Tiêu chuẩn ngành 52TCN-TQTP 0008:2004 Xác định E.coli 0157 trong thực phẩm

TIÊU CHUẨN NGÀNH Y TẾ

52 TCN-TQTP 0008:2004

THƯỜNG QUY KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH

E.COLI 0157 TRONG THỰC PHẨM

Lời nói đầu

52 TCN - TQTP 0008 : 2004 do Viện Dinh dưỡng biên soạn, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm đề nghị, Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành theo Quyết định số 4871/2004/QĐ-BYT ngày 31 tháng 12 năm 2004.

1. Phạm vi áp dụng

Ph­ương pháp này để xác định E.coli O157 trong thực phẩm.

2. Nguyên lý

Sử dụng kỹ thuật làm giàu, xác định khuẩn lạc nghi ngờ E.coli O157 trên thạch SMAC sau khi ủ ấm ở 370c trong 24 giờ. Từ những khuẩn lạc nghi ngờ, tiến hành kiểm tra các tính chất sinh vật hóa học và ngưng kết đặc hiệu để khẳng định là E.coli O157.

3. Thiết bị, Dụng cụ, Môi trường

3.1. Thiết bị, dụng cụ

Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.

3.2. Môi trường

- Canh thang m-EC

- Nước muối sinh lý 8,5⁰/₀₀

- Kháng huyết thanh E. coli O157

- Thạch SMAC

- Thạch CLIG

- Thạch thường

4. Chuẩn bị môi trường và mẫu thử.

 4.1. Chuẩn bị môi trường

Môi trường tăng sinh, nuôi cấy và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức Các môi trường được­ đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110⁰C/30 phút HOặC 121⁰C/15 phút).

4.2. Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu thử được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.

5. Phương pháp tiến hành

5.l. Bước 1: Tăng sinh

- Ghi ký hiệu mẫu lên bình nón có chứa 225 ml canh thang mc-EC.

- Cân chính xác 25 g thực phẩm đã chuẩn bị (hoặc dùng pipét vô trùng hút 25 ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón đã ghi ký hiệu mẫu, lắc đều rồi ủ ấm ở 42⁰C/24 giờ.

5.2. Bước 2: Phân lập

- Từ bình nón canh thang m-EC đã ủ ấm, dùng que cấy vô trùng lấy canh khuẩn cấy phân vùng trên thạch SMAC để tạo các khuẩn lạc riêng rẽ.

- Ủ ấm 37⁰C/24 giờ. Sau ủ ấm, đánh dấu những khuẩn lạc nghi ngờ E.coli O157 trên thạch SMAC có đặc điểm: tròn đều, mặt nhẵn, khống mầu, sáng đục (vì E.coli O157 không lên men đường sorbitol có trong thạch SMAC). Những khuẩn lạc E.coli khác có mầu đỏ, vì lên men đường sorbitol.

5.3. Bước 3: Kiểm tra tính chất sinh vật hóa học.

- Dùng que cấy nhọn đầu vô trùng lấy 1 khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch SMAC cấy vào ống thạch thường và ống thạch CLIG như sau:

+ ống thạch thường: cấy ria lên mặt thạch.

+ ống thạch CLIJ:

* Phần thạch nghiêng: cấy ria lên mặt thạch.

* Phần thạch đứng: cấy đâm sâu ở chính giữa.

- Ủ ấm 37⁰C/24 giờ. Sau ủ ấm đọc kết quả kiểm tra các tính chất sinh hóa trên ống thạch CLIG:

+ Phần thạch nghiêng: giữ nguyên mầu đỏ (cellobiose âm tính)

+ Phần thạch đứng: chuyển sang mầu vàng (lactose d­ương tính)

+ Ngay sau đó chiếu đèn UV có Bước sóng 365 nmi vào ống thạch CLIG, ống thạch CLIG không phát quang (- glucuronidase âm tính).

Thạch CLIG có pH trung tính nên có mầu đỏ của chỉ thị mầu đỏ phênol. Trong thạch có 2 loại đường: cellobiose (10g/1ít) và lactose (lg/1ít). E.coli O157 không lên men đường cellobiose, như­ng lên men đường lactose tạo xít không bên vững đối với oxy. Phần nghiêng của thạch vì tiếp xúc nhiều với oxy có trong không khí nên pH vẫn trung tính, nên thạch giữ nguyên mầu đỏ. Còn phần đứng của thạch vì ít tiếp xúc với không khí nên pH thạch trở thành axit, do đó thạch chuyển sang mầu vàng.

Lưu ý: Mỗi mẫu thử nên bắt 3 khuẩn lạc nghi ngờ để kiểm tra tính chất sinh hóa. Khuẩn lạc nghi ngờ E.coli O157, có tính chất sinh vật hóa học của E.coli O157: cellobiose (-), lactose (+),- glucuronidase (-), thì tiếp tục kiểm tra ngưng kết trên lam kính.

