Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8685-45:2024 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin - Phần 45: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Parvo ở lợn nái

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-45:2024

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 45: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH PARVO Ở LỢN NÁI

Vaccine testing procedure - Part 45: Porcine Parvovirus Vaccine, Inactivated

Lời nói đầu

TCVN 8685-45:2024 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung Ương 1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1:2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2:2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

- TCVN 8685-3:2011, Phần 3: Vắc xin E.coli của lợn;

- TCVN 8685-4:2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5:2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6:2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7:2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;

- TCVN 8685-8:2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9:2022, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm;

- TCVN 8685-10:2022, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11:2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12:2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-13:2014, Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-14:2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15:2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-16:2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn;

- TCVN 8685-17:2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18:2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19:2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8685-20:2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;

- TCVN 8685-21:2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22:2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;

- TCVN 8685-23:2018, Phần 23: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella enteritidis ở gà;

- TCVN 8685-24:2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;

- TCVN 8685-25:2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8685-26:2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27:2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-28:2019, Phần 28: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Tụ huyết trùng ở lợn;

- TCVN 8685-29:2019, Phần 29: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) ở gà;

- TCVN 8685-30:2019, Phần 30: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Viêm não tủy truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-31:2019, Phần 31: Vắc xin phòng bệnh Dại ở chó;

- TCVN 8685-32:2019, Phần 32: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Mycoμlasma gallisepticum ở gia cầm;

- TCVN 8685-33:2019, Phần 33: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Riermerella anatipestifer;

- TCVN 8685-34:2020, Phần 34: Vắc xin phòng bệnh tiêu chảy thành dịch do Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-35:2020, Phần 35: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8685-36:2020, Phần 36: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng và bệnh đóng dấu ở lợn;

- TCVN 8685-37:2020, Phần 37: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8685-38:2020, Phần 38: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh do Leptospira gây ra;

- TCVN 8685-39:2020, Phần 39: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng còi cọc do Circovirus gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-40:2023, Phần 40: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng não tủy truyền nhiễm do Avian Encephalomyelitis ở gà;

- TCVN 8685-41:2023, Phần 41: Vắc xin phòng bệnh viêm khớp do Avian reovirus ở gà;

- TCVN 8685-42:2023, Phần 42: Vắc xin phòng bệnh E.coli ở gia cầm;

- TCVN 8685-43:2023, Phần 43: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do Pasteurella multocida type A ở lợn;

- TCVN 8685-44:2024, Phần 44: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh phù ở lợn do E.coli;

- TCVN 8685-45:2024, Phần 45: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Parvo ở lợn nái;

- TCVN 8685-46:2024, Phần 46: Vắc xin nhược độc phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà.

 

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 45: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH PARVO Ở LỢN NÁI

Vaccine testing procedure - Part 45: Porcine Parvovirus Vaccine, Inactivated

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt phòng bệnh Parvo ở lợn nái.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684:2022 Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.

3  Chữ viết tắt

ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay): Phản ứng miễn dịch gắn enzym

HA (Haemagglutination Assay): Phản ứng ngưng kết hồng cầu

HI (Haemagglutination Inhibition Assay): Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu

PPV (Porcine Parvovirus): Vi rút gây bệnh Parvo ở lợn

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, vô trùng, vô hoạt bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu an toàn và hiệu lực được đánh giá trên động vật thí nghiệm.

5  Vật liệu thử và thuốc thử

5.1  Lợn nái hậu bị từ 6 tuần tuổi đến 6 tháng tuổi, lợn khỏe mạnh, không có kháng thể PPV.

5.2  Chuột lang từ 5 tuần tuổi đến 7 tuần tuổi (khối lượng từ 400 g đến 450 g), chuột khỏe mạnh.

5.3  Trứng gà có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi, được lấy từ đàn gà sạch bệnh.

5.4  Nước muối sinh lý vô trùng (dung dịch NaCl 0,9 %).

5.5  Vắc xin phòng bệnh PPV.

5.6  KIT ELISA xét nghiệm kháng thể PPV.

5.7  Hồng cầu chuột lang 0,8 %.

5.8  Huyết thanh đối chứng dương và huyết thanh đối chứng âm với kháng nguyên PPV,

6  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Tủ ấp trứng duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C.

