Tiêu chuẩn TCVN 12371-2-20:2025 Quy trình giám định virus gây bệnh khảm dưa pepino

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12371-2-20:2025

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT

PHẦN 2-20: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS GÂY BỆNH KHẢM DƯA PEPINO POTEXVIRUS PEPINI

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma

Part 2-20: Particular requirements for Potexvirus pepini

Lời nói đầu

TCVN 12371-2-20:2025 do Cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ thẩm định, công bố.

Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

- TCVN 12371-1:2019: Phần 1: Yêu cầu chung

- TCVN 12371-2-1:2018: Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus

- TCVN 12371-2-2:2018: Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

- TCVN 12371-2-3:2019: Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

- TCVN 12371-2-4:2020: Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus

- TCVN 12371-2-5:2020: Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

- TCVN 12371-2-6:2020: Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Potato spindle tuber viroid

- TCVN 12371-2-7:2021: Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với Coffee ringspot virus

- TCVN 12371-2-8:2021: Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. garcae

- TCVN 12372-2-9:2021: Phần 2-9: Yêu cầu cụ thể đối với Rice grassy stunt virus và Rice ragged stunt virus

- TCVN 12371-2-10:2021: Phần 2-10: Yêu cầu cụ thể đối với Southern rice black streaked dwarf virus

- TCVN 12371-2-11:2022: Phần 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus chùn ngọn chuối do Banana bunchy top virus

- TCVN 12371-2-12:2022: Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus sọc lá lạc Peanut stripe virus

- TCVN 12371-2-13:2024: Phần 2-13: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus đốm vòng cà chua (Tomato ringspot virus - ToRSV)

- TCVN 12371-2-14:2024: Phần 2-14: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ringspot virus - TRSV)

- TCVN 12371-2-15:2024: Phần 2-15: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus nhăn nâu quả cà chua (Tomato brown rugose fruit virus - ToBRFV)

- TCVN 12371-2-16:2024: Phần 2-16: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định Virus khảm lá sắn Sri Lanka (Sri Lankan cassava mosaic virus - SLCMV)

- TCVN 12371-2-17:2025: Phần 2-17: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định vi khuẩn gây bệnh loét cây có múi Xanthomonas citri pv. citri

- TCVN 12371-2-18 :2025: Phần 2-18: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus gây bệnh đốm héo cà chua Orthotospovirus tomatomaculae

- TCVN 12371-2-19:2025: Phần 2-19: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus gây bệnh khảm đốm cà chua Tobamovirus maculatessellati.

- TCVN 12371-2-20:2025: Phần 2-20: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus gây bệnh khảm dưa pepino Potexvirus pepini.

- TCVN 12371-2-21:2025: Phần 2-21: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định vi khuẩn gây bệnh vàng lá gân xanh Candidatus Liberibacter asiaticus.

 

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT

PHẦN 2-20: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VIRUS GÂY BỆNH KHẢM DƯA PEPINO POTEXVIRUS PEPINI

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma

Part 2-20: Particular requirements for Potexvirus pepini

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định virus gây bệnh khảm dưa pepino Potexvirus pepini (PepMV) trên cây ký chủ.

2 Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12371-1:2019, Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.

3 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng giám định được quy định trong TCVN 12371-1:2019 và cụ thể như sau:

3.1 Bể ổn nhiệt, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C, sai số ± 1 °C

3.2 Găng tay sử dụng một lần

3.3 Hệ thống thiết bị đọc bản gel UV tiêu chuẩn

3.4 Máy chu trình nhiệt (PCR), cho phép thực hiện phản ứng PCR có dung tích mẫu 10 ~ 100 μl.

3.5 Máy điện di, có công suất tới 150 W, điện áp tới 300 V và dòng tới 700 mA

3.6 Máy ly tâm, ly tâm tốc độ cao lên tới 15 000 vòng/phút

3.7 Máy minispin, ly tâm tốc độ lên tới 6 000 vòng/phút

3.8 Máy ổn nhiệt khô, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C , sai số ± 1 °C

3.9 Máy realtime PCR, cho phép thực hiện phản ứng PCR thời gian thực có dung tích mẫu 10 ~ 100 μl

3.10 Máy trộn mẫu (máy vortex), tốc độ trộn đạt 1 000 vòng/phút

3.11 Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml, 2 ml

3.12 Ống falcon, dung tích 15 ml, 20 ml, 50 ml

3.13 Pipet và micropipet có các loại dung tích 10 ml, 1000 μl, 100 μl, 10 μl, 1 μl.

3.14 Hộp giữ lạnh (cool box)

3.15 Hộp đựng mẫu

3.16 Tủ mát, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C

3.17 Tủ thao tác PCR

3.18 Túi đựng mẫu có khóa ziμlock

3.19 Lò vi sóng, có thể tạo nhiệt độ lên đến 160 °C

4 Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác. Sử dụng các hóa chất được quy định trong TCVN 12371-1:2019 và cụ thể như sau. Phương pháp pha các loại dung dịch xem phụ lục B.

