Tiêu chuẩn TCVN 14390:2025 Phân bón - Định lượng Bacillus coagulans bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và khẳng định bằng PCR

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14390:2025

PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS COAGULANS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)

Fertilizers - Enumeration of Bacillus coagulans by the colony count technique and confirmation by polymerase chain reaction (PCR)

Lời nói đầu

TCVN 14390:2025 do Học viện Nông nghiệp Việt Nam biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS COAGULANS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)

Fertilizers - Enumeration of Bacillus coagulans by the colony count technique and confirmation by polymerase chain reaction (PCR)

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Bacillus coagulans (Lactobacillus sporogenes, Weizmannia coagulans, Heyndrickxia coagulans) trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) thông qua sự có mặt của gen đặc hiệu marC hoặc comK.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm

TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước. Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

3 Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau

3.1

Bacillus coagulans (Bacillus coagulans)

Lactobacillus sporogenes (Lactobacillus sporogenes)

Weizmannia coagulans (Weizmannia coagulans)

Heyndrickxia coagulans (Heyndrickxia coagulans)

Là trực khuẩn gram dương, loài mang đặc điểm hình thái và sinh hoá điển hình của cả hai chi Bacillus và Lactobacillus: sinh bào tử, có khả năng sinh tổng hợp axit lactic.

3.2

Gen đặc hiệu marC (marC specific gene)

Là gen mã cho protein marC, vùng gen này là duy nhất và bảo tồn cao ở loài Bacillus coagulans mà không hiện diện ở các loài Bacillus khác.

3.3

Gen đặc hiệu comK (comK specific gene)

Là gen mã cho protein comK, vùng gen này là duy nhất và bảo tồn cao ở loài Bacillus coagulans mà không hiện diện ở các loài Bacillus khác.

3.4

Định lượng Bacillus coagulans (Bacillus coagulans enumeration)

Xác định số lượng tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) Bacillus coagulans (3.1) trong một khối lượng hoặc thể tích cụ thể của mẫu phân bón chứa vi sinh vật được tính bằng đơn vị CFU/g hoặc CFU/mL khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

4 Nguyên tắc

Định lượng Bacillus coagualans trong phân bón vi sinh vật bằng kỹ thuật đếm số lượng đơn vị khuẩn lạc đặc trưng phát triển trên môi trường thạch MRS được bổ sung 0,5% CaCO ₃ và được khẳng định thông qua đặc điểm hình thái tế bào và sự có mặt của gen đặc hiệu marC (kích thước khoảng 990 bp) hoặc comK (kích thước khoảng 543 bp) bằng kỹ thuật PCR.

CHÚ THÍCH: Tiến hành chạy PCR với 1 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen một gen (marC hoặc comK) hoặc chạy PCR lần lượt với cả 2 cặp mồi đặc hiệu khuếch đại cả 2 gen (marC và comK) trong trường hợp có sự nghi ngờ về kích thước sản phẩm đặc hiệu hoặc có sự không tương thích giữa các khuẩn lạc có cùng hình thái nhưng kết quả khác về sự có mặt của gen đặc hiệu.

5 Môi trường, hoá chất

5.1 Yêu cầu chung

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết chuyên dùng cho phân tích vi sinh vật và theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy theo TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014).

5.2 Nước, Nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương để pha chế hoá chất, môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo mô tả trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987).

5.3 Môi trường thạch MRS (De Man-Rogosa-Sharpe agar) được bổ sung 0,5 % Calcium Carbonate (CaCO ₃ )

5.3.1 Thành phần

5.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong 1 000 mL nước. Phân phối môi trường với lượng phù hợp vào bình thủy tinh (6.2.1) sao cho lượng môi trường phân phối vào không được vượt quá 70 % thể tích thực của bình. Không vặn chặt nắp bình và khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C. Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc HCl 1 N sao cho sau khi khử trùng pH môi trường nằm trong khoảng từ 6,0 đến 6,5 (khoảng pH 6,2 đến 6,6 trước khi khử trùng) ở 25 °C. Làm nguội môi trường ở nhiệt độ phòng đến 50 °C đến 60 °C. Phân phối môi trường vào các đĩa Petri (6.2.8) với thể tích 13 mL đến 15 mL trong tủ cấy vô trùng (6.1.1).

