Tiêu chuẩn TCVN 12371-2-21:2025 Quy trình giám định vi khuẩn gây bệnh vàng lá gân xanh

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12371-2-21:2025

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT

PHẦN 2-21: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN GÂY BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH CANDIDATES LIBERIBACTER ASIATICUS

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma

Part 2-21: Particular requirements for Candidatus Liberibacter asiaticus

Lời nói đầu

TCVN 12371-2-21:2025 do Cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ thẩm định, công bố.

Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

- TCVN 12371-1:2019: Phần 1: Yêu cầu chung

- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus

- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus

- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Potato spindle tuber viroid

- TCVN 12371-2-7:2021: Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với Coffee ringspot virus

- TCVN 12371-2-8:2021: Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. garcae

- TCVN 12372-2-9:2021: Phần 2-9: Yêu cầu cụ thể đối với Rice grassy stunt virus và Rice ragged stunt virus

- TCVN 12371-2-10:2021: Phần 2-10: Yêu cầu cụ thể đối với Southern rice black streaked dwarf virus

- TCVN 12371-2-11:2022: Phần 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối do Banana bunchy top virus

- TCVN 12371-2-12:2022: Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus

- TCVN 12371-2-13:2024: Phần 2-13: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus đốm vòng cà chua (Tomato ringspot virus - ToRSV)

- TCVN 12371-2-14:2024: Phần 2-14: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ringspot virus - TRSV)

- TCVN 12371-2-15:2024: Phần 2-15: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus nhăn nâu quả cà chua (Tomato brown rugose fruit virus - ToBRFV)

- TCVN 12371-2-16:2024: Phần 2-16: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định Virus khảm lá sắn Sri Lanka (Sri Lankan cassava mosaic virus - SLCMV)

- TCVN 12371-2-17:2025: Phần 2-17: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định vi khuẩn gây bệnh loét cây có múi Xanthomonas citri pv.citri

- TCVN 12371-2-18 :2025: Phần 2-18: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus gây bệnh đốm héo cà chua Orthotospovirus tomatomaculae

- TCVN 12371-2-19:2025: Phần 2-19: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus gây bệnh khảm đốm cà chua Tobamovirus maculatessellạti

- TCVN 12371-2-20:2025: Phần 2-20: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus gây bệnh khảm dưa pepino Potexvirus pepini

- TCVN 12371-2-21:2025: Phần 2-21: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định vi khuẩn gây bệnh vàng lá gân xanh Candidates Liberibacter asiaticus.

 

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT

PHẦN 2-21: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN GÂY BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH CANDIDATES LIBERIBACTER ASIATICUS

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma

Part 2-21: Particular requirements for Candidatus Liberibacter asiaticus

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định vi khuẩn gây bệnh vàng lá gân xanh Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) trên cây ký chủ và trên rầy chổng cánh (Diaphorina citri).

2 Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12371-1:2019, Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.

3 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng giám định được quy định trong TCVN 12371-1:2019 và cụ thể như sau:

3.1 Bể ổn nhiệt, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C, sai số ± 1 °C

3.2 Găng tay sử dụng một lần

3.3 Hệ thống thiết bị đọc bản gel UV tiêu chuẩn

3.4 Máy chu trình nhiệt (PCR), cho phép thực hiện phản ứng PCR có dung tích mẫu 10 ~ 100 μl.

3.5 Máy điện di, có công suất tới 150 W, điện áp tới 300 V và dòng tới 700 mA

3.6 Máy ly tâm, ly tâm tốc độ cao lên tới 15 000 vòng/phút

3.7 Máy minispin, ly tâm tốc độ lên tới 6 000 vòng/phút

3.8 Máy ổn nhiệt khô, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C, sai số ± 1 °C

3.9 Máy realtime PCR, cho phép thực hiện phản ứng PCR thời gian thực có dung tích mẫu 10 ~ 100 μl

3.10 Máy trộn mẫu (máy vortex), tốc độ trộn đạt 1 000 vòng/phút

3.11 Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml, 2 ml

3.12 Ống falcon, dung tích 15 ml, 20 ml, 50 ml

3.13 Ống hút côn trùng

3.14 Pipet và Micropipet có các loại dung tích 10 ml, 1000 μl, 100 μl, 10 μl, 1 μl

3.15 Que nghiền côn trùng chuyên dụng

3.16 Hộp giữ lạnh (cool box)

3.17 Hộp đựng mẫu

3.18 Tủ thao tác PCR

3.19 Túi đựng mẫu có khóa ziplock

3.20 Lò vi sóng, có thể tạo nhiệt độ lên đến 160 °C

4 Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác. Sử dụng các hóa chất được quy định trong TCVN 12371-1:2019 và cụ thể như sau. Phương pháp chuẩn bị các loại dung dịch tham khảo phụ lục B.

