Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8685-22:2018 Vắc xin vô hoạt bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8685-22 : 2018

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 22: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở GIA CẦM

Vaccine testing procedure - Part 22: Fowl cholera vaccine, inactivated

Lời nói đầu

TCVN 8685-22: 2018 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8685 Quy trình kiểm nghiệm vắc xin gồm các phần:

- TCVN 8685-1 : 2011, Phần 1: Vắc xin phó thương hàn lợn nhược độc;

- TCVN 8685-2 : 2011, Phần 2: Vắc xin viêm gan siêu vi trùng vịt;

- TCVN 8685-3 : 2011, Phần 3: Vắc xin E.coli của lợn;

- TCVN 8685-4 : 2011, Phần 4: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng giảm đẻ ở gà;

- TCVN 8685-5 : 2011, Phần 5: Vắc xin ung khí thán;

- TCVN 8685-6 : 2011, Phần 6: Vắc xin Gumboro nhược độc;

- TCVN 8685-7 : 2011, Phần 7: Vắc xin nhiệt thán nha bào vô độc chủng 34 F2;

- TCVN 8685-8 : 2011, Phần 8: Vắc xin dịch tả lợn nhược độc;

- TCVN 8685-9 : 2014, Phần 9: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Cúm gia cầm A/H5N1;

- TCVN 8685-10 : 2014, Phần 10: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Lở mồm long móng (FMD);

- TCVN 8685-11 : 2014, Phần 11: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8685-12 : 2014, Phần 12: Vắc xin nhược độc, đông khô phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-13 : 2014, Phần 13: Vắc xin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS);

- TCVN 8685-14 : 2017, Phần 14: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi thể kính ở lợn;

- TCVN 8685-15 : 2017, Phần 15: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm phổi do pasteurella multocida type D gây ra ở lợn;

- TCVN 8685-16 : 2017, Phần 16: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm ở lợn,

- TCVN 8685-17 : 2017, Phần 17: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh viêm màng phổi ở lợn;

- TCVN 8685-18 : 2017, Phần 18: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh newcastle;

- TCVN 8685-19 : 2017, Phần 19: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh gumboro;

- TCVN 8686-20 : 2018, Phần 20: Vắc xin nhược độc phòng bệnh Newcastle;

- TCVN 8685-21 : 2018, Phần 21: Vắc xin phòng bệnh đậu gà;

- TCVN 8685-22 : 2018, Phần 22: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm;

- TCVN 8685-23 : 2018, Phần 23: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella enteritidis ở gà;

- TCVN 8685-24 : 2018, Phần 24: Vắc xin vô hoạt phòng bệnh Salmonella typhimurium ở gà;

- TCVN 8685-25 : 2018, Phần 25: Vắc xin phòng bệnh giả dại ở lợn

- TCVN 8685-26 : 2018, Phần 26: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm ở gà;

- TCVN 8685-27 : 2018, Phần 27: Vắc xin nhược độc phòng bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà.

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN - PHẦN 22: VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở GIA CẦM

Vaccine testing procedure - Part 22: Fowl cholera vaccine, inactivated

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định về quy trình kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt được sản xuất từ chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phòng bệnh tụ huyết trùng gia cầm.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684 : 2011, Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y- Phép thử độ thuần khiết.

3  Ký hiệu và chữ viết tắt

CFU : Colony Forming Unit.

MLD: Minimum Lethal Dose.

4  Nguyên tắc

Vắc xin được kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ vô trùng bằng phương pháp phân tích trong phòng thử nghiệm và các chỉ tiêu an toàn, hiệu lực được đánh giá trên động vật thí nghiệm.

5  Động vật thí nghiệm và giống gốc công cường độc

5.1  Gà từ 6-8 tuần tuổi, khỏe mạnh không có kháng thể kháng Pasteurella multocida.

5.2  Vịt từ 6-8 tuần tuổi, khỏe mạnh không có kháng thể kháng Pasteurella multocida.

5.3  Thỏ từ 1,8-2 kg, khỏe mạnh không có kháng thể kháng Pasteurella multocida.

5.4  Vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc. Giống Pasteurella multocida serotype 1 và 2

5.5  Nước muối sinh lý, đã được hấp tiệt trùng, nồng độ 0,9 %.

6  Thiết bị, dụng cụ

6.1  Tủ ấm có thể duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0.5°C.

6.2  Tủ lạnh có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

6.3  Tủ lạnh sâu có thể duy trì nhiệt độ âm 80 °C.

6.4  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm.

6.5  Máy ly tâm ly tâm với gia tốc 3000 g/min.

6.6  Nồi hấp có thể duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C trong thời gian 10 min, 15 min, 20 min.

6.7  Cân điện tử có dải đo từ 0 g đến 200 g, độ chính xác cấp I, d = 0,1 mg, e = 1 mg.

6.8  Nồi đun cách thủy.

6.9  Micropipet đơn kênh, dung tích từ 0,5 µl đến 10 µl, từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl, từ 100 µl đến 1000 µl.