4.1 Agarose: tiêu chuẩn phân tích

4.2 Axit acetic (CH ₃ COOH): nồng độ 100 %

4.3 Axit boric (H ₃ BO ₃ ): tinh thể

4.4 Axit Clohidric (HCl): nồng độ 37 %

4.5 Cặp mồi đặc hiệu để giám định PepMV bằng phương pháp RT- PCR tiêu chuẩn

KL05-13: 5'-GTC CTC ACC AAT AAA TTT AG-3'

KL05-14: 5'-AGG AAA ACT TAA CCC GTT C-3'

4.6 Cặp mồi đặc hiệu để giám định PepMV bằng phương pháp Realtime RT- PCR

KL05-48-f1: 5'- ACTCCTAGAGCTGACCTCAC-3'

KL05-49-f2: 5'- ACTCCTAGAGCTGATCTTAC-3'

KL05-51-r1: 5'- TCTCCAGCAACAGGTTGGTA-3’

KL05-52-r2: 5'- TCACCTGCAACTGGTTGATA-3’

4.7 Cồn (C ₂ H ₅ OH) tuyệt đối: 99,7 %

4.8 Dung dịch đệm điện di TAE

4.9 Dung dịch đệm điện di TBE

4.10 Dung dịch EDTA 0,5 M

4.11 Dung dịch NaOH 1 M

4.12 Dung dịch PBS

4.13 Đệm nhuộm điện di

4.14 Axit ethylenedinitrilotetraacetic disodium salt dihydrate (EDTA) (C ₁₀ H _{1 4} N ₂ O ₈ Na ₂ .2H ₂ O): bột tinh thể

4.15 Kali clorua (KCl): tinh thể

4.16 Kali dihydrophosphat (KH ₂ PO ₄ ): tinh thể

4.17 Kit tách chiết RNA thương mại

4.18 Kit thực hiện phản ứng Realtime RT - PCR

4.19 Kit thực hiện phản ứng RT-PCR một bước (one-step)

4.20 Mẫu dò (Probe)

KL05-50 probe: 5’-FAM-TGTCAGCTTGCATTTACTTCCAAAA-BHQ1-3’

4.21 Mẫu đối chứng âm: mẫu không nhiễm PepMV

4.22 Mẫu đối chứng dương: mẫu nhiễm PepMV

4.23 Mẫu trắng: mẫu nước sử dụng trong phản ứng RT-PCR/ Realtime RT-PCR

4.24 Natri clorua (NaCl): tinh thể

4.25 Natri dibiphosphat (Na ₂ HPO ₄ ): tinh thể

4.26 Natri hydroxide (NaOH): viên

4.27 Nước cất

4.28 Silica gel tự chỉ thị

4.29 Thang chuẩn DNA ladder/marker

4.30 Thuốc nhuộm axit nucleic

4.31 Tris-Base (C ₄ H ₁₁ NO ₃ ): tinh thể

4.32 Nước khử ion (Nuclease-free water)

5 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1 Lấy mẫu

Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019.

Mẫu thực vật (chồi, hạt, lá, quả) biểu hiện triệu chứng điển hình của bệnh do PepMV gây ra được thu thập. Mẫu thực vật sau khi thu được để trong túi đựng mẫu (3.18) có chứa silica gel tự chỉ thị (4.28). Ghi các thông tin cần thiết cho việc truy xuất thông tin bên ngoài túi đựng mẫu.

5.2 Bảo quản mẫu

Trường hợp thời gian vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm ngắn (dưới 3 ngày): Mẫu thực vật sau khi thu thập được đựng trong các túi đựng mẫu (3.18) kích thước tương ứng với mẫu thu thập để đảm bảo mẫu giữ được nguyên vẹn hình dạng kèm theo triệu chứng. Mẫu được đựng trong hộp giữ lạnh (cool box) (3.14) hoặc hộp đựng mẫu (3.15) bên trong có chứa đá khô để đảm bảo độ tươi của mẫu trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm.

