polypropylen sạch.

Cần ổn định dung dịch mẫu. Nên bảo quản các dung dịch mẫu ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C, nhưng không quá một ngày làm việc.

Trước khi tiến hành phân tích, pha loãng các dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn đối chứng bằng dung dịch đệm (A.4.2.2).

Tóm tắt các bước chiết được nêu trong Bảng A.5.

A.6.7.2  Quy trình phép thử miễn dịch ELISA

A.6.7.2.1  Yêu cầu chung

Bộ kit thử ELISA có thể thực hiện theo nhiều dạng khác nhau sử dụng bất kỳ số hàng nào trong các hàng 8 giếng hoặc đĩa ELISA 96 giếng. Nên nạp giếng cách ngẫu nhiên khi đánh giá xác nhận phép thử, nghĩa là các mẫu thử và mẫu kiểm chứng không phải khi nào cũng cần phải nạp vào một vị trí cố định để tránh các ảnh hưởng vị trí trên đĩa có thể xảy ra, nếu có.

Tất cả các phản ứng phải được chạy tối thiểu hai lần và tính giá trị hấp thụ trung bình. Mỗi lần chạy bao gồm: phép thử trắng, mẫu trắng và dung dịch chuẩn đối chứng dương. Phân tích mẫu trắng hoặc phép thử trắng có thể được mô tả trong các bản hướng dẫn. Nếu nhà sản xuất không yêu cầu về thuốc thử thì sử dụng chất đệm pha loãng trong phép thử trắng thay cho phần mẫu thử pha loãng. Đối với mẫu thử trắng, phần mẫu thử pha loãng nên được thay thế bằng mẫu kiểm chứng pha loãng không chứa protein cần tìm.

Khi đã bắt đầu phân tích thì thực hiện tất cả các bước không gián đoạn. Tóm tắt quy trình ELISA được đưa ra trong Bảng A.6.

Trong trường hợp này, để thiết lập được CV, phải thực hiện ít nhất ba phép xác định (ví dụ các giá trị từ ba giếng).

A.6.7.2.2  Ủ

Dùng micropipet lấy dung dịch mẫu pha loãng và dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử trắng ở các giếng thích hợp. Sử dụng các đầu tip pipet dùng một lần cho mỗi lần hút để tránh nhiễm bẩn sang các lần tiếp theo. Bọc đĩa bằng giấy bóng kính hoặc giấy nhôm (A.5.4) để tránh nhiễm bẩn và tránh bị bay hơi.

Trước khi ủ, nên lắc nhẹ đĩa vi giếng bằng cách dùng ngón tay trỏ và ngón cái cầm mép đĩa và đưa nhẹ sang hai phía. Ngoài ra, bộ kit thử ELISA có thể phải liên tục lắc trong suốt quá trình ủ, nếu đã được đánh giá xác nhận.

Ủ đĩa vi giếng ở 37 °C trong 1 h hoặc theo yêu cầu của nhà sản xuất.

A.6.7.2.3  Rửa

Rửa bằng dung dịch đệm rửa theo hướng dẫn hoặc SOP đã được đánh giá xác nhận.

Rửa thủ công: Đổ hết lượng chứa trong các giếng bằng cách lật úp xuống các chậu rửa hoặc thùng thích hợp. Dùng chai rửa chứa dung dịch rửa làm việc, đổ đầy các giếng, để khoảng 60 s, sau đó lặp lại thao tác như trên. Lặp lại các bước rửa đó ít nhất 3 lần. Loại bỏ dịch lỏng và bọt khí còn sót lại bằng cách lật úp các giếng xuống lớp giấy lau.

Nếu sử dụng đĩa nhiều hàng giếng, nên dùng băng dính cố định các hàng giếng trên giá đỡ để tránh bị rơi.

Rửa tự động: Sau khi ủ, dùng máy rửa đĩa vi giếng hút hết lượng chứa trong các giếng, sau đó đổ đầy các giếng bằng dung dịch đệm rửa làm việc. Lặp lại thao tác hút rửa giếng ít nhất 3 lần. Cuối cùng, dùng máy hút khô các giếng rồi vỗ các đĩa lật úp lên khăn lau để loại hết chất lỏng và bọt khí. Máy rửa đĩa có thể tự động một hoặc nhiều bước.

CHÚ THÍCH 1  Không được để các giếng khô hẳn, vì có thể ảnh hưởng đến việc phân tích.