6.10  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 µl đến 50 µl, từ 50 µl đến 200 µl.

6.11  Đĩa lồng, ống nghiệm thủy tinh vô trùng.

6.12  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U.

6.13  Bình tam giác 100 ml, 200 ml vô trùng.

6.14  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng.

6.15  Bơm kim tiêm một lần 1ml, 5 ml, 10 ml.

7  Cách tiến hành

7.1  Kiểm tra cảm quan

Quan sát bằng mắt thường, vắc xin đạt chỉ tiêu cảm quan khi lọ vắc xin đồng nhất, không đông vón, không lắng cặn.

7.2  Kiểm tra vô trùng

7.2.1  Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn Theo TCVN 8684 : 2011.

7.2.2  Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc Theo TCVN 8684 : 2011.

7.2.3  Kiểm tra sự có mặt của formaldehyde Theo TCVN 8684 : 2011.

7.3  Kiểm tra tính an toàn

7.3.1  Kiểm tra tính an toàn trên gà

- Tiêm bắp hoặc dưới da ít nhất 10 gà (5.1), mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn, theo dõi gà 14 ngày.

- Vắc xin được coi là đạt chỉ tiêu về an toàn nếu tất cả gà sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng vị trí tiêm, gà ủ rũ, lông xù, kém ăn.

7.3.2  Kiểm tra tính an toàn trên vịt

- Tiêm bắp hoặc dưới da ít nhất 10 vịt (5.2), mỗi con 2 liều vắc xin ghi trên nhãn, theo dõi vịt 14 ngày.

- Vắc xin được coi là đạt chỉ tiêu về an toàn nếu tất cả vịt sống khỏe, phát triển bình thường và không có biến đổi bất thường về cục bộ hay triệu chứng toàn thân như: sưng vị trí tiêm, gà ủ rũ, lông xù, kém ăn.

7.4  Kiểm tra hiệu lực

Chọn 1 trong 2 phương pháp sau:

7.4.1  Phương pháp công cường độc

7.4.1.1  Phương pháp công cường độc trên gà

Gà được chia làm 2 nhóm:

- Nhóm 1: Tiêm bắp ít nhất 20 gà (5.1), mỗi con tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn.

- Nhóm 2: Tiêm bắp ít nhất 10 gà (5.1) nước muối sinh lý (5.5) vô trùng với liều lượng như tiêm vắc xin.

- Ba tuần sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ gà nhóm 1 được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất.

- Hai tuần sau mũi tiêm thứ 2, toàn bộ gà nhóm 1 và nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc (5.4) mỗi con 1 MLD theo đường bắp lườn.

- Theo dõi động vật thí nghiệm trong 7-10 ngày.

- Vắc xin được coi là đạt nếu:

Nếu gà đối chứng chết ít nhất 80%, gà miễn dịch sống ít nhất 50%.

7.4.1.2  Phương pháp công cường độc trên vịt

Vịt được chia làm 2 nhóm:

- Nhóm 1: Tiêm bắp ít nhất 20 vịt (5.2) mỗi con tiêm 1 liều vắc xin ghi trên nhãn.

- Nhóm 2: Tiêm bắp ít nhất 10 vịt (5.2) nước muối sinh lý (5.5) vô trùng với liều lượng như tiêm vắc xin.

- Ba tuần sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ vịt nhóm 1 được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất.

- Hai tuần sau mũi tiêm thứ 2, toàn bộ vịt nhóm 1 và nhóm 2 được thử thách với vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc (5.4) mỗi con 1 MLD theo đường bắp lườn.

- Theo dõi động vật thí nghiệm trong 7 ngày đến 10 ngày.

- Vắc xin được coi là đạt nếu:

Nếu vịt đối chứng chết ít nhất 80%, vịt miễn dịch sống ít nhất 80%.

7.4.2  Phương pháp huyết thanh học

7.4.2.1  Đánh giá hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết chậm.

- Tiêm bắp ít nhất 20 gà (5.1) mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. Ba tuần sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ gà được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. Hai tuần sau mũi tiêm thứ hai, gà được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục A).

- Đánh giá: Vắc xin đạt tiêu chuẩn nếu hiệu giá kháng thể của ít nhất 75 % mẫu huyết thanh miễn dịch phải cho kết quả ≥ 4log2.

- Tiêm bắp ít nhất 20 vịt (5.2) mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn. Ba tuần sau mũi tiêm thứ nhất, toàn bộ vịt được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. Hai tuần sau mũi tiêm thứ hai, vịt được lấy máu, chắt huyết thanh làm phản ứng ngưng kết chậm (xem phụ lục A).

