Tiêu chuẩn TCVN 13290:2021 Sữa công thức cho trẻ sơ sinh - Xác định whey protein HPLC

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13290:2021

SỮA CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH - XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN WHEY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Milk-based infant formula - Determination of whey protein fraction by high performance liquid chromatoghraphic (HPLC) method

Lời nói đầu

TCVN 13290:2021 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2012.07 Calculation of whey protein fraction in milk-based infant formula. Amino acid profile/ratio;

TCVN 13290:2021 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH - XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN WHEY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Milk-based infant formula - Determination of whey protein fraction by high performance liquid chromatoghraphic (HPLC) method

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định các thành phần whey protein trong sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh, có chứa whey nguyên trạng hoặc đã thủy phân một phần.

2 Nguyên tắc

Mỗi loại protein (casein và whey) đều có các thành phần axit amin đặc trưng tạo nên, do đó, tổng hàm lượng của mọi axit amin trong một hỗn hợp có thể được biểu thị theo hàm tuyến tính đơn giản của phân số (hoặc phần trăm) tổng protein tính theo casein hoặc whey. Từ các giá trị tham chiếu đặc trưng đối với hàm lượng axit amin trong whey và casein tương ứng, có thể tính phần protein trong hỗn hợp của cả hai từ tổng hàm lượng của mọi axit amin riêng rẽ đã xác định bằng thực nghiệm.

3 Thuốc thử và vật liệu thử

3.1 Yêu cầu chung

Sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích. Nước sử dụng phải là nước cất có độ dẫn điện > 18 000 Ω hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

Các chất chuẩn có thể sử dụng theo Dược điển Mỹ (USP). Thực hiện theo hướng dẫn trên nhãn từ nhà cung cấp để đảm bảo các điều kiện bảo quản và hạn sử dụng.

Bảo quản tất cả các thuốc thử ở nhiệt độ phòng trừ khi có yêu cầu khác. Thời hạn sử dụng của các thuốc thử không quá 2 năm.

3.2 L-Norleucin, ví dụ: Sigma N6877 ¹⁾ .

3.3 Dung dịch axit clohydric (HCl), 6 N, đã được chưng cất lại.

3.4 Dung dịch đệm và dung dịch Pickering, xem Bảng 1 và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất để bảo quản và sử dụng.

Bảng 1 - Dung dịch đệm và dung dịch Pickering

3.5 Thuốc thử Pickering TRIONE ninhydrin

Thuốc thử TRIONE ninhydrin làm việc được chuẩn bị bằng cách rót cẩn thận 330 mL thuốc thử ninhydrin/hydrindantin từ chai nhỏ vào chai lớn hơn có chứa 570 mL đệm liti axetat. Thổi phần trống phía trên của thuốc thử kết hợp thổi khí nitơ và xoay chai đựng để trộn. Giảm van áp suất trên đỉnh bể chứa thuốc thử phản ứng, tháo nắp và đổ hỗn hợp thuốc thử ninhydrin vào bể chứa. Đậy nắp và thổi khí nitơ trong vài phút để đẩy không khí ra khỏi bể chứa. Xoay bể chứa để thuốc thử dính trên thành rơi xuống dưới, sau đó đóng van để tạo áp lực trong bể chứa khoảng từ 45 psi đến 75 psi ²⁾ .

Thuốc thử TRIONE ninhydrin khi được bảo quản bằng khí trơ ở nhiệt độ phòng có thể bền trong 3 tháng sau khi trộn. Có thể bổ sung nhiều hơn phần hỗn hợp thuốc thử ninhydrin vào lượng còn lại trong bể chứa trước khi bắt đầu chạy. Trong quá trình thử không bổ sung thuốc thử vì phản ứng sẽ thay đổi.

3.6 Dung dịch natri xitrat, 0,584 M

Cân chính xác 42,94 g ± 0,03 g natri xitrat ngậm hai phân tử nước (độ tinh khiết đạt chuẩn của Hiệp hội hóa chất Mỹ - ACS, ví dụ Mallinckrodt Chemicals 0754-12 ¹⁾ ) cho vào bình định mức 250 mL và thêm khoảng 200 mL nước. Xoay bình cho đến khi hòa tan và thêm nước đến vạch. Lắc đều.

Khi bảo quản ở nhiệt độ phòng dung dịch có thể bền đến 2 tháng.

3.7 Dung dịch nội chuẩn norleucin, 12,5 μmol/mL

Cân chính xác 1,640 g ± 0,004 g L-norleucin và cẩn thận cho vào bình định mức 1 L. Thêm khoảng 400 mL nước, xoay bình cho đến khi hòa tan và thêm nước đến vạch. Chuyển sang các lọ riêng rẽ để bảo quản. Có thể thay đổi tổng thể tích bằng cách duy trì cùng tỷ lệ khối lượng/thể tích (0,4099 g/250 mL).

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị ở điều kiện đông lạnh để sử dụng trong 1 năm.

3.8 Dung dịch chuẩn axit amin, nồng độ 0,5 μmol/mL đối với tất cả axit amin

Sử dụng các lượng cân trong Bảng 2, chính xác đến ± 10 % và chuyển vào bình định mức 500 mL. Ghi lại khối lượng thực tế. Nhập số liệu độ tinh khiết, khối lượng đã hiệu chính đối với mỗi axit amin vào bảng hiệu chuẩn phương pháp phân tích. Thêm khoảng 300 mL dung dịch đệm pha loãng mẫu. Khuấy hoặc rung siêu âm đến khi các axit amin tan hết, thêm dung dịch đệm pha loãng đến vạch và lắc đều. Chuyển dung dịch chuẩn này sang 50 lọ đến 60 lọ với lượng bằng nửa dung tích của lọ, hàn kín để bảo quản. Cho phần dung dịch còn lại vào chai nhựa để lưu trữ.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị ở điều kiện đông lạnh để sử dụng trong 1 năm.

Bảng 2 - Lượng cân axit amin sử dụng để chuẩn bị dung dịch chuẩn

3.9 Khí nitơ, đã tinh sạch trước.

3.10 Khí oxy, loại dùng cho công nghiệp hoặc có chất lượng tốt hơn.

3.11 Nguồn khí tự nhiên.

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Cân phân tích, có độ chính xác ± 0,001 g.

4.2 Thuyền cân và giấy cân.

4.3 Ampul, bằng thủy tinh, dung tích 20 mL.

4.4 Máy lửa, loại sử dụng khí oxy, hai ngọn lửa.

4.5 Lò, có thể duy trì nhiệt độ ở 110 °C ± 1 °C.

4.6 Tủ lạnh.

4.7 Tủ đông lạnh.

4.8 Dũa ba cạnh.

4.9 Chai phân phối, dung tích 20 mL và 23 mL.

4.10 Pipet, dung tích 2 mL, 4 mL và 5 mL hoặc pipet tự động.

4.11 Pipet điện tử, dung tích 20 μl.

4.12 Xyranh nhựa dùng một lần, dung tích 5 mL.

4.13 Xyranh có màng lọc, cỡ lỗ 0,45 μm.

4.14 Bình định mức, dung tích 250 mL, 500 mL, 1 L.

4.15 Ống đong thủy tinh có chia vạch, dung tích 50 mL.

4.16 Lọ thủy tinh thiêu kết, dung tích 20 mL.

4.17 Bộ khuấy từ và thanh khuấy từ.

4.18 Lọ lấy mẫu tự động.

4.19 Cốc nhựa có mỏ, dung tích 50 mL.

4.20 Ống ly tâm, dung tích 15 mL.

4.21 Hệ thống HPLC, ví dụ: Agilent Model 1100, kèm với hệ bơm 4 kênh có kit phản ứng sau cột, bộ lấy mẫu tự động có điều nhiệt, detector PDA, phần mềm xử lý số liệu.

