Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7082-2:2002 Sữa và sản phẩm sữa - Dư lượng hợp chất clo hữu cơ (thuốc trừ sâu)

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 7082-2:2002

SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HỢP CHẤT CLO HỮU CƠ (THUỐC TRỪ SÂU) - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP LÀM SẠCH DỊCH CHIẾT THÔ VÀ THỬ KHẲNG ĐỊNH

Milk and milk products – Determination of residues of organochlorine compounds (pesticides) - Part 2: Test methods for crude extract purification and confirmation

Lời nói đầu

TCVN 7082 - 2 : 2002 hoàn toàn tương đương với ISO 3890 - 2 : 2000;

TCVN 7082 - 2 : 2002 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.

Cảnh báo – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các chất liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp thử cho quá trình làm sạch dịch chiết thô thu được bằng phương pháp chung đã được quy định trong TCVN 7082 – 1 : 2002 (ISO 3890-1). Tiêu chuẩn này cũng quy định những phương pháp thử khuyến nghị khác để xác định dư lượng các hợp chất clo hữu cơ trong sữa và các sản phẩm sữa cùng với các phép thử khẳng định và các quy trình làm sạch.

2. Tiêu chuẩn viện dẫn

TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1:2000) Sữa và sản phẩm sữa – Xác định dư lượng các hợp chất clo hữu cơ (thuốc trừ sâu) – Phần 1: Các xem xét chung và phương pháp chiết.

3. Phương pháp A: Tách pha lỏng – lỏng bằng axetonitril và làm sạch trên cột Florisil (xem tài liệu tham khảo [3]).

3.1. Nguyên tắc

Các hợp chất clo hữu cơ cùng với chất béo được chiết ra khỏi mẫu bằng một trong các quy trình mô tả trong TCVN 7082 – 1 : 2002 (ISO 3890-1). Dịch chiết được cô đến gần khô, rồi hòa tan lại trong dầu nhẹ và các hợp chất clo hữu cơ được tách ra bằng axetonitril. Sau khi trộn axetonitril với một lượng nước dư, các hợp chất clo hữu cơ được tách trong dầu nhẹ. Pha hữu cơ này được làm sạch bằng sắc ký trên cột Florisil sử dụng dầu nhẹ/dietyl ete làm dung môi rửa giải. Chất rửa giải được cô rồi được kiểm tra bằng sắc ký khí lỏng (GLC).

Có phương pháp riêng quy định cho phomat.

3.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

3.2.1. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40⁰C đến 60⁰C.

Chưng cất trên các viên kali hidroxit hoặc natri hidroxit.

3.2.2. Axetonitril (CH₃CN), bão hòa với dầu nhẹ.

Trộn 4 lít axetonitril với 1 ml axit octophosphoric và 30 g phospho pentoxit trong bình thủy tinh đáy tròn để làm sạch. Bổ sung các viên bi thủy tinh và chưng cất ở nhiệt độ từ 81⁰C đến 82⁰C. Không được để nhiệt độ vượt quá 82⁰C.

Trộn axetonitril đã làm sạch với dầu nhẹ cho đến khi bắt đầu xuất hiện tách pha.

3.2.3. Dietyl ete (C₂H₅OC₂H₅), không chứa peroxit

Chưng cất và ổn định bằng etanol (C₂H₅CO) tinh khiết với một lượng bằng 2,0% thể tích của nó.

3.2.4. Dung môi rửa giải A: hỗn hợp của dietyl ete (3.2.3) và dầu nhẹ (3.2.1) (tỷ lệ 6:94 theo thể tích).

Cho chảy qua 10 g đến 25 g natri sunfat khan (3.2.6) để loại nước.

3.2.5. Dung môi rửa giải B: hỗn hợp của dietyl ete (3.2.3) và dầu nhẹ (3.2.1) (tỷ lệ 15 : 85 tính theo thể tích).

Cho chảy qua 10 g đến 25 g natri sunfat khan (3.2.6) để loại nước.

3.2.6. Natri sunfat (Na₂SO₄), khan, dạng hạt

Nung ở nhiệt độ 500⁰C ± 25⁰C trong 4h. Để nguội và bảo quản trong chai đậy nắp.

3.2.7. Chất hấp phụ: Florisil (Floridin Co^[1])), cỡ từ 60 mesh đến 100 mesh.

Hoạt hóa bằng cách nung ở nhiệt độ 650⁰C ± 25⁰C trong 4h rót ngay chất hấp phụ này vào các chai có nắp kín và bảo quản nơi tốt. Trước khi sử dụng, sấy ở 130⁰C ít nhất trong 5h.

Nên bảo quản chất hấp phụ này ở 130⁰C ± 2⁰C hoặc trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng. Nếu bảo quản trong bình hút ẩm thì cứ 2 ngày lại sấy ở 130⁰C ± 2⁰C.

Thỉnh thoảng kiểm tra từng mẻ chất hấp phụ như sau:

Cho 1 ml dung dịch hexan tiêu chuẩn chứa 0,1 mg/l lindan, heptaclo epoxit, aldrin và diedrin và 0,3mg/l endrin đi qua cột hấp phụ [Xem TCVN 7082-1 (ISO 3890-1:2000), 9.3]. Rửa giải và cô đặc như mô tả trong 3.4.3. Xác định bằng sắc ký khí.

Chất hấp phụ được coi là thỏa mãn nếu lindan, heptaclo, aldrin và heptaclo epoxit được tìm thấy trong dung môi rửa giải A (3.2.4), dieldrin và endrin được tìm thấy trong dung môi rửa giải B (3.2.5).

3.2.8. Natri clorua (NaCl), dung dịch 2%.

Nung natri clorua rắn ở 500⁰C ± 25⁰C trong 4h trước khi tạo dung dịch.

3.2.9. Etanol (C₂H₅OH), tinh khiết.

3.2.10. Natri oxalat (Na₂C₂O₄) hoặc kali oxalat (K₂C₂O₄).

3.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

3.3.1. Cột sắc ký, có đường kính trong 20 mm và dài 300 mm, có van khóa bằng PTFE và các đĩa thủy tinh chịu nhiệt hoặc nút bông thủy tinh.

3.3.2. Bộ cô quay chân không (Kuderma – Danish ^[2]) hoặc loại tương đương), có bình cầu dung tích 500 ml và được gắn với một ống chia độ.

3.3.3. Bộ trộn tốc độ cao.

3.3.4. Phễu chiết, dung tích 125 ml đến 1000 ml.

3.4. Cách tiến hành

3.4.1. Chiết chất béo và hợp chất clo hữu cơ

3.4.1.1. Phương pháp chung

Xem TCVN 7082 – 1 (ISO 3890-1, phụ lục A).

3.4.1.2. Phương pháp riêng dành cho phomat

Cho đủ một lượng mẫu đã nghiền nhỏ (để có được 3g chất béo), khoảng 2g natri hoặc kali oxalat (3.2.10) và 100 ml etanol (3.2.9) vào bình trộn tốc độ cao (3.3.3) và trộn trong 2 phút đến 3 phút (Theo kinh nghiệm, với sản phẩm khi trộn tạo nhũ tương nếu không phá được bằng ly tâm, thì trước khi trộn cứ 2g mẫu cho thêm 1ml nước). Rót dung dịch nhão đã đồng hóa vào bình ly tâm 500 ml, thêm 50 ml dietyl ete (3.2.3), rồi lắc mạnh trong 1 phút. Thêm 50 ml dầu nhẹ (3.2.1) và lắc mạnh trong 1 phút đến 2 phút (hoặc chia thành hai bình 250 ml và chiết mỗi bình 25 ml dầu nhẹ bằng cách lắc lạnh trong 1 phút đến 2 phút). Tiến hành tiếp theo TCVN 7082-1 (ISO 3890-1 : 2000, A.6.3.3).

3.4.2. Tách pha lỏng – lỏng

Cân từ 1 g đến 3 g, chính xác đến 0,01g, chất béo chiết được, cho vào phễu chiết (3.3.4) và hòa tan trong 15 ml dầu nhẹ (3.2.1). Thêm 30 ml axetonitril đã bão hòa bằng dầu nhẹ (3.2.2) và lắc mạnh từ 1 phút đến 2 phút. Sau khi tách pha, cho lớp axetonitril phía dưới chảy sang phễu chiết 1000 ml (3.3.4) chứa 700 ml dung dịch natri clorua (3.2.8) và 100 ml dầu nhẹ (3.2.1). Lắc mạnh lớp dầu nhẹ còn lại trong phễu chiết 125 ml ba lần với các phần 30 ml axetonitril (3.2.2).

Gộp các dịch chiết bằng axetonitril vào phễu chiết 1000 ml rồi lắc cẩn thận. Tháo pha dưới, cho chất lỏng chảy vào phễu chiết 1000 ml thứ hai và lắc trong 12 giây với 100 ml dầu nhẹ. Gộp các pha của dầu nhẹ thu được từ hai phễu chiết 1000 ml. Làm sạch hai lần mỗi lần bằng 100 ml hoặc dung dịch natri clorua (3.2.8). Loại nước bằng natri sunfat (3.2.6) và lọc vào bộ cô quay chân không (3.3.2) được gắn với ống chia độ. Rửa natri sunfat ba lần, mỗi lần bằng 10 ml dầu nhẹ (3.2.1). Sau đó sử dụng bộ cô quay chân không (3.3.2) để cô dung dịch dầu nhẹ đến 10 ml.

3.4.3. Làm sạch trên Florisil

Cho một lớp 100 mm chất hấp thụ (3.2.7) lên cột sắc ký (3.3.1). Phủ một lớp 10 mm natri sunfat (3.2.6) và tráng bằng 40 ml đến 50 ml dầu nhẹ (3.2.1). Dùng pipet lấy 10 ml dầu nhẹ đã cô (3.4.2) cho vào cột (3.3.1), tráng vật chứa hai lần, mỗi lần dùng khoảng 5 ml dầu nhẹ. Dùng 200 ml dung dịch rửa giải A (3.2.4) để rửa giải rồi cho vào bình cô quay chân không (3.3.2) được gắn với ống chia độ. Tốc độ rửa giải không nên vượt quá 5ml/min. Tương tự, thay bình nhận và dùng 200 ml dung môi rửa giải B (3.2.5) để rửa giải.

Dùng bộ cô quay chân không (3.3.2) để cô hai chất rửa giải riêng rẽ đến thể tích nhỏ yêu cầu. Kiểm tra từng chất rửa giải bằng sắc ký khí lỏng (GLC). Có thể cần phải làm sạch tiếp lên cột hấp phụ thứ hai mới chuẩn bị trong vòng 1 giây hoặc theo quy định trong TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000), phụ lục A.

Chất rửa giải thứ nhất chứa HCB, đồng phân của CHC, heptaclo, heptaclo epoxit, aldrin, DDE, TDE và DDT. Chất rửa giải thứ hai chứa dieldrin và endrin.

3.5. Sắc ký khí

Xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), 6.2. Đối với các phép thử sơ bộ, xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1:2000), từ điều 10 đến điều 14.

4. Phương pháp B: Tách pha lỏng – lỏng bằng dimetylfocmamid (DMF) và làm sạch trên cột alumin (Xem các tài liệu tham khảo [4] và [5])

4.1. Nguyên tắc

Các hợp chất clo hữu cơ cùng với chất béo được chiết ra khỏi mẫu thử bằng một trong các quy trình quy định trong TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), điều A.6, sau đó dư lượng được tách bằng dimetylfocmamid. Sau khi bổ sung dung dịch natri sunfat, các hợp chất hữu cơ được tách tiếp trong n-hexan. Pha hữu cơ được làm sạch bằng chạy sắc ký nhôm oxit trung tính dùng n-hexan làm dung môi rửa giải. Dịch rửa giải được cô rồi kiểm tra bằng sắc ký khí lỏng (GLC).

