Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8685-38:2020 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 38: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh do Leptospira gây ra

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-38:2020

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 38: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH DO LEPTOSPIRA GÂY RA

Vaccine testing procedure - Part 38: Leptospira bacterin

Lời nói đầu

TCVN 8685-38:2020 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung Ương 1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1:2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2:2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

- TCVN 8685-3:2011, Phần 3: Vắc xin E.coli của lợn;

- TCVN 8685-4:2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5:2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6:2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7:2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2:

- TCVN 8685-8:2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc:

- TCVN 8685-9:2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- TCVN 8685-10:2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11:2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12:2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-13:2014, Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-14:2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15:2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn:

- TCVN 8685-16:2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;

- TCVN 8685-17:2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18:2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19:2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8685-20:2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;

- TCVN 8685-21:2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22:2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;

- TCVN 8685-23:2018, Phần 23: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella enteritidis ở gà;

- TCVN 8685-24:2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;

- TCVN 8685-25:2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8685-26:2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27:2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-28:2019, Phần 28: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Tụ huyết trùng ở lợn;

- TCVN 8685-29:2019, Phần 29: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) ở gà;

- TCVN 8685-30:2019, Phần 30: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Viêm não tủy truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-31:2019, Phần 31 vắc xin phòng bệnh Dại ở chó;

- TCVN 8685-32:2019, Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoplasma gallisepticum ở gia cầm;

- TCVN 8685-33:2019, Phần 33: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Riermerella anatipestifer;

- TCVN 8685-34:2020, Phần 34: Vắc xin phòng bệnh tiêu chảy thành dịch do Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-35:2020, Phần 35: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8685-36:2020, Phần 36: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng và bệnh đóng dấu ở lợn;

- TCVN 8685-37:2020, Phần 37: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8685-38:2020, Phần 38: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh do Leptospira gây ra;

- TCVN 8685-39:2020, Phần 39: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng còi cọc do Circovirus gây ra ở lợn.

 

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 38: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH DO LEPTOSPIRA GÂY RA

Vaccine testing procedure - Part 38: Leptospira bacterin

CẢNH BÁO

Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn này.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt được sản xuất từ chủng vi khuẩn Leptospira phòng bệnh Leptospirosis.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684:2011 Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.

3 Chữ viết tắt

EMJH:Ellinghausen - Mecullough - Johnson - Harris (Môi trường Leptospira cơ bản)

MAT: Microscopic agglutination test (Phản ứng vi ngưng kết)

4 Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ thuần khiết, vô hoạt bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu an toàn và hiệu lực được đánh giá trên các động vật thí nghiệm.

5 Vật liệu và thuốc thử

5.1  Động vật đích (trâu, bò, lợn, chỏ, mèo), khỏe mạnh, không có kháng thể Leptospira.

5.2  Thỏ từ 1,8 kg đến 2,0 kg, khỏe mạnh, không có kháng thể Leptospira.

5.3  Chuột lang từ 250 g đến 300 g, khỏe mạnh, không có kháng thể Leptospira.

5.4  Vi khuẩn Leptospira tương ứng với chủng vi khuẩn sản xuất vắc xin.

5.5  Môi trường nuôi cấy Leptospira (xem C.1.3)

5.6  Nước muối sinh lý vô trùng nồng độ từ 0,85 % đến 0,9 %.

6 Thiết bị, dụng cụ

6.1  Tủ ấm có thể duy trì nhiệt độ 28 °C ± 0,5 °C.

6.2  Kính hiển vi tụ quang nền đen có vật kính với độ phóng đại 40 X và 100 X

6.3  Pipette đơn kênh, dung tích từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl.

7 Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

- Lắc nhẹ lọ vắc xin và quan sát độ đồng đều của hỗn dịch bằng mắt thường.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra cảm quan khi có hỗn dịch đồng đều, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra độ thuần khiết

7.2.1  Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc (kiểm tra vô trùng)

- Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc theo 4.1, 4.2 TCVN 8684 : 2011.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc khi không có bất cứ tạp khuẩn hay nấm mốc nào mọc trên các môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

7.2.2  Kiểm tra hình thái vi khuẩn

- Kiểm tra hình thái vi khuẩn Leptospira bằng phương pháp nhuộm Gram và nhuộm bạc. Phương pháp nhuộm Gram được nêu tại Phụ lục A và phương pháp nhuộm bạc được nêu tại Phụ lục B.

- Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi tụ quang nền đen (6.2).

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra hình thái vi khuẩn khi nhuộm Gram và nhuộm bạc chỉ phát hiện hình thái vi khuẩn Leptospira. Vi khuẩn Leptpspira bắt màu tím, có dạng hình que nhỏ, 2 đầu uốn cong.