CHÚ THÍCH 2  Rửa không kỹ sẽ làm sai lệch kết quả. Dù rửa thủ công hay rửa bằng máy, cũng phải chắc chắn rằng mỗi giếng đều được rửa như nhau với cùng lượng nước rửa.

A.6.7.2.4  Bổ sung dung dịch cộng hợp kháng thể

Dùng micropipet cho dung dịch làm việc cộng hợp kháng thể (A.6.6.2) vào mỗi giếng. Bọc đĩa lại để tránh nhiễm bẩn và tránh bị bay hơi.

Đĩa vi giếng được trộn (nếu thích hợp) và được ủ (có hoặc không lắc theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc SOP đã được đánh giá xác nhận).

A.6.7.2.5  Rửa

Sau giai đoạn ủ, lặp lại các bước rửa như mô tả ở trên (A.6.7.2.3)

A.6.7.2.6  Bổ sung cơ chất

Dùng micropipet lấy cơ chất màu (A.4.2.6) cho vào mỗi giếng. Lắc nhẹ đĩa và ủ (tùy chọn) 10 min ở nhiệt độ phòng.

Việc bổ sung cơ chất màu phải thực hiện liên tục, không gián đoạn. Duy trì trình tự và khoảng cách thời gian như nhau trong quá trình bổ sung dung dịch.

A.6.7.2.7  Bổ sung dung dịch dừng phản ứng

Sau khi ủ, dùng pipet lấy dung dịch dừng phản ứng (A.4.2.7) cho vào mỗi giếng, việc bổ sung dung dịch này phải theo đúng trình tự như đối với thuốc thử màu. Lắc nhẹ đĩa để ngừng sự hiện màu và phân bố đều dung dịch dừng.

Việc bổ sung dung dịch dừng phản ứng phải được thực hiện liên tục, không được gián đoạn. Cần bảo vệ các đĩa tránh tiếp xúc lâu với ánh sáng, nếu không cường độ màu có thể thay đổi theo thời gian.

A.6.7.2.8  Đọc độ hấp thụ

Dùng máy đọc đĩa vi giếng phù hợp để đọc ở bước sóng 450 nm, đo độ hấp thụ trong từng giếng. Việc đọc phải thực hiện trong 30 min sau khi bổ sung dung dịch dừng. Hệ thống màu khác có thể cần bước sóng khác trong máy đọc.

Ghi lại kết quả thu được và tính giá trị hấp thụ trung bình hoặc dùng chương trình máy tính.

A.7  Sơ đồ

Bảng A.5 - Quy trình chiết

Bảng A.6 - Quy trình ELISA

A.8  Đánh giá

Dữ liệu phải được ghi lại.

Cần sử dụng các giá trị chuẩn để dựng đường chuẩn. Các giá trị thu được từ phép phân tích mẫu trắng phải được loại khỏi tất cả các giá trị của các dung dịch mẫu thử pha loãng và dung dịch mẫu chuẩn. Trung bình của các giá trị hiệu chính từ mỗi điểm chuẩn được thực hiện hai lần phải được dùng để xây dựng đường chuẩn. Giá trị trung bình thu được từ mỗi dung dịch mẫu thử được thực hiện hai lần được dùng để suy ra nồng độ từ đường chuẩn này.

A.9  Tiêu chí chấp nhận/từ chối

Mỗi vận hành phải đáp ứng được các tiêu chí chấp nhận/từ chối trong quy trình để có giá trị như liệt kê trong Bảng A.7. Một vận hành gồm: phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn dương, tính mẫu chuẩn âm tính và mẫu chưa biết. Tất cả các dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu chuẩn và phân tích trắng phải được chạy hai lần. Nếu vận hành không đáp ứng các tiêu chí chấp nhận thì phải lặp lại toàn bộ quy trình. Các dung dịch mẫu thử không đáp ứng được các tiêu chí chấp nhận trong bất kỳ lần vận hành nào thì phải chạy lại lần hai. Mỗi phép thử phải có tiêu chí được xây dựng và đã được đánh giá xác nhận để chấp nhận hoặc từ chối kết quả. Bảng A.7 là ví dụ về tiêu chí như vậy.