4.1 Agarose: tiêu chuẩn phân tích

4.2 Axit acetic (CH ₃ COOH): nồng độ 100 %

4.3 Axit boric (H ₃ BO ₃ ): tinh thể

4.4 Axit clohidric (HCl): nồng độ 37 %

4.5 Cặp mồi đặc hiệu để giám định vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus bằng phương pháp PCR tiêu chuẩn

A2: 5' -TAT AAA GGT TGA CCT TTC GAG TTT-3 '

J5: 5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3 '

4.6 Cặp mồi đặc hiệu để giám định vi khuẩn Candidates Liberibacter asiaticus bằng phương pháp Realtime PCR

HLBas: 5-TCG AGC GCG TAT GCA ATA CG-3'

HLBr: 5'-GCG TTA TCC CGT AGA AAA AGG TAG-3'

4.7 Cồn (C ₂ H ₅ OH): 70 %

4.8 Cồn (C ₂ H ₅ OH) tuyệt đối: 99,7 %

4.9 Dung dịch đệm điện di TAE

4.10 Dung dịch đệm điện di TBE

4.11 Dung dịch EDTA 0,5 M

4.12 Dung dịch NaOH 1 M

4.13 Dung dịch NaOH 50 mM

4.14 Dung dịch Tris-HCl 1 M

4.15 Đệm nhuộm điện di

4.16 Axit ethylenedinitrilotetraacetic disodium salt dihydrate (EDTA) (C ₁₀ H ₁₄ N ₂ O ₈ Na ₂ .2H ₂ O): bột tinh thể

4.17 Kit tách chiết DNA thương mại

4.18 Kit thực hiện phản ứng PCR tiêu chuẩn

4.19 Kit thực hiện phản ứng Realtime PCR

4.20 Mẫu dò (Probe)

Probe HLBp: FAM - AGA CGG GTG AGT AAC GCG-BHQ1

4.21 Mẫu đối chứng âm: mẫu không nhiễm vi khuẩn CLas

4.22 Mẫu đối chứng dương: mẫu nhiễm vi khuẩn CLas

4.23 Mẫu trắng: mẫu nước sử dụng trong phản ứng PCR/ Realtime PCR

4.24 Natri hydroxide (NaOH): viên

4.25 Nước cất

4.26 Silica gel tự chỉ thị

4.27 Thang chuẩn DNA ladder/marker

4.28 Thuốc nhuộm axit nucleic

4.29 Tris-Base (C ₄ H ₁₁ NO ₃ ): tinh thể

4.30 Nước khử ion (Nuclease-free water)

5 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1 Lấy mẫu

Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019.

Thu thập các bộ phận của thực vật (lá, quả) biểu hiện triệu chứng điển hình của bệnh vàng lá gân xanh do vi khuẩn CLas gây ra được thu thập. Mẫu sau khi thu được để trong túi đựng mẫu (3.19) có chứa silica gel tự chỉ thị (4.26). Ghi các thông tin cần thiết cho việc truy xuất thông tin liên quan đến mẫu bên ngoài túi.

Mẫu rầy chổng cánh Diaphorina citri: Rầy chổng cánh (ấu trùng hoặc trưởng thành) được thu bằng ống hút côn trùng (3.13) và được ngâm trong cồn tuyệt đối (4.8), bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thường trong quá trình thu mẫu và vận chuyển.

5.2 Bảo quản mẫu

Để đảm bảo chất lượng của mẫu giám định vi khuẩn gây bệnh vàng lá gân xanh, sau khi thu mẫu cần vận chuyển đến phòng thí nghiệm để thực hiện giám định trong thời gian nhanh nhất. Mẫu sau khi thu thập được để trong các túi đựng mẫu có kích thước tương ứng với mẫu thu thập nhằm đảm bảo mẫu giữ được nguyên vẹn hình dạng kèm theo triệu chứng. Mẫu (lá, quả) được để trong hộp giữ lạnh (cool box) (3.16) hoặc hộp đựng mẫu (3.17) bên trong có chứa đá khô giữ lạnh nhằm đảm bảo độ tươi của mẫu trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm.

Trong trường hợp cần bảo quản mẫu nghi nhiễm vi khuẩn CLas trong thời gian dài, bảo quản mẫu thu thập trong cồn 70 % (4.7).