6.2  Pipet đơn kênh, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000 μl.

6.3  Pipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 30 μl đến 300 μl.

6.4  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ V.

6.5  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U.

6.6  Bể ổn nhiệt, duy trì nhiệt độ 56 °C ± 0,5 °C.

6.7  Máy ly tâm, ly tâm với tốc độ 2500 vòng/ phút.

6.8  Máy đọc ELISA có bước sóng từ 405 nm đến 650 nm.

6.9  Bình định mức vô trùng.

7  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

- Lắc nhẹ lọ vắc xin và quan sát độ đồng đều của hỗn dịch bằng mắt thường.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu về chỉ tiêu cảm quan khi có hỗn dịch đồng đều, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra vô trùng

- Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, tạp nhiễm nấm mốc, tạp nhiễm Mycoμlasma và tạp nhiễm Salmonella theo quy định tại mục 6.2.1, 6.2.2, 6.2.3 và 6.2.4 của TCVN 8684:2022.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu về chỉ tiêu vô trùng khi không có bất cứ tạp khuẩn, nấm mốc, Mycoμlasma và Salmonella mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

7.3  Kiểm tra vô hoạt

7.3.1  Trường hợp vắc xin được sản xuất từ trứng gà

7.3.1.1  Tiêm vào xoang niệu mô của 10 trứng gà có phôi (5.3), mỗi trứng tiêm 0,2 ml vắc xin (5.5).

7.3.1.2  Ấp các trứng đã được tiêm (7.3.1.1) ở tủ ấp trứng (6.1) trong 3 ngày, soi loại bỏ trứng chết phôi trước 24 h. Soi trứng ở các thời điểm 48 h, 72 h sau tiêm.

7.3.1.3 Sau 3 ngày theo dõi, mổ thu hoạch dịch xoang niệu, mỗi trứng lấy 1 lượng tương đương nhau (từ 2 ml đến 5 ml) vào bình định mức (6.9) sau đó trộn đều.

7.3.1.4  Tiêm dịch xoang niệu thu được ở 7.3.1.3 vào xoang niệu mô của 10 trứng gà có phôi (5.3), mỗi trứng tiêm 0,2 ml.

7.3.1.5  Ấp các trứng đã được tiêm (7.3.1.4) ở tủ ấp trứng (6.1) trong 4 ngày, soi loại bỏ trứng chết phôi trước 24 h. Soi trứng ở các thời điểm 48 h, 72 h và 96 h sau tiêm.

7.3.1.6  Sau 4 ngày theo dõi, mổ thu hoạch nước trứng làm phản ứng ngưng kết hồng cầu HA.

7.3.1.7  Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu về chỉ tiêu vô hoạt khi dịch xoang niệu không có hoạt tính ngưng kết (phản ứng HA cho kết quả âm tính). Các bước tiến hành phản ứng HA được nêu tại phụ lục A.

7.3.2  Trường hợp vắc xin được sản xuất từ sự nuôi cấy tế bào

7.3.2.1  Cấy chuyển vắc xin (5.5) 2 lần trên môi trường tế bào dùng để sản xuất vắc xin (nếu vắc xin có chứa tá dược dạng dầu thì thực hiện các bước tách dung dịch vắc xin dạng nhũ dầu thành 2 pha khác nhau, pha nước và pha dầu).

7.3.2.2  Vắc xin đạt yêu cầu về chỉ tiêu vô hoạt khi không phát hiện thấy vi rút còn sống trên môi trường tế bào nuôi cấy.

7.4  Kiểm tra an toàn

- Tiêm cho 03 lợn (5.1), mỗi con 02 liều vắc xin ghi trên nhãn, đường tiêm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Theo dõi lợn thí nghiệm trong 14 ngày.