Các phương pháp đặc thù được quy định cho sữa và bơ.

4.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích trừ khi các quy định khác, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng nước có chất lượng tương đương.

4.2.1. n-Hexan [CH₃(CH₂)₄CH₃], dải sôi từ 68⁰C đến 70⁰C.

Kiểm tra độ sạch sắc ký dưới các điều kiện cột làm việc. Chưng cất trên kali hidroxit, nếu cần.

4.2.2. Axeton (CH₃COCH₃), loại phân tích dùng cho mục đích chung.

4.2.3. Dimetylfocmamid (DMF)

Kiểm tra dịch chiết bằng n-hexan của dung dịch loãng về sự nhiễu pic trên sắc ký khí lỏng (GLC). Chưng cất lại dung môi, nếu cần, và thu nhận phần có dải sôi từ 152⁰C đến 154⁰C.

4.2.4. n-Hexan, đã bão hòa dimetylfocmamid.

4.2.5. Dimetylfocmamid đã bão hòa n-hexan

4.2.6. Cát, đã rửa bằng axit.

Nung ở 500⁰C trong 4h, để nguội và bảo quản trong chai đậy nắp kín.

4.2.7. Natri sunfat (Na₂SO₄), khan, dạng hạt

Nung ở 500⁰C trong 4h, để nguội và bảo quản trong chai đậy nắp kín.

4.2.8. Nhôm oxit (Al₂O₃), trung tính, đã hoạt hóa.

Nung nhôm axit ở 500 ⁰C trong 4h, rồi để nguội. Cẩn thận cho 7 phần nước vào 93 phần nhôm oxit (theo khối lượng) và trộn kỹ trong bình đậy kín ít nhất 90 phút. Giữ nguyên bình đậy nắp kín này và sử dụng nhôm oxit trong vòng 10 ngày.

4.2.9. Dung dịch natri sunfat, dung dịch 2%.

4.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

4.3.1. Bộ chiết Soxhlet

4.3.2. Bộ cô quay chân không (kuderma – Danish ²⁾ hoặc loại tương đương), có bình cầu dung tích 500 ml và được gắn với một ống chia độ.

4.3.3. Bộ trộn tốc độ cao

4.3.4. Cột sắc ký, dài 300 mm, có đường kính trong 12 mm và có van khóa PTEF.

4.3.5. Cột Micro-Snyder ^[3])

4.4. Cách tiến hành

4.4.1. Chiết chất béo và hợp chất clo hữu cơ

4.4.1.1. Phương pháp chung

Xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), phụ lục A.

4.4.1.2. Phương pháp đặc thù

a) Sữa

Chuyển vào cốc nghiền xoáy dung tích 250 ml theo thứ tự sau đây: 40 ml sữa đã trộn đều, 80 ml axeton (4.2.2) và 80 ml n-hexan (4.2.1). Đồng hóa hỗn hợp trong 3 phút. Chuyển ngay lượng đã trộn đều sang ống ly tâm 250 ml, làm sạch dao trộn bằng 10 ml n-hexan, sau đó bằng 5 ml nước và cho nước rửa vào ống ly tâm.

Quay ống 5 phút trong máy ly tâm ở tần số quay 2500 vòng/phút. Tách lớp dung môi n-hexan và cho đi qua cột natri sunfat khan (4.2.7) ngắn. Rửa lượng chứa trong ống hai lần liên tiếp, mỗi lần dùng 25ml n-hexan và cho nước rửa đi qua cột. Cô dịch chiết hỗn hợp trong bộ cô quay chân không (4.3.2) đến khoảng 15 ml. Chuyển dung dịch này sang phễu chiết 100 ml được chia vạch 25 ml và chỉnh thể tích đến 25 ml. [Đối với sữa, xem thêm phương pháp E, 7.4.1.2 b)].

b) Bơ

Hòa tan 5 g butterfat đã phân loại (đã tan chảy và đã lọc qua bộ lọc) trong 10 ml n-hexan. Chuyển dung dịch này sang phễu chiết 100 ml sử dụng ba phần n-hexan liên tiếp, mỗi lần 5 ml.

4.4.2. Tách pha chất béo và các hợp chất clo hữu cơ bằng DMF

Chiết chất béo từ 25 ml dung dịch hexan (4.4.1) bằng 10 ml dimetylfocmamid (DMF) đã bão hòa n-hexan (4.2.5), bằng cách lắc trong phễu chiết. Sau 2 phút đến 3 phút, cho lớp DMF thấp hơn chảy vào phễu chiết 100 ml thứ hai (giữ lại lớp nhũ tương phân cách trong phễu chiết thứ nhất). Lặp lại việc chiết dung dịch n-hexan thêm hai lần, mỗi lần dùng 10 ml DMF (4.2.5). Gộp các dịch chiết bằng DMF lại và rửa bằng 10 ml n-hexan đã bão hòa DMF (4.2.4).

Tách lấy 10 ml n-hexan và rửa tiếp bằng 10 ml DMF (4.2.5). Loại n-hexan và cho nước rửa vào 30 ml dịch tiết DMF ban đầu đựng trong phễu chiết 500 ml (hoặc tốt hơn là phễu chiết 350 ml). Thêm 6 ml n-hexan (4.2.1) và lắc mạnh với 200 ml dung dịch natri sunfat (4.2.9) trong 2 phút.

Để yên trong 20 phút cho tách pha. Thu lấy pha n-hexan bằng cách khuấy nhẹ. Tháo bỏ pha nước làm khô phễu chiết bằng giấy lọc và cho n-hexan chảy vào ống chia độ có cổ thủy tinh mài đựng 15 ml dung môi. Tráng phễu chiết bằng một lượng nhỏ n-hecxan và cho nước tráng này vào ống.

Lắp ống với cột micro-Snyder (4.3.5) và cô dịch chiết bằng n-hexan cho đến khi còn lại khoảng 2 ml.

4.4.3. Làm sạch n-hexan trên nhôm oxit

Rót 5 g dung dịch nhão của nhôm oxit đã chuẩn bị (4.2.8) trong n-hexan (4.2.1) vào cột sắc ký (4.3.4) có nút bằng bông cotton đã rửa bằng dung môi [TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000), A.5.15]. Để nhôm oxit lắng và phủ lên nó một lớp natri sunfat khan 30 mm (4.2.7). Tháo n-hexan cho đến khi mặt lõm chạm đến đỉnh của lớp natri sunfat. Cho dịch chiết n-hexan (4.4.2) lên cột và rửa bằng các phần 2 ml n-hexan rồi cho nước rửa lên cột.

Rửa giải bằng 50 ml n-hexan (4.2.1) với tốc độ dòng không quá 5 ml/min, thu lấy chất rửa giải vào bộ cô quay chân không (4.3.2). Cô chất rửa giải cho đến khi còn khoảng 5 ml. Tháo ống chia độ ra, lắp cột micro-Snyder (4.3.5) và cô chất rửa giải đến khi còn 1 ml.

4.5. Sắc ký khí

Xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000), điều 6.2. Đối với các phép thử sơ bộ. v.v…, xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000, từ điều 10 đến điều 14.

5. Phương pháp C: Tách pha lỏng – lỏng bằng dimetylfocmamid (DMF) và làm sạch trên cột Florisil (xem tài liệu tham khảo [6])

5.1. Nguyên tắc

Các hợp chất clo hữu cơ cùng với chất béo được chiết ra khỏi mẫu bằng quy trình mô tả trong 5.4.1. Dịch chiết được cô gần như đến khô rồi hòa tan vào dầu nhẹ. Các hợp chất clo hữu cơ được tách trong dimetylfocmamid. Sau khi bổ sung dung dịch natri sunfat, các hợp chất hữu cơ được tách tiếp trong dầu nhẹ.

Pha hữu cơ được làm sạch bằng sắc ký trên cột Florisil, sử dụng dầu nhẹ/dietyl ete làm dung môi rửa giải. Dịch rửa giải được cô rồi được kiểm tra bằng sắc ký khí lỏng (GLC).

5.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

5.2.1. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 30⁰C đến 40⁰C, được cất lại.

5.2.2. Dietyl ete (C₂H₅OC₂H₅), không chứa peroxit.

5.2.3. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 60⁰C đến 80⁰C, được cất lại.

5.2.4. Dung môi rửa giải, hỗn hợp của dietyl ete (5.2.2) và dầu nhẹ (5.2.1) (tỷ lệ 6 : 94 tính theo thể tích).

5.2.5. Chất hấp phụ: Florisil (Floridin Co¹⁾), cỡ từ 60 mesh đến 100 mesh.

Nung chất hấp phụ ở nhiệt độ 650⁰C trong 2h trong lò múp. Để nguội đến 130⁰C và giữ trong 5h ở nhiệt độ này trong tủ sấy. Sau đó, để nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm rồi chuyển sang bình có nắp đậy kín khí. Cho 5 phần nước cất vào 95 phần chất hấp phụ (tính theo thể tích) và lắc cho đến khi tan hết các cục. Để yên trong 24h và lắc trước khi sử dụng.

5.2.6. Natri sunfat (Na₂SO₄), khan, dạng hạt.

Nung ở nhiệt độ 500^0-C ± 25⁰C trong 4 h. Để nguội và bảo quản trong chai đậy nắp.

5.2.7. Dimetylfocmamid (DMF), bão hòa với dầu nhẹ

Chưng cất DMF và thu nhận phần có dải sôi từ 152⁰C đến 154 ⁰C rồi cho bão hòa với dầu nhẹ (5.2.1).

5.2.8. Dầu nhẹ (5.2.1), được bão hòa với dimetylfocmamid

5.2.9. Natri sunfat (Na₂SO₄), dung dịch 2%.

5.2.10. n-Hexan [CH₃(CH₂)₄CH₃].

5.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

5.3.1. Bộ trộn tốc độ cao

5.3.2. Bộ cô quay chân không (Kuderma – Danish ²⁾ hoặc loại tương đương), có bình cầu dung tích 500 ml và được gắn với một ống chia độ.

5.3.3. Cột sắc ký, dài 300 mm, đường kính trong 20 cm, có đĩa thủy tinh chịu nhiệt và có van khóa bằng PTFE

5.4. Cách tiến hành

5.4.1. Chiết chất béo và hợp chất clo hữu cơ

Đối với các phương pháp chung, xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000), phụ lục A.

5.4.2. Tách chất béo và thuốc trừ sâu bằng DMF

Hòa tan dịch chiết của mẫu chứa từ 2 g đến 5 g chất béo vào trong 25 ml dung dịch dầu nhẹ đã bão hòa DMF (5.2.8). Chuyển sang phễu chiết 250 ml. Chiết bằng các lượng nhỏ DMF đã bão hòa dầu nhẹ (5.2.7) đã biết thể tích (thí dụ 75 ml) vào phễu chiết. Mỗi lần lắc mạnh từ 1 phút đến 2 phút và tháo pha DMF cho chảy vào phễu chiết 500 ml. Trộn các pha hỗn hợp với 200ml dung dịch natri sunfat (5.2.9) và mỗi lần lắc từ 1 phút đến 2 phút, một lần dùng 40ml và ba lần tiếp mỗi lần dùng 25 ml dầu nhẹ (5.2.3). Thu lấy các pha dầu nhẹ và rửa với khoảng 10 ml nước. Làm khô trên natri sunfat (5.2.6) và lọc qua nút bông cotton. Sau khi thêm khoảng 5 ml n-hexan (5.2.10) qua nút bông cotton, cô thể tích này đến khi còn khoảng 5 ml trong bộ cô quay chân không (5.3.2).