CHÚ THÍCH: Cần phải trộn đều môi trường đến khi CaCO ₃ được phân tán đều trong dịch trước khi phân phối môi trường vào đĩa Petri.

5.4 Dung dịch pha loãng

5.4.1 Thành phần

5.4.2 Chuẩn bị

Hoà tan sodium chloride trong 1 000 mL nước. Phân phối vào bình thủy tinh với thể tích phù hợp (6.2.1). Không vặn chặt nắp bình và khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C trong 15 min. Sau hấp khử trùng bảo quản ở nhiệt độ phòng

5.5 Hoá chất tách chiết ADN và PCR

Có thể sử dụng các bộ kít thương mại (nếu có) hoặc các quy trình tách chiết ADN hoặc PCR phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thử nghiệm và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.6 Các cặp mồi oligonucleotide

Thông tin về trình tự oligonucleotide đặc hiệu phát hiện Bacillus coagulans trong Bảng 1.

Bảng 1 - Trình tự oligonucleotide của mồi đặc hiệu phát hiện Bacillus coagulans ^[5;6]

6 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007)] và cụ thể như sau:

6.1 Thiết bị

6.1.1 Tủ cấy vi sinh vật, đảm bảo độ vô trùng.

6.1.2 Nồi hấp áp lực, có khả năng duy trì nhiệt độ (121 ± 3) °C, tương đương áp suất tối thiểu 101,3 kPa.

6.1.3 Tủ sấy, thông gió đối lưu, có khả năng sấy ở nhiệt độ lên tới 70 °C ± 1 °C.

6.1.4 Tủ ấm, thông gió đối lưu, có khả năng duy trì nhiệt độ từ (25 đến 37) °C ± 1 °C.

6.1.5 Lò vi sóng, có dung tích 20 L đến 35 L.

6.1.6 Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ nhiệt độ lên đến (99 ± 1) °C.

6.1.7 Máy trộn vortex, có khả năng khuấy trộn mẫu đồng đều.

6.1.8 Kính hiển vi quang học, có vật kính 4X, 10X, 40X và vật kính dầu 100X.

6.1.9 Máy đo pH, có bù nhiệt, độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị ở 25°C.

6.1.10 Máy PCR, có khả năng khuếch đại được ADN của mẫu.

6.1.11 Hệ thống máy điện di ngang ADN, có thể điều chỉnh cường độ dòng điện và thời gian.

6.1.12 Máy chụp ảnh gel điện di, có nguồn sáng tia tử ngoại (UV-light base).

6.1.13 Cân kỹ thuật, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

6.2 Dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải được khử trùng ở điều kiện 121 °C, 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.2) và sấy khô bằng tủ sấy (6.1.3), trước khi tiến hành thử nghiệm.

6.2.1 Bình cấy hoặc bình thủy tinh, có dung tích thích hợp, có nút đậy kín hoặc nắp vặn thích hợp.

6.2.2 Cốc thủy tinh, có vạch chia thể tích và dung tích thích hợp.

6.2.3 Ống đong, có vạch chia thể tích và dung tích thích hợp.

6.2.4 Ống falcon, có nắp vặn và dung tích thích hợp.

6.2.5 Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc kim loại có thể tiệt trùng.

6.2.6 Micropipet, có thể phân phối 0,05 mL ± 0,002 mL; 0,1 mL ± 0,02 mL; 1,0 mL ± 0,02 mL và 10 mL ± 0,2 mL.

6.2.7 Ống PCR, bằng nhựa chịu nhiệt, thành mỏng, dung tích 0,2 mL.