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu kiểm tra an toàn khi tất cả lợn sống khỏe mạnh, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân.

7.5  Kiểm tra hiệu lực

Sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:

7.5.1  Kiểm tra trên lợn

- Sử dụng 10 lợn (5.1), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 05 lợn, mỗi con được tiêm 01 liều vắc xin ghi trên nhãn, đường tiêm theo hướng dẫn của nhà sản xuất;

+ Nhóm 2: gồm 05 lợn, không sử dụng vắc xin.

- 28 ngày sau tiêm vắc xin, lấy máu toàn bộ lợn nhóm 1 và nhóm 2, chất huyết thanh, đánh giá hiệu lực của vắc xin bằng phương pháp HI (các bước tiến hành phản ứng HI được nêu tại Phụ lục B) hoặc phương pháp ELISA, sử dụng kit ELISA (5.6) phát hiện kháng thể kháng PPV.

CHÚ THÍCH: Hiện nay, có nhiều bộ KIT ELISA phát hiện kháng thể PPV bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần sử dụng bộ KIT được cấp phép lưu hành và thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ về phản ứng ELISA sử dụng KIT thương mại được nêu trong phụ lục C

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu về chỉ tiêu hiệu lực khi:

+ Phương pháp ELISA:

Nhóm 1: Ít nhất 4/5 mẫu dương tính (80 %);

Nhóm 2: 5/5 mẫu âm tính (100 %).

+ Phương pháp HI:

Nhóm 1: Ít nhất 4/5 mẫu đạt hiệu giá kháng thể ≥ 1/16 (80 %);

Nhóm 2: 5/5 mẫu âm tính (100 %).

7.5.2  Kiểm tra trên động vật thay thế

- Sử dụng 10 chuột lang (5.2), chia làm 2 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm 05 chuột lang, mỗi con được tiêm với 1/4 thể tích liều vắc xin, đường tiêm theo hướng dẫn của nhà sản xuất;

+ Nhóm 2: gồm 05 chuột lang, không sử dụng vắc xin.

- 28 ngày sau tiêm vắc xin, lấy máu toàn bộ chuột lang nhóm 1 và nhóm 2, chất huyết thanh, đánh giá kháng thể kháng PPV bằng phương pháp HI (các bước tiến hành phản ứng HI được nêu tại Phụ lục B).

- Đánh giá kết quả: Vắc xin đạt yêu cầu về chỉ tiêu hiệu lực khi:

+ Nhóm 1: ít nhất 4/5 mẫu đạt hiệu giá kháng thể ≥ 1/16 (80 %);

+ Nhóm 2: 5/5 mẫu âm tính (100 %).

8  Đánh giá kết quả kiểm nghiệm

Vắc xin đạt yêu cầu kiểm nghiệm khi đáp ứng được tất cả các yêu cầu về cảm quan, vô trùng, vô hoạt, an toàn và hiệu lực theo quy định tại mục 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 và 7.5.

9  Báo cáo kiểm nghiệm

Báo cáo kiểm nghiệm phải nêu rõ:

- Mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- Kết quả kiểm nghiệm thu được.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)

A.1  Vật liệu thử và thuốc thử

A.1.1  Dung dịch hồng cầu chuột lang, 0,8 %.

A.1.2  Kháng nguyên PPV.

A.1.3  Dịch xoang niệu của trứng gà có phôi (7.3.1.6).

A.1.4  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2 ± 0,2.

A.2  Cách tiến hành

Các bước thực hiện phản ứng HA được nêu ở bảng A.1.

Bảng A.1 - Các bước thực hiện phản ứng HA

A.2.1  Dùng pipet (6.3) nhỏ 50 μl PBS (A.1.4) vào các giếng của đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ V (6.4) từ cột thứ 1 đến cột thứ 12.