5.4.3. Làm sạch trên cột Florisil bằng dầu nhẹ

Làm đầy nửa cột sắc ký (5.3.3) bằng dầu nhẹ (5.2.3). Cho 20 g chất hấp phụ đã khử hoạt hóa (5.2.5) với các lượng nhỏ qua phễu, giữ van PTFE mở từng phần và gõ nhẹ cột. Chỉ sử dụng các cột không có bọt khí nhìn thấy được. Phủ lên một lớp natri sunfat khan (5.2.6) 20 mm và để cho dầu nhẹ chảy lên mặt của cột làm đầy.

Chuyển dịch chiết mẫu lên cột với vài mililit dung môi rửa giải (5.2.4). Để cho chảy vào cột, làm đầy bằng cách mở khóa cho đến khi mặt lõm chạm đến lớp natri sunfat (5.2.6).

Dùng vài mililit dung môi rửa giải (5.2.4) để rửa vật chứa ban đầu và tiến hành như trên. Rửa giải cột ở tốc độ dòng không quá 5 ml/min bằng 200 ml dung môi rửa giải rồi cho vào bình đáy tròn 500 ml. Cô dịch rửa giải trong bộ cô quay chân không (5.2.3) còn 5 ml. Chuyển dịch chiết đã cô sang ống chia độ có dietyl ete (5.2.2) và pha loãng bằng dietyl ete đến thể tích đã định (từ 10 ml đến 20 ml).

5.5. Sắc ký khí

Xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000), 6.2. Đối với các phép thử sơ bộ v.v… xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000), từ điều 10 đến điều 14.

6. Phương pháp D: Sắc ký cột nhôm oxit có độ hoạt tính được xác định chính xác (xem tài liệu tham khảo [7])

6.1. Nguyên tắc

Dùng axeton/n-hexan để chiết các hợp chất clo hữu cơ ra khỏi mẫu. Axeton được tách pha trong dung dịch natri sunfat. n-hexan được làm khô và cô đặc. Lượng dịch chiết chất béo quy định được làm sạch bằng sắc ký cột nhôm oxit trung tính có độ hoạt tính được xác định chính xác, dùng n-hexan làm dung môi rửa giải.

Dịch rửa giải được cô rồi kiểm tra bằng sắc ký khí lỏng (GLC).

6.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

6.2.1. Axeton (CH₃COCH₃).

6.2.2. n-Hexan [CH₃(CH_2­)₄CH₃].

6.2.3. Natri sunfat (Na₂SO₄), khan, dạng hạt.

Nung ở nhiệt độ 500⁰C trong 4h, để nguội và bảo quản trong chai đậy nắp.

6.2.4. Natri sunfat, dung dịch 2%.

6.2.5. Nhôm oxit (Al₂O₃), trung tính (Woelm W 200 ^[4]), có độ hoạt tính loại 1 hoặc tương đương).

Nung sơ bộ nhôm oxit này ở nhiệt độ 500⁰C ± 25⁰C trong 3 h đến 4 h để loại hết ẩm và bất kỳ các chất hữu cơ gây nhiễu nào khác và để nguội trên phospho pentoxit. Cho khoảng 10 ml nước chia thành các lượng từ 2 ml đến 3 ml vào 90 g nhôm oxit trong khi vẫn lắc bình hoặc chai để khử một phần hoạt tính. Đậy chặt nắp bình hoặc chai và lắc hoặc đặt trên trục lăn để trộn kỹ. Trước khi sử dụng, để yên cho cân bằng trong 24 h trong bình đậy nắp ở nhiệt độ môi trường. Tiêu chuẩn hóa vật liệu như sau: Cân 22,0 g nhôm oxit. Chuẩn bị dung dịch nhão trong một thể tích nhỏ n-hexan (6.2.2) và chuyển sang cột sắc ký khí (6.3.2). Cho lên cột một lớp 10 mm natri sunfat khan (6.2.3) và rửa cột bằng 15 ml đến 20 ml n-hexan. Chỉnh mức của lớp n-hexan chỉ vừa thấp dưới đỉnh của lớp natri sunfat.

Đặt bình nhận có dung tích thích hợp (tối thiểu là 250 ml) dưới cột. Dùng pipet lấy một thể tích nhỏ của dung dịch n-hexan chứa 1 g dầu hoặc mỡ động vật cho lên đỉnh cột, cẩn thận sao pipet xả hết và dầu không được phép chảy xuống theo thành cột. Để cho mức dầu trong dung dịch n-hexan chảy xuống đỉnh của lớp natri sunfat. Thêm 2ml n-hexan và lại cho chảy xuống dưới.

Rửa giải cột bằng 150 ml n-hexan. Cho bay hơi dịch rửa giải đến một thể tích nhỏ trong bộ bộ cô quay chân không (6.3.3) và chuyển lượng này sang bình cân đã được sấy trước ở 110 ⁰C, làm nguội rồi cân lại. Loại bỏ dung môi còn sót lại bằng cách làm nóng dưới dòng khí nitơ nhẹ. Làm khô trong tủ sấy ở 110⁰C trong 5 phút. Để nguội trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 0,01 g. Đảm bảo rằng khối lượng của chất béo thu được là không đổi. Khối lượng chất béo này là A.

Dùng pipet lấy tiếp một thể tích tương tự của dung dịch n-hexan ban đầu cho vào bình cân khác đã được cân trước, cho bay hơi, sấy khô và cân như trước. Khối lượng chất béo này là B.

Dung tích chất béo của cột bằng (B-A) g chính xác đến 0,01 g. Chỉnh hoạt độ của nhôm oxit, nếu cần trong một số giai đoạn, sao cho dung tích chất béo của cột bằng 0,62 g ± 0,02g chất béo động vật hoặc dầu thực vật tinh luyện hoặc 0,52 g ± 0,02 g butterfat.

Khử hoạt tính của nhôm oxit đủ cho một dãy các phép phân tích (thí dụ, khối lượng còn lại trong chai là 500 g) đối với lượng chất béo được xác định.

6.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

6.3.1. Bộ trộn tốc độ cao

6.3.2. Cột sắc ký, dài 300 mm, đường kính trong 20 mm, có van khóa bằng PTFE.

6.3.3. Bộ cô quay chân không (Kuderma – Danish ²⁾ hoặc loại tương đương), có bình cầu dung tích 500 ml và được gắn với một ống chia độ.

6.3.4. Bông thủy tinh, được rửa bằng dầu nhẹ

6.4. Cách tiến hành

6.4.1. Phương pháp chung

Đối với phương pháp chung, xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2002), phụ lục A.

6.4.2. Phần mẫu thử

Cân một lượng mẫu đủ để cho khoảng 0,7 g chất béo, chính xác đến 0,01 g, đối với sản phẩm dạng rắn thì nghiền nhỏ mẫu.

6.4.3. Chiết chất béo và các hợp chất clo hữu cơ

Trộn phần mẫu thử với 50 ml axeton (6.2.1) trong máy trộn tốc độ cao (6.3.1) trong vòng 2 phút. Thêm 200 ml n-hexan (6.2.2) và trộn tiếp cho đến khi mẫu được phá xong. Để cho tách pha. Gạn lấy một thể tích tối đa dịch chiết được lọc qua natri sunfat khan (6.2.3) trên bông thủy tinh (6.3.4) vào phễu chiết 1 lít. Rửa dịch chiết hai lần bằng 500 ml dung dịch natri sunfat (6.2.4), loại bỏ các lớp dung dịch phía dưới với một ít lớp n-hexan.

Chuyển 10 ml dịch chiết n-hexan vào bình cân đã cân trước và xác định chất béo đã chiết được theo 6.4.4. Dựa vào cách tính trong 5.4.4, chuyển thể tích dịch chiết n-hexan chứa 0,40 g sữa, phomat hoặc butterfat vào bộ cô quay chân không (6.3.3). Cô lượng được chuyển sang cho đến khi còn khoảng từ 5 ml đến 8 ml, lấy ra và cho bay hơi tiếp từ 1ml đến 2 ml trên nồi cách thủy ở nhiệt độ từ 60⁰C đến 70⁰C dưới dòng nitơ.

6.4.4. Xác định chất béo đã chiết được

Chuyển 10 ml dịch chiết hexan vào bình cân đã cân trước. Cho bay hơi đến khô ở nhiệt độ 60⁰C dưới dòng nitơ. Sấy khô cặn 15 phút ở trong lò sấy 105⁰C, để nguội và cân bình chứa với cặn. Lặp lại quy trình sấy cho đến khi thu được khối lượng không đổi của bình cùng với cặn. Tính lượng chất béo bằng gam trên 10 ml dịch chiết hexan bằng cách lấy chênh lệch giữa khối lượng cuối cùng (tính bằng gam) sau khi sấy và khối lượng (tính bằng gam) của bình cân đã được cân trước. Không sử dụng phép xác định hàm lượng chất béo này để tính dư lượng hợp chất clo hữu cơ.

6.4.5. Làm sạch

Chuẩn bị 22 g dung dịch nhão nhôm oxit đã khử hoạt tính (6.2.5), có hàm lượng chất béo thích hợp, trong một thể tích nhỏ n-hexan và chuyển sang cột sắc ký (6.3.2). Phủ một lớp natri sunfat khan (6.2.3) 10 mm lên trên đỉnh cột và rửa cột bằng 15 ml đến 20 ml n-hexan. Chỉnh mức n-hexan chỉ thấp hơn đỉnh lớp natri sunfat. Chuyển lên đỉnh cột một phần dung dịch n-hexan đã cô đặc, chứa 0,50 g chất béo (0,40 g bơ, sữa hoặc phomat) đã chuẩn bị theo mô tả trong 6.4.3. Rửa giải cột bằng 150 ml n-hexan và cô đặc dịch rửa giải trong bộ cô quay chân không (6.3.3) cho đến khi còn khoảng 8ml.

Nếu cần, chuyển sang ống chia độ và cho bay hơi tiếp trong nồi cách thủy ở 50⁰C dưới dòng nitơ, cho đến khi thể tích còn 2 ml đến 3 ml. Lấy ống cùng với dịch rửa giải ra khỏi nồi cách thủy và cho bay hơi tiếp ở nhiệt độ môi trường cho đến khi thể tích cuối cùng còn 1,0 ml rồi đóng ống lại.

6.5. Sắc ký khí

Xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000), 6.2. Đối với các phép thử sơ bộ, xem TCVN 7082-1:2002 (ISO 3890-1 : 2000) từ điều 10 đến điều 14.

7. Phương pháp E: Sắc ký cột trên cột alumin (xem tài liệu tham khảo [8])

7.1. Nguyên tắc

Dùng dầu nhẹ để chiết các hợp chất clo hữu cơ ra khỏi mẫu. Lượng dịch chiết chất béo quy định được làm sạch bằng sắc ký trên nhôm oxit có độ hoạt tính được xác định chính xác, dùng dầu nhẹ làm dung môi rửa giải. Dịch rửa giải được cô đặc và được xác định bằng sắc ký khí lỏng (GLC).