Bảng A.7 - Tiêu chí chấp nhận hoặc loại bỏ kết quả

Phụ lục B

(tham khảo)

Phát hiện protein bằng thiết bị dòng ngang

B.1  Yêu cầu chung

Thiết bị dòng ngang (LFD), còn được gọi là dải dòng ngang, miếng thử miễn dịch hoặc que đo) đã được sử dụng thành công và thường được dùng để phát hiện định tính và bán định lượng các kháng nguyên, bao gồm các protein mới biểu hiện trong thực vật có nguồn gốc công nghệ sinh học. Các protein biểu hiện thường tạo ra đặc tính nông học hay đặc tính chất lượng như dung nạp thuốc diệt cỏ (glyphosate, glufosinate) hoặc kháng sâu bệnh (ví dụ Cry-1Ab, Cry3Bb1, Cry1F). Các protein được sản xuất bởi các thực vật có nguồn gốc công nghệ sinh học có thể được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp dựa trên LFD.

Hầu hết các phương pháp LFD thương mại dùng cho công nghệ sinh học hiện đại đều áp dụng được cho các mẫu được xử lý sơ bộ hoặc không xử lý và chế biến và do đó các protein cần tìm không bị biến tính. Việc gia nhiệt, hấp và sấy khô chỉ là một vài ví dụ về các quy trình mà thành phần thực phẩm phải chịu trong quá trình chế biến sẽ làm biến tính protein và do đó ảnh hưởng hoặc làm giảm đáng kể khả năng của thuốc thử miễn dịch được sử dụng trong LFD để liên kết với các protein đặc hiệu trong trạng thái không tự nhiên. Thông thường, cần phát triển các ứng dụng cụ thể để phát hiện các protein cần tìm có nguồn gốc sinh học trong các phần đã qua chế biến như là món ăn. Ví dụ, phương pháp LFD được phát triển cho các sản phẩm chế biến ở nhiệt độ cao như bột đậu nành nướng để phát hiện sự có mặt của đậu nành EPSPS EPSPS.^[2],[5] Cần báo cáo về tính chọn lọc của phương pháp, trong một số trường hợp các phương pháp LFD cũng sẽ phản ứng với các protein tương tự được tạo thành trong các giống cây trồng khác nhau có nguồn gốc công nghệ sinh học, như Cry1Ab trong ngô Bt11.

Trong trường hợp áp dụng phương pháp bán định lượng để phát hiện một kháng nguyên đặc hiệu, phương pháp này chỉ có thể áp dụng cho các mẫu thực phẩm bao gồm toàn bộ các sản phẩm có nguồn gốc mà protein có thể phát hiện được. Các phương pháp LFD thường được sử dụng để định tính. Độ tin cậy của kết quả cao, nhưng các phương pháp này thường kiểm tra dựa vào ngưỡng. Các phương pháp này có thể dễ dàng chuyển đổi thành áp dụng bán định lượng bằng cách kết hợp với kế hoạch lấy mẫu và số liệu thống kê^[14] cho các lĩnh vực áp dụng.

Giới hạn phát hiện (LOD) đối với bộ kit thử LFD thường do nhà sản xuất bộ kit thử xây dựng phù hợp với biểu hiện ở giống biểu hiện thấp nhất. Kiểm tra phản ứng chéo với các protein đặc hiệu có nguồn gốc sinh học khác. Bộ kit thử LFD có bán sẵn trên thị trường. Các ứng dụng đối với các nền mẫu chứa protein khác (ví dụ không phải hạt), như lá, được xác định rõ bởi nhà sản xuất bộ kit thử trong các sản phẩm bổ sung trong bộ kit thử và cần được hỗ trợ bởi dữ liệu xác nhận phương pháp của nhà sản xuất.

B.2  Phạm vi áp dụng

Phụ lục này quy định LFD để xác định các protein cần tìm có trong các loại cây trồng kháng thuốc trừ cỏ hoặc thuốc trừ sâu hoặc các thành phần chế biến từ cây trồng có nguồn gốc sinh học. Phụ lục này đưa ra các hướng dẫn chung về phương pháp LFD để phát hiện protein cần tìm trong vật liệu thực vật có nguồn gốc sinh học trong nền mẫu xác định và nhìn chung đưa ra các quy trình hiện hành đối với các phương pháp dựa trên LFD.

B.3  Nguyên tắc

Như trong Hình B.1,^[13] LFD điển hình gồm có màng nitrocellulose trên vật liệu nền với hai vạch: vạch thử cố định kháng thể bắt giữ kháng nguyên đặc hiệu và vạch kiểm soát cố định kiểu khác của kháng thể được công nhận là các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên dán nhãn.

