Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-21:2014 Bệnh động vật-Quy trình chẩn đoán-Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-21:2014

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 21: HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRS)

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 21: Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS)

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn.

2. Thuật ngữ, định nghĩa và chữ viết tắt

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và những chữ viết tắt sau:

2.1. Thuật ngữ, định nghĩa

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn: là bệnh truyền nhiễm do vi rút PRRS, họ Arteriviridae gây ra. Bệnh cũng được gọi theo tên viết tắt bằng tiếng Anh là bệnh PRRS hoặc trong dân gian gọi là bệnh Tai xanh.

CHÚ THÍCH 1: Biểu hiện đặc trưng của lợn bệnh là các rối loạn về sinh sản ở lợn nái như sẩy thai, thai chết lưu, lợn sơ sinh chết yểu. Lợn con đang nuôi theo mẹ, lợn nái hậu bị có biểu hiện viêm đường hô hấp rất nặng.

CHÚ THÍCH 2: Vi rút PRRS có hai kiểu gen chính được công nhận là kiểu gen Châu Âu (týp l) có tên gọi là Lelystad và kiểu gen Bắc Mỹ (týp II) có tên gọi là VR2332. Vi rút PRRS gây bệnh ở Việt Nam thuộc kiểu gen Bắc Mỹ nhưng có độc lực cao và giống với các chủng vi rút PRRS của Trung Quốc.

2.2. Chữ viết tắt

- PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome): Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn.

- ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay): Phản ứng ELISA.

- rRT - PCR (real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng Realtime-RT PCR.

- MARC-145: Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi.

- PAM (Porcine alveolar macrophages): Tế bào đại thực bào phổi lợn.

- IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay): Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp.

- CPE (Cytopathic pathogene effect): Bệnh tích tế bào.

- FCS (Fetal calf serum): Huyết thanh thai bê.

- BSC II (Bio-safety cabinet): Buồng an toàn sinh học cấp II.

- MEM (Modified Eagles medium): Môi trường tế bào.

- TCID₅₀ (50 % tissue culture infective dose): Liều gây nhiễm 50 % tế bào.

- BHI (Brain heart infusion): Canh thang tim não.

- PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phốt phát.

- AEC: 3 - Amino - 9 - ethylcarbazole.

- TE buffer (Tris - EDTA buffer): dung dịch đệm TE.

- DMSO (Dimethylsulfoxide): chất bảo vệ đông lạnh.

- NP40: Igepal CA - 630.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất hai lần hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1. Môi trường phát triển tế bào MEM có chứa FCS (huyết thanh thai bê).

3.2. Canh thang tim não BHI.

3.3. Các loại kháng sinh Penicillin, Kanamycin, streptomycin, Mycostatin, Gentamicin.

3.4. Formalin 40%.

3.5. Sữa gầy (skim milk).

3.6. Dung dịch NP40.

3.7. Dung dịch peroxidase (H₂O₂) 30%.

3.8. Dung dịch AEC.

4. Thiết bị, dụng cụ.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và cụ thể như sau:

4.1. Tủ lạnh âm sâu có thể duy trì nhiệt độ ở âm 20 °C và âm 70 °C.

4.2. Tủ lạnh thường.

4.3. Tủ ấm 37 °C có 5 % CO₂.

4.4. Buồng an toàn sinh học cấp II.

4.5. Máy ly tâm có thể tạo gia tốc ly tâm ở 8000g, 10000g, 12000g và 14000g.

4.6. Máy ly tâm có thể tạo gia tốc ly tâm ở 1500g, 2000g, 3000g

4.7. Máy lắc trộn (vortex mixer).

4.8. Máy khuấy từ.

4.9. Kính hiển vi soi ngược.

4.10. Kính hiển vi thường.

4.11. Máy chạy nhân gen Realtime PCR.

4.12. Nồi hấp áp lực, duy trì nhiệt độ ở 121 °C.

4.13. Chai thủy tinh, dung tích 100 ml, 200 ml, 1000 ml và 2000 ml.

4.14. Ống ly tâm dung tích 50 ml và 15 ml.

4.15. Micropipet, dung tích từ 0,5 μl đến 10 μl, từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl, từ 100 μl đến 1000μl, từ 1000 μl đến 5000 μl.

4.16. Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl.

4.17. Bộ cối chày sứ.

4.18. Chai nhựa nuôi tế bào: 25 cm², 75 cm².

4.19. Đĩa nhựa nuôi tế báo: 24 giếng, 96 giếng.

4.20. Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

4.21. Dao, kéo, panh kẹp.

4.22. Bơm kim tiêm dung tích 5ml.

4.23. Ống giữ mẫu eppendorf dung tích 1,5 ml.

5. Cách tiến hành

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1. Đặc điểm dịch tễ

- Lợn ở mọi lứa tuổi đều có thể bị mắc bệnh PRRS.

- Ở những lứa tuổi khác nhau, lợn mắc bệnh PRRS có những triệu chứng, bệnh tích biểu hiện cũng khác nhau.