7.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

7.2.1. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40 ⁰C đến 60 ⁰C, đã chưng cất.

7.2.2. Axeton (CH₃COCH₃)

7.2.3. Natri sunfat (Na₂SO₄), khan, hạng hạt.

Nung trong 4 h ở nhiệt độ 500 ⁰C, để nguội rồi bảo quản trong chai đậy kín.

7.2.4. Cát, đã rửa bằng axit.

Nung trong 4 h ở nhiệt độ 500 ⁰C ± 25 ⁰C, để nguội rồi bảo quản trong chại đậy kín.

7.2.5. Nhôm oxit (Al₂O₃), kiềm tính (Woelm W 200⁴⁾, có hoạt tính loại 1 hoặc tương đương).

Cân bình còn nguyên nắp đậy. Cho nhanh 27 g nước vào lượng chứa trong bình (thường là 515 g). Đậy ngay nắp bình. Lắc mạnh và để yên 24 h rồi chuyển lượng chứa này sang chai có nắp đậy kín.

Cân chai rỗng ban đầu và tính hàm lượng nước của nhôm oxit đã khử hoạt tính. Tỷ lệ của các phần thu được phải là 9,5 : 0,5 (theo thể tích). Điều chỉnh, nếu cần. Kiểm tra hoạt tính của nhôm oxit bằng sắc ký dung dịch chuẩn β-HCH không chứa chất béo theo quy trình được mô tả dưới đây. Độ thu hồi β-HCH cũng như sự lưu giữ chất béo phải lớn hơn 95%. Nếu độ thu hồi β-HCH quá thấp thì tăng từ từ hàm lượng nước của nhôm oxit bằng cách trộn 0,2 phần nước cất vào 99,8 phần nhôm oxit (theo khối lượng).

7.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

7.3.1. Thiết bị Soxhlet

7.3.2. Bộ cô quay chân không (Kuderna-Danish²⁾ hoặc loại tương đương) có bình dung tích 500 ml và được gắn với ống chia độ.

7.3.3. Bộ trộn tốc độ cao

7.3.4. Máy ly tâm, có thể quay với tần số 2 500 vòng/phút.

7.3.5. Bông thạch anh

7.3.6. Cột sắc ký, dài 175 mm với đường kính trong 6 mm, có lối thoát dài 40 mm với đường kính trong 1 mm và có ống đựng dung môi dài 125 mm với đường kính trong 70 mm.

7.3.7. Ống chia độ, dung tích 25 ml

7.4. Cách tiến hành

7.4.1. Chiết chất béo và các hợp chất clo hữu cơ

7.4.1.1. Phương pháp chung

Xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1: 2000), phụ lục A.

7.4.1.2. Phương pháp đặc thù

a) Butterfat khan

Làm nóng mẫu đến khoảng 50⁰C và lọc qua bộ lọc ấm, khô. Hòa tan chất béo trong dầu nhẹ (7.2.1) để thu được dung dịch chứa 35 mg/ml đến 50 mg/ml. Dùng 2 ml để phân tích.

b) Sữa

Chuyển vào bộ trộn tốc độ cao (7.3.3) theo thứ tự sau: 40 ml sữa, 80 ml axeton và 80 ml dầu nhẹ (7.2.1). Trộn và cho ly tâm hỗn hợp ở tần số quay 2 500 vòng/phút trong 5 phút. Lấy một phần chất lỏng thí dụ: 10 ml từ lớp dầu nhẹ phía trên. Làm khô bằng cách lọc qua natri sunfat (7.2.3) và rửa natri sunfat bằng một ít dầu nhẹ. Loại bỏ dầu nhẹ trong bộ cô quay chân không (7.3.2). Chỉnh thể tích sao cho thu được nồng độ chất béo từ 35 mg/ml đến 50 mg/ml. Sử dụng 2 ml đển phân tích. [Xem thêm phương pháp B, 4.4.1.2 a)].

c) Phomat

Trộn 20 g đến 25 g mẫu trong bộ trộn tốc độ cao (7.3.3) với 50 ml dầu nhẹ (7.2.1). Làm khô bằng cách lọc qua natri sunfat (7.2.3) và rửa natri sunfat bằng một ít dầu nhẹ. Loại bỏ dầu nhẹ trong bộ cô quay chân không (7.3.2).

Chỉnh thể tích sao cho thu được nồng độ chất béo từ 35 mg/ml đến 50 mg/ml. Dùng 2 ml để phân tích.

7.4.2. Sắc ký cột

Chèn nút nhỏ bằng bông thạch anh (7.3.5) vào lối thoát của cột sắc ký (7.3.6). Cân 4,0 g nhôm oxit đã khử hoạt tính (7.2.5) rồi chuyển lên cột. Gõ thành cột để nhồi cột được tốt. Chuyển sang cột 2 ml dung dịch thu được theo 7.4.1. Tráng thành trong của cột ba lần, mỗi lần dùng 1 ml dầu nhẹ (7.2.1). Rửa giải bằng 25 ml dầu nhẹ, thu lấy tất cả dịch rửa giải vào ống chia độ (7.3.7) và cô đến thể tích thích hợp.

Để có được độ thu hồi tốt, đặc biệt là β-HCH, cần sử dụng ít nhất 70 mg chất béo trên cột 4,0 g nhôm oxit. Cột này có thể giữ được 100 mg chất béo một cách dễ dàng. Nếu cần phải xác định các lượng chất béo lớn hơn (thí dụ, khi detectơ không đủ độ nhạy), thì các lượng nhôm oxit và dầu nhẹ đề cập ở trên cần phải tăng lên tương ứng. Giai đoạn làm sạch cũng có thể tăng cường một cách dễ dàng cho phù hợp với 250 mg chất béo.

7.5. Sắc ký khí

Xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890 – 1: 2000), 6.2. Đối với các phương pháp thử sơ bộ, xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890 – 1: 2000) từ điều 10 đến điều 14.

8. Phương pháp F: Sắc ký cột trên Florisil đã khử hoạt tính từng phần (Xem các tài liệu tham khảo [9], [10] và [11])

8.1. Nguyên tắc

Các hợp chất clo hữu cơ cùng với chất béo được chiết ra khỏi mẫu thử bằng quy trình mô tả trong TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1: 2000), A.6. Dịch chiết được cô gần đến khô và tái hòa tan trong dầu nhẹ. Lượng dịch chiết chất béo quy định được làm sạch bằng sắc ký trên cột Florisil dùng dầu nhẹ/diclorometan làm dung môi rửa giải. Dịch rửa giải được cô đến gần khô rồi tái hòa tan vào dầu nhẹ để xác định bằng sắc ký khí lỏng (GLC).

Có phương pháp riêng quy định cho sữa, sữa đặc không đường và sữa đặc có đường.

8.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

8.3.1. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40 ⁰C đến 60 ⁰C, đã chưng cất.

8.2.2. Diclorometan, được chưng cất trên các hạt natri hidroxit (có điểm sôi ở 39⁰C).

8.2.3. Dung môi rửa giải: hỗn hợp dầu nhẹ (8.2.1) và diclorometan (8.2.2) (tỷ lệ 4:1 tính theo thể tích).

8.2.4. Chấp hấp phụ: Florisil (Floridin Co¹⁾), cỡ 60 mesh đến 100 mesh.

Nung qua đêm ở nhiệt độ 550⁰C ± 25⁰C. Để nguội và bảo quản trong vật chứa kín khí.

Trước khi sử dụng, sấy ở 130⁰C ± 2⁰C ít nhất trong 5 h và thêm 3 phần nước cất vào 97 phần chất hấp phụ (tính theo khối lượng). Lắc hỗn hợp ít nhất trong 20 phút và bảo quản trong vật chứa kín khí từ 10 h đến 12 h để đảm bảo sự phân bố đồng đều của nước. Sử dụng trong vòng 3 ngày.

8.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

8.3.1. Bộ cô quay chân không (Kuderna-Danish ²⁾ hoặc loại tương đương) có bình dung tích 500 ml và được gắn với ống chia độ.

8.3.2. Cột sắc ký, dài 600 mm với đường kính trong 22 mm, có van khóa PTFE.

8.4. Cách tiến hành

8.4.1. Chiết chất béo và hợp chất clo hữu cơ

8.4.1.1. Phương pháp chung

Xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1: 2000), phụ lục A

8.4.1.2. Phương pháp cụ thể

a) Sữa và sữa đặc không đường

Cân 10 g mẫu thử cho vào cốc 250 ml và thêm 25 g chất hấp thụ (8.2.4), dùng đũa thủy tinh để khuấy. Cơ bản là sau khi khuấy không còn cục đông vón để dung dịch có thể chảy qua được phễu hẹp.

b) Sữa đặc có đường

Cân 10 g mẫu thử cho vào cốc 250 ml. Trộn kỹ với 5 ml nước cất. Thêm 25 g chất hấp phụ (8.2.4) và trộn như trên.

8.4.2. Làm sạch trên Florisil

Nút cột sắc ký (8.3.2) bằng nút bông thủy tinh. Rót vào 100 ml dầu nhẹ (8.2.1) và thêm 25 g chất hấp phụ (8.2.4). Sau khi cột điền đầy đã ổn định, cho dung môi chảy qua đến khoảng cách 10 mm phía trên lớp chất hấp phụ. Hòa tan 0,5 g đến 1 g chất béo đã chiết được trong 10 ml dầu nhẹ và chuyển lượng này lên trên chất hấp phụ trong cột.

Khi kiểm tra sữa và sữa đặc không đường (xem 8.4.1.2), cho chất hấp phụ đã được làm ướt bằng chất nền khi qua phễu hẹp lên cột của chất hấp phụ (8.2.4) đã được chuẩn bị như mô tả ở trên. Lắc để làm lắng. Rửa giải bằng 300 ml dung môi rửa giải (8.2.3). Tốc độ rửa giải không vượt quá 5 ml/min. Cô dịch rửa giải trong bộ cô quay chân không (8.3.1) dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 40⁰C, cho đến khi còn 2 ml. Sử dụng dòng không khí để loại bỏ dung môi thừa và chuyển lượng còn lại sang ống đong bằng các lượng nhỏ dầu nhẹ (8.2.1) và pha loãng đến 5 ml.

Chú thích 1 – Không cần thiết phải khô tuyệt đối sau khi đã sử dụng không khí hoặc nitơ. Vết dấu nhẹ còn sót lại không ảnh hưởng đến kết quả, vì diclorometan gần như đã bay hơi hết trong suốt quy trình.

Với lý do kinh tế, quy trình đề nghị trên đây có thể được sửa đổi hành quy trình nhỏ chỉ sử dụng 10% chất hấp phụ có độ tinh kiết cao và các dung môi như sau. Cân 1,00 g chất béo chiết được, chính xác đến 0,01 g, cho vào bình định mức 20 ml. Pha loãng đến vạch 20 ml bằng dầu nhẹ và lắc kỹ để trộn đều.

Nhét nút bông thủy tinh nhỏ vào cộc sắc ký có đường kính 8 mm x 200 mm, được gắn một van thoát và có ống 30 ml ở đỉnh. Cho 15 ml dầu nhẹ lên cột và thêm từ từ 3,0 g Florisil đã tiêu chuẩn hóa (8.2.4). Đảm bảo việc nhồi chặt chất hấp phụ bằng cách dùng đũa thủy tinh gõ nhẹ cạnh của cột. Khi Florisil đã ổn định, cho dung môi chảy qua cột đến cách đỉnh cột khoảng 10 mm.

