Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-30:2015 Bệnh động vật-Quy trình chẩn đoán-Phần 30: Bệnh Marek ở gà

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-30:2015

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 30: BỆNH MAREK Ở GÀ

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 30: Mareks disease

Lời nói đầu

TCVN 8400-30:2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần:

- TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

- TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6: 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7: 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela;

- TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

- TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22 : 2014 phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27: 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28: 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus.

 

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 30: BỆNH MAREK Ở GÀ

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 30: Marek’s disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh Marek do virus thuộc nhóm Herpesvirus gây ra ở gà.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1. Bệnh Marek (Marek’s disease)

Bệnh do virus thuộc nhóm Herpesvirus, họ Herpesviridae, là virus hướng tế bào lympho, gây suy giảm hệ thống miễn dịch của gà.

CHÚ THÍCH: Virus này gồm 3 kiểu huyết thanh (serotype), trong đó serotype 1 gồm những dòng virus có độc lực cao và những dòng có độc lực thấp; serotype 2 không có độc lực; serotype 3 liên quan đến gà tây.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp parafin

3.1.1. Formalin, dung dịch 10 % (thể tích)

Chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (xem Phụ lục A) với tỷ lệ 1 : 9 (thể tích).

3.1.2. Etanol 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

3.1.3. Xylen.

3.1.4. Haematoxylin.

3.1.5. Eosin.

3.1.6. Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

3.1.7. Keo dán lamen.

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime PCR

3.2.1. Dung dịch PBS, pH 7,0 (xem Phụ lục A)

3.2.2. Etanol tuyệt đối, dùng cho tách chiết mẫu ADN (axit deoxyribonucleic).

3.2.3. Mẫu ADN kiểm chứng dương, tách chiết từ virus gây bệnh Marek, có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) đã biết trước.

3.2.4. Kít tách chiết ADN.

3.2.5. Kít nhân gen.

3.2.6. Bộ mồi và mẫu dò (primers và probe).

3.2.7. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.8. Nước, tinh khiết không có nuclease.

4. Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phương pháp parafin

4.1.1. Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.1.2. Máy xử lý mẫu mô tự động.

4.1.3. Nồi đun parafin, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.

4.1.4. Khay sắt, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.1.5. Máy làm lạnh, có thể duy trì ở nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.

4.1.6. Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ mỏng từ 3 mm đến 5 mm.

4.1.7. Nồi dãn tiêu bản, có thể làm nóng nước ở nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.

4.1.8. Phiến kính, vô trùng.

4.1.9. Lamen, vô trùng.

4.1.10. Bộ cốc nhuộm tiêu bản.

4.1.11. Kính hiển vi quang học, vật kính 4 X, 10 X, 20 X, 40 X, 60 X.

4.2. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR

4.2.1. Máy nhân gen, (realtime PCR).

4.2.2. Máy spindown.

4.2.3. Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

4.2.4. Máy ly tâm, có thể tạo gia tốc ly tâm 3 000 g, 6000 g và 20 000 g.

4.2.5. Máy lắc, có thể hoạt động với tốc độ 200 r/min đến 2 500 r/min.

4.2.6. Cối chày sứ, vô trùng.

5. Chẩn đoán lâm sàng

5.1. Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh thường xảy ra ở gà từ 3 tuần tuổi đến 4 tuần tuổi trở lên, phổ biến nhất ở giữa 12 tuần tuổi và 30 tuần tuổi;

- Giai đoạn ủ bệnh biến đổi từ 1 vài tuần đến lâu hơn;

- Đối với thể cấp tính tỷ lệ mắc bệnh từ 10 % đến 30 %, trong các ổ dịch có thể lên tới 70 %, tỷ lệ chết tăng nhanh trong vài tuần, sau đó có thể giữ nguyên hoặc giảm trong vài tháng; đối với thể cổ điển (thể mãn tính) tỷ lệ chết không vượt quá 10 % đến 15 %;

- Virus Marek gây bệnh chủ yếu ở gà, đôi khi gà tây và chim cút cũng bị nhiễm bệnh, các loài gia cầm, thủy cầm khác hiếm gặp;

- Virus lây lan trực tiếp qua tiếp xúc giữa con bệnh và con khỏe trong đàn hoặc gián tiếp qua không khí.