6.2.8 Đĩa Petri, bằng chất dẻo hoặc thủy tinh không màu, trong suốt, đường kính 90 mm, sâu tối thiểu là 10 mm hoặc đĩa có đường kính 200 mm, cao 30 mm.

6.2.9 Lam kính, bằng thủy tinh, trong suốt, kích thước (25 × 75) mm, dày (1 đến 1,2) mm.

6.2.10 Lamen kính, bằng thủy tinh, trong suốt, kích thước (22 × 22) mm, dày (0,13 đến 0,16) mm.

6.2.11 Đầu hút vô trùng các loại, có khả năng chịu nhiệt.

6.2.12 Đèn cồn, bằng inox hoặc thủy tinh chịu nhiệt.

6.2.13 Que cấy, bằng nhựa hoặc kim loại, đầu tròn.

7 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 12105:2018.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

8 Cách tiến hành

8.1 Pha loãng mẫu thử

Dùng cân kỹ thuật (6.1.13) cân 10 g mẫu hoặc dùng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2,11) hút 10 mL mẫu cho vào bình thủy tinh (6.2.1) chứa 90 mL dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % (5.4.2). Trộn đều mẫu bằng máy trộn vortex (6.1.7) cho đến khi mẫu đồng nhất và ủ mẫu trong bể ổn nhiệt (6.1.6) ở 80 °C trong 10 min để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh bào tử. Dung dịch trên sau khi các phần tử nặng lắng xuống được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu có độ pha loãng 10 ^{- 1} .

Dùng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2.11) hút 1 mL dịch huyền phù ban đầu cho vào ống falcon (6.2.4) hoặc bình thủy tinh (6.2.1) chứa 9 mL dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % (5.4.2).Tránh chạm đầu hút vào dung dịch pha loãng. Trộn kỹ trên máy trộn vortex (6.1.7) khoảng 10 s, dung dịch thu được có độ pha loãng 10 ^{- 2} . Lặp lại qui trình để thu được dung dịch có các độ pha loãng thập phân tiếp theo. Mẫu thử nghiệm được tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng phù hợp.

CHÚ THÍCH: Hoạt hoá mẫu theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo kết quả chính xác, nếu có.

8.2 Cấy và ủ

Sử dụng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2.11) hút 0,1 mL dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào mỗi đĩa Petri (6.2.8) chứa môi trường dinh dưỡng MRS được bổ sung 0,5% CaCO ₃ (5.3.2). Mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa.

Dùng que dàn mẫu (6.2.5) dàn đều dịch cấy trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt. Sử dụng que dàn mẫu vô trùng cho mỗi đĩa. Đậy nắp đĩa và để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 min để dịch cấy hấp thụ vào bề mặt thạch.

Lập úp các đĩa đã chuẩn bị và nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở 45 °C trong 36 h đến 48 h. Nếu sau thời gian trên, các khuẩn lạc chưa hình thành hoặc hình thành nhưng không rõ ràng, ủ đĩa thêm 12 h.

8.3 Đếm và nhận diện khuẩn lạc

Đếm các khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định ở hai độ pha loãng liên tiếp, trên các đĩa Petri có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc.

Trên môi trường MRS được bổ sung 0,5% CaCO ₃ , khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định là các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO ₃ (sinh axit lactic phân giải CaCO ₃ được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy), khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt trơn có xuất hiện vòng tròn đồng tâm, tâm lồi và mép viền khuẩn lạc không đều (xem Hình 1).

Khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định được khẳng định thông qua phép thử khẳng định.

Hình 1 - Hình thái khuẩn lạc Bacillus coagulans trên môi trường MRS dược bổ sung 0,5% CaCO ₃ sau 48 h nuôi cấy ở 45 °C; (A) Khuẩn lạc mặt trước; (B) Khuẩn lạc mặt sau.

8.4 Phép thử khẳng định

Từ các đĩa Petri đã chọn (8.3), lấy ít nhất 05 khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định để thực hiện phép thử khẳng định.