Dùng pipet chuyển 2,00 ml (tương đương với 100 mg mẫu) dung dịch chất béo thu được bằng phương pháp thông thường hoặc bằng phương pháp rút ngắn, lên cột Florisil. Cho dung dịch chảy qua và rửa giải các hợp chất clo hữu cơ bằng 30 ml dung môi rửa giải (8.2.3). Thu dịch rửa giải vào bình cầu đáy tròn 100 ml. Thời gian rửa giải hoàn toàn ít nhất là 15 phút.

Cô dịch rửa giải trong bộ cô quay chân không (8.3.1) cho đến khi còn khoảng 2 ml. Loại bỏ dung môi còn lại bằng cách thổi nhẹ luồng không khí sạch. Thêm 2,00 ml isooctan vào lượng còn lại không nhìn thấy được, đậy nắp và xoay bình. Dùng dịch cô đặc này để phân tích sắc ký khí.

8.5. Sắc ký khí

Xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), 6.2. Đối với các phương pháp thử sơ bộ, xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000) từ điều 10 đến điều 14.

9. Phương pháp G: Sắc ký cột trên silicagel đã khử hoạt tính từng phần (xem tài liệu tham khảo [12])

9.1. Nguyên tắc

Các hợp chất clo hữu cơ cùng với chất béo được chiết ra khỏi mẫu thử. Dịch chiết được làm sạch trên sắc ký cột silicagel rửa giải bằng dầu nhẹ/dichloromethane (tỷ lệ 80 : 20 tính theo thể tích). Dịch rửa giải được cô rồi xác định bằng sắc ký khí lỏng (GLC).

9.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

9.2.1. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40 ⁰C đến 60 ⁰C.

Chưng cất trên cột Raschig có chiều dài tối thiểu 500 mm, nếu cần.

9.2.2. Diclorometan, được chưng cất trên các hạt natri hidroxit (NaOH) (có điểm sôi ở 39⁰C).

9.2.3. Dung môi rửa giải: hỗn hợp dầu nhẹ (9.2.1) và diclorometan (9.2.2) (tỷ lệ 4:1 tính theo thể tích).

9.2.4. Silica gel, cỡ 70 mesh đến 230 mesh^[5])

Hoạt hóa bằng cách nung ở nhiệt độ 450 ⁰C ± 25 ⁰C trong 3h. Để nguội và bảo quản trong vật chứa kín khí.

9.2.5. Silicagel đã khử hoạt tính

Trộn 90 phần silicagel hoạt tính (9.2.4) với 10 phần nước (theo thể tích). Lắc hỗn hợp ít nhất trong 20 phút rồi bảo quản trong chai kín ít nhất từ 10 h đến 12 h để đảm bảo nước được phân bố đồng đều.

9.2.6. n-Hexan [CH₃(CH₂)₄CH₃], hoặc n-heptan hoặc isooctan

Chưng cất trên cột Raschig có chiều dài tối thiểu 500 mm, nếu cần.

9.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

9.3.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

9.3.2. Bộ cô quay chân không (Kuderna-Danish²⁾ hoặc loại tương đương), có bình dung tích 500 ml và được gắn với ống chia độ.

9.3.3. Cột sắc ký, đường kính trong 22 mm, có van khóa PTFE.

Các cột có chiều dài 250 mm với đoạn nối phía trên cho thấy thỏa mãn.

9.3.4. Bình cô, dung tích 500 ml.

9.3.5. Cốc, với các loại kích cỡ khác nhau.

9.3.6. Pipet

9.3.7. Phễu

9.3.8. Bông thủy tinh, được rửa bằng dầu nhẹ (9.2.1).

9.3.9. Đũa thủy tinh, đường kính 8 mm.

9.3.10. Bơm nước chân không

9.4. Cách tiến hành

9.4.1. Chiết chất béo và hợp chất clo hữu cơ

Phương pháp chung, xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), phụ lục A.

9.4.2. Làm sạch

9.4.2.1. Chất béo và các hợp chất clo hữu cơ

Nhét nút bông thủy tinh (9.3.8) vào cột sắc ký (9.3.3) và làm đầy cột bằng 15 g silicagel đã khử hoạt tính (9.2.5). Hòa tan 0,5 g chất béo chiết được (9.4.1) trong 5 ml dầu nhẹ (9.2.1) và dùng pipet thích hợp chuyển lượng này lên đỉnh cột silicagel.

Rửa giải bằng 130 ml dung môi rửa giải (9.2.3). Thêm 1 ml dung dịch chuẩn nội vào dịch rửa giải. Cô dịch rửa giải chậm dưới áp suất giảm đến 1 ml trong bộ cô quay chân không (9.2.3) ở 40⁰C và bơm nước (9.3.10). Loại bỏ dung môi còn lại bằng luồng không khí và chuyển lượng cặn sang ống đong bằng các lượng nhỏ n-hexan (9.2.6). Pha loãng đến 1 lít.

9.4.2.2. Quy trình rút gọn đối với sữa, sữa bột và phomat (xem tài liệu tham khảo [13]).

Trộn 10 g sữa hoặc 10g sữa bột đã được pha loãng bằng nước theo hệ số đông đặc, hoặc 2 g đến 4 g sữa bột đã hoàn nguyên với 10 ml nước ở 40 ⁰C hoặc từ 2 g đến 5 g phomat cùng 8 ml đến 9 ml nước với 15 g silicagel đã hoạt hóa (9.2.4) trong cốc. Khuấy liên tục bằng đũa thủy tinh để thu được bột chảy tự do không vón cục.

Khối lượng của chất béo trong mẫu phải từ 0,3 g đến 0,8 g, phù hợp với dung tích chất béo của việc “tách” lớp silicagel với 10% nước (phía dưới).

Khối lượng nước trong mẫu phải đạt khoảng 10 g. Nếu không đạt, thì bổ sung một lượng nước thích hợp. Chỉ có lượng nước tải bằng 40% silicagel đã khử hoạt tính theo cách đó thì các hợp chất clo hữu cơ mới được vận chuyển cùng với dung môi phía trước đến đỉnh của lớp silicagel “tách pha” với 10% nước phía dưới.

Làm đầy cột sắc ký (9.3.3) bằng 30 g silicagel đã hoạt hóa (9.2.5) và chuyển hỗn hợp mô tả ở trên của mẫu với silicagel lên đỉnh cột. Tráng cốc bằng hai phần 50 ml dung môi rửa giải (9.2.3) và cẩn thận cho nước tráng lên đỉnh cột. Cho tiếp 300 ml dung môi rửa giải (9.2.3) lên cột và rửa giải với tốc độ dòng không quá 5 ml/min. Cho dung dịch chuẩn nội vào dịch rửa giải. Cô từ từ dịch rửa giải dưới áp suất giảm đến khoảng 1 ml, thí dụ như dùng bộ cô quay chân không (9.3.2) ở 30 ⁰C. Cẩn thận cho bay hơi dung môi còn lại ở áp suất môi trường và nhiệt độ phòng đến (gần) khô. Thêm n-hexan hoặc isooctan (9.2.6) vào lượng cặn cho đến 2 ml.

Chú thích – Quy trình này có thể được thu nhỏ theo hệ số 2 bằng cách giảm lượng mẫu và thuốc thử tương ứng.

9.5. Sắc ký khí

Xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), 6.2. Đối với các phương pháp thử sơ bộ, xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000) từ điều 10 đến điều 14.

10. Phương pháp H: Sắc ký lọc gel

10.1. Nguyên tắc

Các hợp chất clo hữu cơ được chiết ra khỏi mẫu thử và dung môi chiết được làm bay hơi đến một thể tích nhỏ. Dịch chiết được hòa tan trong etyl axetat/xyclohexan và được làm sạch bằng sắc ký sử dụng cột gel, dùng etyl axetat/xyclohexan làm dung môi rửa giải. Dịch rửa giải được cô đặc rồi được kiểm tra bằng sắc ký khí lỏng (GLC).

10.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

10.2.1. Xyclohexan (C₆H₁₂), được chưng cất với sự có mặt của chất làm phân tán natri paraffin.

10.2.2. Etyl axetat (CH₃CO₂C₂H₅), đã chưng cất.

10.2.3. Etanol (C₂H₅OH), đã chưng cất.

10.2.4. Dietyl ete (C₂H₅­OC₂H₅), không chứa peroxit, được chưng cất với sự có mặt của canxi clorua.

10.2.5. Natri sunfat (Na₂SO₄), khan, dạng hạt.

Nung trong 4 h ở nhiệt độ 500 ⁰C, để nguội rồi bảo quản trong chai đậy kín.

10.2.6. Natri sunfat, dung dịch 2% trong nước cất hai lần.

10.2.7. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40⁰C đến 60 ⁰C, được chưng cất lại.

10.2.8. Gel sắc ký (Biorad, Bio-beads S-X 3, cỡ 200 mesh đến 400 mesh hoặc tương đương) ^[6])

10.2.9. Dung môi rửa giải: hỗn hợp của etyl axetat (10.2.2) và xyclohexan (10.2.1) (tỷ lệ 1:1 theo thể tích).

10.3.. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

10.3.1. Bộ trộn tốc độ cao

10.3.2. Thiết bị nhào trộn

10.3.3. Bộ cô quay chân không (Kuderna-Danish ²⁾ hoặc loại tương đương) có bình dung tích 500 ml và được gắn với ống chia độ.

10.3.4. Máy sấy lạnh

10.3.5. Bộ chiết Soxhlet

10.3.6. Sắc ký lọc gel (có bán sẵn hoặc do phòng thử nghiệm chế tạo).

10.3.7. Phễu chiết, dung tích 500 ml.

10.4. Cách tiến hành

10.4.1. Chiết chất béo và hợp chất clo hữu cơ

Phương pháp chung, xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), phụ lục A.

10.4.2. Làm sạch bằng sắc ký lọc gel

Cách 3 g chất béo, chính xác đến 0,01 g (chất béo thu được trong TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), điều A.3. Hòa tan dung môi rửa giải (10.2.9) và pha loãng bằng dung môi này đến 50 ml. Cho 5 ml dung dịch này vào vòng của bộ sắc ký lọc gel (10.3.6).

Tách chất béo ra khỏi phần còn lại, sử dụng cột sắc ký gel (10.2.8) dài 320 mm; đã được ngâm trước trong dung môi rửa giải (10.2.9) và được nhồi vào ống có đường kính 25 mm x 400 mm.

Chỉnh tốc độ rửa giải đến 5 ml/min bằng cách đặt áp suất nhẹ vào cột (áp suất không quá 0,5 bar) và thu lấy 100 ml đến 160 ml dịch rửa giải có chứa chất béo cho vào bình cầu đáy tròn. Cô dịch rửa giải đến 5 ml trong bộ cô quay chân không (10.3.3) dưới áp suất giảm ở 40 ⁰C.

Sau mỗi mẫu, rửa cột bằng dung môi rửa giải (10.2.9) trong 3 phút.

Nếu sử dụng cột do phòng thử nghiệm chế tạo thì nên điều chỉnh lượng mẫu và lượng thuốc thử tương ứng.

10.5. Sắc ký khí

Xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000), 6.2. Đối với các phương pháp thử sơ bộ, xem TCVN 7082-1 : 2002 (ISO 3890-1 : 2000) từ điều 10 đến điều 14.