A.2.2  Dùng pipet (6.2) nhỏ 50 μl kháng nguyên PP (A.1.2) hoặc dịch xoang niệu (A.1.3) vào giếng 1 của đĩa phản ứng.

A.2.3  Pha loãng kháng nguyên: sử dụng pipet (6.3) trộn đều kháng nguyên với PBS (A.1.4) ở giếng 1, hút 50 μl chuyển sang giếng 2, trộn đều, hút 50 μl chuyển sang giếng 3, trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 rồi hút bỏ đi 50 μl.

A.2.4  Dùng pipet (6.3) nhỏ tiếp 50 μl PBS (A.1.4) vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng.

A.2.5  Dùng pipet (6.3) nhỏ 50 μl hồng cầu chuột lang 0,8 % (A.1.1) vào các giếng của đĩa phản ứng. A.2.6 Lắc nhẹ đĩa phản ứng và ủ đĩa ở nhiệt độ 37 °C trong thời gian 1 h, sau đó đọc kết quả.

A.5  Đọc kết quả

- Phản ứng âm tính: hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn.

- Phản ứng dương tính: xảy ra hiện tượng ngưng kết, hồng cầu ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.

- Đọc hiệu giá ngưng kết: hiệu giá ngưng kết kháng nguyên được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Hl)

B.1  Vật liệu thử và thuốc thử

B.1.1  Kháng nguyên PPV.

B.1.2  Huyết thanh cần kiểm tra, là huyết thanh thu được sau khi lấy máu động vật thí nghiệm ở mục 7.5.

B.1.3  Dung dịch hồng cầu chuột lang, 0,8 %.

B.1.4  Huyết thanh đối chứng dương.

B.1.5  Huyết thanh đối chứng âm.

B.1.6  Dung dịch Kaolin, 25 %.

B.1.7  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2 ± 0,2.

B.1.8  Kháng nguyên 4 đơn vị HA

B.2  Xử lý huyết thanh cần kiểm tra

B.2.1  Vô hoạt huyết thanh cần kiểm tra (B.1.2) bằng bể ổn nhiệt (6.6) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.

B.2.2  Cho huyết thanh đã được vô hoạt vào các tuýp eppendorf, mỗi tuýp 50 μl huyết thanh. Thêm 150 μl dung dịch Kaolin 25 % (B.1.6) và để yên ở nhiệt độ phòng trong 20 min.

B.2.3  Ly tâm dung dịch (B.3.2) bằng máy ly tâm (6.7) tốc độ 2500 vòng/ phút trong 10 min, sau đó thêm 25 μl hồng cầu chuột lang 0,8 % (B.1.3), lắc nhẹ và để yên ở nhiệt độ phòng trong 1 h.

B.2.4  Tiếp tục ly tâm dung dịch (B.3.3) bằng máy ly tâm (6.7) tốc độ 2500 vòng/ phút trong 10 min, thu huyết thanh nổi ở trên.

B.3  Cách tiến hành

B.3.1  Dùng pipet (6.3) nhỏ 50 μl PBS (B.1.7) vào đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U (6.5) từ cột thứ 1 đến cột thứ 12.

B.3.2  Dùng pipet (6.5) nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng dương (B.1.4) vào giếng A1 và B1, nhỏ 50 μl huyết thanh đối chứng âm (B.1.5) vào giếng C1 và D1, nhỏ 50 μl huyết thanh đã xử lý (B.2) vào giếng E1 và G1 của đĩa phản ứng.

B.3.3  Pha loãng huyết thanh: sử dụng pipet (6.3) trộn đều huyết thanh với PBS (B.1.7) ở cột 1, rồi hút 50 μl chuyển sang cột 2, trộn đều, hút 50 μl chuyển sang cột 3, trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến cột 11 rồi bỏ đi 50 μl.

B.3.4  Dùng pipet (6.3) nhỏ 50 μl dung dịch kháng nguyên 4 đơn vị HA (B.1.8) vào các giếng từ cột thứ 1 đến cột 11. Lắc nhẹ đĩa, ủ đĩa ở nhiệt độ 37 °C trong thời gian 1 h.

