Tiêu chuẩn TCVN 13299:2021 Sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh - Xác định hàm lượng whey protein bằng điện di mao quản

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13299:2021

SỮA CÔNG THỨC DẠNG BỘT DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG WHEY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Milk-based infant formula powders - Determination of whey protein content by capillary electrophoresis method

Lời nói đầu

TCVN 13299:2021 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2016.15 Quantification of whey protein content in milk-based infant formula powders. Sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis (SDS-CGE) method;

TCVN 13299:2021 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA CÔNG THỨC DẠNG BỘT DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG WHEY PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Milk-based infant formula powders - Determination of whey protein content by capillary electrophoresis method

CẢNH BÁO: Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng whey protein trong sữa công thức dạng bột dành cho trẻ sơ sinh bằng phương pháp điện di mao quản.

Tiêu chuẩn này có thể xác định được tỷ lệ giữa whey protein với casein trong khoảng từ 20 : 80 đến 80 : 20.

Tiêu chuẩn này không sử dụng để phân tích protein thủy phân hoặc protein thực vật trong các sản phẩm sữa công thức cho trẻ sơ sinh.

2 Nguyên tắc

Các protein trong mẫu bị biến tính bởi chất hoạt động bề mặt anion SDS và được khử bằng β-mercaptoethanol. Các protein tích điện liên kết với SDS di chuyển trong điện trường chứa đầy gel phân tách và được phát hiện bằng detector UV ở bước sóng 220 nm. Casein và whey protein được tách ra thành hai nhóm khác nhau, không chồng pic, tỷ lệ được tính dựa trên diện tích pic tích phân mà không cần đường chuẩn. Hệ số hiệu chỉnh khối lượng trên diện tích (CF) là 1,4 được sử dụng cho whey protein so với casein trong phép tính hàm lượng whey protein.

3 Thuốc thử và vật liệu thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, nước được sử dụng là nước cất hai lần đã loại ion hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Đệm gel natri dodecyl sulfat-khối lượng phân tử (SDS-MW), ví dụ: Part No. A30341 của Beckman Coulter, Inc 1).

3.2  Đệm mẫu SDS-MW, 100 mM Tris-HCl, pH 9,0; với SDS 1 %, ví dụ: Part No. 390953 của Beckman Coulter, Inc ¹⁾.

3.3  Dung dịch SDS-MW kích thước tiêu chuẩn (10 kDa đến 225 kDa, 16 mg/ml) ¹⁾.

3.4  Dung dịch nội chuẩn protein, 10 kDa, ví dụ: Part No. A26487 của Beckman Coulter, Inc ¹⁾.

3.5  Dung dịch rửa axit, HCl 0,1 M.

3.6  Dung dịch rửa kiềm, NaOH 0,1 M.

3.7  β-mercaptoetanol.

LƯU Ý - Thao tác rót dung môi β-mercaptoethanol phải thực hiện trong tủ hút hiệu quả.

4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Thiết bị điện di mao quản Proteome Lab PA 800 Plus ¹⁾ hoặc thiết bị tương đương, được trang bị detector UV cài đặt ở bước sóng 220 nm.

Diện tích pic có thể được tích phân bằng phần mềm phù hợp bất kỳ.

4.2  Bộ phân tích nhanh SDS-MW, ví dụ: Model 338451 của Beckman Coulter, Inc ¹⁾, bao gồm mao mạch trần (bar), cột mao quản silica nung chảy (đường kính trong 50 μm, dài 30 cm).

4.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,0001 g.

4.4  Nồi cách thủy, có thể kiểm soát nhiệt độ ở 100 °C ± 5 °C.

4.5  Máy ly tâm micro, dùng cho lọ dung tích 1,5 ml.

4.6 Máy trộn Vortex.

4.7  Pipet, dung tích 20 μl, 100 μl và 1000 μl.

4.8 Lọ ly tâm, có nắp đậy kín, dung tích 2,0 ml.

4.9  Ống ly tâm, đáy tròn, dung tích 10 ml.