11. Thử khẳng định và quy trình làm sạch bổ sung

11.1. Phép thử khẳng định A: Xác định các hợp chất clo hữu cơ bằng sắc ký khí mao dẫn thủy tinh (Xem các tài liệu tham khảo [14], [15] và [16])

11.1.1. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

11.1.1.1. Máy sắc ký khí, có bộ detectơ giữ electron, có hệ thống bơm mao dẫn.

11.1.1.2. Cột mao dẫn, có các đặc tính sau:

- chiều dài ít nhất là 25 m;

- pha tĩnh CP-Sil 7, SE 30, OV1 hoặc tương đương.

- độ dày màng 0,1 μm đến 0,4 μm

- đường kính trong 0,1 mm đến 0,4 mm;

- pha động khống chế được áp suất (khí mang: heli hoặc hidro);

- tốc độ tuyến tính 200 mm/s đến 400 mm/s;

- khí phụ trợ (nitơ hoặc agon/metan) tốc độ dòng khoảng 20 ml/min;

- làm sạch detectơ khoảng 30 ml/min (nitơ hoặc agon/metan);

- nhiệt độ của bộ bơm 210 ⁰C;

- nhiệt độ của detectơ từ 300 ⁰C đến 350 ⁰C; chương trình nhiệt độ phụ thuộc vào kỹ thuật bơm (xem dưới đây).

11.1.2. Kỹ thuật bơm

11.1.2.1. Bộ bơm không phân dòng

Đóng bộ phận dòng và nắp của bộ phận xả nếu có.

Bơm 1 μl đến 5μl (không phân dòng) khi nhiệt độ cột đạt 100 ⁰C. Khi sử dụng các dung môi bay hơi mạnh hơn isooctan, thì nên hạ nhiệt độ cột đến 90⁰C hoặc thậm chí hạ đến 80 ⁰C.

Sau khi bơm, mở bộ phân dòng và nắp của bộ phận xả nếu có trong thời gian ngắn (từ 0,25 phút đến 3 phút). Thời gian này phải được xác định bằng thực nghiệm.

Một phút sau khi mở bộ phân dòng, bắt đầu đặt chương trình nhiệt độ. Chương trình tăng nhiệt độ từ 5 ⁰C/min đến 40 ⁰C/min. Chương trình kết thúc khi nhiệt độ đã đạt 210 ⁰C đến 230 ⁰C.

Thời gian lưu cuối cùng phụ thuộc vào tốc độ chương trình nhiệt độ, nhưng cũng phải nằm trong phạm vi từ 15 phút đến 30 phút.

Làm nguội đến nhiệt độ ban đầu.

Đóng bộ phân dòng (và nắp của bộ phận xả, nếu có).

Bơm mẫu tiếp theo.

11.1.2.2. Bộ bơm hạt thủy tinh

Với dụng cụ này, có thể bơm 1 μl hoặc 2μl qua nút nén cho vào mao dẫn. Vì dung môi đã được bay hơi hết nên phép phân tích đẳng nhiệt có thể được thực hiện, việc làm lạnh hệ thống sắc ký khí ở cuối phép phân tích là không cần thiết.

11.1.3. Thử toàn bộ hệ thống

11.1.3.1. Kiểm tra cột mao dẫn thường xuyên (cột bán sẵn hoặc cột do phòng thử nghiệm chế tạo) dưới các điều kiện tiêu chuẩn với các hợp chất cần thử.

11.1.3.2. Bơm một lượng hỗn hợp thuốc trừ sâu clo hữu cơ, chứa β-HCH, dieldrin, endrin và p,p’-DDT, ở 210 ⁰C bằng một nhánh nhỏ (tỷ lệ 1 : 20). Đối với dieldrin (tỷ lệ dung tích > 5) thì số đĩa lý thuyết ít nhất là 80 000.

11.1.3.3. Các lượng endrin và dieldrin bằng nhau được bơm không phân dòng dưới các điều kiện trong 11.1.2 nên cho kết quả tỷ lệ chiều cao pic ít nhất là 65%. Nếu không đạt, thì sự hấp phụ cản trở sự rửa giải thông thường của endrin.

11.1.3.4. p,p’-DDT, loại này rất dễ bị phân hủy dùng làm hợp chất thử là thích hợp. Với các điều kiện đề cập trong 11.1.2.1 thời gian lưu dài tại cổng bơm. Đặc biệt lớp lót thủy tinh chưa khử hoạt tính, thì sẽ xảy ra sự phân hủy. Bơm đẳng nhiệt (210⁰C) p,p’-DDT có phân dòng (thời gian lưu ngắn), với phân dòng trên các cột lạnh (thể tích và nhiệt độ được quy định trong 11.1.2.1) và bơm không phân dòng dưới các điều kiện trong 11.1.2.1 cho thông tin về thời điểm sự phân hủy và ở chừng mực nào.

11.1.3.5. Các phép thử độ tuyến tính nên được thực hiện đều đặn. Với thời gian sử dụng, chất lượng của cột giảm dần và sự hấp phụ tăng, đặc biệt ở các nồng độ thấp hơn.

11.1.4. Áp dụng và phân tích mẫu

Các hợp chất clo hữu cơ được chiết ra khỏi mẫu thử theo một trong các phương pháp đề cập trong tiêu chuẩn này. Đặc biệt với các dịch chiết từ các mẫu béo, các chất có nhiệt độ sôi cao được bơm cùng với các hợp chất clo hữu cơ. Các hợp chất có nhiệt độ sôi cao hơn sẽ nhiễm lớp lót thủy tinh trong hệ thống bơm (hoặc bộ bơm hạt thủy tinh), dẫn đến hấp phụ các hợp chất có liên quan. Cần phải làm sạch thường xuyên. Trong trường hợp có lớp lót thủy tinh, có thể dùng tiền cột để thay cho lớp lót thủy tinh. Đặc biệt chú ý đền sự suy giảm p,p’-DDT.

11.2. Phép thử khẳng định B: Sắc ký lớp mỏng các hợp chất clo hữu cơ (xem tài liệu tham khảo [9])

11.2.1. Nguyên tắc

Cho phần dịch chiết mẫu đã làm sạch vào lớp mỏng nhôm oxit, cùng với một dãy hợp chất chuẩn. Sắc ký đồ được xác định bằng sắc ký lên dùng dầu nhẹ làm pha động và các hợp chất tách được, được nhìn thấy bằng cách phun dung dịch bạc nitrat và phơi tiếp dưới đèn tia cực tím cường độ mạnh.

11.2.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

11.2.2.1. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40 ⁰C đến 60 ⁰C, được chưng cất và hồi lưu qua các hạt natri hidroxit.

11.2.2.2. Dung dịch bạc nitrat, (thuốc thử phun).

Hòa tan 0,5 g bạc nitrat (AgNO₃) trong khoảng 1 ml nước. Cho 99 ml etanol (C₂H₅OH) 95% và trộn.

11.2.2.3. Các dung dịch chuẩn của hợp chất clo hữu cơ, chứa 0,05 μg/μl, trong isooctan.

11.2.2.4. Các tấm sắc ký lớp mỏng (TLC) được mạ trước, nhôm oxit, loại E (trung tính), F254, các tấm nhôm mỏng Merck số 5550 ^[7]).

11.2.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

11.2.3.1. Đèn tia cực tím, để phát hiện quang hóa các hợp chất clo hữu cơ trên TLC.

Nên dùng sản phẩm Quarzbrenner fur photochemische Zewcke của hãng Philip, loại HPK 125 W/L⁸⁾ với bộ biến thế VGI/HP 125 W.

11.2.4. Cách tiến hành

Cô mẫu và dịch chiết thử mẫu trắng đến một thể tích thích hợp trong ống chia độ hoặc trong bình Kontes. Dùng micropipet chấm dịch chiết mẫu chứa một lượng hợp chất clo hữu cơ vừa đủ để tạo một vết chấm chứa từ 0,025 μg đến 0,25 μg trên tấm nhôm oxit đã mạ trước E. Thực hiện tương tự đối với thể tích thử mẫu trắng bằng thể tích mẫu.

Tiến hành chấm dung dịch chuẩn với tuần tự các vết chấm chứa 0,025 μg, 0,05 μg, 0,10 μg, 0,15 μg, 0,20 μg và 0,25 μg các hợp chất clo hữu cơ. Để có các kết quả tốt nhất cần giữ kích thước (đường kính vết chấm) của các phần mẫu và các dung dịch tiêu chuẩn càng nhỏ càng tốt.

Dựng sắc ký đồ trên một khoảng 150 mm bằng sắc ký lên trong bể đã bão hòa trước, dùng dầu nhẹ (11.2.2.1) làm pha động. Khi pha động chạm đến đường phía trước, thì lấy tấm ra khỏi bể và để cho dung môi bám vào bay hơi hết.

Phun một lượng thừa dung dịch bạc nitrat trong etanol (11.2.2.2). Vì việc phun không đủ sẽ dẫn đên độ nhạy kém. Sau khi phun, chờ 10 phút và xác định tấm phun một cách cẩn thận. Nếu tại thời điểm này, xuất hiện các vết chấm nâu hoặc đen thì chúng không phải là các hợp chất clo hữu cơ. Đôi khi cả mẫu thử lẫn thử mẫu trắng cho thấy có vùng vàng – nâu nhạt ở Rf 0,70.

Đánh dấu vị trí của các vết chấm bằng bút chì rồi đặt sắc ký đồ dưới đèn tia cực tím. Rọi 10 phút. Lấy tấm này ra và phun nhẹ bằng nước cất cho đến khi sắc ký đồ chỉ vừa đủ ẩm. Phơi lại tấm này dưới đèn tia cực tím. Các hợp chất clo hữu cơ là các vết chấm đen tím xuất hiện trong 1 phút đến 2 phút.

Nếu không nhìn thấy rõ các vết chấm thì rọi tiếp 10 phút. Làm ẩm lại và tiếp tục rọi từ 1 phút đến 2 phút cho đến khi ngay cả nồng độ thấp nhất của các dung dịch tiêu chuẩn có thể nhìn thấy rõ. Nếu các giá trị Rf khá thấp và tách kém, thì lặp lại phép sắc ký sử dụng dầu nhẹ chứa 1% axeton.

Chú ý – Để phát hiện tốt các hợp chất clo hữu cơ trên các lớp mỏng, môi trường thử nghiệm không nên chứa axit clohidric, clo hoặc các hợp chất sunfua dù ở dạng vết. Thậm chí hơi của các dung môi halogen hóa, như clorofom, sẽ làm đen một cách nền đáng kể và dẫn đến độ nhạy phát hiện thấp.

11.2.5. Đánh giá sắc ký đồ

Nhận biết các vết chấm trong phần mẫu thử bằng cách so sánh với các vết chấm của các hợp chất chuẩn. Chỉ tính các vết chấm mà không xuất hiện trong mẫu thử trắng. Các giá trị Rf đối với thuốc trừ sâu clo hóa được đưa ra trong bảng 1.

Đánh giá lượng thuốc trừ sâu trong phần mẫu bằng cách so sánh với các vết chấm được đưa ra bởi các lượng khác nhau của các hợp chất chuẩn. Tốt nhất là sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí cùng cho các kết quả định tính và định lượng như nhau. Nhưng vì các đánh giá bằng sắc ký lớp mỏng không được chính xác lắm, nên có thể chênh lệch đáng kể so với kết quả thu được bằng sắc ký khí.