Trường hợp thời gian vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm dài (từ 3 ngày trở lên): Mẫu sau khi thu thập ngoài đồng ruộng được xử lý làm khô bằng hạt silica gel tự chỉ thị trong ống Falcon (3.12) hoặc túi đựng mẫu (3.18), sau đó được vận chuyển về phòng thí nghiệm ở nhiệt độ thường.

Bảo quản và vận chuyển mẫu về phòng giám định theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12371-1:2019.

6 Phát hiện và triệu chứng điển hình của bệnh

- Triệu chứng điển hình trên các cây ký chủ do Potexvirus pepini gây ra bao gồm lá khảm, lá biến màu, cuốn lá. Cây thấp lùn, sinh trưởng kém. Quả khảm loang lỗ màu xanh vàng, có thể bị nứt hoặc biến dạng quả.

- Thông tin về phân bố, đặc điểm sinh học của PepMV và triệu chứng điển hình do virus gây ra trên một số cây ký chủ xem phụ lục A.

7 Giám định virus gây bệnh

7.1 Giám định bằng phương pháp RT- PCR tiêu chuẩn

7.1.1 Tách chiết RNA tổng số

- Đối với mẫu hạt: nghiền vỡ mẫu hạt, sau đó ủ mẫu hạt đã vỡ theo tỷ lệ: 1,3 - 1,4 g hạt trong trong 20 ml dung dịch PBS (4.12). Hạt được ủ qua đêm ở 4 °C trong tủ mát (3.16). Sau đó ly tâm 10 000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4 °C. Sử dụng 300 μl dung dịch phía trên kết tủa để tách chiết RNA theo điều 7.2.1 của TCVN 12371-1:2019 hoặc theo hướng dẫn của Kit tách chiết RNA thương mại (4.17).

- Đối với mẫu chồi, lá, vỏ quả: thực hiện tách chiết RNA của virus từ mẫu nghi nhiễm theo điều 7.2.1 của TCVN 12371-1:2019 hoặc theo hướng dẫn của Kít tách chiết RNA thương mại (4.17).

7.1.2 Nhân gen

RNA tổng số thu được sau khi tách chiết được sử dụng để nhân gen trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.4).

Đối chứng dương (mẫu nhiễm PepMV) (4.22), đối chứng âm (mẫu không nhiễm PepMV) (4.21) và mẫu trắng (mẫu nước sử dụng để chuẩn bị phản ứng PCR) (4.23) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Thực hiện phản ứng RT- PCR một bước (one step).

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu của PepMV (4.5).

Thành phần và dung tích các chất trong phản ứng như sau:

Chu trình nhiệt:

CHÚ THÍCH 1: Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm sử dụng của từng nhà sản xuất.

7.1.3 Đọc kết quả

Sản phẩm PCR được trộn với đệm nhuộm điện di (4.13) theo tỷ lệ quy định, sau đó điện di bằng máy điện di (3.5) sử dụng gel agarose 1,5 % (4.1) đã có sẵn thuốc nhuộm axit nucleic (4.30) trong dung dịch đệm điện di TAE (4.8) hoặc TBE (4.9) với thời gian 30 phút ở hiệu điện thế 110 V.

Đọc kết quả điện di bằng hệ thống đọc bản gel UV (3.3).

Các loại đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Đối chứng dương: xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~200 bp.

+ Đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện vạch trên bản gel

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nhiễm virus) khi xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~200 bp.

+ Mẫu kiểm, tra cho kết quả âm tính (không nhiễm virus) khi không xuất hiện vạch trùng với kích thước đối chứng dương trên bản agarose gel.

+ Thực hiện giám định lại nếu mẫu cho kết quả PCR không rõ ràng.

7.2 Giám định bằng phương pháp Realtime RT- PCR

7.2.1 Tách chiết RNA tổng số

Thực hiện tách chiết RNA tổng số của mẫu nghi nhiễm PepMV theo điều 7.1.1 của tiêu chuẩn này.

7.2.2 Phản ứng Realtime RT - PCR

RNA tổng số thu được sau khi tách chiết tiến hành phản ứng Realtime RT - PCR trong máy Realtime PCR (3.9).

Đối chứng dương (mẫu nhiễm PepMV) (4.22), đối chứng âm (mẫu không nhiễm PepMV) (4.21) và mẫu trắng (mẫu nước sử dụng để chuẩn bị phản ứng PCR) (4.23) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu (4.6) và mẫu dò probe (Taqman) (4.20):

Thành phần và dung tích các chất trong phản ứng như sau:

Chu trình nhiệt:

CHÚ THÍCH 2: Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm sử dụng của từng nhà sản xuất.