5 Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu. Tham khảo các tiêu chuẩn cụ thể về lấy mẫu sản phẩm. Trong trường hợp chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm, việc lấy mẫu theo thỏa thuận giữa các bên liên quan.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

6 Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị các dung dịch đệm và dung dịch mẫu

6.1.1  Nạp thuốc thử vào hệ thống đầu vào (trái) và đầu ra (phải) sử dụng 6 x 6 khay đệm được sắp xếp theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị hoặc tham khảo trong Phụ lục A (cấu hình khay đệm).

6.1.2  Dùng cân (4.3) cân khoảng 135 mg ± 5 mg sữa bột đã tách chất béo (hàm lượng protein khoảng 37 %) hoặc 500 mg ± 20 mg thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh dạng bột (hàm lượng protein khoảng 11 %) cho vào ống ly tâm 10 ml (4.9).

6.1.3  Pha loãng mẫu đến 5 ml bằng nước đã loại ion. Trộn từng ống trên máy trộn Vortex (4.6) cho đến khi dung dịch đồng nhất. Mỗi dung dịch cuối chứa từ 10 mg/ml đến 15 mg/ml protein.

6.1.4  Chuẩn bị mẫu rửa giải sơ bộ bằng cách trộn 1 % dung dịch natri dodecyl sulfat (SDS) (3.3) với dung dịch nội chuẩn protein 10 kDa (3.4) tỷ lệ 84:1. Tổng thể tích dung dịch rửa giải sơ bộ được dựa trên tổng lượng mẫu được phân tích trong bộ mẫu (90 μl/mẫu).

6.1.5  Dùng pipet (4.7) lấy 10 μl của dung dịch mẫu vào các lọ ly tâm 2,0 ml (4.8) riêng rẽ.

6.1.6  Lần lượt thêm 85 μl mẫu rửa giải sơ bộ và 5 μl β-mercaptoetanol (3.7) vào từng lọ của máy ly tâm (4.5). Trộn kỹ trước khi đun nóng các lọ trong nồi cách thủy (4.4) ở 100 °C ± 5 °C trong 10 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 min ở vận tốc khoảng 7 000 r/min (gia tốc 5000 g).

6.1.7  Trộn trên máy trộn Vortex (4.6) trước khi chuyển từng mẫu vào lọ bơm mẫu tương ứng.

6.2 Xác định

6.2.1  Cài đặt phương pháp tách tối ưu để phân tích mẻ mẫu, bao gồm một mẫu trắng dung dịch đệm (10 μl nước), dung dịch SDS-MW kích thước tiêu chuẩn (3.3) và mẫu sữa bột đã tách chất béo.

6.2.2  Đối với mỗi chu trình tách (45 min), trước tiên hoạt hóa mao quản bằng dung dịch rửa kiềm (3.6) trong 3 min, tiếp theo là dung dịch rửa axit (3.5) trong 1 min, bằng nước trong 1 min và dung dịch đệm gel SDS (3.1) trong 10 min. Thiết lập chương trình tách trong 30 min.

6.2.3  Điện di mẫu ở điện thế -5 kV trong 20 s.

6.2.4  Thực hiện điện di ở điện thế không đổi với cường độ điện trường -497 V/cm và mao quản được giữ nhiệt ở 25°C bằng dịch làm mát tuần hoàn.

6.2.5  Dòng điện được tạo ra phải xấp xỉ 27 μA.

6.2.6  Thông thường một vial thuốc thử chỉ thực hiện cho 8 lần phân tích, nên cần tăng lượng lọ nhỏ thuốc thử khi có nhiều mẫu phân tích.

6.2.7  Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống thử nghiệm bằng cách sử dụng chất đánh dấu MW là dung dịch SDS-MW kích thước tiêu chuẩn (3.3). Tiêu chí chấp nhận đối với sự phù hợp của hệ thống như sau:

a) Thời gian di chuyển của dung dịch chuẩn nội là 12,3 min ± 0,5 min khi sử dụng thiết bị và mao quản (4.1 và 4.2).