5.2. Triệu chứng lâm sàng

5.2.1. Thể cấp tính

- Đặc điểm của thể này là có các u lympho ở các cơ quan nội tạng nên ít có triệu chứng điển hình ngoài hiện tượng chết đột ngột;

- Gà có triệu chứng bỏ ăn, phân loãng;

- Đi lại khó khăn, bại liệt, sã một bên cánh.

5.2.2. Thể mạn tính

Thể mạn tính thường diễn ra ở hai loại là thể thần kinh và thể mắt.

a) Thể thần kinh

- Gà thường có triệu chứng liệt một bên hoặc cả hai bên chân và cánh;

- Gà bị ngoẹo cổ sang một bên do thần kinh điều khiển cơ cổ bị ảnh hưởng;

- Gà có thể có triệu chứng thở gấp.

b) Thể mắt

- Giai đoạn đầu có hiện tượng viêm mắt nhẹ, con vật rất mẫn cảm với ánh sáng, chảy nước mắt trong;

- Giai đoạn sau viêm mống mắt thể mi gây hiện tượng “mắt nâu”: viêm màng tiếp hợp rồi viêm mống mắt. Mủ trắng đóng đầy khóe mắt, con vật nhìn kém, không mổ trúng thức ăn, cuối cùng con vật có thể bị mù.

5.3. Bệnh tích đại thể

5.3.1. Thể cấp tính

- Các cơ quan nội tạng như gan, lách, buồng trứng, thận, tim và dạ dày tuyến: có các u lympho tràn lan;

- Ở gà con: gan sưng ở mức độ trung bình; ở gà trưởng thành: gan sưng to;

- Các u lympho có thể thấy trên da xung quanh các nang lông và ở trong cơ lườn;

- Dây thần kinh vùng đùi, cánh sưng to.

5.3.2. Thể mạn tính

- Một hoặc nhiều dây thần kinh ngoại biên như dây thần kinh và đám rối thần kinh hông, cánh, đám rối thần kinh bụng; thần kinh gian sườn sưng to gấp 2 đến 3 lần bình thường, phù và có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt, mất các vạch sáng, sợi ngang và dọc;

- Đôi khi có các u lympho ở buồng trứng, thận, tim, gan và các mô khác. Các u thường nhỏ, mềm, màu nâu;

- Viêm mống mắt thể mi gây hiện tượng “mắt nâu”: đồng tử bị biến dạng, hiện tượng này phổ biến ở gà lứa tuổi từ 16 tuần tuổi đến 18 tuần tuổi.

5.4. Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng

Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko theo Bảng 1.

Bảng 1 - So sánh triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể trên gà nhiễm bệnh

Đặc điểm		Bệnh Marek	Bệnh Lympho leuko
Lứa tuổi mắc bệnh		Từ vài ngày tuổi trở lên	Từ 16 tuần tuổi trở lên
Triệu chứng		Gà thường bị liệt chân, sã cánh	Thường không đặc trưng
Bệnh tích đại thể	Dây thần kinh ngoại vi sưng to	Thường xuyên	Không có
	Túi Fabricius	Teo nhỏ hoặc sưng to	Có các u cục
	U ở dạ dày tuyến, da, cơ	Có thể có	Không có

6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh Marek

6.1.1. Lấy mẫu

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình mổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau:

- Dây thần kinh: lấy hai dây thần kinh đùi và hai dây thần kinh cánh, độ dài khoảng 2 cm;

- Gan: lấy phần gan nghi có bệnh tích với độ dày khoảng 0,5 cm;

- Lách: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm;

- Túi Fabricius: cắt ngang túi Fabricius;

- Tuyến ức: lấy toàn bộ tuyến;

- Não: mở hộp sọ, lấy phần đại não và tiểu não;

- Mắt: cắt đứt phần da xung quanh hố mắt và các dây thần kinh;

- Bệnh phẩm da: lấy phần da có các nang lông sưng to.

Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa formalin (3.1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin có tỷ lệ khoảng 1 : 10, ghi ký hiệu mẫu trên lọ.

6.1.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.1.1) được đảm bảo ngập trong formalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi formalin ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới formalin, đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10.