4.22 Bộ phận tạo dẫn xuất sau cột, ví dụ: Pickering Model PCX5200 để sử dụng thuốc thử TRIONE Ninhydrin.

4.23 Buồng cột HPLC có điều nhiệt.

4.24 Cột phân tích, trao đổi cation natri, kích thước 4,0 mm × 150 mm.

4.25 Cột bảo vệ, kích thước 3,0 mm × 20 mm (ví dụ: Pickering; Part No. 1193020 ³⁾ ).

5 Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Tham khảo các tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm. Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm, việc lấy mẫu theo thỏa thuận giữa các bên liên quan.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

6 Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu thử

6.1.1 Đối với mẫu dạng bột và dạng lỏng đậm đặc

Cân mẫu (tương đương khoảng 250 mg protein) cho vào cốc nhựa 50 mL (4.19) (ghi lại khối lượng mẫu đến 4 chữ số có nghĩa) và thêm 10 mL norleucin (3.2). Thêm nước đến tổng thể tích 25 mL và xoay cốc cho đến khi hòa tan (tối thiểu 15 min). Chuyển 2 mL dịch sang ampul thủy tinh 20 mL (4.3).

6.1.2 Đối với mẫu dạng lỏng dùng ngay

Cân mẫu (chứa tương đương khoảng 20 mg protein) và thêm 0,8 mL norleucin (3.2) trực tiếp vào ampul 20 mL (4.3) (ghi lại khối lượng mẫu đến 4 chữ số có nghĩa).

6.2 Thủy phân mẫu

Cài đặt nhiệt độ của lò ở 110 °C ± 1 °C.

Sử dụng pipet dùng một lần bổ sung 8 mL dung dịch HCl 6 N (3.3) vào ampul chứa dung dịch thử (6.1).

Thổi ampul bằng khí nitơ (3.9) trong thời gian ít nhất 3 min. Loại bỏ dòng khí nitơ, đóng nắp ngay và hàn kín ampul bằng máy lửa khí oxy (4.4).

Đặt ampul đã hàn kín vào lò (4.5) ở 110 °C ± 1 °C trong 22 h ± 0,25 h.

Lấy ampul ra và để nguội đến nhiệt độ phòng.

6.3 Pha loãng, lọc và trung hòa

Dùng miếng vải sạch bọc đầu ampul và bẻ, cẩn thận để không làm vỡ phần cổ. Nếu cần, dùng dũa ba cạnh (4.8) mài cổ ampul trước khi bẻ.

Chuyển lượng chứa trong ampul vào ống ly tâm 15 mL (4.20) và thêm nước đến tổng thể tích 12 mL.

Lấy ít nhất 4 mL đến 5 mL dịch thủy phân đã pha loãng vào xyranh có màng lọc cỡ lỗ 0,45 μm (4.13), lọc vào vật chứa có dung tích thích hợp.

Dùng pipet (4.10) hoặc xyranh (4.12), thêm 5,0 mL dung dịch đệm natri xitrat 0,584 M (3.6) vào lọ thủy tinh thiêu kết (4.16). Lặp lại với nhiều mẫu để trung hòa. Thêm 2,0 mL từng mẫu đã lọc vào các lọ thủy tinh thiêu kết riêng chứa dung dịch đệm natri xitrat (có thể thay đổi thể tích nhưng vẫn duy trì tỷ lệ, nghĩa là 2,5 mL dung dịch natri xitrat cho 1 mL dung dịch mẫu). Đậy nắp lọ và xoay lọ để trộn đều. Chuyển mẫu vào lọ lấy mẫu tự động (4.18).

CHÚ THÍCH: Nếu mẫu không được phân tích ngay, thì dán nhãn lọ thủy tinh thiêu kết và bảo quản đông lạnh. Mẫu bảo quản ở điều kiện này có thể bền đến 6 tuần.

6.4 Xác định

6.4.1 Điều kiện vận hành HPLC

Các điều kiện vận hành HPLC sau đây được cho là thích hợp:

- Thể tích mẫu bơm: 10 μl

- Nhiệt độ bộ phản ứng pickering: 130 °C

- Cài đặt detector: thời gian phân tích 52,0 min.