5.4. Bước 4: Kiểm tra ngưng kết trên lam kính

5.4.1. Kiểm tra hiện tượng tự ngưng kết

- Tiến hành: Lấy 1 lam kính trong, vô trùng, nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý 8,5⁰/₀₀ vào bên trái lam kính. Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn ở ống thạch thường hòa vào giọt nước muối. Nghiêng đi nghiêng lại nhẹ nhàng lam kính vài lần sao cho vi khuẩn hòa đều vào giọt nước muối sinh lý.

- Đọc kết quả: Dùng kính lúp để quan sát. Nếu giọt nước muối sinh lý đục đều (tức không xảy ra hiện tượng ngưng kết), thì tiếp tục kiểm tra ngưng kết đặc hiệu.

5.4.2. Kiểm tra ngưng kết đặc hiệu

- Tiến hành: tiếp tục nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh E.coli O157 lên lam kính.

Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn ở ống thạch thường hòa vào giọt kháng huyết thanh E.coli O157. Nghiêng đi nghiêng lại nhẹ nhàng lam kính vài lẩn sao cho vi khuẩn hòa đều vào giọt kháng huyết thanh E.coli O157.

Đọc kết quả: Dùng kính lúp để quan sát. Nếu giọt kháng huyết thanh E.coli O157 xuất hiện những hạt nhỏ (tức đã xảy ra hiện tượng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể). Có thể đối chiếu sự khác biệt với giọt nước muối ở bên cạnh.

Lưu ý:

- Chỉ được đọc kết quả ngưng kết trong vòng từ 30 giây đến 2 phút.

- Nếu xảy ra hiện tượng ngưng kết với nước muối sinh lý, thì không cần tiếp tục kiểm tra ngưng kết đặc hiệu (vì có thể nước muối sinh lý đã hỏng hoặc vi khuẩn phân lập không chính xác).

Tiêu chuẩn xác định là E. coli O157:

- Khuẩn lạc tròn đều, mặt nhẵn, không mầu, sáng đục.

- Không lên men đường cellobiose.

- Lên men đường lactose.

- Không có men -glucuronidase.

- Ngưng kết với kháng huyết thanh E.coli O157.

PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

1. Canh thang m-EC (hãng Merek - cođe l.14582)

Peptone                       20g

Lactose                        5g

Bile salts          1,12g

K₂ HPO₄         4g

KH₂ PO₄          l,5g

NaCL              5g

Novobiocin     0,02g

pH = 6,9  0,2

Pha chế: Cân chính xác 36,7g bột m-EC, rồi pha trong 1000 ml nước cất. Đun nóng, khuấy đều cho tan bột. Rót vào bình nón có dung tíeh 500 ml, mỗi bình 225 ml canh thang. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở 121⁰C/15 phút, rồi bảo quản trong tủ lạnh không quá 7 ngày.

2. Thạch SMAC (Merck - code l.09207)

Bile salts                      lg

Peptone                                    19g

D-sorbitol                    l0g

Nacl                             5g

Crystal violet                0,001g

Netral red                     0,03g

Thạch                           15g

pH = 7  0,2

Pha chế: Cân chỉnh xác 25g thạch SMAC, rồi pha trong 500 ml nước cất. Đun nóng, khuấy đều cho tan thạch. Rót vào bình cầu dung tích 250 ml, mỗi bình 150 ml thạch. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở 121⁰C/15 phút. Thạch để nguội đến 45⁰C, rồi rót vào các hộp lồng vô trùng, mỗi hộp 15 – 18 ml thạch. Để đĩa thạch đông tự nhiên, bảo quản trong tủ lạnh không quá 15 ngày.

3. Thạch CLIG (kyokuto - Nhật Bản - Lot BL.2231)

Casein peptone                        7,5g

Meat peptone              2,5g

Lactose                        lg

Cellobiose                    10g

Tryptophan                  0,lg

MUG                0,02g

NaCL                          5g

Phenol red                   0,02g

Thạch                          15g

ph = 7  0,2

Pha chế: Cân chính xác 4, lg thạch CLIG , rồi phá trong 100 ml nước cất. Đun nóng, khuấy đều cho tan thạch. Rót vào ống nghiệm  = 12mm, mỗi ống 3 ml thạch. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ l10⁰C/80 phút, đợi thạch nguội, rồi để ống thạch nằm nghiêng (sao cho mặt nghiêng dài khọảng 2 cm) cho đến khi thạch đông, rồi bảo quản trong tủ lạnh không quá 15 ngày.

 4. Thạch thường

Cao thịt                       1g

Peptone                       2g

NaCL              1g

Thạch              3,6g

Nước cất         200ml

Pha chế: Cân chính xác cácthành phần môi trường. Đun nhỏ lửa khuấy đều đến khi sôi để hòa tan các chất. Điều chỉnh pH = 7,4 - 7,6. Rót vào ống nghiệm = 16 mm, mỗi ống 5 ml thạch. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở l10⁰C /30phút, đợi thạch nguội rồi để ống thạch nằm nghiêng cho đến khi thạch đông, rồi bảo quản trong tủ lạnh không quá 30 ngày./.