- Ở Việt Nam, bệnh đã trở thành dịch địa phương nên có thể xảy ra quanh năm nhưng tập trung nhất vào thời gian từ tháng 3 đến tháng 4 và từ tháng 9 đến tháng 10 hàng năm khi người chăn nuôi tái đàn gia súc.

5.1.2. Triệu chứng

- Lợn nái: khi nhiễm bệnh thường kém ăn, bỏ ăn, sốt cao 39 °C - 40 °C, một số con bị ho.

Triệu chứng đặc trưng thường gặp là viêm vú và mất sữa. Hiện tượng tai tím, tai xanh có xuất hiện nhưng không nhiều, nếu xuất hiện thì trong vài giờ là hết.

Ở thể cấp tính lợn có thể bị sảy thai. Một số lợn đẻ non sau khi mang thai 4 tuần, sau đó duy trì tình trạng động dục giả và chậm động dục sau cai sữa. Lợn đẻ ra thai chết, thai gỗ hoặc thai vẫn sống nhưng rất yếu hoặc chết yểu ngay sau đó.

Đôi khi lợn nái có triệu chứng thần kinh như mất điều hòa vận động.

- Lợn đực: mắc PRRS thường sốt trong thời gian ngắn, bỏ ăn. Một số lợn có biểu hiện hôn mê và có triệu chứng đường hô hấp như ho, thở khò khè. Đặc biệt là viêm tinh hoàn, giảm tính năng giao phối, xuất tinh kém, tỷ lệ thụ thai thấp.

- Lợn con đang nuôi theo mẹ: thường chết yểu. Nếu sống hay mắc các bệnh đường hô hấp và thường bị ỉa chảy. Lợn có biểu hiện viêm kết mạc, sưng mí mắt. Lợn con sốt, ủ rũ, bỏ ăn, gầy còm, thở nhanh, đôi khi đi liêu xiêu, nghiêng ngả.

- Lợn cai sữa và lợn choai: có biểu hiện sốt, ủ rũ, bỏ ăn, thở nhanh, thở khó. Xuất huyết dưới da vùng tai, mông, đùi, lông xơ xác, nếu có nhiễm trùng kế phát thì có triệu chứng đường hô hấp, tiêu hóa rõ rệt.

5.1.3. Bệnh tích

5.1.3.1. Bệnh tích đại thể

Bệnh tích đặc trưng nhất là ở phổi. Phổi có hiện tượng viêm hoại tử, đặc trưng bởi những đám chắc đặc. Trên các thùy phổi bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ, chắc đặc. Mặt cắt ngang của các thùy phổi bệnh lồi ra, khô. Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hóa mủ.

5.1.3.2. Bệnh tích vi thể

Quan sát dưới kính hiển vi thường (xem 4.10) có độ phóng đại 400 lần thấy phổi có hiện tượng dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm bạch cầu, trong phế nang chứa đầy dịch viêm, đại thực bào. Một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân. Một bệnh tích khá đặc trưng ở phổi là hiện tượng phế nang bị nhăn và có hiện tượng đại thực bào bị phân hủy.

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1. Lấy mẫu

5.2.1.1. Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên

- Bệnh phẩm nội tạng là phổi, hạch lâm ba của lợn nghi mắc bệnh PRRS.

- Bệnh phẩm là huyết thanh của lợn nghi mắc bệnh đang có triệu chứng sốt cao: dùng bơm tiêm (xem 4.22) lấy máu lợn kiểm tra (khoảng 3 ml - 4 ml), đặt nghiêng, yên tĩnh cho máu đông và tránh dung huyết, sau đó chắt lấy huyết thanh cho xét nghiệm (0,5 ml đến 1 ml) giữ trong ống giữ mẫu (xem 4.23).

Tất cả mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải được bao gói cẩn thận không làm lây lan bệnh, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm nhất có thể (trong vòng 24 h) (kèm theo phiếu bệnh phẩm). Tại phòng thí nghiệm mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ âm sâu -70 °C.

CHÚ THÍCH: Đối với xét nghiệm kháng nguyên, không lấy mẫu phù tạng hoặc máu chất huyết thanh từ lợn đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc PRRS chủng JXA1-R hoặc tương tự trong phạm vi 33 ngày kể từ ngày tiêm để phát hiện vi rút PRRS.

5.2.1.2. Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể

Mẫu lấy xét nghiệm kháng thể là huyết thanh từ 0,5 đến 1 ml của lợn cần kiểm tra: dùng bơm tiêm (xem 4.22) lấy máu lợn cần kiểm tra (khoảng 3 ml - 4 ml), đặt nghiêng, yên tĩnh cho máu đông và tránh dung huyết, sau đó chắt lấy huyết thanh giữ trong ống giữ mẫu (xem 4.23) cho xét nghiệm.

CHÚ THÍCH : Đối với xét nghiệm kháng thể, không lấy mẫu chất huyết thanh của lợn được tiêm vắc xin PRRS và kể cả lợn con sinh ra từ nái mẹ đã được tiêm vắc xin PRRS. Nếu lấy mẫu huyết thanh để xét nghiệm, cần lấy 3 mẫu/đàn (đối với đàn có từ 3 con trở lên).

Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải được bao gói cẩn thận không làm lây lan bệnh, bảo quản ở 4 °C đến 8 °C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm sớm nhất có thể (trong vòng 24 h) (kèm theo phiếu bệnh phẩm). Tại phòng thí nghiệm mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ âm sâu -70 °C.

5.2.2. Phát hiện và giám định kháng nguyên

5.2.2.1. Xử lý bệnh phẩm

- Mẫu bệnh phẩm là phổi, hạch (xem 5.2.1.1): dùng panh, kéo (xem 4.21) lấy 1 g, cắt nhỏ rồi nghiền trong cối chày sứ (xem 4.17) vô trùng với 10 ml dung dịch PBS pH = 7,2 (xem phụ lục A) thành huyễn dịch 10 %. Chuyển toàn bộ huyễn dịch vào ống ly tâm 50 ml (xem 4.14) rồi ly tâm bằng máy ly tâm (xem 4.6) ở gia tốc 2000 g trong 15 min. Hút lấy dịch nước trong ở phía trên xử lý với kháng sinh penicillin (200 Ul/ml) và Streptomycin (200 μg/ml) (xem 3.3) hoặc có thể lọc vô trùng qua màng lọc (xem 4.20). Kiểm tra lại độ vô trùng trên canh thang BHI (xem 3.2).

- Bệnh phẩm là huyết thanh (xem 5.2.1.1): lắc bằng máy lắc trộn (xem 4.7), rồi ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (xem 4.5) ở gia tốc 8000 g trong 1 min sau đó đem chiết tách ARN.

5.2.2.2. Phương pháp rRT-PCR (real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

5.2.2.2.1. Nguyên tắc

Phản ứng rRT-PCR dùng để phát hiện ARN của vi rút PRRS. Phản ứng này có thể phân biệt vi rút PRRS thuộc chủng Châu Âu, Bắc Mỹ và Trung Quốc (vi rút PRRS độc lực cao) bằng việc sử dụng các cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu.

Danh mục các mẫu dò và cặp mồi sử dụng cho phản ứng rRT-PCR trong quy trình này để phát hiện vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ (NA), Châu Âu (EU) và Trung Quốc

5.2.2.2.2. Cách tiến hành:

- Mẫu bệnh phẩm sau khi xử lý (xem 5.2.2.1), được chiết tách ARN (xem phụ lục B) bằng kít chiết tách để làm khuôn mẫu cho phản ứng rRT-PCR.

- Phản ứng rRT-PCR (xem phụ lục B) có thể khác nhau tùy thuộc vào loại kít nhân gen sử dụng.

5.2.2.2.3. Đánh giá kết quả

Kết quả chạy rRT - PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng (Ct) phát hiện tín hiệu huỳnh quang.

- Mẫu được coi là dương tính khi có Ct ≤ 35.

- Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct.

- Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35, trường hợp này phải xét nghiệm lại hoặc dùng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng định.

5.2.2.3. Phương pháp phân lập vi rút trên tế bào

- Chuẩn bị tế bào MARC-145 hoặc tế bào PAM (xem phụ lục C) nuôi cấy lên các chai nhựa nuôi tế bào 25 cm² (xem 4.18) hoặc đĩa nhựa nuôi tế bào 24 giếng (xem 4.19) với môi trường phát triển tế bào (xem 3.1) MEM có 5% FCS (xem Phụ lục A). Sau 2 ngày đến 3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 80 %) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm (xem 5.2.2.1) với liều 50 μl/giếng đến 100 μl/giếng hoặc 500 μl/chai.

- Kiểm tra tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi soi ngược (xem 4.9). Nếu có vi rút PRRS, vi rút sẽ gây nên những biến đổi bệnh tích tế bào (CPE) với đặc điểm các tế bào co tròn, thảm tế bào bong tróc khỏi bề mặt dụng cụ nuôi cấy. CPE thường xuất hiện sau 4 ngày đến 7 ngày gây nhiễm.

- Sau 7 ngày thu lấy hết huyễn dịch tế bào vào ống ly tâm 50 ml (xem 4.14), cất ở tủ lạnh âm sâu (xem 4.1), sau đó lấy ra rã đông, ly tâm bằng máy ly tâm (xem 4.6) ở gia tốc 3000 g trong 10 min. Thu dịch nước trong cho giám định vi rút hoặc cấy chuyển lần thứ hai.

5.2.2.4. Phương pháp giám định vi rút

Giám định vi rút bằng phương pháp rRT- PCR (5.2.2.2).

5.2.3. Phát hiện kháng thể

Phản ứng huyết thanh học có ý nghĩa chẩn đoán khi lợn mắc bệnh có triệu chứng, bệnh tích nghi PRRS và chưa tiêm phòng vắc xin PRRS, hoặc sử dụng để đánh giá kết quả tiêm phòng vắc xin PRRS.

5.2.3.1. Xử lý bệnh phẩm

Bệnh phẩm là huyết thanh (xem 5.2.1.2): lắc bằng máy lắc trộn (xem 4.7), rồi ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (xem 4.5) ở gia tốc 8000 g trong 1 min. Sau đó xử lý ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min để diệt bổ thể rồi đem tiến hành các phương pháp để phát hiện kháng thể.