Các bước tiến hành thực hiện phản ứng HI được nêu ở bảng B.1, ví dụ sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa phản ứng được nêu ở bảng B.2.

Bảng B.1 - Các bước thực hiện phản ứng HI

Bảng B.2 - Ví dụ sơ đồ một đĩa phản ứng

Độ pha loãng	Cột
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	2-3	2-4	2-5	2-6	2-7	2-8	2-9	2-10	2-11	2-12	2-13	2-14
A SC+ B
C SC - D
E SP F
G Đối chứng 4 HAU H	2 HAU	1 HAU	0,5 HAU	0,25 HAU	0,13 HAU	0,06 HAU	RBC	RBC	RBC	RBC	RBC	RBC
							RBC	RBC	RBC	RBC	RBC	RBC
SC+ = Huyết thanh đối chứng dương SC- = Huyết thanh đối chứng âm SP = Huyết thanh được kiểm tra Đối chứng 4 HAU = Kháng nguyên 4 đơn vị HA RBC = Đối chứng hồng cầu

Giếng chuẩn đỡ 4-HAU (gồm các giếng từ hàng G đến hàng H, từ cột 1 đến cột 6), mỗi giếng đã chứa 50 μl PBS:

- Dùng pipet (6.2) nhỏ 50 μl dung dịch kháng nguyên 4 đơn vị HA vào giếng G1 và H1 của đĩa phản ứng.

- Pha loãng kháng nguyên: sử dụng pipet (6.3) trộn đều kháng nguyên với PBS ở cột 1, hút 50 μl chuyển sang cột 2, trộn đều, hút 50 μl chuyển sang cột 3, trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến cột 6 rồi hút bỏ đi 50 μl.

- Dùng pipet (6.3) nhỏ 50 μl PBS (B.1.7) vào các giếng từ G1 đến H6 của đĩa phản ứng (làm thể tích tương đương với những hàng chứa huyết thanh).

Giếng đối chứng tế bào (gồm các giếng từ hàng G đến hàng H, từ cột 7 tới cột 12), mỗi giếng đã chứa 50 μl PBS:

- Dùng pipet (6.3) nhỏ 50 μl PBS (B.1.7) vào giếng G7 đến H12 của đĩa phản ứng

- Vỗ nhẹ đĩa và ủ đĩa ở nhiệt độ 37 °C trong thời gian 1 h.

B.4.5  Dùng pipet (6.3) nhỏ 50 μl PBS (B.1.7) vào cột 12 làm đối chứng hồng cầu.

B.4.6  Dùng pipet (6.3) nhỏ 50 μl hồng cầu chuột lang 0,8 % (B.1.3) vào các giếng của đĩa phản ứng.

B.4.7  Lắc nhẹ đĩa phản ứng và để ở nhiệt độ phòng trong 45 phút đến 60 phút, sau đó đọc kết quả.

B.5  Đọc kết quả

Ví dụ sơ đồ bố trí phản ứng và giải thích kết quả được nêu tại bảng B.3.

Bảng B.3 - Ví dụ sơ đồ bố trí phản ứng và giải thích kết quả

Độ pha loãng

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

2-3

2-4

2-5

2-6

2-7

2-8

2-9

2-10

2-11

2-12

2-13

2-14

A SC+ B

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

C SC- D

E SP F

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

G Đối chứng 4 HAU H

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

CHÚ THÍCH: SC +:1024; SC-: negative (<8); SP: 512; Đối chứng 4-HAU: Đạt; Đối chứng hồng cầu: Đạt

- Điều kiện phản ứng: hiệu giá huyết thanh đối chứng dương cao hơn đối chứng âm ít nhất 4 log₂. Đối chứng 4-HAU và đối chứng tế bào phải đạt.

- Phản ứng âm tính: có hạt ngưng kết lấm chấm.

- Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng xuống đáy tạo chấm tròn.

- Hiệu giá của huyết thanh là nghịch đảo của giá trị pha loãng lớn nhất mà ức chế 50 % 4 HA vi rút.

 

Phụ lục C

(tham khảo)

Ví dụ về phản ứng ELISA phát hiện kháng thể PPV

C.1  Vật liệu thử

C.1.1  Huyết thanh cần kiểm tra, là huyết thanh thu được sau khi lấy máu động vật thí nghiệm ở mục 7.5.

C.1.2  Bộ Kit ELISA thương mại (Ví dụ bộ Kit ELISA của hãng INGEZIM - INGEZIM PPV 11.PV.K1)[I].

C.2  Chuẩn bị mẫu

• Đối với sàng lọc Dương tính/ Âm tính: Pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/100 trong dung dịch pha loãng được cung cấp.

• Đối với chuẩn độ gần đúng: Pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/200 trong dung dịch pha loãng được cung cấp.

• Đối với sự chuẩn độ chính xác của huyết thanh, thực hiện pha loãng theo cơ số 2 bắt đầu từ 1/100 (5 μl mẫu và 495 μl dung dịch pha loãng), dao động đến 1/12800. Để quá trình pha loãng dễ dàng, bước này có thể được thực hiện trực tiếp trên đĩa như sau:

+ Thêm 200 μl của dung dịch pha loãng 1/100 vào giếng đầu tiên của mỗi cột.

+ Thêm 100 μl chất pha loãng vào bảy giếng còn lại của mỗi cột.

+ Chuyển 100 μl từ giếng thứ nhất sang giếng thứ hai, trộn đều và tiến hành theo cách tương tự cho đến giếng cuối cùng (loại bỏ 100 μl ở giếng cuối cùng).

C.3  Chuẩn bị các chất phản ứng

• Dung dịch rửa: Pha loãng một phần dung dịch rửa đậm đặc được cung cấp trong bộ sản phẩm với 24 phần nước cất hoặc nước khử ion (nghĩa là 100 ml dung dịch đậm đặc với 2,4 L nước). Sau khi pha loãng, dung dịch này vẫn ổn định trong khoảng + 2 °C đến + 8 °C.

• Chuẩn bị chất pha loãng: Chất pha loãng được cung cấp có nồng độ 5x, Trước khi sử dụng, phải pha loãng theo tỷ lệ 1/5 bằng nước cất hoặc nước khử ion (1 thể tích chất pha loãng được cung cấp đậm đặc với 4 thể tích nước cất).

• Chuẩn bị chất liên kết: pha ngay trước khi sử dụng. Pha loãng lượng cần thiết. Chất liên kết được cung cấp trong bộ thử nghiệm pha loãng với dung dịch pha loãng theo tỷ lệ 1/100 thành dung dịch pha loãng: Lượng cần và đủ cho một đĩa hoàn chỉnh là 110 μl chất liên kết với 10 ml dung dịch pha loãng.

Lượng cần và đủ cho một dãy 8 giếng là 10 μl chất liên hợp với 1 ml dung dịch pha loãng. Lắc kỹ dung dịch trước khi sử dụng. Chỉ chuẩn bị số lượng cần thiết cho mỗi lần vì số lượng còn lại phải được loại bỏ.

C.4  Cách tiến hành

Sơ đồ bố trí mẫu cho phần ứng ELISA được nêu tại bảng C.1.