- Đánh giá: Vắc xin đạt tiêu chuẩn nếu hiệu giá kháng thể của ít nhất 75 % mẫu huyết thanh miễn dịch phải cho kết quả ≥ 4log2.

8  Kết luận

Vắc xin đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm khi đạt các chỉ tiêu kiểm tra cảm quan, kiểm tra vô trùng, kiểm tra tính an toàn và kiểm tra hiệu lực.

Phụ lục A

(Quy định)

Kiểm tra hiệu giá kháng thể Pasteurella multocida bằng phản ứng ngưng kết chậm

A.1  Chuẩn bị môi trường hóa chất

- Blood Agar Base (BAB), được pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau đó đem hấp vô trùng trong nồi hấp (6.6).

- Máu thỏ vô trùng, bổ sung 5- 8 % vào thạch BAB.

- Đĩa thạch máu đường kính 8 cm đến 10 cm .

- Canh thang Brain heart infusion (BHI) được pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất chia 4 ml/ống, đem hấp vô trùng trong nồi hấp (6.6).

- Acid Chlohydric 1N (HCl 1N).

- Sodium hydroxide 1N (NaOH 1N).

- Formaldehyde solution 37 % (HCHO 37%).

- Dung dịch PBS: 1000ml được pha theo công thức sau:

Natri clorua (NaCl)  8 g.

Kali clorua (KCl)  2 g.

Natri hiđro photphat (Na₂HPO₄)  1,15 g.

Mono kali photphat (KH₂PO₄)  0,2 g.

Nước cất  1000ml.

Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min ở nồi hấp (6.6). Bảo quản ở tủ lạnh (6.2) sử dụng trong 3 tháng.

- Nước muối sinh lý 0,9%

Natri clorua (NaCl)  9g.

Nước cất  1000ml.

Chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min ở nồi hấp (6.6). Bảo quản ở tủ lạnh (6.2).

A.2  Chuẩn bị kháng nguyên thân (Kháng nguyên O - Somatic antigen - Kháng nguyên xử lý acid HCl 1N).

A.2.1  Ria cấy 0,01 ml vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc (5.4) vào môi trường thạch máu thỏ, ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h.

A.2.2  Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch máu thỏ (A.2.1) cấy vào môi trường canh thang BHI (A.1), rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h.

A.2.3  Láng 4 ml canh trùng (A.2.2) lên 2 đĩa thạch máu thỏ (A.1) rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h.

A.2.4  Thu hoạch vi khuẩn sau khi láng trên mặt thạch máu thỏ (A.2.3) bằng cách dùng 5 ml PBS (A.1) rửa bề mặt hai đĩa thạch, hút huyễn dịch vi khuẩn thu được vào ống nghiệm.

A.2.5  Nhỏ 0,02 ml dung dịch Formaldehyde 37 % (A.1) vào huyễn dịch vi khuẩn thu được (A.2.4) rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h, sau đó đem kiểm tra vô trùng huyễn dịch vi khuẩn bằng cách ria trên thạch máu thỏ ủ 37 °C (6.1), trong 24 h.

A.2.6  Huyễn dịch vi khuẩn (A.2.5) đạt chỉ tiêu vô trùng (không có vi khuẩn mọc trên đĩa thạch) sẽ được ly tâm bằng máy ly tâm (6.5) 3000 g trong 15 min ở nhiệt độ 4 °C, thu lấy cặn, hoàn nguyên lại bằng 20 ml HCl 1N (A.1), lắc đều rồi ủ ở tủ ấm 37 °C (6.1) trong 24 h.

A.2.7  Sau đó tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.6) bằng máy ly tâm (6.5) 3000 g trong 15 min ở nhiệt độ 4 °C, cặn thu được sẽ rửa bằng 5 ml PBS (A.1) có bổ sung 0,3 % dung dịch Formaldehyde 37 % (A.1).

A.2.8  Lặp lại bước A.2.7 2 lần.

A.2.9  Tiếp tục ly tâm huyễn dịch vi khuẩn (A.2.8) bằng máy ly tâm (6.5) 3000 g trong 15 min ở nhiệt độ 4 °C, cặn thu được sẽ được hoàn nguyên bằng 5 ml PBS (A.1) để thu hoạch kháng nguyên.

A.2.10  Kiểm tra kháng nguyên (A.2.9) xem có tự ngưng kết không, kháng nguyên đạt yêu cầu khi không có hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên lắng tròn nhỏ đáy giếng.

A.3  Chuẩn bị huyết thanh kiểm tra

A.3.1  Huyết thanh thí nghiệm

Lấy máu động vật (7.4.2.1), chắt lấy huyết thanh. Sau đó khử bổ thể bằng cách đun ở nồi đun cách thủy (6.8) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.

A.3.2  Huyết thanh tối miễn dịch

A.3.2.1  Từ canh trùng (A.2.4) pha thành canh trùng có mật độ 2 tỷ CFU/ml.

A.3.2.2  Tiêm 2ml dưới da cho thỏ (5.3) canh trùng (A.3.2.1).

A.3.2.3  Sau 7 ngày tiêm tiếp cho thỏ (5.3) 0.2ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.4  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 0.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.5  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 1 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.6  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 1.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.7  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 2 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.8  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 2.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.9  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 3 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.10  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 3.5 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.11  Sau 3 ngày đến 4 ngày tiêm tiếp 4 ml canh trùng (A.3.2.1) theo đường tĩnh mạch tai.

A.3.2.12  Sau 1 tuần tiêm mũi cuối cùng tiến hành lấy máu thỏ thu hoạch huyết thanh tối miễn dịch.

A.3.3  Cách pha canh trùng 2 tỷ

A.3.3.1  Cho 9 ml nước muối sinh lý vô trùng/ ống vào 7 ống nghiệm vô trùng có đánh số từ 1 đến 7.

A.3.3 2  Cho 1 ml canh trùng đếm số vào ống thứ 1 trộn đều chuyển sang ống thứ 2 cứ như vậy đến ống thứ 7 (pha loãng 1/10)

A.3.3.3  Hút 0,01 ml ở ống thứ 7 nhỏ lên đĩa thạch máu thỏ rồi ria đều (mỗi nồng độ 2 đĩa), để tủ ấm 37 °C (6.1).

A.3.3.4  Hút 0,01 ml ở ống thứ 6 nhô lên đĩa thạch máu thỏ rồi ria đều (mỗi nồng độ 2 đĩa) để tủ ấm 37°C(6.1).

A.3.3.5  Sau 18h đến 20 h, đọc kết quả: Đếm số khuẩn lạc mọc trên mỗi dĩa.

Cách tính kết quả

Số lượng vi khuẩn (N) trong 1 ml được tính theo công thức sau:

Trong đó: C: Là số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa có nồng độ liền nhau.

V: Thể tích cấy ở mỗi đĩa

n1: Số đĩa của độ pha loãng ban đầu 10^-7 (2 đĩa)

n2: Số đĩa của độ pha loãng tiếp theo 10^-6

d: Độ pha loãng ban đầu (nhân nghịch đảo): 10⁶

Pha canh trùng 2 tỷ:

Canh trùng 2 × 10⁹ cfu/ml = 1ml canh trùng (A.2.4) + (N/2×10⁹ - 1) ml NaCI.

A.4  Cách tiến hành

Quy trình cho phản ứng ngưng kết chậm với kháng nguyên O (kháng nguyên Somatic)(A.2) thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U(6.12).

- Bố trí thí nghiệm.

+ Giếng thí nghiệm: A1 đến H8.

+ Giếng đối chứng âm: A8 đến H10.

+ Giếng đối chứng dương: A11 đến H12.

Sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm

- Thực hiện thí nghiệm theo sơ đồ phản ứng ngưng kết chậm như trên

- Đối với các giếng thí nghiệm:

+ Cho 50 µl dung dịch PBS (A.1) vào mỗi giếng thí nghiệm (A1 đến H8).

+ Thêm vào giếng đầu tiên 50 µl huyết thanh (A.3.1) và pha loãng theo cơ số 2 bằng cách trộn đều rồi chuyển 50 µl sang giếng thứ 2, cứ như vậy đến giếng số 8 trộn đều rồi hút bỏ đi 50 µl.

+ Nhỏ 50 µl kháng nguyên (A.2) vào các giếng.

- Đối với các giếng đối chứng:

+ Đối chứng âm: 50 µl dung dịch PBS (A.1) + 50 µl kháng nguyên (A.2).

+ Đối chứng dương: 50 µl huyết thanh tối miễn dịch(A.3.2) + 50 µl kháng nguyên (A.2).

- Lắc nhẹ cho đều rồi đậy nắp để ở tủ ấm 37 °C (6.1) qua đêm.

- Đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: Kháng nguyên lắng tròn đáy giếng.

+ Phản ứng dương tính: Xảy ra hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên ngưng kết thành cụm lấm tấm xung quanh giếng.

+ Đọc hiệu giá ngưng kết: Hiệu giá ngưng kết được đánh giá ở độ pha loãng cao nhất còn có phản ứng ngưng kết xảy ra.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1]  TCCS 04VT-94/KNI: Quy trình kiểm tra vắc xin Tụ huyết trùng gà

[2]  ASEAN Standards for Animal Vaccine: Asean standard Requirements for Fowl cholera Bacterin.

[3]  OIE Terrestrial Manual 2008- Chapter 2.4.12-.Haemorrhagic septicaemia.