5.2.3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme linked immonosorbent assay)

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể PRRS có bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục D).

5.2.3.3. Phương pháp IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay)

5.2.3.3.1. Nguyên tắc

Đây là phương pháp sử dụng một thảm tế bào đã gây nhiễm vi rút chuẩn để phát hiện kháng thể. Nếu huyết thanh có kháng thể thì có sự kết hợp của kháng nguyên, kháng thể và kháng kháng thể, khi cho cơ chất vào sẽ xuất hiện màu đỏ đậm, đó là phản ứng dương tính. Phản ứng âm tính nếu thảm tế bào có màu hồng nhạt.

5.2.3.3.2. Chuẩn bị

- Môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS (huyết thanh thai bê) (xem phụ lục A).

- Dung dịch A: dung dịch cố định tế bào, gồm: PBS có 10 % formalin (xem 3.4) và 1 % NP40 (xem 3.6).

- Dung dịch B: dung dịch nước rửa, gồm PBS (xem phụ lục A) với 1 % Tween 80.

- Dung dịch C: dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS (xem phụ lục A) với 1 % Tween 80 và 5 % sữa gây (xem 3.5).

- Dung dịch E: dung dịch AEC (3 - Amino - 9 - ethylcarbazole), gồm 1 ml dung dịch AEC (xem 3.8) nguyên chất + 14 ml dung dịch đệm axetat 0,1 M (pH 5,2) + 15 μl H₂O₂ 30 % (xem 3.7).

- Tế bào MARC-145 hoặc tế bào PAM (xem phụ lục C).

- Giống vi rút chuẩn PRRS.

5.2.3.3.3. Cách tiến hành

a) Bước 1: Chuẩn bị tế bào MARC -145 (hoặc tế bào PAM) trên đĩa nuôi tế bào 96 giếng

- Tế bào MARC-145 (hoặc tế bào PAM) (xem phụ lục C) đựng trong ống cryo được đưa ra khỏi bình nitơ lỏng, nhanh chóng giải đông rồi cho hỗn hợp tế bào vào ống ly tâm 15 ml (xem 4.14) có chứa sẵn 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS. Trộn đều bằng pipet 5000 ml (xem 4.15), cho vào ly tâm ở gia tốc 1500 g trong 5 min. Hút bỏ nước trong ở trên, giữ phần cặn ở dưới rồi cho tiếp vào 5ml môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS, trộn đều bằng pipet. Hút chuyển dung dịch này vào chai nuôi tế bào 25 cm². Đem giữ trong tủ ấm (xem 4.3), sau 24 h đưa ra quan sát dưới kính hiển vi (xem 4.9), xem sự phát triển của tế bào. Thay môi trường phát triển tế bào 1 lần/ngày. Sau từ 2 ngày đến 4 ngày sẽ thu được một thảm tế bào. Thu tế bào khi đã phát triển trên 90 % diện tích chai nuôi cấy.

- Thu hoạch tế bào MARC-145 (hoặc tế bào PAM) rồi tiến hành pha loãng tế bào với môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS với số lượng cần thiết (5 x 10⁴ tế bào/ml), chia đều vào đĩa nuôi tế bào 96 giếng với lượng 100 μl/giếng bằng pipet đa kênh (xem 4.16).

- Ủ đĩa tế bào trong tủ ấm (xem 4.3) và nuôi từ 1 ngày đến 2 ngày cho đến khi tế bào trong các giếng phát triển thành một lớp ở đáy giếng.

b) Bước 2: Gây nhiễm tế bào với vi rút PRRS

- Lấy giống vi rút chuẩn từ nơi bảo quản, làm tan đá nhanh rồi pha loãng với môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS để được liều 500 TCID₅₀ vi rút/ml (giống vi rút đã được hiệu chỉnh nồng độ trước). Xem phụ lục E về cách tính liều TCID₅₀.

- Cho 100 μl dung dịch vi rút đã pha loãng ở trên vào mỗi giếng.

- Ủ đĩa trong tủ ấm 37 °C (xem 4.3) trong 2 ngày.

c) Bước 3: Cố định tế bào đã nhiễm vi rút

- Đổ bỏ dung dịch có trong tất cả các giếng của đĩa.

- Cho 100 μl dung dịch A vào mỗi giếng.

- Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 min.

- Đổ bỏ dung dịch A, rồi rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch rửa B với lượng 300 μl/giếng.

d) Bước 4: Cho huyết thanh cần kiểm tra

- Đối với phản ứng định tính kháng thể thì chỉ pha loãng huyết thanh ở mức 1/160.

- Đối với phản ứng định lượng kháng thể pha loãng huyết thanh gấp 4 lần bắt đầu từ 1/10 đến 1/2560.

- Cho 50 μl huyết thanh cần kiểm tra đã pha loãng vào các giếng tương ứng.

- Ủ đĩa ở 37 °C trong 30 min.

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch B với lượng 300 μl/giếng.

e) Bước 5: Cho kháng kháng thể PRRS có gắn enzyme (conjugate + peroxidase) (kháng thể này được chế trên thỏ)

- Pha loãng kháng kháng thể với dung dịch pha loãng (dung dịch nước rửa B) theo tỷ lệ 1/600.

- Cho 50 μl kháng kháng thể đã pha loãng này vào mỗi giếng.

- Ủ đĩa ở 37 °C trong 30 min.

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch rửa B với lượng 300 μl/giếng.

f) Bước 6: Cho cơ chất

- Cho vào mỗi giếng 50 μl dung dịch AEC - dung dịch E.

- Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng 30 min.

g) Bước 7: Đọc kết quả

Để đọc kết quả, sử dụng kính hiển vi soi ngược (xem 4.9) để quan sát:

- Nếu quan sát thấy thảm tế bào trong giếng có những đám tế bào bắt màu đỏ đậm thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó dương tính kháng thể PRRS,

- Nếu quan sát thảm tế bào trong giếng thấy toàn bộ thảm tế bào có màu hồng nhạt - màu của môi trường phát triển tế bào thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó âm tính kháng thể PRRS.

6. Báo cáo kết quả

Lợn được kết luận mắc bệnh PRRS khi có các đặc điểm về triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với vi rút PRRS hoặc dương tính kháng thể PRRS bằng các phương pháp trong tiêu chuẩn này.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị môi trường và dung dịch thuốc thử

A.1. Dung dịch kháng khuẩn

A.1.1. Thành phần

A.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan kháng sinh với nước cất trong chai thủy tinh vô trùng 100 ml (xem 4.13) rồi lọc bằng màng lọc (xem 4.20). Bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh thường (xem 4.2).

A.2. Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,2

A.2.1. Thành phần

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai thủy tinh vô trùng (xem 4.13), chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc dung dịch HCl 1 N. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (xem 4.12) ở nhiệt độ 121 °C trong 15 min, bảo quản ở 4 °C của tủ lạnh thường (xem 4.2).

A.3. Dung dịch NaHCO₃ 7 %

A.3.1. Thành phần

A.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan NaHCO₃ với nước cất trong chai thủy tinh vô trùng (xem 4.13), hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (xem 4.12) ở nhiệt độ 121°C trong 15 min và bảo quản ở 4 °C của tủ lạnh thường (xem 4.2).

A.4. Dung dịch L-glutamin 3 %

A.4.1. Thành phần

A.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan L-glutamin với nước cất trong chai thủy tinh vô trùng (xem 4.13), lọc vô trùng bằng màng lọc (xem 4.20), sau đó chia ra các ống ly tâm 15 ml (xem 4.14) vô trùng với lượng 10 ml/ống và bảo quản ở tủ âm -20 °C (xem 4.1).

A.5. Dung dịch trypsin 0,5 %

A.5.1. Thành phần

A.5.2. Chuẩn bị

Hòa tan trypsin với nước cất trong chai thủy tinh vô trùng (xem 4.13), khuấy bằng máy khuấy từ (xem 4.8) qua đêm ở 4 °C, lọc vô trùng bằng màng lọc (xem 4.20). Bảo quản ở tủ âm -20 °C (xem 4.1).

A.6. Môi trường phát triển tế bào

A.6.1. Chuẩn bị

Hòa tan MEM với nước cất khử ion trong chai thủy tinh vô trùng (xem 4.13), hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 15 min và bảo quản ở 4 °C. Sau đó bổ sung các chất để được môi trường sử dụng cho nuôi cấy tế bào.

A.6.2. Pha môi trường tế bào (để sử dụng)

Sau khi bổ sung các chất để được môi trường tế bào sử dụng, chia ra các chai thủy tinh nhỏ vô trùng (xem 4.13) với lượng 200 ml/chai, bảo quản ở 4 °C. Khi nào dùng phát triển hay cất giữ tế bào thì bổ sung thêm FCS.

A.6.3. Chuẩn bị môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS

A.6.4. Chuẩn bị môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS

A.6.5. Chuẩn bị môi trường cất giữ tế bào

A.7. Chuẩn bị mồi

- Mồi đông khô phải được ly tâm ngắn để chắc chắn rằng mồi được lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 pmol/μl làm gốc.

- Mồi sử dụng ở nồng độ 10 pmol/μl: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Phương pháp rRT-PCR phát hiện ARN của vi rút PRRS

B.1. Chiết tách ARN

Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Nếu sử dụng kít chiết tách Qiagen RNearsy minikit thì các bước chiết tách được thực hiện như sau:

a) Chuẩn bị

Chuẩn bị dung dịch RLT (600 μl/mẫu) vào ống ly tâm 50 ml vô trùng (xem 4.14). Thêm 1/100 β- mercaptoetanol (β-ME) vào dung dịch RLT (sau khi bổ sung β-ME, dung dịch RLT này có thể giữ được 1 tháng ở nhiệt độ phòng).

b) Tiến hành chiết tách

Lắc mẫu trong 5 s bằng máy lắc rồi ly tâm nhanh. Cho 600 μl dung môi RLT đã bổ sung β-ME vào ống giữ mẫu 1,5 ml (xem 4.23).