Kháng thể phát hiện kháng nguyên đặc hiệu cộng hợp thành màu vàng và sấy khô thành một dải sợi (dải cộng hợp kháng thể hoặc dải màu vàng). Các dung dịch đã tối ưu cần cho thử nghiệm hiệu năng được kết hợp vào dải mẫu. Trên đầu đối diện, dải này có tấm sợi xốp để chất lỏng di chuyển qua màng nitrocellulose. Khi dải này ngâm vào chất chiết mẫu dương tính, thì kháng nguyên đích trong mẫu đầu tiên sẽ liên kết với kháng thể đặc hiệu gắn nhãn màu vàng và trôi qua màng. Khi đi qua vạch thử tạo thành lớp độn có bắt giữ kháng thể có trong vạch thử. Kết quả là dương tính khi quan sát thấy một vạch màu hồng đến hơi đỏ. Kháng thể gắn nhãn màu vàng đậm di chuyển tiếp và khi đi qua vạch kiểm soát, thì được nhận diện bởi các kháng thể cố định trong vạch này và cho phép phát triển vạch thứ hai. Vạch thứ hai, thường được gọi là vạch kiểm soát, để kiểm soát nội bộ. Các vạch thử và vạch kiểm soát có thể có cường độ khác nhau. Kết quả là âm tính nếu chỉ quan sát thấy một vạch kiểm soát và kết quả âm tính này không được hiểu là không có chất phân tích. Để biết thêm chi tiết về kết quả báo cáo, xem 9.1.

Hình B.1

Các ví dụ về kết quả dương tính, âm tính và không hợp lệ thu được bằng LFD được thể hiện trong Hình B.2.^[8]

Các kết quả thử nghiệm quan sát được bằng LFD. Việc hiện rõ vạch kiểm soát trong thời gian phản ứng yêu cầu cho thấy rằng LFD đã hoạt động đúng. Bất kỳ LFD nào không hiện rõ vạch kiểm soát (trong Hình B.2 gần với số lô) cần được loại bỏ và cần phân tích lại phần mẫu thử sử dụng một dải thử nghiệm mới. Nếu chất chiết mẫu có chứa protein cần tìm, thì vạch thứ hai (trong Hình B.2 vạch gần mũi tên) sẽ hiện rõ trên LFD trong thời gian phản ứng yêu cầu. Các kết quả thực nghiệm phải được giải thích theo hướng dẫn của nhà sản xuất đối với protein cần tìm. Nếu không quan sát thấy vạch thử quan sát được sau thời gian phản ứng yêu cầu, thì kết quả cần được giải thích theo hướng dẫn của nhà sản xuất đối với protein cần tìm. Nếu kết quả được giải thích là âm tính, nghĩa là phần thử nghiệm không chứa protein cần tìm, protein cần tìm có thể có mặt ở dưới mức giới hạn phát hiện, hoặc protein cần tìm đã biến đổi, không thể phát hiện được (ví dụ, phần thử nghiệm được xử lý ở nhiệt độ cao, bột đã khử chất béo).

Hình B.2

B.4  Thuốc thử và dụng cụ của bộ kit thử

B.4.1  Yêu cầu chung

Mọi sai lệch so với các tiêu chí hiệu năng xác định có thể cho thấy thuốc thử không ổn định. Không sử dụng nước chứa đồng, sắt và các cation hóa trị hai có hàm lượng cao.

Các LFD phải được bảo quản theo quy định của nhà sản xuất. Thông thường, bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc trong một số trường hợp, có thể bảo quản lạnh để kéo dài thời gian sử dụng và phải thực hiện theo các nguyên tắc trong phụ lục này trong khoảng thời gian ít hơn một năm kể từ ngày giao nhận sản phẩm hoặc ngày hết hạn ghi trên bao bì sản phẩm. Việc tiếp xúc kéo dài với những điều kiện sai lệch, đặc biệt là điều kiện nhiệt độ hoặc ẩm độ cao, có thể ảnh hưởng xấu đến kết quả phép thử. Trong trường hợp hộp chứa dải thử được bảo quản trong điều kiện lạnh, thì đưa nhiệt độ của hộp về nhiệt độ phòng trước khi mở để tránh ngưng tụ. Chất hút ẩm thường được cho vào thùng. Do đó, điều quan trọng là giữ các dải thử trong thùng chứa ban đầu của nhà sản xuất.