Mẫu rầy chổng cánh Diaphorina citri: ngâm trong cồn tuyệt đối (4.8) và bảo quản, ở điều kiện - 20 °C đến khi thực hiện giám định.

Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau khi giám định theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12371-1:2019.

6 Phát hiện và triệu chứng điển hình của bệnh

- Lá non: có màu vàng, xung quanh gân lá còn giữ màu xanh lục, phồng gân, phiến lá hẹp, khoảng cách giữa các lá ngắn lại. Lá già: lá dày nhám, gân lồi sần sùi và có màu nâu đen. Triệu chứng đặc trưng nhất trên lá là hai nửa lá có màu vàng và xanh không đối xứng.

- Hoa thường ra trái mùa, ít hoa và rụng nhiều. Quả ít và có kích thước nhỏ hơn bình thường, biến dạng, khi bổ dọc thì tâm quả lệch hẳn sang một bên, hạt trong quả bị bệnh thường bị thối, có màu nâu. Cây nhiễm bệnh vàng lá gân xanh xuất hiện hiện tượng quả chín ngược. Quả trên cây bị nhiễm bệnh hình thành màu vàng từ cuống quả trước, sau lan dần xuống rốn quả, trong khi quả khỏe khi chín sẽ có màu vàng phát triển từ rốn quả đến cuống quả.

Thông tin về phân bố, đặc điểm sinh học của vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus và triệu chứng điển hình của bệnh xem phụ lục A.

7 Giám định vi khuẩn gây bệnh

7.1 Giám định bằng phương pháp PCR tiêu chuẩn

7.1.1 Tách chiết DNA tổng số

- Mẫu lá, cành, quả: thực hiện tách chiết mẫu nghi nhiễm bệnh theo điều 7.1.3.2 của TCVN 12371-1:2019.

- Mẫu rầy chổng cánh D. citri: tách chiết bằng phương pháp sử dụng NaOH 50 mM (4.13) và Tris-HCl 1 M (4.14) (quy trình tách chiết chi tiết xem phụ lục C).

7.1.2 Nhân gen

DNA tổng số thu được sau khi tách chiết tiến hành nhân gen trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.4).

Đối chứng dương (mẫu nhiễm vi khuẩn CLas) (4.22), đối chứng âm (mẫu không nhiễm vi khuẩn CLas) (4.21) và mẫu trắng (mẫu nước sử dụng để chuẩn bị phản ứng PCR) (4.23) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để giám định vi khuẩn CLas (4.5):

Thành phần và dung tích các chất trong phản ứng như sau:

Chu trình nhiệt:

CHÚ THÍCH 1: Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm sử dụng của từng nhà sản xuất.

7.1.3 Đọc kết quả

Sản phẩm PCR được trộn với đệm nhuộm điện di (4.15) theo đúng tỷ lệ quy định, sau đó điện di bằng máy điện di (3.5) sử dụng gel agarose 1,5 % (4.1) đã có sẵn thuốc nhuộm axit nucleic (4.28) trong dung dịch đệm điện di TAE (4.9) hoặc TBE (4.10) với thời gian 30 phút ở hiệu điện thế 110 V.

Đọc kết quả điện di bằng hệ thống đọc bản gel UV (3.3).

Các loại đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Đối chứng dương: xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~700 bp.

+ Đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện vạch trên bản agarose gel

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nhiễm vi khuẩn CLas) khi xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~700 bp.

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính (không nhiễm vi khuẩn CLas) khi không xuất hiện vạch trên bản gel.

+ Thực hiện giám định lại nếu mẫu cho kết quả PCR không rõ ràng.

7.2 Giám định bằng phương pháp Realtime PCR

7.2.1 Tách chiết DNA tổng số

Thực hiện tách chiết DNA tổng số của mẫu nghi nhiễm CLas theo điều 7.1.1 của tiêu chuẩn này.

7.2.2 Phản ứng Realtime PCR

DNA thu được sau khi tách chiết tiến hành phản ứng Realtime PCR trong máy Realtime PCR (3.9).

Mẫu đối chứng dương (mẫu nhiễm vi khuẩn CLas) (4.22), mẫu đối chứng âm (mẫu không nhiễm vi khuẩn CLas) (4.21) và mẫu trắng (mẫu nước sử dụng để chuẩn bị phản ứng PCR) (4.23) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (4.6) và mẫu dò probe (Taqman) (4.20):

Thành phần và dung tích các chất trong phản ứng như sau:

Chu trình nhiệt:

CHÚ THÍCH 2: Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm sử dụng của từng nhà sản xuất.

7.2.3 Đọc kết quả

Kết quả phản ứng Realtime PCR được hiển thị trên màn hình máy Realtime PCR.