Chuyển 200 μl mẫu sang ống giữ mẫu 1,5 ml (xem 4.23). Lắc ống 1,5 ml bằng máy lắc trong 15 s và ly tâm nhanh.

Thêm 400 μl ethanol 100 % (cồn tuyệt đối) và lắc trong 15 s. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min ở nhiệt độ phòng.

Chuyển 600 μl hỗn hợp dung dịch ở trên vào ống cột lọc (spin column) có trong bộ kit. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min. Vứt bỏ phần ống thu dung dịch ở dưới, chuyển phần cột lọc phía trên sang ống thu mới. Chuyển nốt 600 μl hỗn hợp dung dịch còn lại vào trong cột lọc. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min.

Vứt bỏ phần ống thu dung dịch ở dưới, chuyển phần cột lọc phía trên sang ống thu mới.

Rửa lần 1: Cho 700 μl dung dịch RW1 vào cột lọc. Ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min.

Vứt bỏ phần ống thu dung dịch ở dưới, chuyển phần cột lọc phía trên sang ống thu mới.

Rửa lần 2: Cho 500 μl dung dịch RPE vào cột lọc, ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min. Đổ bỏ phần dung dịch ở dưới, giữ lại ống thu, cho tiếp 500μl dung dịch RPE vào cột lọc, ly tâm ở gia tốc 8000g trong 1 min.

Đặt cột lọc vào ống thu mới. Ly tâm cột lọc ở gia tốc 14 000g trong 2 min.

Thu ARN: Chuyển cột lọc sang ống giữ mẫu 1,5 ml mới. Cho 50 μl nước không chứa nuclease vào cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 1 min ở gia tốc lớn hơn 10 000g.

Chuyển mẫu ARN đã thu sang ống giữ mẫu 1,5 ml mới.

Cất giữ ARN: Có thể giữ ARN ở 4 °C trong vài giờ nếu sử dụng ngay hoặc cất giữ ở nhiệt độ - 20 °C nếu chưa dùng ngay trong ngày.

B.2. Tiến hành phản ứng rRT-PCR

a) Tiến hành pha master mix

Áp dụng với Kít Qiagen one-step RT-PCR và Kít Invitrogen SS3 qRT-PCR.

Master mix được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít như sau:

Sau khi chuẩn bị xong master mix:

- Cho 20 μl master mix vào ống PCR.

- Cho 5 μl mẫu ARN vào ống PCR.

- Đặt ống PCR vào máy nhân gen real-time PCR machine (xem 4.11).

- Chạy chương trình.

- Chọn đọc màu ở bước kéo dài.

b) Chạy phản ứng

Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng được cài đặt trên máy nhân gen (xem 4.11) theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít sử dụng trong phản ứng. Đối với kít Qiagen one-step RT-PCR và Invitrogen superscript3 qRT- PCR, chu kỳ nhiệt cài đặt như sau:

B.3. Đánh giá kết quả

Kết quà chạy rRT - PCR được công nhận khi:

- Đối chứng dương tính cho giá trị Ct đã biết (± 2).

- Đối chứng âm tính không có Ct.

- Mẫu được coi là dương tính khi có Ct ≤ 35.

- Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct.

- Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35, trường hợp này phải xét nghiệm lại hoặc dùng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng định.

PHỤ LỤC C

(Quy định)

Phương pháp tạo và nuôi cấy tế bào sơ cấp đại thực bào phổi lợn PAM (Porcine alveolar macrophages)

C.1. Chuẩn bị

- Lợn con khỏe mạnh dưới 8 tuần tuổi, thuộc đàn miễn nhiễm với bệnh PRRS hoặc là lợn SPF.

- Dung dịch PBS pH 7,2 (xem phụ lục A) chứa 1 % dung dịch kháng khuẩn (xem phụ lục A).

- Dung dịch trypsin 0,25 % (pha loãng 2 lần Trypsin 0,5 % với PBS pH 7,2).

- Môi trường tế bào MEM và FCS.

- Dao, panh, kéo, chai thủy tinh vô trùng.

C.2. Tiến hành

- Mổ lợn, tiến hành lấy phổi lợn một cách vô trùng (chú ý không được làm rách phổi). Sau đó tiến hành các bước để thu hoạch tế bào PAM trong buồng cấy an toàn sinh học cấp 2 (xem 4.4).

- Rửa phổi lợn bằng cách đổ dung dịch PBS pH 7,2 có chứa 1 % dung dịch kháng khuẩn với lượng 200 ml/lần vào ống khí quản, dùng tay bóp nhẹ phổi để rửa. Sau đó dốc ngược phổi vào chai thủy tinh vô trùng để thu lại toàn bộ phần nước rửa phổi này.

- Tiến hành rửa phổi lợn 3 lần.

- Các lần rửa phổi phải được tiến hành cẩn thận và vô trùng.

- Sau 3 lần rửa phổi vô trùng sẽ thu hoạch được nước rửa phổi có chứa tế bào đại thực bào PAM trong chai thủy tinh vô trùng.