B.4.2  Thuốc thử và dụng cụ đi kèm với bộ kit thử

B.4.2.1  Dải thử đựng trong hộp kín (LFD).

B.4.2.2  Ống đựng mẫu (thể tích ống nhỏ hơn hoặc bằng 1,5 ml là thích hợp).

B.4.2.3  Pipet phân phối.

B.4.3  Thuốc thử và vật liệu thử không cung cấp kèm theo bộ kit thử

B.4.3.1  Nước cất, nước đã khử ion, nước tinh sạch hoặc nước có chất lượng tương đương.

B.4.3.2  Máy trộn phòng thử nghiệm.

B.4.3.3  Bình trộn hoặc chai thích hợp cho máy trộn.

B.4.3.4  Giá đựng ống mẫu.

B.4.3.5  Ống đong, có chia độ, dung tích 250 ml.

B.5  Thiết bị phòng thử nghiệm

B.5.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

B.5.2  Tủ lạnh.

B.5.3  Cân phòng thử nghiệm.

B.5.4  Bộ trộn mẫu loại nhỏ (tùy chọn).

B.5.5  Pipet.

B.5.6  Máy đọc dải LFD (tùy chọn).

B.5.7  Giá đựng ống nghiệm

B.6  Cách tiến hành

B.6.1  Cảnh báo và/hoặc phòng ngừa

Thực hiện đúng tất cả các hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kit thử/thuốc thử và các quy trình an toàn chuẩn khác của phòng thử nghiệm. Đọc và thực hiện theo bảng chỉ dẫn an toàn (MSDS).

B.6.2  Hạn chế của quy trình

LFD được giới hạn trong các ứng dụng định tính hoặc bán định lượng. Ngoài ra, các LFD còn giới hạn đối với các mẫu có dư lượng protein đích chiết được để thiết lập giới hạn phát hiện và có thể được giải thích rõ là dương tính với độ tin cậy cao. Đối với các mẫu được xử lý nhiệt, ép đùn và các mẫu hỗn hợp, thì mối tương quan này có thể không áp dụng được vì protein chuyển hóa gen bị phân hủy và biến tính do đó không thể nhận dạng bằng các kháng thể bắt giữ và/hoặc phát hiện được trong những điều kiện này.

Việc sử dụng máy nghiền trộn khác với máy nghiền trộn do nhà sản xuất bộ kit thử quy định phải được đánh giá xác nhận trước khi thay thế và có thể phải thiết lập các thông số mới.

Những xem xét khác về việc không thực hiện đối với LFD, bao gồm việc kết tủa cộng hợp màu vàng trong quá trình thực hiện phép thử, có thể là do các kết quả dương tính giả và âm tính giả. Chất keo cộng hợp màu vàng của loại được sử dụng trong hầu hết các LFD để phát hiện các protein cần tìm có thể được kết tủa bởi hàm lượng muối đậm đặc hoặc pH cao. Một phần chất màu vàng kết hợp có thể bị giữ lại không rõ rệt trên vạch thử, tạo ra kết quả dương tính giả. Nếu chất màu vàng được kết hợp nhiều hơn, một số có thể ngăn cản sự xâm nhập vào màng, làm giảm tín hiệu và do đó tạo ra kết quả âm tính giả. Chất màu vàng kết tủa cao có thể không bao giờ xâm nhập được vào màng, dẫn đến phép thử không hợp lệ.

Khi các LFD tiếp xúc với điều kiện bảo quản không thích hợp, đặc biệt là độ ẩm cao, thì các kết quả dương tính giả và âm tính giả có thể xảy ra do sự kết hợp của chất keo màu vàng và/hoặc làm mất hoạt tính kháng thể. LFD thường được sản xuất dưới độ ẩm thấp và được đóng gói với chất hút ẩm để giữ khô. LFD có thể ổn định trong nhiều tháng, miễn là được giữ khô. Nhà sản xuất phải cung cấp hạn sử dụng cho mỗi lô hàng.