Dùng que cấy đầu tròn (6.2.13) lấy sinh khối trực tiếp từ các khuẩn lạc Bacillus coagulans giả định để thực hiện các phép thử khẳng định (xem phụ lục A).

Các kết quả của phép thử khẳng định được nêu trong Bảng 2. Các khuẩn lạc giả định như sau được xác định là Bacillus coagulans.

Bảng 2 - Các kết quả của phép thử khẳng định

CHÚ THÍCH: Tiến hành chạy PCR với 01 cặp mồi đặc hiệu (khuếch đại gen marC hoặc gen comK) hoặc tiến hành chạy 2 mỗi lần lượt (khuếch đại gen marC và gen comK) trong trường hợp có sự nghi ngờ về kích thước sản phẩm đặc hiệu hoặc có sự không tương thích giữa các khuẩn lạc có cùng hình thái nhưng có kết quả khác nhau về sự có mặt của gen đặc hiệu.

9 Tính và biểu thị kết quả

9.1 Tính số lượng Bacillus coagulans trong mẫu thử

- Số lượng khuẩn lạc Bacillus coagulans, a, trên mỗi đĩa Petri được tính theo công thức (1)

Trong đó:

Kết quả được làm tròn đến số nguyên gần nhất.

- Số lượng vi khuẩn Bacillus coagulans, N, trong một đơn vị kiểm tra, được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gam (CFU/g) hoặc trên mililit (CFU/mL), đã được nhận dạng hoặc khẳng định có trong mẫu thử được tính theo công thức (2):

Trong đó:

Kết quả được làm tròn đến một chữ số sau dấu phẩy. Biểu thị kết quả bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10 ^x , trong đỏ X là số mũ của 10.

9.2 Báo cáo kết quả trong trường hợp đặc biệt

Biểu thị kết quả trong trường hợp số đếm thấp hoặc trường hợp đặc biệt theo quy định trong TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007).

10 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng (nếu biết);

c) Phương pháp thử đã sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) Kết quả thử nghiệm thu được.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Phép thử khẳng định Bacillus coagulans

A.1 Nhuộm Gram

A.1.1 Thuốc nhuộm

Ưu tiên sử dụng thuốc nhuộm thương mại có sẵn. Trong trường hợp này, phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.1.1.1 Dung dịch tím tinh thể

A.1.1.1.1 Thành phần

A.1.1.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan tím tinh thể trong Etanol 95 % thu được dung dịch (a). Hòa tan amoni oxalat trong nước cất thu được dung dịch (b);

Trộn dung dịch (a) và (b), thu được dung dịch tím tinh thể. Để yên hỗn hợp 24 h trước khi sử dụng.

A.1.1.2 Dung dịch iốt

A.1.1.2.1 Thành phần

A.1.1.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan kali iodua trong 10 mL nước, thêm 1,0 g Iốt với các phần nhỏ, khuấy cho đến tan hoàn toàn, thêm nước đến 100 mL. Bảo quản dung dịch trong lọ sẫm màu, sử dụng trong vòng 1 tháng.

A.1.1.3 Dung dịch Safranin

A.1.1.3.1 Thành phần

A.1.1.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan Safranin trong dung dịch Etanol 95 %, sau đó bổ sung nước cất. Chuẩn bị dung dịch trước khi sử dụng.

A.1.2 Cách tiến hành

Nhỏ 1 giọt dung dịch pha loãng NaCl 0,85 % (5.4.2) lên lam kính (6.2.9). Dùng que cấy đầu tròn (6.2.13) lấy một phần sinh khối vi sinh vật từ các khuẩn lạc được lựa chọn (8.3) được nuôi cấy trên môi trường MRS được bổ sung 0,5% CaCO ₃ ở 45 °C trong 36 h đến 48 h và hòa vào giọt dịch pha loãng.

Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn (6.2.12).

CHÚ THÍCH: Kiểm tra độ nóng (nóng nhẹ vừa phải trên mu bàn tay) để mẫu khô vừa đủ, nếu nóng quá, hoặc hơ lâu, vi sinh vật sẽ biến dạng.