- Chuyển toàn bộ phần dung dịch rửa phổi có chứa tế bào thu được sang ống ly tâm 50 ml vô trùng, ly tâm ở gia tốc 1500g trong 10 min.

-Đổ bỏ phần nước trên, giữ lại phần tế bào sơ cấp PAM lắng ở đáy ống ly tâm, rửa và ly tâm 1 lần nữa với dung dịch PBS.

- Pha loãng tế bào với môi trường phát triển MEM có 10 % FCS (xem phụ lục A) và đếm tế bào để được lượng tế bào cần thiết tối thiểu là 4 x 10⁷ tế bào/1 ml.

- Chuẩn bị môi trường phát triển MEM có 10 % FCS (xem phụ lục A), chia vào các chai nuôi tế bào với lượng cần thiết (20 ml trên chai 75 cm², 10 ml trên chai 25 cm²). Sau đó dùng pipet chuyển dung dịch môi trường có chứa tế bào ở trên vào các chai với lượng 5ml trên chai 75 cm², 3 ml trên chai 25 cm².

- Đối với đĩa nuôi tế bào (đĩa 24 giếng hoặc 96 giếng) thi tế bào được pha loãng luôn với môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS, rồi chia vào các giếng với tỷ lệ theo quy định để đảm bảo tối thiểu có 5 x 10⁴ tế bào/ml. (Với đĩa 24 giếng là 1 ml/ giếng, với đĩa 96 giếng là 100 μl/giếng).

- Sau đó nuối ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO₂. Sau 1 ngày đến 2 ngày đổ bỏ môi trường cũ, rửa sạch thảm tế bào bằng dung dịch PBS, cho tiếp môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS mới vào nuôi tiếp. Khi tế bào mọc đạt từ 80 % đến 90 % thì có thể sử dụng.

C.3. Chuyển đời tế bào

- Hút bỏ môi trường phát triển cũ trong chai 75 cm², cho 20 ml dung dịch PBS vào để rửa sạch lớp tế bào sau đó hút bỏ dung dịch rửa này đi.

- Cho 5 ml dung dịch Trypsin 0,1 % vào và ủ ở 37 °C trong 2 min đến 5 min để tế bào bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ vào thành chai nuôi cấy để tế bào bong ra hết.

- Cho thêm 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS (xem phụ lục A) (huyết thanh trong môi trường phát triển tế bào sẽ vô hoạt trypsin), rồi hút toàn bộ dung dịch này sang ống ly tâm 50 ml.

- Ly tâm ở gia tốc 1500 g trong 5 min.

- Hút bỏ phần dịch nổi. Giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới. Cho tiếp 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS vào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút lên và hút xuống.

- Chia đều dung dịch chứa tế bào này sang các chai nuôi cấy có chứa môi trường phát triển tế bào MEM có 5 % FCS mới với lượng 5 x 10⁴ tế bào/ml. Ủ đĩa ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO₂, từ 5 ngày đến 7 ngày. Theo dõi tế bào phát triển hàng ngày và loại bỏ ngay những chai tế bào bị nhiễm khuẩn.

- Chuyển đời tế bào theo tỷ lệ 1:5. Lượng tế bào từ 1 chai 75 cm² đạt 100 % diện tích nuôi cấy có thể chuyển đời sang 5 chai 75 cm² khác.

- Nếu tế bào phát triển kém, hút bỏ môi trường phát triển tế bào cũ, rửa thảm tế bào bằng dung dịch đệm PBS rồi đưa môi trường phát triển tế bào mới vào.

C.4. Đông lạnh tế bào

- Hút bỏ môi trường cũ, thêm 20 ml dung dịch PBS để rửa lớp tế bào, sau đó hút bỏ dung dịch rửa này.

- Cho 5 ml dung dịch Trypsin 0,1 % vào và ủ ở 37 °C trong 2 min đến 5 min để tế bào bong ra khỏi bề mặt chai nuôi cấy. Có thể vỗ nhẹ vào thành chai nuôi cấy để tế bào bong ra.

- Cho thêm 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM 5 % FCS (xem phụ lục A) (huyết thanh trong môi trường phát triển tế bào sẽ vô hoạt trypsin), rồi hút toàn bộ dung dịch này sang ống ly tâm 50 ml.

- Ly tâm ở gia tốc 1500g trong 5 min.

- Đổ bỏ phần dung dịch nổi, hòa phần tế bào lắng cặn trong 4 ml môi trường cất giữ tế bào (xem phụ lục A) và dùng pipet trộn đều nhẹ bằng cách hút nhả nhiều lần (tránh bọt).

- Chuyển 4 ml dung dịch tế bào trên vào ống đông lạnh cryo (4,5 ml). Bọc ống đông lạnh trong bông vô trùng hoặc giấy vô trùng để làm chậm quá trình đông lạnh. Đặt ống đông lạnh vào tủ âm có nhiệt độ 50 °C đến -90 °C qua đêm, sau đó chuyển vào giữ ở nitơ lỏng.

C.5. Khôi phục tế bào

- Lấy ống tế bào được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ra và rã đông nhanh chóng bằng cách đặt vào nước ấm 35 °C đến 39 °C trong 1 min.

- Chuẩn bị chai nuôi tế bào 25 cm² với 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS (xem phụ lục A).

- Khi tế bào đã rã đông, nhanh chóng dùng pipet hút dung dịch tế bào sang ống ly tâm 15 ml và cho tiếp vào 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS, trộn đều bằng pipet hút lên, hút xuống nhẹ nhàng để tránh bọt.

- Ly tâm ở gia tốc 1500 g trong 5 min.

- Hút bỏ phần dịch nổi. Giữ lại phần tế bào lắng cặn ở dưới. Cho tiếp 2 ml môi trường phát triển tế bào MEM 10 % FCS vào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút lên và hút xuống.

- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào 25 cm² chứa 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM có 10 % FCS. Ủ ở tủ ấm 37 °C chứa 5 % CO₂.

- Qua một ngày, đổ bỏ môi trường cũ để loại nốt DMSO (Dimethylsulfoxide), rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường phát triển tế bào mới MEM có 5 % FCS vào. Ủ ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO₂ để tế báo phát triển.

PHỤ LỤC D

(Tham khảo)

Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PRRS

Hiện nay có rất nhiều các loại kít phát hiện kháng thể PRRS khác nhau được cung cấp trên thị trường nên khi sử dụng tuân theo quy trình của nhà sản xuất.

Nếu sử dụng bộ kit chẩn đoán PRRS-HERDCHECK X3 của IDEXX thì các bước tiến hành được thực hiện như sau:

- Bước 1: Chuẩn bị bộ kit: số mẫu huyết thanh cần kiểm tra (xem 5.2.3.1) + 02 đối chứng dương + 02 đối chứng âm.

- Bước 2: Pha loãng mẫu huyết thanh cần kiểm tra với tỷ lệ 1/40: 10 μl mẫu kiểm tra + 390 μl dung dịch pha loãng mẫu trong ống pha loãng. Sau đó chuyển 100 μl dung dịch mẫu kiểm tra đã pha loãng sang đĩa ELISA với sơ đồ bố trí mẫu tương ứng.

* Nhỏ 100 μl đối chứng âm và đối chứng dương (không pha loãng) vào đĩa ELISA theo vị trí bố trí.

- Bước 3: Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 min.

- Bước 4: Pha nước rửa đĩa 1X từ dung dịch rửa đĩa 10X có sẵn trong bộ kit với nước cất.

- Bước 5: Sau 30 min ủ đĩa, đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với lượng 300 μl/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X.

- Bước 6: Nhỏ 100 μl chất gắn kết (conjugate) vào tất cả các giếng. Ủ tiếp đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min.

- Bước 7: Sau đó đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với lượng 300 μl/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X.

- Bước 8: Nhỏ 100 μl cơ chất vào các giếng, ủ đĩa trong 15 min.

- Bước 9: Dừng phản ứng bằng cách cho 100 μl dung dịch stop vào các giếng.

- Bước 10: Đọc đĩa ở bước sóng 650 nm và tính kết quả.

Phản ứng được công nhận khi:

+ OD của đối chứng âm ≤ 0,15

+ OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm ≥ 0,15

S/P = (OD của mẫu - OD của đối chứng âm)/(OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm)

Đánh giá kết quả:

+ mẫu dương tính:         S/P không nhỏ hơn 0,4.

+ mẫu âm tính:              S/P nhỏ hơn 0,4.

Sơ đồ đĩa

CHÚ THÍCH: - ĐC (-): mẫu đối chứng âm.

- ĐC (+): mẫu đối chứng dương.

- S1, S2, S3,…,S80: mẫu huyết thanh cần kiểm tra số 1, số 2, số 3.... đến mẫu số 80.

PHỤ LỤC E

(Quy định)

Công thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí nghiệm (TCID₅₀) của Reed Muench

Công thức tính liều gây nhiễm 50 % tế bào thí nghiệm (TCID₅₀) của Reed Muench:

TCID₅₀ = 10^x

Với X được tính như sau:

Trong đó:

A là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm sát trên 50 %, tính bằng phần trăm (%).

B là tỷ lệ giếng tế bào nhiễm sát dưới 50 %, tính bằng phần trăm (%).

a là nồng độ pha loãng vi rút tại A (lấy giá trị số mũ),

b là nồng độ pha loãng vi rút tại B (lấy giá trị số mũ).

VÍ DỤ:

Trong 100 μl dung dịch pha loãng vi rút nhiễm vào mỗi giếng có:

Vậy TCID₅₀ là: 10^7,68/ 100l μl dung dịch pha loãng vi rút.

CHÚ THÍCH: Cách tính liều gây chết 50 % trứng thí nghiệm (EID₅₀) hay liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm (LD₅₀) cũng tương tự như trên.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] O.I.E., 2010, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Porcine Reproductive and Respiratory syndrome, chapter 2.8.7.

[2] Bộ Nông nghiệp và PTNT - Viện Thú y Quốc gia - Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản JICA (2002). Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp. Trong Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam (trang 102-103).