Thông thường trong các trường hợp này nên có hướng dẫn chung. Thí dụ, nếu sắc ký khí chỉ rõ 500 μg/kg và sắc ký lớp mỏng chỉ rõ 350 μg/kg, thì các kết quả này được coi là thỏa mãn. Mặt khác, nếu các kết quả thu được bằng sắc ký khí là 500 μg/kg và thu được bằng sắc ký lớp mỏng là 150 μg/kg tương ứng thì nên lặp lại phép phân tích.

11.3. Phép thử khẳng định C: Thay đổi hóa chất (Xem tài liệu tham khảo [17], [18], [19], [20] và [21])

11.3.1. Khái quát

Nhiều hợp chất clo hữu cơ có thể được chuyển thành các hợp chất khác bằng các phản ứng hóa học. Phản ứng chuyển hóa xảy ra trên cả dịch chiết mẫu chứa dư lượng được ước đoán và trên cả một lượng thích hợp của hợp chất chuẩn.

Việc so sánh tác động của hóa chất và sắc ký của sản phẩm phản ứng từ dịch chiết mẫu và hợp chất chuẩn cung cấp bằng chứng bổ sung để khẳng định sự có mặt dư lượng đã ước đoán có trong mẫu.

Trong số các hệ thống hóa chất khác nhau được xây dựng cho mục đích này, thì sự hình thành dẫn xuất trong chất nền đặc được khuyến nghị, vì sự đặc trưng của nó, nhạy và dễ thực hiện.

Bốn kỹ thuật chuyển hóa hóa chất nền đặc để khẳng định việc nhận biết các hợp chất clo hữu cơ khác nhau được mô tả dưới đây. Chưa có kỹ thuật như vậy cho HCB và do đó dùng quy trình khẳng định chuyển hóa ướt cho hợp chất này.

Bảng 1 – Các giá trị Rf của các hợp chất clo hữu cơ và các sản phẩm thoái biến của chúng trong hệ thống Al₂O₃E/dầu nhẹ

11.3.2. Hình thành dẫn xuất trong chất nền đặc

11.3.2.1. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

11.3.2.1.1. Nhôm oxit 60 (Al₂O₃) loại E kiềm hoạt tính, hoạt độ I, Merck 1067⁹⁾.

11.3.2.1.2. Nhôm oxit 90 (Al₂O₃), đã hoạt hóa, tính axit, hoạt độ I, Merck 10789).

Kiểm tra độ sạch của cả hai chất hấp phụ bằng cách lắc 0,5 g với 2 ml toluen tinh khiết. Để cho chất rắn lắng xuống và bơm phần nổi phía trên cho sang bộ sắc ký khí lỏng dưới cùng điều kiện đã sử dụng để phân tích thuốc trừ sâu. Nếu quan sát thấy các pic, thì làm sạch bằng cách nung ở 550⁰C ± 25⁰C ít nhất 3h.

11.3.2.1.3. Toluen, etyl axetat hoặc isooctan (2,2,4-trimetylpentan), thích hợp cho phép phân tích dư lượng thuốc trừ sâu.

11.3.2.1.4. Axit sunfuric, c(H₂SO₄) = 95% đến 97% dung dịch (phần khối lượng).

11.3.2.1.5. Axit clohidric (HCl), dễ bốc khói (ít nhất 37% phần khối lượng).

11.3.2.1.6. Kẽm clorua (ZnCl₂), khan, thí dụ: Merck 88169 ⁹⁾.

11.3.2.1.7. Chất nền đặc, để xử lý kiềm quy mô rất nhỏ (alumin kiềm).

Hòa tan 5 g kali hidroxit (KOH) dạng hạt trong 4 ml nước vào cốc thủy tinh 400 ml. Thêm 50 g nhôm oxit (11.3.2.1.1) với các lượng nhỏ trong khi vẫn khuấy kỹ bằng đũa thủy tinh. Chuyển sang bình 500 ml và lắc kỹ. Bảo quản trong bình hút ẩm cho đến khi sử dụng. Dung dịch này bền trên 6 tháng nếu được bảo quản khô.

11.3.2.1.8. Chất nền đặc, để khẳng định endrin (nhôm oxit axit).

Cẩn thận cho 5 ml axit sunfuric (11.3.2.1.4) vào 2,5 ml nước. Làm mát trước trong bể đá từ 20 phút đến 30 phút. Dùng chày để nghiền nhanh 50 g alumin có tính axit tinh khiết ở dạng đá lạnh (11.3.2.1.2) trong cối cùng với axit sunfuric pha loãng. Chuyển hỗn hợp này sang bình thủy tinh đậy kín và lắc trong 2 h trong máy lắc. Để bình vẫn đậy kín vào bình hút ẩm. Chất nền đặc được chuẩn bị như vậy có giá trị sử dụng trên 1 năm.

11.3.2.1.9. Chất nền đặc, để khẳng định endosunfan (nhôm oxit có tính axit mạnh).

Làm lạnh 5 ml axit sunfuric đậm đặc (11.3.2.1.4) và 25 g nhôm oxi axit đã làm sạch (11.3.2.1.2) một cách riêng rẽ đến dưới zero trong khoảng 30 phút. Trộn trong cối đã làm lạnh trước và nghiền nhanh cho đến khi thu được hỗn hợp dạng bột rời.

Bảo quản trong bình đậy kín khí để trong bình hút ẩm cho đến khi sử dụng.

11.3.2.1.10. Chất nền đặc, để khẳng định nhận biết dieldrin (nhôm oxit thấm đầy kẽm clorua và axit clohidric).

Cho 0,4g kẽm clorua dạng khan (11.3.2.1.6) vào cốc 100 ml. Thêm 0,8 ml axit clohidric (11.3.2.1.5) và khuấy nhanh bằng đũa thủy tinh cho đến khi chất rắn được hòa tan hết. Thêm 10g nhôm oxit axit (11.3.2.1.2) và trộn kỹ cho đến khi thu được hỗn hợp bột rời.

Bảo quản trong chai đậy kín. Cứ hai ngày thì chuẩn bị chất nền mới.

11.3.2.2. Cách tiến hành

11.3.2.2.1. Khẳng định DDT, TDE, metoxyclo, anpha-clorodan, heptaclo và heptaclo epoxit

Cho vào hai ống thủy tinh 10 ml, mỗi ống khoảng 1 g chất nền có tính kiềm (11.3.2.1.7). Cho vào một ống nghiệm một phần thích hợp của dịch chiết mẫu đã làm sạch và cô đặc. Cho vào ống còn lại một phần dung dịch tiêu chuẩn chứa một lượng hợp chất clo hữu cơ giống như hợp chất đã dự đoán có trong dịch chiết mẫu.

Loại trừ các dung môi bằng cách thổi nhẹ một dòng không khí sạch hoặc làm ấm nhẹ các ống. Trộn chất nền đặc khô bằng cách đặt hai ống lên máy rung hoặc trong bể siêu âm. Tra cứu bảng 2 về các điều kiện phản ứng và dung môi sử dụng để chiết các dẫn xuất khác nhau. Thêm 1 ml hoặc 2 ml dung môi thích hợp và chiết dẫn xuất bằng cách lắc mạnh hoặc đặt các ống nghiệm trong bể siêu âm 2 phút. Để cho các hạt hấp phụ lắng xuống và bơm một phần chất lỏng nổi phía trên lên bộ sắc ký khí. Sự nhận dạng các sản phẩm phản ứng, lượng có thể phát hiện nhỏ nhất của chúng và thời gian lưu tương đối được liệt kê trong bảng 2.

Bảng 2 – Khẳng định việc nhận dạng hợp chất clo hữu cơ bằng sự hình thành dẫn xuất trong chất nền đặc nhôm oxit/KOH

Các hợp chất clo hữu cơ khác, tức là HCB, PCB, g-clodan, aldrin, dieldrin và endrin giữ nguyên không đổi trong quá trình phản ứng. Các đồng phân HCH hoàn toàn bị phá vỡ thành các đồng phân triclobenzen, các đồng phân này rửa giải cùng với dung môi tạo pic trong suốt quá trình sắc ký khí lỏng.

Nếu có mặt một lượng HCH đáng kể, thì có thể quan sát thấy ba đồng phân triclobenze bằng cách hạ nhiệt độ cột đến khoảng 110⁰C. Đồng phân 1,2,4- chiếm phần lớn.

11.3.2.2.2. Khẳng định dư lượng endrin

Chuẩn bị các dẫn xuất như mô tả trong 11.3.2.2.1, sử dụng chất nền đặc như quy định trong 11.3.2.1.8. Sau khi đã loại dung môi và trộn xong các chất rắn, đậy nút các ống nghiệm và để cho phản ứng xảy ra ít nhất 2 h hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Thêm 1 ml hoặc 2 ml toluen. Chiết dẫn xuất và phân tích bằng sắc ký khí lỏng như mô tả trong 11.3.2.2.1 sử dụng cột 1,5% OV-17/1, 95% QF-1.

Dẫn xuất keton hexacloropentaxyclic có thời gian lưu tương đối (aldrin = 1,00) 7,9 trên cột 1,5% OV – 17/1, 95% QF-1 và 30,7 trên 2% DEGS + 0,5% H₃PO₄.

13.3.2.2.3. Khẳng định dư lượng endosulfan

Chuẩn bị các dẫn xuất như mô tả trong 11.3.2.2.1, sử dụng chất nền đặc như quy định trong 11.3.2.1.10 (nhôm oxit có tính axit mạnh). Đun nóng chất nền đặc đã tẩm ở nhiệt độ 95⁰C trong 1h.

Để nguội và thêm 2 ml toluen vào cả hai ống nghiệm. Đậy nắp và lắc mạnh 1 phút để chiết chất đã được phản ứng và phân tích chất lỏng nổi phía trên bằng sắc ký khí lỏng.

Endosulfan đã nhận được khẳng định, nếu sắc ký đồ của dịch chiết mẫu đã phản ứng cho thấy không có mặt các pic đã quan sát thấy trước đó ứng với các đồng phân của alpha – và beta – và dạng ngoài của pic endosulfan ete lớn cũng có mặt trên sắc ký đồ của dung dịch tiêu chuẩn đã xử lý theo cách tương tự. Thời gian lưu tương đối (aldrin = 1,00) của endosulfan ete là 0,77 trên cột 1,5% OV-17/1, 95% QF-1 và 1,32 trên cột 2% DEGS + 0,5% H₃PO₄.

11.3.2.2.4. Khẳng định dư lượng dieldrin

Tương tự như quy trình nêu trong 11.3.2.2.1, chuẩn bị các dẫn xuất dieldrin trong chất nền đặc thích hợp (11.3.2.1.10) ở 120⁰C trong 30 phút. Chiết dẫn xuất bằng toluen và phân tích bằng sắc ký khí lỏng.

Diedrin đã nhận dạng được khẳng định, nếu sắc ký đồ của dịch chiết mẫu đã phản ứng cho thấy không có mặt dieldrin đã quan sát thấy trước đó và dạng ngoài pic của dẫn xuất (aldrin clorohydrin) cũng có mặt trên sắc ký đồ của dung dịch tiêu chuẩn đã xử lý đồng thời.

Thời gian lưu tương đối (aldrin = 1,00) của aldrin clorohydrin là 5,35 trên cột 1,5% OV-17/1, 95% QF-1.