Phủ lên lam kính dung dịch tím tinh thể (A.1.1.1.2). Để cho phản ứng xảy ra trong 1 min. Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước, thấm khô.

Phủ lên lam kính dung dịch Iốt (A.1.1.2.2), để phản ứng xảy ra trong 1 min. Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài giây.

Rót nhẹ nhàng và liên tục một lớp mỏng dung dịch Etanol 95 % lên lam kính, để nghiêng trong khoảng thời gian ít hơn 30 s cho đến khi không còn màu tím.

Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước để loại Etanol. Phủ lên lam kính bằng dung dịch safranin (A.1.1.3.2) trong 10 s. Tráng nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước. Làm khô lam kính. Đậy lamen kính (6.2.10) lên trên lam kính.

Quan sát hình dạng và màu sắc tế bào bằng kính hiển vi quang học (6.1.8).

A.1.3 Đọc kết quả

Gram dương (Gram +): các tế bào vi khuẩn có màu xanh tím hoặc tím.

Gram âm (Gram -): các tế bào vi khuẩn có màu từ hồng thẫm đến đỏ.

Hình A.1 - Hình ảnh nhuộm gram của vi khuẩn Bacillus coagulans NBRC12583

A.2 Xác định Bacillus coagulans bằng phương pháp PCR sử dụng gen đích đặc hiệu

A.2.1 Chuẩn bị ADN tổng số

Chuẩn bị mẫu ADN từ khuẩn lạc: Bổ sung 20 μl nước sử dụng cho PCR vào ống PCR (6.2.7). Sử dụng micropipet (6.2.6) với đầu hút 10 μl để chấm vào khuẩn lạc và đưa đầu hút này hút lên hút xuống (3 đến 5) lần trong ống. Ống PCR chứa phần khuẩn lạc này sẽ được gia nhiệt trong máy PCR (6.1.10) với quy trình 2 bước: (1) 95 °C trong 5 min và (2) 25 °C trong 5 min. Sử dụng ADN thu được làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen đặc hiệu.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng trực tiếp khuẩn lạc để thực hiện PCR khuẩn lạc hoặc các phương pháp tách chiết ADN khác hoặc sử dụng kít tách chiết ADN có sẵn trên thị trường để thu được sản phẩm chứa ADN

A.2.2 Trình tự oligonucleotit

Xem trong Bảng 1 Điều 5.6. Tính đặc hiệu của các cặp mồi (Bảng 1) đối với các chủng Bacillus coagulans được xác nhận bởi TLTK ^[5;6] .

A.2.3 Thực hiện phản ứng PCR

A.2.3.1 Chuẩn bị phản ứng PCR

Bảng A.1 - Thành phần phản ứng PCR

Trộn đều hỗn hợp phản ứng bằng micropipet (6.2.6), sau đó ly tâm nhanh trong 3 s đến 5 s.

CHÚ THÍCH: Quy trình luôn phải thực hiện song song mẫu thử nghiệm các mẫu sau đây:

+ Mẫu đối chứng trắng (ADN khuôn được thay bằng nước);

+ Mẫu đối chứnqg âm là mẫu ADN không phải của Bacillus coagulans;

+ Mẫu đối chứng dương là ADN của chủng chuẩn Bacillus coagulans.

A.2.3.2 Chu trình nhiệt PCR

Bảng A.2 - Chu trình PCR áp dụng cài đặt cho máy PCR

A.2.3.3 Điện di sản phẩm PCR

Hút 10 μL sản phẩm PCR trộn đều với 2 μL loading dye, hỗn hợp được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 % trong đệm TAE 1X, dòng điện có hiệu điện thế 80 V trong 45 min bằng hệ thống máy điện di ngang (6.1.11) và chụp ảnh bằng máy chụp ảnh gel điện di (6.1.12).