Dòng chất lỏng bị suy giảm có thể tạo ra cả kết quả dương tính giả lẫn âm tính giả và có thể xảy ra khi tỷ lệ chiết giữa dung dịch đệm với mẫu quá thấp, mẫu nghiền quá mịn hoặc dầu hoặc các thành phần khác của mẫu làm cản trở dòng chảy. Chất hạt có thể bít kín màng, ngăn cản chất màu vàng xâm nhập vào dải. Màng bị tắc có thể gây ra liên kết không đặc hiệu ở vạch thử hoặc ngăn mẫu được rửa đi qua vạch thử, tạo ra kết quả dương tính giả mờ hoặc khó giải thích kết quả.

Hầu hết các LFD có giới hạn về thể tích mẫu và độ sâu được chèn vào mẫu. Nếu ngâm quá sâu vào chất lỏng, dải chất cộng hợp tiếp xúc trực tiếp với chất chiết mẫu, chất cộng hợp màu vàng được giải phóng vào chất lỏng và vạch thử sẽ không xuất hiện hoặc rất mờ. Khi một số LFD được sử dụng với tế bào thực vật nồng độ cao, thì chất diệp lục có thể liên kết không đặc hiệu với vạch thử, dẫn đến xuất hiện vạch màu xanh nhạt (thay cho vạch màu hồng dương tính). Người phân tích thiếu kinh nghiệm có thể giải thích phép thử là dương tính.

Các LFD được thiết kế cho hiệu năng tối ưu ở nhiệt độ môi trường, từ 15 °C đến 30 °C. Độ nhạy của LFD được nêu trong hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất, cố gắng tránh đo mức protein thể hiện dưới mức độ nhạy này (tức là LOD của nhà sản xuất).

B.6.3  Lấy mẫu

B.6.3.1  Chuẩn bị mẫu

Trong quá trình nghiền cần cẩn thận để tránh làm nóng mẫu quá mức. Hoạt động của máy nghiền gồm cả trộn và nghiền mẫu. Thực hiện theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất bộ kit thử đối với các cỡ bình, mẫu nghiền với tỷ lệ thể tích dung dịch đệm và thời gian nghiền để chiết mẫu. Kích cỡ hạt nhỏ hơn hoặc bằng 450 μm là thích hợp cho LFD. Để chuẩn bị mẫu, thực hiện theo quy trình sau.

a) Cân mẫu cho vào vật chứa có kích cỡ thích hợp.

b) Đậy nắp bảo vệ vật chứa gắn được với máy nghiền.

c) Nghiền mẫu ở tốc độ cao với thời gian quy định hoặc cho đến khi tất cả các hạt vỡ và mẫu được đồng nhất.

d) Thêm lượng nước (B.4.3.1) theo yêu cầu của nhà sản xuất đối với từng bộ kit thử.

e) Đậy nắp và lắc kỹ cho đến khi mẫu ướt hoàn toàn (theo yêu cầu của nhà sản xuất; từ 20 s đến 30 s tùy thuộc vào số lượng hạt và loại hạt).

f) Mẫu bắt đầu lắng ngay; loại bỏ dịch lỏng ra khỏi vật chứa mẫu sau 10 s đến 20 s.

g) Rút đủ lượng chất lỏng vào đầy pipet lên đến vạch trên của bầu pipet. Cho dịch chiết vào lọ phản ứng, thường đến phần thon của lọ hoặc khoảng 0,5 ml. Trong một số trường hợp, nhà sản xuất có thể quy định các thể tích cụ thể hơn.

h) Sử dụng pipet và lọ phản ứng mới đối với từng mẫu.

Việc chuẩn bị mẫu phụ thuộc nhiều vào các thông số được quy định bởi mỗi nhà sản xuất dải thử, đặc biệt là tỷ lệ khối lượng mẫu với thể tích dung dịch đệm chiết.

B.6.3.2  Các biện pháp để tránh nhiễm bẩn trong chuẩn bị mẫu

B.6.3.2.1  Yêu cầu chung

LFD có thể rất nhạy và thường được dùng để phát hiện các lượng rất nhỏ protein. Vì lý do này, điều bắt buộc là tất cả các thiết bị được sử dụng để xử lý mẫu phải được làm sạch kỹ giữa các mẻ mẫu. Đầu tiên là quy trình loại bỏ cơ học chất dạng hạt càng nhiều càng tốt. Bước thứ hai là làm biến tính và thu hồi protein không phản ứng còn lại trên thiết bị.

