Tiêu chuẩn TCVN 14389:2025 Phân bón - Định lượng Bacillus laterosporus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và PCR

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14389:2025

PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS LATEROSPORUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)

Fertilizers - Enumeration of Bacillus laterosporus by colony count technique and confirmation by polymerase chain reaction (PCR)

Lời nói đầu

TCVN 14389:2025 do Học viện Nông nghiệp Việt Nam biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS LATEROSPORUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)

Fertilizers - Enumeration of Bacillus laterosporus by colony count technique and confirmation by polymerase chain reaction (PCR)

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Bacillus laterosporus (Brevibacillus laterosporus) trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thông qua sự có mặt của gen đặc hiệu cpbA.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm.

TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

3 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau đây:

3.1

Bacillus laterosporus (Bacillus laterosporus)

Brevibacillus laterosporus (Brevibacillus laterosporus)

Vi khuẩn thuộc chi Brevibacillus, có tế bào hình que, di động, đặc trưng bởi việc sản xuất bào tử hình oval hoặc bầu dục dạng “thể ký sinh hình xuồng” độc đáo gắn vào một bên của bào tử.

Vi khuẩn này có khả năng đối kháng với nhiều loại vi khuẩn/nấm gây bệnh cây trồng, có khả năng phân hủy các chất thải hữu cơ cải tạo đất và/hoặc sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật.

3.2

Thể ký sinh hình xuồng (Canoe-Shaped Parasporal Body - CSPB)

Thể ký sinh còn được biết đến với hình chữ C (C-shape) đính ở một phía cạnh bào tử; được hình thành và tồn tại cùng bào tử.

3.3

Gen đặc hiệu cpbA (spore coat-canoe shaped parasporal complex protein A)

Gen mã hóa cho protein cpbA 28 kDa liên quan đến phức hợp spore coat - CSPB (SC-CSPB), gen mã hoá cho protein này là duy nhất và bảo tồn cao ở các chủng Bacillus laterosporus. Cặp mồi phát hiện gen cpbA (có kích thước 709 bp) được chứng minh không nhân bản vùng ADN ở các loài Brevibacillus hay Bacillus khác.

3.4

Định lượng Bacillus laterosporus (Bacillus laterosporus enumeration)

Việc xác định số lượng tế bào vi khuẩn Bacillus laterosporus (3.1) (CFU/g hoặc CFU/mL) trong một khối lượng hoặc thể tích cụ thể của phân bón vi sinh vật khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

4 Nguyên tắc

Định lượng Bacillus laterosporus trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm số lượng đơn vị khuẩn lạc đặc trưng phát triển trên môi trường thạch MYP và được khẳng định thông qua đặc điểm hình thái tế bào, bào tử và sự có mặt của gen đặc hiệu cpbA (kích thước 709 bp).

5 Môi trường, hóa chất

5.1 Yêu cầu chung

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết chuyên dùng cho phân tích vi sinh vật và theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy theo TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014).

5.2 Nước, nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương để pha chế hoá chất, môi trường nuôi cấy vi sinh vật [xem TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987)].

5.3 Môi trường thạch mannitol lòng đỏ trứng Polymyxin (thạch MYP)

5.3.1 Môi trường thạch MYP cơ bản

5.3.1.1 Thành phần

5.3.1.2 Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong 1 000 mL nước. Phân phối môi trường với lượng phù hợp vào các bình thủy tinh (6.2.2). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng ở 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, dùng máy đo pH (6.1.7).

5.3.2 Dung dịch polymyxin B

5.3.2.1 Thành phần

5.3.2.2 Chuẩn bị:

Hòa tan Polymyxin B sulfate trong 100 mL nước và lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 μm (6.2.5) để khử trùng.