7.2.3 Đọc kết quả

Kết quả phản ứng Realtime RT - PCR được hiển thị trên màn hình máy Realtime PCR (3.9).

Các loại đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Đối chứng dương: xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 37.

+ Đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct).

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nhiễm virus) khi xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 37.

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính (không nhiễm virus) khi không xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct).

+ Mẫu kiểm tra có giá trị chu kỳ ngưỡng 37 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ nhiễm virus. Những mẫu nghi ngờ này cần được thực hiện giám định lại để khẳng định kết quả.

7.3 Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là nhiễm Potexvirus pepini khi:

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng RT - PCR tiêu chuẩn

Hoặc

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng Realtime RT - PCR

8 Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

Thông tin về mẫu giám định

Tên loài virus

Phương pháp giám định

Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu kết quả giám định chi tiết tham khảo phụ lục C.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: virus gây bệnh khảm dưa pepino

Tên khoa học: Potexvirus pepini (Syn.: Pepino mosaic virus - PepMV)

Vị trí phân loại:

Bộ: Tymovirales

Họ: Alphaflexiviridae

Chi: Potexvirus

A.2 Phân bố

Châu Á: Hàn Quốc, Israel, Syria, Thổ Nhĩ Kỳ, Trung Quốc; Châu Âu: Anh, Áo, Ba Lan, Bỉ, Đan Mạch, Đức, Hà Lan, Hy Lạp, Italia, Pháp, Tây Ban Nha; Châu Đại Dương: New Zealand; Châu Mỹ: Canada, Chile, Ecuador, Hoa Kỳ, Peru; Châu Phi: Ai Cập, Ma-rốc.

A.3 Ký chủ chính

Cà chua (Solanum lycopersicum), cà tím (Solanum melongena), dưa pepino (Solanum muricatum), khoai tây (Solanum tuberosum).

A.4 Đặc điểm sinh học

Potexvirus pepini lây truyền chủ yếu qua tiếp xúc cơ học, đặc biệt trong quá trình thu hoạch hoặc cắt tỉa, dẫn đến sự lây lan nhanh chóng trong ruộng cà chua. Ngoài ra, PepMV có thể lây truyền qua hạt giống..., tuy nhiên tỷ lệ lây truyền qua hạt giống tương đối thấp, chỉ dao động từ 0,005% đến 2% và PepMV không lây nhiễm vào phôi hoặc nội nhũ mà chỉ tồn tại ở phần vỏ hạt (Córdoba-Sellés và cs. 2007; Hanssen và cs. 2010). Loài virus này có thể lan truyền nhờ côn trùng môi giới là bọ phấn (Trialeurodes vaporariorum) và loài ong thụ phấn hoa (Bombus impatiens) (DAWE, 2021). Sự lây lan ở khoảng cách xa của PepMV được xác định là thông qua hoạt động thương mại hạt giống hoặc cây con bị nhiễm virus (Clark & Crook, 2012). Giống như hầu hết các potexvirus khác, PepMV có phổ ký chủ tự nhiên khá hẹp, chủ yếu gây hại trên các loài thực vật thuộc họ Cà (Solanaceae). Ngoài cà chua và dưa pepino (S. muricatum) là ký chủ chính trong tự nhiên, bằng lây nhiễm nhân tạo, PepMV có khả năng gây bệnh trên một số cây trồng thuộc họ cà khác như khoai tây, thuốc lá, ớt và cà tím (CABI, 2023). Từ năm 1999, khi PepMV bắt đầu lây nhiễm cho cây cà chua (Solanum lycopersicum) ở Hà Lan, Anh và Tây Ban Nha. Sự gây hại của PepMV đối với ngành sản xuất cà chua là đáng kể do virus này khi nhiễm trên cây sẽ làm giảm năng suất và giá trị thương phẩm của cà chua (Spencea và cs., 2006).

A.5 Triệu chứng do virus gây ra trên một số cây ký chủ

- Trên cây cà chua: triệu chứng ban đầu xuất là các đốm nhỏ màu vàng trên lá, dễ nhầm lẫn với triệu chứng do virus PVX (virus khoai tây X) gây ra. Ở giai đoạn sau, lá già có thể xuất hiện các vết đốm vàng loang lỗ, và lá non có thể bị cuốn dạng thìa. Ngoài ra, cây còn có thể biểu hiện các triệu chứng khác như vàng quanh gân lá, lá biến dạng, khảm lá, đốm vàng xuất hiện trên chồi non và cuống lá. Trên thân, xuất hiện các sọc vàng chạy dọc theo chiều dài thân. Quả của cây bị nhiễm PepMV có thể có màu loang lổ, khảm xanh vàng, bị nứt hoặc biến dạng.