B.6.3.2.2  Làm sạch máy nghiền hoặc máy xay

Trong trường hợp lý tưởng, các bộ phận của máy nghiền trộn, bình trộn được làm sạch kỹ trước khi chuẩn bị mẫu thứ hai. Cọ sạch bằng bàn chải mềm. Rửa bằng cồn nếu cần. Nên rửa hoặc xịt nước hai lần. Tiếp theo là rửa bằng nước ấm. Để thiết bị khô trong không khí. Định kỳ, sau khi rửa bàn chải, ngâm trong dung dịch cồn. Luôn làm sạch và làm khô bàn chải trước khi sử dụng tiếp. Trước khi sử dụng, lau tất cả dụng cụ bằng khăn mềm hoặc dùng khăn lau phòng thử nghiệm.

Trong những trường hợp nhất định, khi lượng lớn các mẫu protein cần tìm âm tính được thử nghiệm, thường rửa bình bằng nước giữa các lần sử dụng và làm sạch kỹ hơn sau khi thử nghiệm mẫu protein cần tìm dương tính.

B.6.3.2.3  Độ sạch của khu vực làm việc

Tránh nhiễm bụi trong khu vực làm việc. Không sử dụng dụng cụ bị nhiễm bụi bẩn từ quá trình xử lý cho công đoạn tiếp theo. Để có hiệu năng tối ưu, sử dụng LFD trong một phòng cách ly bộ phận nghiền và chuẩn bị, để tránh nhiễm bụi tiềm ẩn. Để ngăn ngừa bụi, việc nghiền có thể được thực hiện trong khu vực có áp suất không khí âm.

B.6.4  Quy trình thử nghiệm

B.6.4.1  Để LFD và mẫu thử đạt đến nhiệt độ phòng, nếu đã được bảo quản trong điều kiện lạnh.

B.6.4.2  Dùng pipet lấy 0,5 ml chất chiết mẫu đã chuẩn bị cho vào ống đựng mẫu. Một số bộ kit thử có quy định thể tích cần chuyển, do đó cần dụng cụ sử dụng từ cùng bộ kit thử.

B.6.4.3  Đặt dải mẫu LFD vào ống đựng mẫu và để trong bình ủ 5 min hoặc theo quy định của nhà sản xuất. Nếu dải được đặt đúng, thì chất lỏng sẽ chảy về phía trên của dải nhờ mao quản.

B.6.4.4  Nếu quy trình phòng thử nghiệm yêu cầu, thì cả mẫu kiểm soát protein cần tìm và mẫu kiểm soát không chứa protein cần tìm có thể được sử dụng khi thích hợp.

B.6.4.5  Giải thích kết quả

a) không xuất hiện vạch nào trên dải cho thấy phép thử không hợp lệ;

b) chỉ xuất hiện vạch kiểm soát trên dải cho thấy kết quả âm tính;

c) xuất hiện hai vạch trên dải cho thấy kết quả dương tính với ít nhất một protein cần tìm;

d) xuất hiện nhiều hơn hai vạch trên dải cho thấy kết quả dương tính đối với nhiều hơn protein cần tìm.

B.6.5  Phép thử hiệu năng

B.6.5.1  Chất chiết của phần thử và chất chuẩn đối chứng

Cần tiến hành chiết, nếu sử dụng mẫu chuẩn phù hợp với nền mẫu không chứa protein cần tìm và có chứa protein cần tìm, trong các điều kiện tương tự như mẫu thử.

B.6.5.2  Đọc dải thử LFD

B.6.5.2.1  Đảm bảo mũi tên trên nắp bộ lọc chỉ vào ống sao cho bể chứa ở phía trên.

B.6.5.2.2  Kiểm tra kết quả thường xuyên sau khi cho dải thử vào ống mẫu.

B.6.5.2.3  Ở ít nhất một vạch, vạch kiểm soát luôn xuất hiện ở xấp xỉ 1 cm xuống dưới dải sợi. Vạch màu đỏ hoặc màu hồng ở vị trí này cho thấy thiết bị hoạt động bình thường.

B.6.5.2.4  Vạch màu hồng đến đỏ xuất hiện dưới vạch kiểm soát là vạch thử cho kết quả dương tính; nếu LFD hiển thị hai vạch màu hồng hoặc đỏ, phép thử hoàn thành và mẫu là dương tính đối với protein cần tìm.