5.3.3 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng

Chọn các quả trứng gà còn nguyên vẹn và rửa sạch vỏ bằng xà phòng. Tráng sạch dưới vòi nước chảy. Trong tủ cấy vi sinh vật (6.1.2), ngâm ngập trứng trong Etanol 95 % trong 30 s và để khô. Đập vỡ quả trứng và tách riêng lòng đỏ trứng gà bằng cách chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ này sang nửa vỏ còn lại. Cho lòng đỏ vào ống ly tâm 50 mL (6.2.8), bổ sung nước (5.2) đã hấp khử trùng theo thể tích với tỷ lệ 1:4 và khuấy bằng cách lắc đều theo một chiều, ủ hỗn hợp trong bể ổn nhiệt (6.1.10) ở nhiệt độ 44 °C đến 47 °C trong 2 h, sau đó để hỗn hợp trong ngăn mát tủ lạnh (6.1.5) ở (4 ± 1) °C trong 18 h đến 24 h để tạo kết tủa. Kết thúc thời gian ủ, thu dung dịch nhũ tương ở phía trên, bảo quản dung dịch nhũ tương ở nhiệt độ ở (4 ± 1)°C và sử dụng trong vòng 72 h.

5.3.4 Môi trường thạch MYP hoàn chỉnh

5.3.4.1 Thành phần

5.3.4.2 Chuẩn bị

Môi trường thạch MYP cơ bản sau khi hấp tiệt trùng (5.3.1) được làm nguội ở nhiệt độ phòng về nhiệt độ khoảng 44 °C đến 47 °C. Trong thời gian làm nguội môi trường, ủ dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (5.3.3) trong bể ổn nhiệt (6.1.10) ở nhiệt độ 44 °C đến 47 °C. Sau đó, cho lần lượt các dung dịch polymyxin B (5.3.2) và dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (5.3.3) vào môi trường thạch MYP cơ bản (5.3.1), trộn đều hỗn hợp. Phân phối lượng khoảng 18 mL đến 20 mL môi trường vào các dĩa Petri (6.2.3). Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng bằng cách lật úp các đĩa thạch và ủ trong tủ ấm (6.1.3) ở nhiệt độ 25 °C đến 37 °C trong 20 min đến 25 min. Nếu chưa dùng ngay, bảo quản các đĩa thạch ở (4 ± 1) °C trong ngăn mát tủ lạnh (6.1.5), sử dụng trong vòng một tuần. Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy vi sinh vật (6.1.2).

CHÚ THÍCH: Ưu tiên sử dụng các sản phẩm thương mại trong thành phần có sẵn Polymyxin (5.3.2) và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.4 Môi trường Luria-Bertani (LB)

5.4.1 Thành phần

CHÚ THÍCH: Không bổ sung thạch khi chuẩn bị môi trường LB lỏng, ưu tiên sử dụng các môi trường thương mại (nếu có).

5.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong 1 000 mL nước. Phân phối môi trường với lượng phù hợp vào các bình thủy tinh (6.2.2). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, dùng máy đo pH (6.1.7). Phân phối lượng khoảng 18 mL đến 20 mL môi trường vào các đĩa Petri (6.2.3) đã được chuẩn bị. Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng bằng cách lật úp các đĩa thạch và ủ trong tủ ám (6.1.3) ở nhiệt độ 25 °C đến 37 °C trong 20 min đến 25 min. Nếu chưa dùng ngay, bảo quản các đĩa thạch ở (4 ± 1) °C trong ngăn mát tủ lạnh (6.1.5), sử dụng trong vòng một tuần. Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy vi sinh vật (6.1.2).

5.5 Dung dịch pha loãng

5.5.1 Thành phần

Sodium chloride (NaCl) 8,5 g

Nước 1 000 mL

5.5.2 Chuẩn bị

Hòa tan sodium chloride trong 1 000 mL nước đựng trong bình thủy, tinh (6.2.2). Phân phối dung dịch pha loãng, với lượng 90,0 mL vào mỗi bình thủy tinh (6.2.2) và 9,0 mL vào mỗi ống nghiệm (6.2.12). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng ở 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1). Sai số cho phép đo của thể tích cuối cùng sau khi khử trùng không được vượt quá ± 0,2 %.