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

- Mẫu bệnh phẩm (6.1.1) được cố định trong dung dịch formalin (3.1.1) trong 24 h;

- Cắt các bệnh phẩm đã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.1.1).

6.1.4. Cách tiến hành

6.1.4.1. Đúc khuôn

- Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) thời gian từ 2 đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mô tự động (4.1.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

- Đúc khuôn: rót parafin (3.1.6) được nóng chảy từ nồi đun parafin (4.1.3) vào khay sắt (4.1.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.1.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.1.4.2. Cắt tiêu bản

- Cắt gọt khối parafin (6.1.4.2) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.1.5);

- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.1.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 mm đến 5 mm, cắt một vài lát;

- Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.1.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C; dùng phiến kính (4.1.8) vớt lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.1.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;

- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.1.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.1.11).

6.1.5. Đọc kết quả^[1]

- Ở cả hai thể cấp tính và thể mạn tính, bệnh khởi đầu bằng việc tăng sinh các tế bào lympho đa hình thái. Đặc điểm tế bào ở u lympho trong bệnh Marek là các tế bào lympho không đồng nhất về kích thước và độ bắt màu. Các nguyên bào lympho, tế bào lympho to, nhỏ, trung bình và các đại thực bào xâm nhập, trong đó ưu thế là tế bào lympho nhỏ và vừa không đều nhau, nguyên sinh chất bắt màu hồng;

- Dây thần kinh ngoại biên có biểu hiện tăng sinh, viêm, hoặc có các biến đổi nhẹ. Cụ thể là sự tăng sinh của các nguyên bào lympho, các tế bào lympho to, nhỏ, đại thực bào và các tế bào plasma cùng với sự tăng sinh của các tế bào schwann tạo thành viêm;

- Tại gan phát hiện các đám tế bào lympho nằm ở ngoại vi mạch quản;

- Tại lách phát hiện các đám tế bào lympho phân bố tràn lan;

- Tại tuyến ức và túi Fabricius số lượng các tế bào lympho giảm;

- Mạch ở tiểu não, đại não và thùy mắt bị viêm, có các tế bào viêm xâm nhập, chủ yếu loại tế bào lympho.

6.1.6. Chẩn đoán phân biệt về bệnh tích vi thể giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko

Chẩn đoán phân biệt về bệnh tích vi thể giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko theo Bảng 2.

Bảng 2 - So sánh bệnh tích vi thể

Đặc điểm	Bệnh Marek	Bệnh Lymphp leuko
Bệnh tích ở dây thần kinh ngoại biên	Thường xuyên có tế bào viêm	Không có
U cục ở gan	Các đám tế bào tăng sinh thường ở ngoại vi mạch quản	Các đám tế bào tăng sinh thường dạng điểm hoặc tràn lan
U cục ở lách	Các đám tế bào tăng sinh trong khối u thường tràn lan	Các đám tế bào tăng sinh trong khối u thường dạng điểm
Túi Fabricius	Các đám tế bào tăng sinh trong các u nằm ở giữa các nang và/hoặc nang bị teo giảm	Các đám tế bào tăng sinh trong các u cục nằm rải rác trong các nang
Tế bào lympho tăng sinh ở da, nang lông	Thường xuyên	Không có
Bệnh tích ở hệ thần kinh trung ương	Có thể có	Không có
Tế bào ở các u cục	Các tế bào lympho không đồng nhất gồm: các nguyên bào lympho, tế bào lympho lớn, trung bình, nhỏ và tế bào plasma.	Các nguyên bào lympho đồng đều về kích thước, màu sắc

6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek

6.2.1. Lấy mẫu

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình mổ lấy dây thần kinh, gan, lách, nang lông (khối lượng tổng các loại từ 3 g đến 5 g) cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.2.1) đựng trong túi kín và được bảo quản trong thùng lạnh (có nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh âm 20 °C (4.2.3).

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lấy 1 g mẫu bệnh phẩm (6.2.1) gồm dây thần kinh, gan, lách, nang lông cắt nhỏ, rồi nghiền với dung dịch PBS (3.2.1) theo tỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ (4.2.6). Ly tâm (4.2.4) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ADN cho phản ứng realtime PCR.

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.4) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy Blood tissue (Cat. No. 69506)1) (xem Phụ lục B).