A.2.4 Đọc kết quả

Khẳng định Bacillus coagulans dựa trên kết quả điện di được công nhận như sau: Khuẩn lạc giả định cho sản phẩm đặc hiệu đúng kích thước (gen marC khoảng 990 bp hoặc gen comK khoảng 543 bp)

Hình A.2 - Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai cặp mồi đặc hiệu BC1-F/BC1-R và BC2-F/ BC2- R của chủng vi khuẩn Bacillus coagulans NBRC 12583 và 25 chủng vi khuẩn khác.

CHÚ THÍCH: M. Thang ADN chuẩn 1 500 bp; ĐC. Đối chứng trắng ADN được thay bằng nước; (1) Đối chứng dương Bacillus coagulans NBRC 12583; từ (2) đến (26) Đối chứng âm. (Cụ thể: (2) Bacillus cereus ATCC 1778; (3) Bacillus subtilis ATCC 6633; (4) Bacillus subtilis VTCC 11010; (5) Bacillus subtilis HVN 011; (6) Bacillus pumilus VTCC 10756; (7) Bacillus amyloliquefaciens VTCC 11041; (8) Bacillus amyloliquefaciens HVN 007; (9) Bacillus amyloliquefaciens HVN 018; (10) Bacillus laterosporus NBRC 15654; (11) Bacillus laterosporus HVN 006; (12) Bacillus laterosporus HVN 211; (13) Bacillus licheniformis ATCC14580; (14) Bacillus licheniformis HVN12; (15) Bacillus mycoides HVN 001; (16) Bacillus mycoides ATCC 6462; (17) Bacillus thuringiensis HVN 041; (18) Bacillus thuringiensis HVN 004; (19) Bacillus clausii HVN069; (20) Staphylococcus aureus ATCC25923; (21) Escherichia coli ATTCC35218; (22) Cupriavidus metallidurans HVN 034; (23) Lactobacillus fermentum HVN 099? (24) Enterococcus faecium HVN 007; (25) Paenibacillus polymyxa HVN 079; (26) Paenibacillus polymyxa HVN 065.

Hình A.3 - Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai cặp mồi BC1-F/BC1-R và BC2-F/ BC2-R trên 05 khuẩn lạc giả định (1 đến 5)

CHÚ THÍCH: M. Thang ADN chuẩn 1 500 bp; (+) Đối chứng dương với ADN của chủng chuẩn Bacillus coagulans NBRC 12583; (-) Đối chứng trắng ADN được thay bằng nước.

A.3 Kết quả giải trình tự vùng gen marC của chủng Bacillus, coagulans NBRC12583 được khuếch đại bằng cặp mồi BC1-F/BC1-R

A.4 Kết quả giải trình tự vùng gen comK của chủng Bacillus coagulans NBRC 12583 được khuếch đại bằng cặp mồi BC2-F/BC2-R

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6507-1 (ISO 6687-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân.

[2] TCVN 12105:2018, Phân bón vi sinh vật - Lấy mẫu.

[3] TCVN 13637:20023 (ISO 21148:2017), Mỹ phẩm - Vi sinh Vật - Hướng dẫn chung về kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật

[4] TCVN 7682: 2007 (ISO 20838:2006), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi -Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính.

[5] United States Patent Application Publication: Pub. No.: US 2017/0096700 A1: Novel, PCR primers and methods thereof for the indentification of Bacillus coagulans. Pub. Date: Apr.6,2017

[6] Europrean patent specification: International publication number: wo 2017/058741 (06.04.2017 Gazette 2017/14): Use of PCR primers and methods for the identification of Bacilus coagulans. Date of publication and mention of the grant of the patent: 17.02.2021.

[7] de Man, J. D., Rogosa, D., & Sharpe, M. E. (1960). A medium for the cultivation of lactobacilli. Journal of applied microbiology, 23(1), 130-135.

[8] UK Standards for Microbiology Investigations (2018). Identification of Bacillus species. Issued by the Standards Unit, Microbiology Services, Public Health England. Bacteriology - Identification, ID 9, Issue no: 3.1, Issue date: 04.04.18, Page 1 -27.