Bảng C.1 - Sơ đồ bố trí mẫu cho phản ứng ELISA

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NC

NC

S7

S7

S15

S15

S23

S23

S31

S31

S39

S39

B

PC

PC

S8

S8

S16

S16

S24

S24

S32

S32

S40

S40

C

S1

S1

S9

S9

S17

S17

S25

S25

S33

S33

S41

S41

D

S2

S2

S10

S10

S18

S18

S26

S26

S34

S34

S42

S42

E

S3

S3

S11

S11

S19

S19

S27

S27

S35

S35

S43

S43

F

S4

S4

S12

S12

S20

S20

S28

S28

S36

S36

S44

S44

G

S5

S5

S13

S13

S21

S21

S29

S29

S37

S37

S45

S45

H

S6

S6

S14

S14

S22

S22

S30

S30

S38

S38

S46

S46

CHÚ THÍCH: NC: negative control (đối chứng âm) PC: positive control (đối chứng dương) S: samμle (mẫu kiểm tra) S1 đến S46: mẫu kiểm tra số 1 đến mấu Kiểm tra số 46

C.4.1  Dùng pipet (6.2) nhỏ 100 μl huyết thanh đối chứng âm vào hai giếng A1, A2 của đĩa phản ứng.

C.4.2  Dùng pipet (6.2) nhỏ 100 μl huyết thanh đối chứng dương vào hai giếng B1, B2 của đĩa phản ứng.

C.4.3  Dùng pipet (6.2) nhỏ 100 μl mẫu huyết thanh cần kiểm tra (C.2) vào các giếng còn lại của đĩa, mỗi mẫu cho vào 2 giếng (ví dụ: mẫu S1 cho vào 2 giếng C1, C2; mẫu S2 cho vào 2 giếng D1, D2). Đậy kín đĩa và ủ trong 1 h ở 37 °C.

C.4.4  Loại bỏ dung dịch trong giếng và rửa các giếng của dĩa bằng dung dịch rửa (C.3), mỗi giếng 350 μl, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vô đĩa vào giấy thấm cho khô nước.

C.4.5  Dùng pipet (6.3) nhỏ 100 μl chất liên kết (C.3) vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Đậy kín đĩa và ủ trong 1 h ở nhiệt độ phòng.

C.4.6 Loại bỏ dung dịch trong giếng và rửa các giếng của dĩa bằng dung dịch rửa (C.3), mỗi giếng 350 μl, rửa từ 3 lần đến 5 lần, sau khi rửa xong vô đĩa vào giấy thẩm cho khô nước.

C.4.7 Dùng pipet (6.3) nhỏ 100 μl chất nền vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Giữ đĩa trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

C.4.8 Dùng pipet (6.3) nhỏ 100 μl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng, sau đó đặt đĩa vào máy đọc ELISA (6.8) và đọc ở bước sóng 605 nm để thu được các giá trị mật độ quang học (Optical density - OD) của các mẫu trong đĩa phản ứng.

C.5  Đọc và giải thích kết quả

• Điều kiện kết quả: Thử nghiệm chỉ có hiệu lực khi: OD đối chứng dương > 1,5; OD đối chứng âm < 0,3.

• Giải thích kết quả: Giá trị tham chiếu là 0,3. Các mẫu có giá trị OD tối thiểu bằng giá trị tham chiếu là dương tính và các mẫu có giá trị OD thấp hơn giá trị tham chiếu là âm tính. Hiệu giá của mẫu sẽ là độ pha loãng cuối cùng của mẫu có giá trị OD tối thiểu bằng giá trị tham chiếu.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ASEAN Standard Requirements for Porcine Parvovirus Vaccine, Inactivated.

[2] Porcine Parvovirus Infection, Virology and Serology.

[3] European Pharmacopoeia 10.0 Porcine Parvovirosis Vaccine, Inactivated.

[4] Porcilis®Parvo - MSD Animal Health, Intervet.

[5] Efficacy of porcine parvovirus vaccine - ADAS, The Veterinary Record, August 30, 1986 - Trích dẫn từ Porcilis Parvo - MSD Animal Health, Intervet.

[6] TCCS 1-34:2010/KN1 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Parvovirus ở lợn.

[7] Antibody responses of guinea-pig, rabits and pigs to inactivated porcine parvovirus vaccine

[8] An enzyme-linked immunosorbent assay for dectection of antibody to porcine parvovirus.

[9] Experience of Vaccine against Porcine Parvovirus in Pig-Breeding Herds: Serological Status and Reproductive Performance.