- Trên cây khoai tây: virus khi nhiễm vào cây thường tạo ra triệu chứng khảm lá, lá biến màu. Một số trường hợp cây có thể thấp lùn, sinh trưởng kém.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp chuẩn bị các dung dịch

B.1 Dung dịch đệm điện di TAE

Hoà tan các thành phần trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.2 Dung dịch đệm điện di TBE

Hoà tan các thành phần trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.3 Dung dịch EDTA 0,5 M (pH 8)

Hoà tan lượng EDTA trong 40 ml - 60 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 1 M (B.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.4 Dung dịch NaOH 1 M

Hoà tan lượng NaOH trên trong 40 ml - 60 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.5 Dung dịch PBS (pH = 7,4)

Hoà tan các thành phần trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1 M (B.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Hấp khử trùng ở 121 °C và bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.6 Agarose gel 1,5 %

Hoà lượng Agarose trên trong 100 ml nước cất, khuấy đều, làm tan hoàn toàn bột agarose trong dung dịch bằng đun nóng trong lò vi sóng (3.19). Để nguội 2 - 3 phút, đổ dung dịch vào khuôn để tạo bản gel. Sau khi agarose gel đã đông đặc, sử dụng bản gel để chạy điện di sản phẩm PCR.

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

 

KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH SINH VẬT GÂY HẠI

Kính gửi: ........................................................................

1. Tên mẫu:

2. Mã số mẫu:

3. Tình trạng mẫu:

4. Ngày nhận mẫu:

5. Nội dung giám định:

 

_________________________________________________

Ghi chú:

- Kết quả ghi trong phiếu này chỉ có giá trị đối với mẫu giám định tại phòng thí nghiệm.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] CABI (2024). Crop Protection Compendium (https://www.cabidigitallibrary.org/) truy cập ngày 10/6/2025.

[2] EPPO (2024). EPPO Global Database (https://gd.eppo.int/) truy cập ngày 09/6/2025.

[3] EPPO (2013). PM 7/113 (1) Pepino mosaic virus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin (2013) 43 (1), 94-104

[4] Ephytia Pepino mosaic virus (PepMV) (https://ephytia.inra.fr/en/C/21065/Potato-Pepino-mosaic-virus-PepMV).

[5] Clark, S & Crook, K (2012). 'Import risk analysis: tomato and capsicum seed for sowing from all countries’, Ministry of Agriculture and Forestry, Welington, New Zealand, available at https://www.mpi.govt.nz/dmsdocument/2887.

[6] Córdoba-Sellés, M del C, García-Rández, A, Alfaro-Fernández, A & Concepción, J (2007). Seed transmission of Pepino mosaic virus and efficacy of tomato seed disinfection treatments, Plant Disease, vol. 91, no. 10, pp. 1250-4.

[7] DAWE (2021). Final pest risk analysis for Pepino mosaic virus and pospiviroids associated with tomato seed, Department of Agriculture, Water, and the Environment of Australia.

[8] Hanssen, IM, Mumford, JD, Blystad, D, Cortez, I, Hasiów-Jaroszewska, B, Hristova, D, Pagán, I, Pereira, A, Peters, J, Pospieszny, H, Ravnikar, M, Stijger, I, Tomassoli, L, Varveri, C, van der Vlugt, RAA & Nielsen, SL (2010). Seed transmission of Pepino mosaic virus in tomato, European Journal of Plant Pathology, vol. 126, pp. 145-52.

[9] Ling, K.-S., Wintermantel, W. M., and Bledsoe, M. (2008). Genetic composition of Pepino mosaic virus population in North American greenhouse tomatoes. Plant Dis. 92:1683-1688.

[10] Spèncea N. J., J. Bashamb, R. A. Mumforda, G. Haymanc, R. Edmondsondand D. R. Jones (2006). Effect of Pepino mosaic virus on the yield and quality of glasshouse-grown tomatoes in the UK. Plant Pathology 55, 595-606.

[11] Wen-Chi Hu, Chin-Hsing Huang, Shu-Chuan Lee, Chun-I Wu, Ya-Chun Chang (2010). Detection of four calla potyviruses by multiμlex RT-PCR using nad5 mRNA as an internal control. Eur J Plant Pathol 126:43-52.