5.6 Hoá chất tách chiết ADN và PCR

Ưu tiên sử dụng các bộ kít thương mại (nếu có) hoặc các quy trình tách chiết ADN hoặc PCR phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thử nghiệm và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.7 Cặp mồi oligonucleotit

Thông tin về trình tự oligonucleotit phát hiện vi khuẩn Bacillus laterosporus được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 -Trình tự oligonucleotit phát hiện vi khuẩn Bacillus laterosporus ^[5]

6 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007)] và cụ thể như sau:

6.1 Thiết bị

6.1.1 Nồi hấp áp lực, có khả năng duy trì nhiệt độ (121 ± 3) °C, tương đương áp suất tối thiểu 101,3 kPa.

6.1.2 Tủ cấy vi sinh vật, đảm bảo độ vô trùng.

6.1.3 Tủ ấm, thông gió đối lưu, có khả năng duy trì nhiệt độ từ (25 đến 37) °C ± 1 °C.

6.1.4 Tủ sấy, thông gió đối lưu, có khả năng sấy ở nhiệt độ lên tới 70 °C ± 1 °C.

6.1.5 Tủ lạnh, ngăn đông có thể duy trì nhiệt độ ổn định ở (- 20 ± 1) °C và ngăn lạnh duy trì nhiệt độ ổn định ở (4 ± 1) °C

6.1.6 Máy trộn vortex, có khả năng khuấy trộn mẫu đồng đều.

6.1.7 Máy do pH, có bù nhiệt, chính xác đến ± 0,1 đơn vị ở 25 °C.

6.1.8 Cân kỹ thuật, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

6.1.9 Kính hiển vi quang học, vật kính có độ phóng đại 4 X, 10 X, 40 X và vật kính dầu 100 X.

6.1.10 Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ lên đến (99 ± 1) °C.

6.1.11 Máy ly tâm, có thể vận hành ở gia tốc 13 000 g và điều chỉnh nhiệt độ đến (4 ± 1) °C.

6.1.12 Máy PCR, có khả năng khuếch đại được ADN của mẫu.

6.1.13 Máy quang phổ đo nồng độ ADN, có khả năng đo mẫu vi thể tích (1 μL), bước sóng bao phủ được 260 nm và 280 nm.

6.1.14 Hệ thống điện di ngang, điện di axit nucleic, có thể điều chỉnh hiệu điện thế, cường độ dòng điện và thời gian.

6.1.15 Máy chụp ảnh gei điện di, có nguồn sáng tia tử ngoại (UV-light base).

6.1.16 Máy lắc, có thể vận hành liên tục, tốc độ tối đa đạt 300 r/min.

6.2 Dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được tiệt trùng ở điều kiện 121 °C, 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.1) và sấy khô bằng tủ sấy (6.1.4), nếu cần, trước khi tiến hành thử nghiệm.

6.2.1 Micropipet, có thể phân phối 0,05 mL ± 0,002 mL, 0,1 mL ± 0,02 mL, 1,0 mL ± 0,02 mL và 10 mL ± 0,2 mL.

6.2.2 Bình cấy hoặc bình thủy tinh, có dung tích thích hợp, có nút đậy kín hoặc nắp vặn thích hợp.

6.2.3 Đĩa Petri, bằng chất dẻo hoặc thủy tinh không màu, trong suốt, đường kính 90 mm, sâu tối thiểu là 10 mm.

6.2.4 Đầu hút vô trùng các loại, có khả năng chịu nhiệt.

6.2.5 Màng lọc, bằng xenluloza axetat, cỡ lỗ 0,22 μm.

6.2.6 Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc kim loại có thể tiệt trùng.

6.2.7 Que cấy, đầu tròn bằng nhựa hoặc kim loại.

6.2.8 Ống ly tâm, 15 mL và 50 mL, bằng nhựa chịu nhiệt, có vạch chia đến 5 mL.

6.2.9 Lam kính, bằng thủy tinh chịu nhiệt, trong suốt, kích thước 25 × 75 mm, dày 1 mm đến 1,2 mm.

6.2.10 Lamen kính, bằng thủy tinh, trong suốt, kích thước 22 × 22 mm, dày 0,13 mm đến 0,16 mm.

6.2.11 Đèn cồn, bằng inox hoặc thủy tinh chịu nhiệt.

6.2.12 Ống nghiệm, bằng thủy tinh hoặc nhựa chịu nhiệt, có nắp đậy.

6.2.13 Ống ly tâm, bằng nhựa chịu nhiệt, dung tích 1,5 mL và 2,0 mL, có vạch chia đến 0,5; 1 ; 1,5 và 2,0 mL.

6.2.14 Ống PCR, bằng nhựa chịu nhiệt, thành mỏng, dung tích 0,2 mL.

7 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 12105:2018.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

8 Cách tiến hành

8.1 Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng mẫu

Dùng cân kỹ thuật (6.1.8) cân 10 g mẫu hoặc dùng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút 10 mL mẫu cho vào bình thủy tinh (6.2.2) chứa 90 mL dung dịch pha loãng (5.5). Trộn đều mẫu trên máy lắc (6.1.16) cho đến khi đồng nhất, ủ mẫu trong bể ổn nhiệt (6.1.10) ở 80 °C trong 10 min để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh bào tử. Dung dịch phía trên sau khi phần tử nặng lắng xuống được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu có độ pha loãng 10 ^-1 .

Dùng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút 1 mL dịch huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm (6.2.12) chứa 9 mL dung dịch pha loãng (5.5). Tránh đầu hút chạm vào dung dịch pha loãng. Trộn kỹ trên máy trộn vortex (6.1.6) khoảng 10 s, dung dịch thu được có nồng độ 10 ^{- 2} . Lặp lại quy trình để thu được dung dịch có các nồng độ pha loãng thập phân tiếp theo.

CHÚ THÍCH: Hoạt hóa mẫu (nếu có) theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo kết quả chính xác.

8.2 Cấy và ủ mẫu

Sử dụng micropipet (6.2.1) với đầu hút vô trùng (6.2.4) hút 0,1 mL dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào mỗi đĩa Petri (6.2.3) chứa môi trường thạch MYP (5.3). Mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa.

Dùng que dàn mẫu (6.2.6) dàn đều dịch cấy trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt, sử dụng một que dàn mẫu vô trùng cho mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa và để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 min để dịch cấy hấp thụ vào bề mặt thạch.

Lập úp các đĩa đã chuẩn bị và nuôi trong tủ ấm (6.1.3) ở 30 °C trong 24 h đến 48 h. Nếu sau thời gian trên, các khuẩn lạc chưa hình thành hoặc hình thành nhưng không thể hiện đặc trưng nhận dạng, ủ đĩa thêm 24 h đến 48 h.

8.3 Đếm và nhận diện khuẩn lạc

Trên môi trường thạch MYP, khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định là các khuẩn lạc có màu hồng nhạt (không lên men hoặc lên men mannitol yếu) và được bao quanh bởi một vùng kết tủa (cho thấy hình thành lecithinase); khuẩn lạc kích thước khoảng 2 đến 4 mm, dạng tròn, bờ không đều, mép rìa hơi lượn sóng, bề mặt hơi lồi ở giữa; vùng kết tủa thường không lan rộng và chỉ bao quanh khuẩn lạc (xem Hình 1).

CHÚ THÍCH: Trên môi trường thạch MYP, khuẩn lạc của một số vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn Bacillus cereus (ví dụ Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis) xuất hiện màu sắc, hình dạng tương tự như Bacillus laterosporus giả định. Các khuẩn lạc này có thể được nhận diện và loại trừ bằng phép thử khẳng định.

Đếm các khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định ở hai độ pha loãng liên tiếp, trên các đĩa Petri có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc.

Khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định được khẳng định thông qua phép thử khẳng định.

Hình 1 - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử của vi khuẩn Bacillus laterosporus

(A, B) Khuẩn lạc và vòng kết tủa bao quanh khuẩn lạc sau 48 h nuôi cấy trên môi trường thạch MYP (C) Bào tử sau 96 h; (a) Bào tử sinh dưỡng; (b) Bào tử có gắn thể kí sinh hình xuồng dạng chữ C.

8.4 Phép thử khẳng định

Từ mỗi đĩa Petri đã chọn (8.3), lấy ít nhất năm khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định để thực hiện phép thử khẳng định.

Dùng que cấy đầu tròn (6.2.7) lấy sinh khối các khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định cấy trên đĩa Petri chứa môi trường LB (5.4), ủ đĩa ở 30 °C trong thời gian nhất định được nêu rõ khi thực hiện các thử nghiệm trong phép thử khẳng định (xem phụ lục A).

Các kết quả của phép thử khẳng định được nêu trong Bảng 2. Các khuẩn lạc giả định như sau được xác định là Bacillus laterosporus.

Bảng 2 - Các kết quả của phép thử khẳng định

CHÚ THÍCH 1: Bacillus laterosporus có đặc điểm hình thái bào tử rõ rệt, đặc trưng bởi thể ký sinh hình xuồng (dạng chữ C) bao quanh vỏ bào tử. Do vậy, hoàn toàn có thể sử dụng đặc điểm hình thái bào tử để xác định loài Bacillus laterosporus. Trường hợp cần phát hiện nhanh vi khuẩn Bacillus laterosporus, ưu tiên sử dụng PCR với cặp mồi nhân gen cpbA đặc hiệu cho loài vi khuẩn Bacillus laterosporus.

CHÚ THÍCH 2: Một số chủng Bacillus laterosporus chỉ sinh ít hoặc không sinh lecithinase, các khuẩn lạc thuộc các chủng này sẽ không có vùng kết tủa bao quanh.

9 Tính và biểu thị kết quả

9.1 Tính số lượng Bacillus laterosporus trong mẫu thử

- Số lượng khuẩn lạc Bacillus laterosporus, a, trên mỗi đĩa Petri được tính theo Công thức (1)

Trong đó:

b là số lượng khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định cho thấy có đặc điểm như phép thử khẳng định;

A là số lượng khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định được lấy để thực hiện phép thử khẳng định;

C là tổng số khuẩn lạc Bacillus laterosporus giả định đếm được trên đĩa Petri.

Kết quả được làm tròn đến số nguyên gần nhất.

- Số lượng vi khuẩn Bacillus laterosporus, N, trong một đơn vị kiểm tra, được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gam (CFU/g) hoặc trên mililit (CFU/mL), đã được nhận dạng hoặc khẳng định có trong mẫu thử được tính theo Công thức (2):

Trong đó:

Kết quả được làm tròn đến một chữ số sau dấu phẩy. Biểu thị kết quả bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10 ^x , trong đó × là số mũ của 10.

9.2 Báo cáo kết quả trong trường hợp đặc biệt

Biểu thị kết quả trong trường hợp số đếm thấp hoặc trường hợp đặc biệt theo quy định trong TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007).

10 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống, bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Phép thử khẳng định Bacillus laterosporus

A.1 Nhuộm Gram

A.1.1 Thuốc nhuộm

Ưu tiên sử dụng thuốc nhuộm thương mại có sẵn. Trong trường hợp này, phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.1.1.1 Dung dịch tím tinh thể

A.1.1.1.1 Thành phần

A.1.1.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan tím tinh thể trong Etanol 95 % thu được dung dịch (a). Hòa tan amoni oxalat trong nước cất thu được dung dịch (b);

Trộn dung dịch (a) và (b), thu được dung dịch tím tinh thể. Để yên hỗn hợp 24 h trước khi sử dụng.

A.1.1.2 Dung dịch iốt

A.1.1.2.1 Thành phần

A.1.1.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan kali iodua trong 10 mL nước, thêm 1,0 g lốt với các phần nhỏ, khuấy cho đến tan hoàn toàn, thêm nước đến 100 mL. Bảo quản dung dịch trong lọ sẫm màu, sử dụng trong vòng 1 tháng.

A.1.1.3 Dung dịch Safranin

A.1.1.3.1 Thành phần

A.1.1.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan Safranin trong dung dịch Etanol 95 %, sau đó bổ sung nước cất. Chuẩn bị dung dịch trước khi sử dụng.

A.1.2 Cách tiến hành

Nhỏ 1 giọt dung dịch pha loãng (5.5) lên lam kính (6.2.9). Dùng que cấy đầu tròn (6.2.7) lấy một phần sinh khối vi sinh vật từ các khuẩn lạc được lựa chọn (8.3) được nuôi cấy trên môi trường LB ở 30 °C trong 24 h và hòa vào giọt dịch pha loãng;

Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn (6.2.11);

CHÚ THÍCH: Kiểm tra độ nóng (nóng nhẹ vừa phải trên mu bàn tay) để mẫu khô vừa đủ, nếu nóng quá, hoặc hơ lâu, vi sinh vật sẽ biến dạng.

Phủ lên lam kính dung dịch tím tinh thể (A.1.1.1). Để cho phản ứng xảy ra trong 1 min. Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước, thấm khô;

Phủ lên lam kính dung dịch lốt (A.1.1.2), để phản ứng xảy ra trong 1 min. Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài giây;

Rót nhẹ nhàng và liên tục một lớp mỏng dung dịch Etanol 95 % lên lam kính, để nghiêng trong khoảng thời gian ít hơn 30 s cho đến khi không còn màu tím;

Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước để loại Etanol. Phủ lên lam kính bằng dung dịch safranin (A.1.1.3) trong 10 s. Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước. Làm khô lam kính. Đậy lamen kính (6.2.10) lên trên lam kính (6.2.9);

Quan sát hình dạng và màu sắc tế bào bằng kính hiển vi quang học (6.1.9).

A.1.3 Đọc kết quả

Gram dương (Gram +): các tế bào vi khuẩn có màu xanh tím hoặc tím.

Gram âm (Gram -): các tế bào vi khuẩn có màu từ hồng thẫm đến đỏ.

Hình A.1- (a) Gram dương; (b) Gram âm

A.2 Nhuộm bào tử

A.2.1 Dung dịch Coomassie blue

A.2.1.1 Thành phần

A.2.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước cất đựng trong bình thủy tinh (6.2.2). Thêm nước cất đến 100 mL và bảo quản lạnh ở (4 ± 1) °C trong lọ sẫm màu.

A.2.2 Cách tiến hành

Nhỏ 1 giọt dung dịch pha loãng (5.5) lên lam kính (6.2.9). Dùng que cấy đầu tròn (6.2.7) lấy một phần sinh khối vi khuẩn đã được cấy trên môi trường LB ở 30 °C trong ít nhất 96 h hòa vào giọt dung dịch pha loãng, cố định tiêu bản bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn (6.2.11). Phủ lên lam kính dung dịch Coomassie blue (A.2.1). Để cho phản ứng xảy ra trong 10 min. Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài giây. Để tiêu bản khô tự nhiên hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. Quan sát bào tử bằng kính hiển vi quang học (6.1.9) ở vật kính dầu 100 X.

A.2.3 Đọc kết quả

Bào tử có dạng oval, thể kí sinh hình xuồng dạng chữ c đính ở một phía của bào tử bắt màu xanh.

Hình A.2 - Bào tử vi khuẩn Bacillus laterosporus

(Mũi tên chỉ thể kí sinh hình xuồng dạng chữ C gắn ở một phía của bào tử)

A.3 Xác định Bacillus laterosporus bằng phương pháp PCR sử dụng gen đích đặc hiệu

A.3.1 Chuẩn bị ADN tổng số

ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp xử lý nhiệt như sau:

Lấy khuẩn lạc đơn của chủng vi sinh vật, nhúng vào 100 μL nước cất hai lần trong ống PCR (6.2.14) và làm nóng đến 95 °C trong 10 min trên máy PCR (6.1.12). Chuyển toàn bộ dịch được xử lý nhiệt vào ống ly tâm 1,5 mL (6.2.13), ly tâm 13 000 g ở 4 °C trong 5 min trong máy ly tâm (6.1.11). Hút 80 μL dịch phía trên sang ống ly tâm 1,5 mL (6.2.13) mới và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Bảo quản ở - 20 °C.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng trực tiếp khuẩn lạc để thực hiện PCR khuẩn lạc hoặc các phương pháp tách chiết ADN khác hoặc sử dụng kít tách chiết ADN có sẵn trên thị trường để thu được sản phẩm chứa ADN.

A.3.2 Trình tự oligonucleotit

Trình tự oligonucleotit của cặp mồi phát hiện vi khuẩn Bacillus laterosporus (xem bảng 1).

A.3.3 Thực hiện phản ứng PCR

A.3.3.1 Chuẩn bị phản ứng PCR

Bảng A.1- Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR

Trộn đều hỗn hợp phản ứng bằng micropipet (6.2.1), sau đó ly tâm nhanh trong vài giây. Chú ý: Quy trình luôn phải thực hiện song song mẫu thử nghiệm các mẫu sau đây:

+ Mẫu đối chứng trắng (ADN khuôn được thay bằng nước);

+ Mẫu đối chứng âm là mẫu ADN không phải của Bacillus laterosporus;

+ Mẫu đối chứng dương là ADN của chủng chuẩn Bacillus laterosporus.

A.3.3.2 Chu trình nhiệt PCR

Bảng A.2 - Chu trình nhiệt và thời gian cài đặt cho máy PCR

A.3.3.3 Điện di sản phẩm PCR

10 μL sản phẩm PCR bổ sung 2 μL loading dye 6x được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1 % trong đệm 1 × TAE, dòng điện có hiệu điện thế 80 V trong 45 min bằng hệ thống máy điện di ngang (6.1.14) và chụp ảnh bằng máy chụp ảnh gel điện di (6.1.15).

A.3.4 Đọc kết quả

Khẳng định vi khuẩn Bacillus laterosporus dựa trên kết quả điện di được công nhận như sau: khuẩn lạc giả định cho sản phẩm đặc hiệu đúng kích thước (709 bp).

Hình A.3 - Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen cpbA (~ 709 bp)

CHÚ THÍCH: L: thang chuẩn marker 1 Kb; (+) Đối chứng dương Bacillus laierosporus NBRC 156546; (1) Paenibacillus polymyxa (mẫu đã giải trình tự bộ genome); (2) Bacillus megaterium VACC607; (3) Bacillus thuringiensis NBRC 101235; (4) Bacillus licheniformis VTCC 10723; (5) Bacillus pumilus VTCC 10756; (6) Bacillus subtilis ATCC 6633; (7) Bacillus subtilis VTCC 11010; (8) Bacillus mycoides VNUA08 (mẫu đã giải trình tự); (9) Bacillus cereus ATCC 17778; (10) Bacillus amyloliquefaciens VTCC 11041; (11 -12) mẫu phân lập Bacillus laierosporus T2, T10; (13) Escherichia coli ATCC 35218; (-): Đối chứng trắng.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6507-1 (ISO 6687-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân

[2] TCVN 12105:2018, Phân bón vi sinh vật- Lấy mẫu

[3] Borris, R. (2020). Bacillus. In: Beneficial Microbes in Agro-Ecology, chapter 7, pages 107-132. Eds: N. Amaresan, M. Senthil Kumar, K. Annapurna, Krishna Kumar, A. Sankaranarayanan. Academic Press, ISBN: 9780128234143. doi: 10.1016/B978-0-12-823414-3.00007-1.

[4] Health Protection Agency (2004). Enumeration of Bacillus cereus and other Bacillus species. National standard Method F 15 Issuel.

[5] International Patent, Number WO 2016/135766 A1 (2016). Markers for the detection of Bacillus laterosporus and related methods and kits. -

[6] Logan, N.A., De Vos, P. (2015). Brevibacillus. In: Whitman, W.B., editor, Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. John Wiley & Sons, Inc., in association with Bergey's Manual Trust. DOI: 10.1002/9781118960608.gbm00550.

[7] Shida, O., Takagi, H., Kadowaki, K., and Komagata, K. (1996). Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 939-946.

[8] UK Standards for Microbiology Investigations (2018). Identification of Bacillus species. Issued by the Standards Unit, Microbiology Services, Public Health England. Bacteriology - Identification, ID 9, Issue no: 3.1, Issue date: 04.04.18, Page 1 -27.