B.6.5.2.5  Nếu trong khoảng 5 min (hoặc theo quy định của nhà sản xuất), dải thử nghiệm cho thấy vạch kiểm soát rõ và không có vạch thử dương tính, thì mẫu thử âm tính và phải được báo cáo thử nghiệm theo Điều 12.

B.6.5.2.6  Các dải chỉ được giải thích sau khi việc ủ mẫu đã hoàn thành. Mẫu và dải sợi có thể được cắt bỏ nếu dải cần được lưu giữ. Có thể lưu giữ hình ảnh các dải dưới dạng số vì tính ổn định của dải phản ứng không được nhà sản xuất xác định cho mục đích lưu giữ.

B.7  Ứng dụng thống kê đối với phân tích ngưỡng

Phép thử dựa vào ngưỡng thường được áp dụng trong xử lý hạt và kiểm soát chất lượng hạt.^[10] Khi các mẫu thử bao gồm các hạt rời, có thể sử dụng các phương pháp định tính với kế hoạch lấy mẫu thống kê để xác định hàm lượng protein cần tìm ở trên hay dưới ngưỡng xác định với độ tin cậy thống kê cao.

CHÚ THÍCH  Để xây dựng kế hoạch thử nghiệm thống kê, có thể sử dụng website của Grain Inspection, Packers and Stockyard Administration (USDA/GIPSA), Bộ Nông nghiệp, Hoa Kỳ hoặc áp dụng bảng tính Seedcalc được cung cấp bởi website ISTA.

B.8  Tình trạng

Trong suốt quá trình xây dựng phương pháp, hiệu năng được đánh giá xác nhận trong điều kiện bảo quản do nhà sản xuất quy định.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6165 (ISO/IEC Guide 99) Từ vựng quốc tế về đo lường học - Khái niệm, thuật ngữ chung và cơ bản

[2] TCVN 6900-2:2001 (ISO 78-2:1999) Hóa học - Cách trình bày tiêu chuẩn - Phần 2: Các phương pháp phân tích hóa học

[3] TCVN 8244-2:2010 (ISO 3534-2:2006) Thống kê học - Từ vựng và ký hiệu - Phần 2: Thống kê ứng dụng

[4] TCVN 6910 (ISO 5725) (tất cả các phần) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo

[5] TCVN ISO/IEC 17025:2007 (ISO/IEC 17025:2005) Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn

[6] ISO 19001:2013, In vitro diagnostic medical devices - Information supplied by the manufacturer with in vitro diagnostic reagents for staining in biology

[7] TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung

[8] Kit for Ready Bulk Grain, Catalogue number AS 010 BGB. Available at: http://www.envirologix.com/library/as010bgbinsert.pdf

[9] GM Food Ingredient Testing, Soya kit User's Guide, 1999, Strategic Diagnostics Inc., Rev. 052009, Vers. 1.8. Available at:http://www.sdix.com/Products/Agricultural-Tests/GMO-Processed-Foods-Test.aspx

[10] G.D. Grothaus, M. Bandla, T. Currier, R. Giroux, G.R. Jenkins, M. Kipp Immunoassays as an analytical tool in agricultural biotechnology. J. AOAC Int. 2006, 89, pp. 913-928

[11] International Seed Testing Association website: http://www.seedtest.org

[12] IUPAC Commission on General Aspects Of Analytical Chemistry Selectivity in analytical chemistry. Pure Appl. Chem. 2001, 73, pp. 1381-1386 [Available (viewed 2012-08-16) at: http://www.iupac.org/publications/pac/pdf/2001/pdf/7308x1381.pdf]

[13] M. Lipp, E. Anklam, J. Stave Validation of an immunoassay for detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food fractions using reference materials: Interlaboratory study. J. AOAC Int. 2000, 83, pp. 919-927

 [14] K.M. Remund, D.A. Dixon, D.L. Wright, L.R. Hoden Statistical considerations in seed purity testing for transgenic traits. Seed Sci. Res. 2001, 11, pp. 101-119

[15] Strategic Diagnostics' TraitChek RUR Bulk Soybean Grain Test Kit-10 Strips (USDA GIPSA Certified), Product number 7000016. Available at: http://www.sdix.com/Products/Agricultural-Tests/GMO-Grain-TraitChek.aspx

[16] US Department of Agriculture. Grain Inspection, Packers and Stockyard Administration (USDA/GIPSA) website:http://www.gipsa.usda.gov