Các loại đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Đối chứng dương: xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 35.

+ Đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct).

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nhiễm vi khuẩn CLas) khi xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 35.

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính (nhiễm vi khuẩn CLas) khi không xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct).

+ Mẫu kiểm tra có giá trị chu kỳ ngưỡng 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ nhiễm vi khuẩn. Những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện giám định lại để khẳng định kết quả.

7.3 Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là nhiễm vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus khi:

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng PCR tiêu chuẩn

Hoặc

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng Realtime PCR

8 Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

Thông tin về mẫu giám định

Tên loài vi khuẩn

Phương pháp giám định

Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu kết quả giám định chi tiết tham khảo phụ lục D.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: vi khuẩn gây bệnh vàng lá gân xanh

Tên khoa học: Candidatus Liberibacter asiaticus

Tên tiếng Anh: citrus greening

Vị trí phân loại:

Bộ: Rhizobiales

Họ: Phyllobacteriaceae

Chi: Candidatus Liberibacter

A.2 Phân bố

Châu Á: Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nepal, Nhật Bản, Phillipine, Thái Lan, Việt Nam; Bắc Mỹ: Cuba, Hoa Kỳ, Mexico; Châu Đại Dương: Đông Timor, Papua New Guinea; Châu Phi: Ethiopia, Kenya, Mauritius, Reunion; Nam Mỹ: Argentina, Brazil, Colombia, Paraguay, Uruguay.

A.3 Ký chủ chính

Bưởi (Citrus maxima), Cam chua (Citrus aurantium), Cam ngọt (Citrus sinensis), Chanh ngọt (Citrus limetta), Chanh Tahiti (Citrus latifolia), Chanh vàng (Citrus limon), Chanh xanh (Citrus aurantiifolia), Chanh yên (Citrus medica), Quất (Citrus madurensis), Quýt (Citrus reticulata), Xoài (Mangifera indica).

A.4 Đặc điểm sinh học

Bệnh vàng lá gân xanh (Huanglongbing-HLB) trên thế giới do 02 loài vi khuẩn gây ra là vi khuẩn dòng Châu á Candidatus Liberibacter asiaticus và vi khuẩn dòng Châu phi Candidatus Liberibacter africanus. Ở Việt Nam, bệnh HLB do vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus gây ra. Vi khuẩn có độ dày vỏ khoảng 25 mm với 3 lớp của vi khuẩn gram âm. Vi khuẩn này có 2 dạng: dạng dài và dạng hình cầu, dạng dài có chiều dài từ 1 - 4 mm, đường kính 0,15 - 0,3 mm và dạng hình cầu có đường kính 0,1 mm. Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo. CLas chủ yếu tồn tại trong mỏ libe của cây và lan truyền chủ yếu qua côn trùng môi giới rầy chổng cánh (Diaphorina citri), một loài côn trùng môi giới có khả năng thích nghi cao với điều kiện môi trường khác nhau, theo kiểu bền vững (Gottwald, 2010). Ngoài ra, bệnh còn được lây qua việc nhân giống, ghép cây (CABI, 2025).

Vi khuẩn này có khả năng tồn tại và phát triển ở điều kiện nhiệt độ tương đối cao, điều này giải thích tại sao bệnh HLB thường có mức độ nghiêm trọng hơn tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới như Đông Nam Á, Trung Quốc, và các bang miền Nam Hoa Kỳ. CLas gây tắc nghẽn hệ thống vận chuyển dinh dưỡng của cây, dẫn đến triệu chứng lá vàng, quả nhỏ và méo mó, làm giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả (Graca và cs., 2016).

Do không thể nuôi cấy CLas trong điều kiện môi trường nhân tạo làm cho công tác nghiên cứu, chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh gặp nhiều trở ngại. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) hiện vẫn là phương pháp phổ biến nhất để phát hiện sự hiện diện của CLas trong cây chủ (Li và cs., 2006). Sự lây lan nhanh chóng và hậu quả kinh tế nặng nề của HLB đã khiến CLas trở thành một trong những đối tượng quan trọng nhất trong nghiên cứu bệnh học thực vật toàn cầu.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp chuẩn bị các dung dịch

B.1 Dung dịch đệm điện di TAE

Hoà tan các thành phần trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.2 Dung dịch đệm điện di TBE

Hoà tan các thành phần trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.3 Dung dịch EDTA 0,5 M (pH 8)

Hoà tan lượng EDTA trong 40 ml - 60 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 1 M (B.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.4 Dung dịch NaOH 1 M