7.3  Kiểm tra vô hoạt

- Dùng pipette đơn kênh (6.3) nhỏ 100 μl vắc xin vào môi trường nuôi cấy Leptospira (5.5) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) từ 7 ngày đến 10 ngày.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra vô hoạt khi không phát hiện vi khuẩn Leptospira trên môi trường kiểm tra.

7.4  Kiểm tra an toàn

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

7.4.1  Phương pháp kiểm tra trên động vật đích

- Tiêm bắp hoặc dưới da cho ít nhất 03 động vật đích (5.1), mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn.

- Sau khi tiêm, theo dõi 03 động vật đích trong 14 ngày.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra an toàn khi cả 03 động vật đích sống khỏe mạnh, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng vị trí tiêm, chậm chạp, kém ăn.

7.4.2  Phương pháp kiểm tra trên động vật thay thế

- Tiêm dưới da cho ít nhất 03 thỏ (5.2) và 05 chuột lang (5.3), mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn.

- Sau khi tiêm, theo dõi thỏ và chuột lang trong 10 ngày.

- Đánh giá kết quả:

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra an toàn khi 03 thỏ và 05 chuột lang sống khỏe mạnh, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường tại vị trí tiêm hay triệu chứng toàn thân như: sưng vị trí tiêm, chậm chạp, lông xù, chán ăn.

7.5  Kiểm tra hiệu lực

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

7.5.1  Phương pháp vi ngưng kết (MAT)

7.5.1.1  Phản ứng vi ngưng kết trên động vật đích

- Sử dụng ít nhất 10 động vật đích (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 05 động vật đích, mỗi con được tiêm bắp hoặc dưới da 1 liều vắc xin ghi trên nhãn;

+ Nhóm 2: gồm 05 động vật đích làm đối chứng, mỗi con được tiêm nước muối sinh lý vô trùng (5.6) với liều lượng và đường tiêm như nhóm 1.

- 7 ngày sau mũi tiêm thứ 1, toàn bộ động vật đích nhóm 1 và nhóm 2 được tiêm nhắc lại với liều lượng và đường tiêm như lần 1.

- 21 ngày sau mũi tiêm thứ 2, toàn bộ động vật đích nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu chắt huyết thanh và làm phản ứng vi ngưng kết. Các bước tiến hành phản ứng vi ngưng kết được nêu tại Phụ lục C.

- Đánh giá kết quả: vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra hiệu lực khi:

+ Ít nhất 80 % mẫu huyết thanh nhóm 1 có kháng thể Leptospira tương ứng với các chủng Leptospira có trong vắc xin;

+ 100 % mẫu huyết thanh nhóm 2 không có kháng thể Leptospira.

7.5.1.2  Phản ứng vi ngưng kết trên thỏ

- Sử dụng ít nhất 10 thỏ (5.2), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 05 thỏ, mỗi con được tiêm dưới da 1 liều vắc xin ghi trên nhãn;

+ Nhóm 2: gồm 05 thỏ làm đối chứng, mỗi con được tiêm nước muối sinh lý vô trùng (5.6) với liều lượng và đường tiêm như thỏ nhóm 1.

- 7 ngày sau mũi tiêm thứ 1, toàn bộ thỏ nhóm 1 và nhóm 2 được tiêm nhắc lại với liều lượng và đường tiêm như lần 1.

- 21 ngày sau mũi tiêm thứ 2, toàn bộ thỏ nhóm 1 và nhóm 2 được lấy máu chắt huyết thanh và làm phần ứng vi ngưng kết. Các bước tiến hành phản ứng vi ngưng kết được nêu tại Phụ lục C.

- Đánh giá kết quả:

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra hiệu lực khi:

+ Ít nhất 80 % mẫu huyết thanh nhóm 1 có kháng thể Leptospira tương ứng với các chủng Leptospira có trong vắc xin;

+ 100 % mẫu huyết thanh nhóm 2 không có kháng thể Leptospira.

7.5.2  Phương pháp trung hòa

7.5.2.1  Phản ứng trung hòa trên động vật đích

- Sử dụng ít nhất 07 động vật đích (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 05 động vật đích, mỗi con được tiêm bắp hoặc dưới da 1 liều vắc xin ghi trên nhãn;

+ Nhóm 2: gồm 02 động vật đích làm đối chứng, mỗi con được tiêm nước muối sinh lý vô trùng (5.6) với liều lượng và đường tiêm như nhóm 1.