6.2.4.2. Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của virus gây bệnh Marek sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.6) được nêu trong Bảng 3.

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.2) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 ml mồi gốc và 80 ml nước (3.2.8)).

- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 mM: pha loãng mẫu dò gốc bằng nước (3.2.8) (6 ml mồi gốc và 94 ml nước (3.2.8)).

Bảng 3 - Trình tự cặp mồi và mẫu dò^[2]

Mẫu dò, mồi	Trình tự từ 5’ đến 3’
Mẫu dò	FAM-AGACCCTGATGATCCGCATTGCGACT-TAMRA
Mồi xuôi	GGTCTGGTGGTTTCCAGGTGA
Mồi ngược	GCATAGACGATGTGCTGCTGA

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của hãng Invitrogen Platinum One - step qPCR SuperMix - UDG (Cat. No. 11730-017) 2), thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 4.

Bảng 4 - Thành phần phản ứng

Thành phần	Thể tích, ml
Dung dịch đệm 2 X (2 X Reaction buffer)	12,5
Mồi/ mẫu dò	1,5
Nước tinh khiết không có nuclease	6,0
Tổng thể tích	20,0

Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ADN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ADN (phụ lục B) vào ống phản ứng.

CHÚ Ý:

- Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương, mẫu kiểm chứng âm.

- Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (4.2.1) đã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong bảng 5.

Bảng 5 - Chu trình nhiệt phản ứng

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
95 °C	2 min	1
95 °C	10 s	40
60 °C	30 s	40

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.2.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền)

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < ct="">≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

7. Kết luận

Gà được xác định mắc bệnh Marek khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể đặc trưng của bệnh và dương tính với một trong hai phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.1. Thành phần

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄) 9,47 gm

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄) 9,08 gm

Nước cất 900 ml

A.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Qui trình tách chiết ADN sử dụng kít QIAGEN RNeasy Blood & Tissue kit (Cat. No. 69506) như sau:

B.1. Pha dung dịch

- Dung dịch AW1: thêm 125 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;

- Dung dịch AW2: thêm 160 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc.

B.2. Cách tiến hành

- Cho 20 ml protease vào ống 1,5 ml;

- Chuyển 200 ml dịch mẫu (dịch nổi xử lý ở 6.2.3) vào ống 1,5 ml;

- Thêm 200 ml dung dịch AL (lysis buffer) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s, sau đó ly tâm (4.2.4) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Ủ ở nhiệt độ 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm (4.2.4) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Cho 200 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s, sau đó ly tâm với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Chuyển 620 ml dung dịch mẫu đã tách chiết vào cốc lọc (spin column) với ống thu (collection tube);

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 ml dung dịch AW1 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Cho cột lọc vào ống thu mới;

- Thêm 500 ml dung dịch AW2 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 ml;

- Nhỏ 200 ml dung dịch AE vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu sang ống 1,5 ml mới;

- Bảo quản mẫu ADN ở 4 °C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime PCR ngay và giữ ở âm 20 °C để lưu mẫu trong thời gian dài.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Aly M.Fadly, 2008, Disease of poultry, 12th, Blackwell Publishing, p.449 - p.616.

[2] Butter C., Staines K., Baaten B., Smith L., Davison F. T. (2007) Route of challenge is critical in determining the clinical outcome of infection with a very virulent oncogenic herpesvirus, Marek’s disease virus, Avian Pathology (April 2007) 36(2), 9399.

[3] Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, 2010, OIE, Chapter 2.3.13. Marek’s disease.

[4] Venugopal Nair, Richard C. Jones, R.E. Gough, 2008, Poultry disease, 6^th Edition, Saunders Elserier, p.258 - p.267.

[5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Đại học Nông nghiệp.

[6] L.N. Payne & K. Venugopal, “Neoplastic diseases: Marek’s disease, avian leukosis and reticuloendotheliosis”, Rev. sci. tech. Off. int. cpiz., 2000,19 (2), 544-564. Available at: http://www.oie.int/doc/ged/D9316.PDF

[7] Marek’s Disease in Poultry. Available at: http://www.merckmanuals.com/vet/pourtry/neoplasms/mareks_disease_in_poultry.html

[8] Marek’s disease. Available at: http://www.thepoultrysite.com/diseaseinfo/90/mareks-disease