Hòa tan lượng NaOH trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.5 Dung dịch NaOH 50 mM

Hoà 5 ml dung dịch NaOH 1 M (B.4) trong 95 ml nước cất trước, khuấy đều. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.6 Dung dịch Tris-HCl 1 M (pH 8)

Hoà tan lượng Tris-Base (4.29) trong 40 ml - 60 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch axit HCl (4.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.7 Agarose gel 1,5 %

Hoà lượng Agarose trên trong 100 ml nước cất, khuấy đều, làm tan hoàn toàn bột agarose trong dung dịch bằng đun nóng trong lò vi sóng (3.20). Để nguội 2 - 3 phút, đổ dung dịch vào khuôn để tạo bản gel. Sau khi agarose gel đã đông đặc, sử dụng bản gel để chạy điện di sản phẩm PCR.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu rầy chổng cánh D. citri bằng dung dịch NaOH 50 mM và Tris-HCl 1 M

- Cho 01 - 03 cá thể rầy chổng cánh D.citri vào ống eppendorf 1,5 ml (3.11).

- Nghiền nát cá thể rầy chổng cánh D.citri trong 5 μl dung dịch NaOH 50 mM (B.5) bằng que nghiền côn trùng chuyên dụng (3.15). Dùng pipet (3.14) nhỏ thêm 5 μl dung dịch NaOH 50 mM (B.5) để rửa dịch nghiền còn bám trên que nghiền côn trùng (3.14).

- Đậy chặt nắp ống eppendorf chứa dịch nghiền rầy chổng cánh và ủ dịch nghiền rầy chổng cánh trong bể ổn nhiệt (3.1) hoặc máy ổn nhiệt khô (3.8) ở điều kiện nhiệt độ 95 °C trong 5 phút.

- Để nguội dịch nghiền trong 1 - 2 phút, thêm 10 μl dung dịch Tris-HCl 1 M (pH 8) (B.6) vào ống eppendorf chứa dịch nghiền rầy chổng cánh đã ủ.

- Trộn dịch nghiền trong ống eppendorf bằng máy trộn mẫu (máy vortex) (3.10), làm lắng dịch nghiền bằng máy minispin (3.7) trong 30 giây. Dịch nghiền sau khi làm lắng được sử dụng để thực hiện giám định hoặc có thể bảo quản ở nhiệt độ 4 °C trong 05 ngày trong trường hợp thực hiện giám định sau.

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

 

KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH SINH VẬT GÂY HẠI

Kính gửi: .......................................................................

1. Tên mẫu:

2. Mã số mẫu:

3. Tình trạng mẫu:

4. Ngày nhận mẫu:

5. Nội dung giám định:

 

___________________________________________________

Ghi chú:

- Kết quả ghi trong phiếu này chỉ có giá trị đối với mẫu giám định tại phòng thí nghiệm.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Bové, J.M. (2006). Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of cittus. Journal of Plant Pathology, 88: 7-37.

[2] CABI (2025). Crop Protection Compendium (https://www.cabidigitallibrary.org/) truy cập ngày 30/5/2025.

[3] EPPO (2025). https://gd.eppo.int/ truy cập ngày 30/5/2025.

[4] Gottwald, T.R. (2010). Current epidemiological understanding of citrus Huanglongbing. Annual Review of Phytopathology, 48,119-139.

[5] Graga, J.V., et al. (2016). Citrus Huanglongbing: From A Bacterial Infection to Crop Disease. Springer.

[6] Hung T.-H., S.-C. Hung, C.-N. Chen, M.-H. Hsu and H.-J. Su (2024). Detection by PCR of Candidatus Liberibacter asiaticus, the bacterium causing citrus huanglongbing in vector psyllids: apμlication to the study of vector-pathogen relationships

[7] Li, W., Hartung, J.S., & Levy, L. (2006). Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. Journal of Microbiological Methods, 66(1), 104-115.

[8] Jorge Evelio Ángel, Erick Geovanni Hernández, Néstor Andrés Herrera, Linda Yhiset Gómez, Ángela Patricia Castro, Adriana Milena Sepúlveda, and Everth Emilio Ebratt (2015). Citrus huanglongbing: validation of Real-Time PCR (qPCR) for the detection of Candidatus Liberibacter asiaticus and Candidatus Liberibacter americanus in Colombia. Agronomia Colombiana 32(3), 377-389

[9] OEPP/EPPO PM 7/121(2) (2021). Diagnostic protocols for regulated pests: Candidatus Liberibacter africanus’,‘Candidatus Liberibacter americanus’ and ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’. EPPO Bulletin. 2021; 51:267-282.