- 7 ngày sau mũi tiêm thứ 1, toàn bộ động vật đích nhóm 1 và nhóm 2 được tiêm nhắc lại với liều lượng và đường tiêm như lần 1.

- 21 ngày sau mũi tiêm thứ 2, toàn bộ động vật đích nhóm 1 và nhóm 2 được tiêm huyễn dịch canh trùng của tất cả các chủng Leptospira (xem C.3.1) có trong vắc xin, mỗi con 3 ml huyễn dịch canh trùng theo đường tiêm dưới da.

- Lấy máu toàn bộ động vật đích nhóm 1 và nhóm 2 ở thời điểm 24 giờ và 48 giờ sau khi tiêm huyễn dịch canh trùng, cấy lên môi trường nuôi cấy Leptospira (5.5) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 7 ngày đến 14 ngày.

- Đánh giá kết quả:

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra hiệu lực khi:

+ Ít nhất 80 % mẫu máu động vật đích nhóm 1 cấy trên môi trường không có Leptospira mọc;

 

Phụ lục A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

A.1  Hóa chất

A.1.1  Dung dịch tím gentians, sản phẩm thương mại.

A.1.2  Dung dịch lugol, sản phẩm thương mại.

A.1.3  Dung dịch cồn 90 %.

A.1.4  Dung dịch fuchsin kiềm, sản phẩm thương mại.

A.2  Thiết bị và dụng cụ

A.2.1  Phiến kính sạch.

A.2.2  Que cấy vô trùng.

A.2.3  Đèn cồn.

A.3  Chuẩn bị tiêu bản

Bước 1: Dùng pipette đơn kênh (6.3) nhỏ một giọt vắc xin lên phiến kính (A.2.1) rồi dùng que cấy (A.2.2) dàn đều, để khô.

Bước 2: Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn (A.2.3) từ 2 lần đến 3 lần.

A.4  Cách tiến hành

Bước 1: Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ một lượng dung dịch tím gentians (A. 1.1) lên tiêu bản sao cho dung dịch phủ đều chỗ phết vi khuẩn, để từ 1 phút đến 2 phút sau đó rửa nhanh bằng nước và làm khô tiêu bản.

Bước 2: Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ một lượng dung dịch lugol (A.1.2) lên tiêu bản sao cho dung dịch phủ đều chỗ phết vi khuẩn, để 1 phút, sau đó rửa nhanh bằng nước và làm khô tiêu bản.

Bước 3: Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ một lượng dung dịch cồn (A.1.3) lên tiêu bản sao cho dung dịch phủ đều chỗ phết vi khuẩn, rửa nhanh bằng nước và làm khô tiêu bản.

Bước 4: Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ một lượng dung dịch tuchsin sao cho dung dịch phủ đều chỗ phết vi khuẩn, để 1 phút, sau đó rửa nhanh bằng nước và làm khô tiêu bản.

Bước 5: Xem tiêu bản dưới kính hiển vi tụ quang nền đen (6.2) ở vật kính 40 X và 100 X.

+ 100 % mẫu máu động vật đích nhóm 2 cấy trên môi trường có Leptospira mọc.

7.5.2.2  Phản ứng trung hòa trên thỏ

- Sử dụng ít nhất 10 thỏ (5.2), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 05 thỏ, mỗi con được tiêm bắp hoặc dưới da 1 liều vắc xin ghi trên nhãn;

+ Nhóm 2: gồm 05 thỏ làm đối chứng, mỗi con được tiêm nước muối sinh lý vô trùng (5.6) với liều lượng và đường tiêm như nhóm 1.

- 7 ngày sau mũi tiêm thứ 1, toàn bộ thỏ nhóm 1 và nhóm 2 được tiêm nhắc lại với liều lượng và đường tiêm như lần 1.

- 21 ngày sau mũi tiêm thứ 2, toàn bộ thỏ nhóm 1 và nhóm 2 được tiêm huyễn dịch canh trùng của các chủng Leptospira (xem phụ lục C.3.1) có trong vắc xin, mỗi con 3 ml huyễn dịch canh trùng theo đường tiêm phúc xoang.

- Lấy máu toàn bộ thỏ nhóm 1 và nhóm 2 ở thời điểm 24 giờ và 48 giờ sau khi tiêm huyễn dịch canh trùng, cấy lên môi trường nuôi cấy Leptospira (5.5) rồi ủ ở tủ ấm (6.1) trong 7 ngày đến 14 ngày.

- Đánh giá kết quả:

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra hiệu lực khi:

+ Ít nhất 80 % mẫu máu thỏ nhóm 1 cấy trên môi trường không có Leptospira mọc;

+ 100 % mẫu máu thỏ nhóm 2 cấy trên môi trường có Leptospira mọc.

8  Kết luận

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, độ thuần khiết, vô hoạt, an toàn và hiệu lực như đã nêu lần lượt ở mục 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 và 7.5.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Bạc

B.1  Hóa chất

Dùng sản phẩm thương mại hoặc pha chế dung dịch theo công thức sau:

B.1.1  Dung dịch 1 (cố định tiêu bản)

- Axít axetic 1 ml

- Formol 40 % 2 ml

- Nước cất 100 ml

Dung dịch 1 được lắc nhẹ cho hòa tan hết.

B.1.2  Dung dịch 2

- Axit Tamin 5g

- Phenol 1 ml

- Nước cất 100 ml

Dung dịch 2 được lắc nhẹ cho hòa tan hết.

B.1.3  Dung dịch 3

- Bạc Amoniac 5 g

- Nước cất 100 ml

Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ từng giọt dung dịch Ammonium hydroxide vào dung dịch 3 (B.1.3) đến khi kết tủa rồi trong trở lại.

B.2  Thiết bị và dụng cụ

B.2.1  Phiến kính sạch.

B.2.2  Que cấy vô trùng.

B.2.3  Đèn cồn.

B.3  Cách tiến hành

Bước 1: Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ một giọt vắc xin lên phiến kính sạch (B.2.1) rồi dàn mỏng, sau đó để tự khô ở nhiệt độ phòng thí nghiệm.

Bước 2: Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ kín tiêu bản bằng dung dịch 1 (B.1.1), để trong 1 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất.

Bước 3: Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ kín tiêu bản bằng dung dịch 2 (B.1.2) rồi hơ dưới ngọn lửa đèn cồn cho bốc hơi khoảng 1 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất.

Bước 4: Dùng pippette đơn kênh (6.3) nhỏ kín tiêu bản bằng dung dịch 3 (B.1.3), để từ 1 phút đến 2 phút, rồi hơ dưới ngọn lửa đèn cồn cho đến khi có màu vàng nhạt.

Bước 5: Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất sau đó làm khô.

Bước 6: Xem tiêu bản dưới kính hiển vi tụ quang nền đen (6.2) với vật kính 40 X và 100 X.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Kiểm tra hiệu giá kháng thể Leptospira bằng phản ứng vi ngưng kết

C.1  Môi trường hóa chất

C.1.1  Môi trường EMJH cơ bản, được pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.1.2  Dung dịch Enrichment (môi trường bổ sung dinh dưỡng)

Chuẩn bị dung dịch Enrichment như sau:

Dung dịch 1:
Sắt II sunphat	0,5 g
Nước cất tinh khiết vừa đủ	100 ml
Dung dịch 2:
Canxi Clorua	0,2 g
Magie clorua	0,2 g
Nước tinh khiết vừa đủ	10 ml
Dung dịch 3:
Vitamin B12	0,02 g
Nước tinh khiết vừa đủ	100 ml
Dung dịch 4:
Tween 80	10 ml
Nước tinh khiết vừa đủ	50 ml
Dung dịch 5:
Kẽm sunphat	0,04 g
Nước tinh khiết vừa đủ	10 ml
Dung dịch 6:
Vitamin B1	0,1 g
Nước tinh khiết vừa đủ	10 ml
Dung dịch 7
Albumin bò	25 g
Nước cất tinh khiết	166,75 ml

Tất cả các dung dịch trên đều được làm cho hòa tan hoàn toàn. Sau đó lần lượt cho các dung dịch trên với số lượng như sau: 25 ml dung dịch 1; 2.5 ml dung dịch 2; 2,5 ml dung dịch 3; 15,63 ml dung dịch 4; 2,5 ml dung dịch 5; 1,25 ml dung dịch 6; 166,75 ml dung dịch 7, cho nước vừa đủ tới 250 ml. Lắc đều và đem lọc qua màng lọc millipore có kích thước lỗ lọc 0,2 μm. Môi trường sau khi pha chế sử dụng tốt nhất trong 1 tháng ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C.

C.1.3  Môi trường nuôi cấy Leptospira: Hoà tan 2,3 g môi trường EMJH cơ bản vào trong 900 ml nước cất 2 lần. Môi trường được hấp vô trùng ở 121 °C trong 15 phút. Sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm dung dịch Enrichment (900 ml môi trường EMJH cơ bản + 100 ml dung dịch Enrichment). Trộn đều, điều chỉnh pH 7,5 bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc dung dịch HCl 1 N. Môi trường sau đó được chia ra các ống nghiệm thủy tinh 12 X 120 mm, sử dụng tốt nhất trong 3 tháng ở nhiệt độ 2°C đến 8°C.

C.1.4  Dung dịch PBS 1 X, pH 7,2.

C.2  Thiết bị và dụng cụ

C.2.1  Tủ lạnh âm sâu, duy trì nhiệt độ âm 80 °C.

C.2.2  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

C.2.3  Bể ủ nhiệt, duy trì nhiệt độ 56 °C.

C.2.4  Ống nghiệm thủy tinh vô trùng kích thước 12 × 120 mm.

C.2.5  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U.

C.2.6  Phiến kính sạch.

C.3  Chuẩn bị

C.3.1  Canh khuẩn Leptospira

- Các chủng Leptospira được lấy ra từ tủ lạnh âm sâu (C.2.1) rồi đem giải đông ở tủ lạnh (C.2.2) sau đó khôi phục lại giống ở tủ ấm (6.1) từ 10 ngày đến 14 ngày.

- Dùng pipette đơn kênh (6.3) cấy chuyển các chùng Leptospira sang môi trường nuôi cấy Leptospira (C.1.3) nuôi cấy ở tủ ấm (6.1) từ 4 ngày đến 5 ngày.

- Kiểm tra độ tự ngưng kết của các chủng Leptospira bằng cách soi tươi trên kính hiển vi tụ quang nền đen (6.2). Chủng Leptospira được coi là đạt nếu không có các cụm ngưng kết.

C.3.2  Huyết thanh thí nghiệm

Lấy máu động vật (7.5.1), chắt lấy huyết thanh, sau đó khử bổ thể bằng cách ủ ở bể ủ nhiệt (C.2.3) trong 30 phút ở nhiệt độ 56 °C.

C.3.3  Huyết thanh tối miễn dịch

Vô hoạt canh khuẩn Leptospira (C.1.3) bằng cách ủ ở bể ủ nhiệt (C.2.3) trong 30 phút ở nhiệt độ 56 °C, sau đó canh khuẩn vô hoạt được tiêm cho thỏ (5.2) với các liều lần lượt như sau:

- Ngày thứ 1: tiêm 2 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường dưới da.

- Ngày thứ 8: tiêm 4 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường dưới da.

- Ngày thứ 15: tiêm 1 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 18: tiêm 4 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Ngày thứ 22: tiêm 6 ml canh khuẩn Leptospira (C.1.3) cho thỏ theo đường tĩnh mạch tai.

- Một tuần sau mũi tiêm cuối cùng tiến hành lấy máu thỏ, chắt huyết thanh kiểm tra hiệu giá kháng thể với kháng nguyên cùng chủng. Huyết thanh thỏ phải đạt hiệu giá ngưng kết ≥ 1/12.800.

C.4  Cách tiến hành

- Pha loãng huyết thanh thí nghiệm (C.3.2) với nước muối sinh lý vô trùng (5.6) theo tỷ lệ 1/10 (1 ml huyết thanh với 9 ml nước, muối sinh lý vô trùng).

- Dùng pippette đơn kênh (6.3) hút 50 μl dung dịch PBS (C.1.4) vào mỗi giếng thí nghiệm của đĩa nhựa 96 giếng (C.2.5) (từ giếng A1 đến giếng H8).

- Dùng pippette đơn kênh (6.3) hút 50 μl huyết thanh thí nghiệm đã pha loãng theo tỷ lệ 1/10 vào giếng A1 và pha loãng theo cơ số 2 bằng cách trộn đều rồi chuyển 50 μl sang giếng thứ 2, cứ như vậy đến giếng số 8 trộn đều rồi hút bỏ đi 50 μl.

- Dùng pippette đơn kênh (6.3) hút 50 μl canh khuẩn Leptospira (C.3.1) vào các giếng của đĩa phản ứng.

- Ủ đĩa trong tủ ấm (6.1) ở nhiệt độ 28 °C trong 30 phút.

- Dùng pippette đơn kênh (6.3) hút 10 μl huyễn dịch ở mỗi độ pha loãng lên phiến kính sạch rồi soi dưới kính hiển vi tụ quang nền đen (6.2) và đọc kết quả.

+ Phản ứng âm tính: không có cụm ngưng kết;

+ Phản ứng dương tính: có cụm ngưng kết.

Bảng C.1 - Sơ đồ bố trí thí nghiệm phản ứng vi ngưng kết

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ASEAN, (2012). Asean Standard Requirements for Leptospira for dog, bacterin. 2nd edition, p93 -94.

[2] Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I, (1994). TCCS 05VT- 94/KNI: Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Leptospira.

[3] OIE Terrestrial Manual (2012). Chapter 2.4.12. Leptospirosis. Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.