Các thuốc trừ sâu khác không gây nhiễu. Các đồng phân của HCH, HCB, PCB, heptaclo epoxit, các đồng phân của clodan, p,p’-DDE và p,p’-TDE giữ nguyên không đổi. Endrin được chuyển thành hợp chất keton, chất này rửa giải tiếp dẫn xuất dieldrin. Heptaclo tạo ra sản phẩm phản ứng với thời gian lưu giống như thời gian lưu của hidroxycloden, trong khi p,p’-DDT lại chuyển thành p,p’-DDE trên cột OV-17/QF-1. Tuy nhiên, tốc độ chuyển hóa ít khi cao hơn 50%.

11.3.3. Khẳng định việc nhận dạng các dư lượng hexaclorobenzen (HCB)

11.3.3.1. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

11.3.3.1.1. Dầu nhẹ, đạt chất lượng để phân tích dư lượng.

11.3.3.1.2. Thuốc thử metoxyl hóa

Hòa tan 4 g natri hidroxit trong 25 ml metanol, dùng bộ khuấy từ. Thêm từ từ 50 ml pyridin tinh khiết (được chưng cất qua kali hidroxit). Chuẩn bị dung dịch mới hàng ngày.

11.3.3.1.3. Natri sunfat (Na₂SO₄), khan, dạng hạt.

11.3.3.2. Cách tiến hành

Cho một thể tích thích hợp dịch chiết mẫu đã làm sạch vào bình cầu đáy tròn 50 ml và cô đặc đến khoảng 2 ml. Thêm 5 ml thuốc thử metoxyl (11.3.3.1.2). Đậy chặt nắp bình và làm nóng đúng 20 phút trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 50⁰C.

Làm mát dưới dòng nước chảy và chuyển lượng hỗn hợp phản ứng sang phễu chiết 125 ml, dùng 30 ml dầu nhẹ (11.3.3.1.1). Thêm 20ml nước, lắc mạnh trong 1 phút và chuyển pha lỏng phía dưới sang phễu chiết thứ hai. Chiết lại hai lần bằng 15ml dầu nhẹ. Gộp các dịch chiết bằng dầu nhẹ và rửa bốn lần, mỗi lần dùng 15 ml nước.

Làm khô dịch chiết bằng natri sunfat khan (11.3.3.1.3) và đưa về một thể tích thích hợp và phân tích bằng sắc ký khí lỏng.

Xử lý một phần thích hợp của dung dịch tiêu chuẩn HCB theo cách tương tự.

Kiểm tra các dịch chiết đã phản ứng bằng sắc ký khí lỏng. Hợp chất có thời gian lưu của pentacloroanisol sẽ được quan sát trong cả hai dịch chiết nếu HCB có mặt trong dịch chiết mẫu.

11.4. Phép thử khẳng định D: Thay đổi quang hóa (xem tài liệu tham khảo [22]).

11.4.1 Khái quát

Có thể sử dụng việc rọi ánh sáng cực tím ở bước sóng 254 nm để khẳng định các dư lượng giả định của aldrin, γ-clodan, dieldrin, endrin, hexaclobenzen và heptaclo epoxit trong số các loại khác. Việc thay đổi trong sắc đồ khí gây ra do việc rọi được đặc trưng cho các hợp chất liên quan.

11.4.2. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

11.4.2.1. Ống thủy tinh, dài 53 mm và đường kính trong 8 mm.

11.4.2.2. Đèn thủy ngân, có bước sóng chính 254 nm (thí dụ, “Pen-Ray”, Agpe 11 8c-1, 5,5W hoặc tương đương 10).

11.4.2.3. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 20⁰C ± 1⁰C.

11.4.3. Cách tiến hành

Chuyển 1 ml dịch chiết đã làm sạch trong dầu nhẹ vào ống nghiệm thủy tinh (11.4.2.1) và đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy (11.3.2.3). Đặt đèn cực tím (11.4.2.2) vào dung dịch và rọi từ 5 phút đến 10 phút. Pha loãng một lần nữa đến 1 ml, nếu cần, và bơm 5 μl dung dịch theo cách tương tự như trước khi rọi. So sánh các sắc ký khí thu được trước và sau khi rọi.

12. Quy trình làm sạch bổ sung

Chú thích – Quy trình làm sạch khuyến nghị bổ sung thêm alumin đã phủ bạc nitrat để loại bỏ các chất gây nhiễu gặp phải trong quá trình phân tích phomat có hương vị tỏi.

12.1. Nguyên tắc

Dịch chiết đã hấp phụ được làm sạch bằng sắc ký đổ trên cột nhôm oxit phủ bạc nitrat

12.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương.

12.2.1. Nhôm oxit (Al₂O₃) trung tính (Merck số 1077 11) hoặc tương đương).

Nung ở 550⁰C trong 4 h. Để nguội rồi cho thêm 7 phần nước vào 93 phần nhôm oxit (tính theo thể tích) và lắc mạnh cho đến khi nước đã được hấp thụ hoàn toàn và được phân bố đồng đều.

12.2.2. n-Hexan [CH₃(CH₂)₄CH₃], đạt chất lượng phân tích dư lượng.

12.2.3. Chất hấp phụ sắc ký

Hòa tan 0,75 g bạc nitrat (AgNO₃) trong 0,7 ml nước. Đun nóng và cho thêm từ từ 4 ml axeton (CH₃COCH₃). Trộn nhanh dung dịch với 10 g nhôm oxit (12.2.1). Loại bỏ axeton bằng dòng khí nitơ.

12.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và các loại sau:

11.3.1. Cột sắc ký, dài 150 mm và đường kính trong 8 mm, có van khóa PTFE.

12.3.2. Bộ cô quay chân không (Kuderna-Danish²⁾ hoặc loại tương đương) có bình dung tích 100 ml và được gắn với ống chia độ.

12.4. Cách tiến hành

Đặt nút bông cotton hoặc bông thủy tinh vào đáy cột sắc ký (12.3.1) và rót 5 ml n-hexan (12.2.2) lên cột (12.3.1), giữ vòi ở trạng thái khóa. Trộn 2 g chất hấp phụ (12.2.3) và 10 ml n-hexan trong bình 100 ml. Rót huyền phù này lên cột và rửa sạch bình để chuyển hết hỗn hợp. Cho n-hexan chảy đến mức 10 mm cao hơn đỉnh chất hấp phụ trong cột và loại bỏ dịch rửa giải. Cho lên cột 1,0ml dịch chiết cô đặc thu được bằng quy trình làm sạch chính.

Rửa giải bằng 20ml n-hexan với tốc độ dòng không quá 3 ml/min cho vào bình cô quay chân không 100 ml (12.3.2). Cô dịch rửa giải đến khi thể tích còn từ 2 ml đến 3 ml trong bộ cô quay chân không (12.3.2) và cho dung dịch bay hơi đến chính xác 1,0 ml bằng dòng khí nitơ. Dịch chiết đã làm sạch này thích hợp cho phép phân tích sắc ký khí lỏng.

Trong suốt quy trình, heptaclo tạo ra dẫn xuất có thời gian lưu giống với thời gian lưu của aldrin trên một số cột sắc ký khí lỏng nhất định.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] GUNTHER, F.A et al. Anal, Chem., 23, 1951, p: 1835.

[2] BURKE, J.A. MILLS, P.A. and BOSTWICK, D.C.J.AOAC, 49, 1966, p.999.

[3] HORWITZ, w. (ed). Official Methods of Analysis of the AOAC, 12^th edition, Washington DC, 1975, pp. 518-525.

[4] DE FAUBER MAUNDER, M.J. et al. Clean up of Animal Fats and Dairy Products for the Analysis of Chlorinated Pesticide Residues, Analyst, 89, 1964, pp. 168-174.

[5] BRO-RASMUSSEN, F., RODIN, F. and VOLDUM-CLAUSEN, K. Uberprufung einer gaschromatographischen Methode zur Bestimmung chlorieter Insektizide in Butter and pflanzlichen Erzeugnissen. Zeitschrift fur Lebensmittel Untersuchung and –Forschung, 138, 1968, pp. 276-284.

[6] SPECHT, W. Untersuchung von Lebensmitteln auf Pestizidruckstande (Gaschromatographische Methode zur gleichzetigen Bestimmung von Ruckstanden der Organochlor and Organophosphor-Pesrizide). Working paper (1974).

[7] TELLING, G.M, SISSONS, D.J., BRINKMAN H.W.J Chromatography, 137, 1977, p.405.

[8] GREVE, P.A. and GREVENSTUK, W.B.F. A convenient small-scale-up method for extracts of fatty samples with basic alumina before GLC-analysis on organochlorine pesticides residues. Mededeling Fakulteit Landbouwwetenschappen (Gent), 40, 1975, pp. 1115-1124.

[9] STIJVE, T. and CARDINALE, E. Rapid Determination of Chlorinated Pesticides, Polychlorinated Biphenyls and a Number of Phosphated Insecticides in Fatty Foods. Mitt. Levensmitterunters. Hyg., 65, 1974, pp. 131-150.

[10] LANGLOIS, B.E., STEMP, A.R, and LISKA B.J. Rapid Clean-up of Dairy Products for Analysis of Chlorinated Insecticide Residue by Electron Capture Chromatography. J.Agr. Food Chem., 12.1964, pp. 243-245.

[11] STIJVE, T. and BRAND, E. A Rapid Low Cost Small-Scale Clean-up. Method for the Determination of Orgnochlorine Pesticide Residues in Fats and Oils. Deutsche Lebensm. Rundschau. 37, 1977, pp. 41-42

[12] STEINWANDTER, H. Beitrage zur Verwendung von Kieselgel in der Pestizidanalytik: II. Analytik and Kapill Gas-Chromatographie von β-HCH and anderen Chlorkohlenwasserstoff-Pestiziden. Z Anal. Chem., 304, 1980, pp. 137-140.

[13] STEINWANDTER, H. Contributions to silica gel application in pesticide residue analysis: III. An online method for extracting and isolating chlorinated hydrocarbon pesticides and PCB’s from milk and dairy products. Z. Anal. Chem., 312, 1982, pp-342-345.

[14] GROB, K and GROB, G. Techniques of capillary gas-chromatography. Possibilities of the full utilization of high-performance columns. Part I: Direct sample injection. Chromatographia, 5, 1972, pp. 3-12.

[15] VAN DEN BERG, P.M.J. and COX, T.P.H. An all-glass solid sampling device for open tubular columns in gas chromatography. Chromatographia, 5, 1972, pp. 301-305.

[16] TUINSTRA, L.G.M.Th. and TRAAG, W.A. Automated glass capillary gas chromatography analysis of PCB and organochlorine pesticide residues in agricultural products. J. HRC & CC, 2, 1979, pp. 723-728.

[17] CHAU, A.S.Y and LA NOUETTE, M. J. AOAC, 55, 1972, pp. 1058-1066.

[18] CHAU, A.S.Y. Bulletin of Environmental Contamination & Toxicology, 8, 1972, pp. 169-176.

[19] CHAU. A.S.Y.J. AOAC, 55, 1972, pp. 1232-1238.

[20] WIENCKE, W.W. and BURKE, J.A. J. AOAC, 52, 1969, pp. 1277-1280.

[21] ZIMMERLI, B. and MAREK, B. Entwicklung einer gaschromatographischen Bestimmungs- and Bestatigungsmethode fur Hexachlorbenzolruckstande in Fetten and Olen. Mitt. Lebenmittelunters. Hyg., 63, 1972, pp. 273-389.

[22] MANSOUR, M. and PARLAR, HJ. Agric. Food Chem., 26, 1978, pp. 483-485.