Thu lấy tất cả các tín hiệu tại bước sóng 570 nm trừ prolin nền tại bước sóng 700 nm. Chương trình gradient bước sóng theo Bảng 3.

Bảng 3 - Chương trình gradient bước sóng

- Bơm: 4 kênh;

- Tốc độ dòng: 0,38 mL/min;

- Thời gian dừng: 70 pmin.

Chương trình phân tích theo Bảng 4.

Bảng 4 - Chương trình phân tích

Chương trình nhiệt độ của lò cột theo Bảng 5.

Bảng 5 - Chương trình nhiệt độ của lò cột

6.4.2 Dựng đường chuẩn

Sau khi thiết bị đã ổn định, tiến hành phân tích lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc axit amin (3.8) trên hệ thống HPLC.

Khi bắt đầu chạy, bơm các dung dịch chuẩn làm việc lặp lại hai lần. Bỏ qua lần bơm đầu tiên cho mục đích hiệu chuẩn. Đối với trình tự bơm, cứ sau tám lần bơm mẫu thì bơm dung dịch chuẩn axit amin.

Hiệu chuẩn lại phương pháp phân tích bởi trung bình các lần bơm dung dịch chuẩn sau tám dung dịch mẫu thử.

Trước khi bắt đầu trình tự bơm, thổi cột trong thời gian từ 5 min đến 6 min bằng natri tái sinh. Trả lại hệ thống đến 100 % Na 1700 - 1200.

Xác định độ hấp thụ, dựng đường chuẩn dựa vào độ hấp thụ quang và nồng độ dung dịch chuẩn làm việc tương ứng, với R ² ≥ 0,995.

6.4.3 Phân tích mẫu thử

Mẫu thử được tiến hành tương tự như đối với các dung dịch chuẩn.

7 Tính kết quả

7.1 Hàm lượng từng axit amin đơn lẻ

Hàm lượng từng axit amin đơn lẻ trong phần mẫu thử, AA, được biểu thị bằng gam trên 100 gam (g/100g), tính theo Công thức (1):

Trong đó:

Trong đó:

7.2 Hàm lượng whey

Tổng hàm lượng của các axit amin trong hỗn hợp của whey và casein, AA _{T ,} được tính theo Công thức (3) hoặc Công thức (4):

Trong đó:

ƒ _w là tỷ lệ phần protein có nguồn gốc từ whey;

AA _w và AA _C lần lượt là hàm lượng của các axit amin trong hỗn hợp của whey và casein.

Tỷ lệ tổng quát Q của tổng axit amin được xác định theo Công thức (5):

Trong đó:

N là nồng độ của các thành phần tử số, trong đó có n thành phần;

D là nồng độ của các thành phần mẫu số, trong đó có d thành phần.

Thay thế hàm lượng mỗi axit amin từ Công thức (3) hoặc Công thức (4) vào Công thức (5):

hoặc tính được ƒ _w theo Công thức (7):

Các hằng số tương ứng với Công thức (6) và Công thức (7) là:

Trong tiêu chuẩn này sử dụng dữ liệu cho năm axit amin (từ kết quả của bốn thực nghiệm) để xác định hàm lượng whey, X _w , tính theo % protein, theo Công thức (12):

B _T , A _T , P _T và F _T là các kết quả thực nghiệm xác định cho tổng axit aspartic (Asx), alanin (Ala), prolin (Pro) và phenylalanin (Phe) tương ứng (tỷ lệ BAPF), sau quá trình thủy phân bằng axit (xem 6.2). Các hằng số được tính theo Công thức (8) đến Công thức (11) từ dữ liệu về lấy mẫu các thành phần whey và casein, trong đó có sản phẩm thủy phân whey (Bảng 6).

Bảng 6 - Dữ liệu axit amin và tỷ số giữa thành phần whey và casein ^{a , b}

8 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.