Nếu sử dụng mao quản hoặc thiết bị tương đương thì xác định thời gian di chuyển của dung dịch nội chuẩn tương ứng. Mô hình di chuyển và thời gian di chuyển của bảy chất đánh dấu MW trong dung dịch SDS-MW kích thước tiêu chuẩn (3.3) (tương ứng với loại 10, 20, 35, 50, 100, 150 và 225 kDa) phải hoàn toàn tách biệt trong vòng 30 min sử dụng phương pháp này hoặc khi sử dụng thiết bị tương đương (xem Phụ lục B).

b) Tiêu chí chấp nhận cho chu trình tách

Thời gian di chuyển của dung dịch nội chuẩn phải là 12,3 min ± 0,5 min (nếu sử dụng thiết bị tương đương thì thời gian di chuyển phải được xác định trước). Chênh lệch chiều cao của đỉnh pic nội chuẩn đến điểm uốn giữa pic của chuỗi miễn dịch giàu globulin (Ig H) và pic của albumin huyết thanh bò (BSA) không được vượt quá 25 % chiều cao của dung dịch nội chuẩn trong mẫu.

6.2.8  Tích hợp các electropherogram (eGram)

Tích hợp eGram của cả sữa bột đã tách chất béo (Phụ lục B, hình B.2) và sản phẩm thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh (Phụ lục B, hình B.3) bằng cách thiết lập đường nền từ 0,4 min trước pic nội chuẩn đến điểm uốn giữa đầu pic K-casein và pic của Ig H và BSA (không có pic âm nào được tạo ra bởi sự tích hợp); thực hiện tích hợp thủ công từ pic của Ig H và BSA đến pic cuối cùng trong eGram (tích hợp tất cả các pic sau pic Ig H và BSA).

Tham khảo Phụ lục B, hình B.1 đối với việc tách protein kích thước chuẩn MW.

6.2.9  Xác định vùng casein

Đối với sữa bột đã tách chất béo, cài đặt thời gian bắt đầu tích phân casein ngay trước pic β-casein (khoảng 3,1 min sau pic của nội chuẩn 10 kDa). Đối với sản phẩm thức ăn công thức cho trẻ sơ sinh, xác định pic của β-casein theo eGram của sữa bột đã tách chất béo và cài đặt thời gian bắt đầu tích phân casein ngay trước pic này. Đối với tất cả các mẫu, cài đặt thời gian kết thúc giữa điểm uốn cuối của-pic K-casein, pic Ig H và BSA (khoảng 7,0 min sau dung dịch nội chuẩn 10 kDa).

Tách tổng các pic ở ba vùng: hai vùng ở mỗi đầu của eGram (các whey protein MW thấp hơn và MW cao hơn) và một vùng giữa. Vùng giữa tương ứng với các protein casein (A_cn), và hai vùng còn lại được gộp lại để thu được các whey protein (A_w).

7 Tính kết quả

Hàm lượng whey protein, W, biểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính được bằng Công thức (1):

Trong đó

A_w là tổng diện tích của các thành phần whey;

A_cn là diện tích của các thành phần casein;

A_w.c là diện tích của các thành phần whey đã hiệu chính, tính được bằng Công thức (2);

Trong đó: 1,4 là hệ số chuyển đổi, có tính đến chênh lệch giữa tỷ lệ khối lượng và diện tích của whey và casein.

CHÚ THÍCH  Các pic trong eGram có thể dịch chuyển dần dần từ đầu đến cuối quá trình chạy. Pic nội chuẩn được sử dụng để hiệu chỉnh thời gian di chuyển cho tất cả pic trên các đỉnh trong eGram.

8 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Cấu hình khay đệm (đối với thiết bị Beckman)

Hình A.1 - Cấu hình khay đệm (đối với thiết bị Beckman)

Phụ lục B

(Tham khảo)

Ví dụ về sắc ký đồ

Hình B.1 - Tách protein kích thước chuẩn MW

Hình B.2 - eGram của sữa bột đã tách chất béo

Hình B.3 - eGram của bột sữa công thức cho trẻ sơ sinh

Phụ lục C

(Tham khảo)

Kết quả thử liên phòng thử nghiệm

Bảng C.1 - Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với hàm lượng whey protein trong mẫu sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh