Tiêu chuẩn TCVN 13802:2023 Sữa, sản phẩm sữa, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và thức ăn dinh dưỡng dành cho người lớn

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13802:2023

ISO 16958:2015

SỮA, SẢN PHẨM SỮA, THỨC ĂN CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ THỨC ĂN DINH DƯỠNG DÀNH CHO NGƯỜI LỚN - XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN AXIT BÉO - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ MAO QUẢN

Milk, milk products, infant formula and adult nutritionals - Determination of fatty acids composition - Capillary gas chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 13802:2023 hoàn toàn tương đương với ISO 16958:2015;

TCVN 13802:2023 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA, SẢN PHẨM SỮA, THỨC ĂN CÔNG THỨC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ THỨC ĂN DINH DƯỠNG DÀNH CHO NGƯỜI LỚN - XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN AXIT BÉO -
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ MAO QUẢN

Milk, milk products, infant formula and adult nutritionals - Determination of fatty acids composition - Capillary gas chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng từng axit béo riêng lẻ và/hoặc tổng các axit béo có trong sữa, các sản phẩm sữa, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh và thức ăn dinh dưỡng dành cho người lớn có chứa chất béo sữa và/hoặc dầu thực vật, được bổ sung hoặc không bổ sung các loại dầu giàu axit béo không bão hòa đa chuỗi dài (LC-PUFA). Điều này cũng bao gồm các nhóm axit béo thường được dán nhãn [tức là axit béo dạng trans (TFA), axit béo bão hòa (SFA), axit béo không bão hòa đơn (MUFA), axit béo không bão hòa đa (PUFA), axit béo omega-3, omega-6 và omega-9] và/hoặc axit béo riêng lẻ [tức là axit linoleic (LA), axit a-linolenic (ALA), axit arachidonic (ARA), axit eicosapentaenoic (EPA) và axit docosahexaenoic (DHA)].

Phép xác định được thực hiện bằng phương pháp chuyển este hóa trực tiếp trên nền mẫu, không cần chiết chất béo trước và do đó có thể áp dụng cho các mẫu dạng lỏng hoặc mẫu dạng bột đã hoàn nguyên với nước, có tổng hàm lượng chất béo ≥ 1,5 % khối lượng.

Chất béo chiết được từ các sản phẩm có chứa ít hơn 1,5 % khối lượng chất béo được phân tích bởi cùng phương pháp sau khi chiết chất béo sơ bộ bằng các phương pháp nêu trong Điều 2. Các sản phẩm từ sữa, như phomat mềm hoặc cứng có độ axit ≤ 1 mmol/100 g chất béo, có thể được phân tích sau khi chiết chất béo sơ bộ bằng các phương pháp nêu trong Điều 2. Đối với các sản phẩm được bổ sung hoặc làm giàu PUFA từ dầu cá hoặc tảo, dung môi phải để bay hơi ở nhiệt độ thấp nhất có thể (ví dụ: tối đa 40 °C) để thu hồi các axit béo này.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6510 (ISO 1740), Bơ và sản phẩm chất béo của sữa - Xác định axit béo của chất béo (Phương pháp chuẩn)

TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức

TCVN 8103 (ISO 14156), Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp chiết lipit và các hợp chất hòa tan trong lipit

TCVN 8181 (ISO 1735), Phomat và sản phẩm phomat chế biến - Xác định hàm lượng chất béo - Phương pháp khối lượng (Phương pháp chuẩn)

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Hàm lượng axit béo (fatty acids content)

Phần khối lượng của từng chất hoặc nhóm chất được xác định bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH 1 Xem Bảng A.1.

CHÚ THÍCH 2 Hàm lượng axit béo được biểu thị bằng phần trăm khối lượng tính bằng gam (hoặc miligam) của axit béo trên 100 g sản phẩm (xem Bảng A.1). Kết quả axit béo có thể được chuyển đổi thành các định dạng biểu thị kết quả khác (xem 10.2).

4  Nguyên tắc

Bổ sung dung dịch nội chuẩn vào mẫu, chuẩn bị metyl este của axit béo (FAME) bằng cách chuyển este hóa trực tiếp với natri metoxit metanol đối với các mẫu dạng lỏng; hòa tan (hoàn nguyên) trong nước đối với mẫu dạng bột và chuyển este hóa trực tiếp bằng natri metoxit metanol. Quá trình chuyển este hóa tương tự được áp dụng cho chất béo chiết từ các loại thực phẩm khác nhau (ví dụ: các sản phẩm có chất béo thấp, phomat).

Tách các FAME bằng sắc ký khí lỏng mao quản. Nhận dạng FAME bằng cách so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn tinh khiết và định lượng theo axit béo đối chứng với chất nội chuẩn (FAME C11:0) và các hệ số đáp ứng của thiết bị. Sử dụng chất nội chuẩn thứ hai (TAG C13:0) để đánh giá xác nhận hiệu năng phân hủy.

5  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử phân tích, trừ khi có quy định khác:

5.1 n-hexan, [CH₃(CH₂)₄CH₃], loại dùng cho sắc ký.

5.2  Metanol, [CH₃OH], loại dùng cho sắc ký.

5.3  Nước, loại dùng cho HPLC hoặc chất lượng tinh khiết tương đương.

5.4  Dung dịch natri metoxit [CH₃ONa], được hòa tan trong metanol 30 % khối lượng/thể tích, hoặc 25 % khối lượng/thể tích, tùy thuộc vào tình trạng sẵn có.

5.5  Dung dịch chuyển este hóa (dung dịch natri metoxit 5 % khối lượng/thể tích trong metanol)

Dùng pipet lấy 50 ml (hoặc 60 ml) dung dịch natri metoxit 30 % khối lượng/thể tích (hoặc 25 % khối lượng/thể tích) cho vào bình định mức dung tích 300 ml và khuấy nhẹ với 250 ml metanol sử dụng máy khuấy từ. Rút máy khuấy từ ra, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng và thêm metanol đến vạch.

Dung dịch này bền trong một tuần khi bảo quản trong tối ở 4 °C. Để dung dịch đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Lượng dung dịch này đủ để phân tích khoảng 40 mẫu. Khi số lượng phân tích ít hơn, thì chỉnh thể tích thuốc thử tương ứng.

Thực hiện phản ứng chuyển este hóa ở nhiệt độ môi trường (từ 20 °C đến 25 °C).

CHÚ THÍCH: Giá trị ghi trong ngoặc () tương ứng với dung dịch natri metoxit nồng độ 25 % khối lượng/thể tích.

5.6  Di-natri hydro xitrat sesquihydrat, [HOC(COOH)(CH₂COONa)₂.1,5 H₂O].

5.7  Natri clorua, [NaCI].

5.8  Dung dịch trung hòa, (di-natri hydro xitrat sesquihydrat 10 % khối lượng/thể tích, natri clorua 15 % khối lượng/thể tích trong nước).

Cân 50,0 g di-natri hydro xitrat sesquihydrat và 75,0 g natri clorua cho vào bình định mức 500 ml. Hòa tan trong 450 ml nước sử dụng máy khuấy từ. Nhấc khỏi máy khuấy từ, sau đó thêm nước đến vạch.

Dung dịch này bền trong một tháng khi bảo quản trong tối ở 4 °C. Các tinh thể muối có thể xuất hiện trong dung dịch trong quá trình bảo quản, nhưng mất đi sau khi lắc.

Để dung dịch đạt đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Thể tích dung dịch này đủ để phân tích khoảng 40 mẫu trở lên. Khi số lượng phân tích ít hơn (hoặc phân tích một lần) thì chỉnh khối lượng và thể tích dung dịch tương ứng.

5.9  Tert-butyl metyl ete (MTBE), loại dùng cho sắc ký.

5.10  Metyl undecanoat (C11:0 FAME), có độ tinh khiết ≥ 99 % phần khối lượng.

5.11  Tritridecanoin (C13:0 TAG), có độ tinh khiết ≥ 99 % phần khối lượng.

5.12  Dung dịch chuẩn C11:0 FAME/C13:0 TAG.

Cân khoảng 500 mg tritridecanoin và 500 mg metyl undecanoat, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức 250 ml. Hòa tan và đổ đầy đến vạch định mức bằng MTBE.

Dung dịch bền trong một tuần khi bảo quản trong tối ở 4 °C. Để dung dịch đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

Thể tích dung dịch này đủ để phân tích khoảng 40 mẫu trở lên. Khi số lượng mẫu phân tích nhỏ hơn thì chỉnh khối lượng và thể tích dung môi chuẩn tương ứng.

5.13  Hỗn hợp metyl este của axit octadecenoic, hỗn hợp đồng phân cis và trans của C18:1 với trans-4 đến trans-16 octadecenoic (tất cả các đồng phân) và các đồng phân cis chính. Nồng độ 2,5 mg/ml trong metylen clorua.

CHÚ THÍCH: Chất chuẩn này có sẵn trên thị trường từ Supelco Inc, nhãn hiệu của Sigma-Aldrich (Cat. 40495-U)1).

5.14  Hỗn hợp metyl este của axit linoleic, hỗn hợp đồng phân cis và trans của C18:2 với axit trans-9, trans- 12-octadecadienoc (khoảng 50 %), axit cis-9, trans- 12-octadecadienoic (khoảng 20 %), axit trans-9, cis- 12-octadecadienoic (khoảng 20 %) và axit cis-9, cis-12-octadecadienoic (khoảng 10 %). Nồng độ 10 mg/ml trong metylen clorua.

CHÚ THÍCH: Chất chuẩn này có sẵn trên thị trường từ Supelco Inc, thương hiệu của Sigma-Aldrich (Cat. 47791)1).

5.15  Hỗn hợp đồng phân metyl este của axit linolenic, hỗn hợp đồng phân cis và trans của C18:3 với

- metyl este của axit cis-9, cis-12, cis- 15-octadecatrienoic (khoảng 3 % phần khối lượng),

- metyl este của axit cis-9, cis-12, trans-15-octadecatrienoic (khoảng 7 % phần khối lượng),

- metyl este của axit cis-9, trans-12, cis- 15-octadecatrienoic (khoảng 7 % phần khối lượng),

- metyl este của axit cis-9, trans-12, trans-15-octadecatrienoic (khoảng 15 % phần khối lượng),

- metyl este của axit trans-9, cis-12, cis-15-octadecatrienoic (khoảng 7 % phần khối lượng),

- metyl este của axit trans-9, cis-12, trans- 15-octadecatrienoic (khoảng 15 % phần khối lượng),

- metyl este của axit trans-9, trans-12, cis-15-octadecatrienoic (khoảng 15 % phần khối lượng), và

- metyl este của axit trans-9, trans-12, trans-15-octadecatrienoic (khoảng 30 % phần khối lượng).

Nồng độ 10 mg/ml trong metylen clorua.

CHÚ THÍCH: Chất chuẩn này có bán sẵn trên thị trường từ hãng Supelco Inc, thương hiệu Sigma Aldrich (Cat. 47792)1). Chất chuẩn này chứa tất cả các đồng phân trans của C18:3 (tổng cộng là tám đồng phân) nhưng độ nhiễu và tỷ lệ của chúng khác với độ nhiễu và tỷ lệ quan sát được trong dầu và mỡ tinh luyện/khử mùi.

5.16  Metyl octadecadienoate liên kết axit, hỗn hợp của C18:2 cis-9, trans-11 và cis-10, trans-12- octadecadienoat liên kết axit, có độ tinh khiết ≥ 99 % phần khối lượng.

CHÚ THÍCH: Chất chuẩn này có bán sẵn trên thị trường từ hãng Supelco Inc, thương hiệu Sigma Aldrich (Cat. 05507)1). Chất chuẩn này chứa hai đồng phân CLA chính, nhưng tỷ lệ đồng phân có thể thay đổi tùy theo từng lô.

5.17  Định tính dung dịch hỗn hợp chuẩn đồng phân cis và trans

Để xác định thời gian lưu (RT) nhận diện các đồng phân cis và trans (tức là C18:1, C18:2, C18:3 và CLA), chuẩn bị dung dịch chuẩn định tính với các chất chuẩn được liệt kê trong 5.13 đến 5.16. Có thể sử dụng tất cả các chất chuẩn có sẵn trên thị trường. Cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung từng dung dịch đồng phân chuẩn theo tỷ lệ bằng nhau. Hòa tan và thêm n-hexan đến vạch. Pha loãng để phù hợp với bộ bơm được sử dụng.

5.18  Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn FAME

5.18.1  Chuẩn bị với các chất chuẩn FAME riêng lẻ

5.18.1.1  Chất chuẩn FAME riêng lẻ

Các chất chuẩn FAME riêng lẻ như sau (độ tinh khiết ≥ 99 %):

Metyl este axit butyric (C4:0), metyl este axit caproic (C6:0), metyl este axit caprylic (C8:0), metyl este axit capric (C10:0), metyl este axit undecanoic (C11:0), metyl este axit lauric (C12:0), metyl este axit tridecanoic (C13:0), metyl este axit myristic (C14:0), metyl este axit myristoleic (C14:1 cis-9 hoặc n-5), metyl este axit pentadecanoic (C15:0), metyl este axit cis- 10-pentadecenoic (C15:1 cis-10 n-5), metyl este axit palmitic (C16:0), metyl este axit palmitoieic (C16:1 cis-9 hoặc n-7), metyl este axit heptadecanoíc (C17:0), metyl este axit cis-10-heptadecenoic (C17:1 cis-10 hoặc n-7), metyl este axit stearic (C18:0), metyl este axit elaidic (C18:1 trans-9 hoặc n-9), metyl este axit oleic (C18:1 cis-9 hoặc n-9), metyl este axit linolelaidic (C18:2 all trans-9,12 hoặc n-6), linoleic axit metyl este (C18:2 all cis-9,12 hoặc n-6), metyl este axit arachidic (C20:0), metyl este axit gamma-linoleic (C18:3 all cis-6,9,12 hoặc n-6), metyl este axit cis-11-eicosenoic (C20:1 cis-11 hoặc n-9), metyl este axit linolenic (C18:3 all cis-9,12,15 hoặc n-3), metyl este axit heneicosanoic (C21:0), metyl este axit cis-11,14-eicosadienoic (C20:2 all cis-11,14 hoặc n-6), metyl este axit behenic (C22:0), metyl este axit cis-8,11,14- eicosatrienoic (C20:3 all cis-8,11,14 hoặc n-6 cis), metyl este axit erucic (C22:1 cis-13 hoặc n-9), metyl este axit cis-11,14,17-eicosatrienoic (C20:3 all cis-11,14,17 hoặc n-3), metyl este axit arachidonic (C20:4 all cis-5,8,11,14 hoặc n-6), metyl este axit cis -13,16-docosadienoic (C22:2 all cis-13,16 hoặc n-6), metyl este axit lignoceric (C24:0), metyl este axit cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic (C20:5 all cis- 5,8,11,14,17 hoặc n-3), metyl este axit nervonic (C24:1 cis-15 hoặc n-9), metyl este axit cis- 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic (C22:6 all cis-4,7,10,13,16,19 hoặc n-3).

CHÚ THÍCH:Việc mua các chất chuẩn FAME riêng lẻ sẽ đắt hơn hỗn hợp chất chuẩn FAME đơn lẻ. Ngoài ra, việc cân từng chất chuẩn FAME riêng lẻ có thể không chính xác và yêu cầu cân với độ chính xác cao.

5.18.1.2  Dung dịch gốc 1 - Bão hòa

Cân khoảng 25 mg metyl este axit linoceric (C24:0), 25 mg metyl este axit behenic (C22:0), 25 mg metyl este axit heneicosanoic (C21:0), 25 mg metyl este axit arachidic (C20:0), 25 mg metyl este sacid (C18:0), 25 mg metyl este axit heptadecanoic (C17:0), 50 mg metyl este axit palmitic (C16:0), 25 mg metyl este axit pentadecanoic (C15:0), 25 mg metyl este axit myristic (C14:0), 25 mg metyl este axit tridecanoic (013:0), 25 mg metyl este axit lauric (C12:0), 25 mg metyl este axit undecanoic (C11:0), 25 mg metyl este axit capric (C10:0), 25 mg metyl este axit caprylic (C8:0), 25 mg metyl este axit caproic (C6:0) và 25 mg metyl este axit butyric (C4:0), chính xác đến 0,1 mg. Cho vào bình định mức dung tích 100 ml, thêm n-hexan đến vạch.

Axit palmitic được cân với lượng gấp đôi. Các metyl este axit béo mạch ngắn (tức là C4:0, C6:0 và C8:0) dễ bay hơi và phải được cân khi kết thúc quy trình.

5.18.1.3  Dung dịch gốc 2 - Không bão hòa đơn

Cân khoảng 25 mg metyl este axit nervonic (C24:1 cis-15 hoặc n-9), 25 mg metyl este axit erucic (C22:1 cis-13 hoặc n-9), 25 mg metyl este axit cis-11-eicosenoic (C20:1 cis-11 hoặc n-9), 25 mg metyl este axit oleic (C18:1 cis-9 hoặc n-9), 25 mg metyl este axit elaidic (C18:1 trans-9 hoặc n-9 trans), 25 mg metyl este axit cis-10-heptadecenoic (C17:1 cis-10 hoặc n-7), 25 mg metyl este axit palmitoleic (C16:1 cis-9 hoặc n-7), 25 mg metyl este axít cis-10-pentadecenoic (C15:1 cis-10 hoặc n-5) và 25 mg metyl este axit myristoleic (C14:1 cis-9 hoặc n-5), cân chính xác đến 0,1 mg. Cho vào bình định mức 100 ml, thêm n-hexan đến vạch.

5.18.1.4  Dung dịch gốc 3 - Không bão hòa đa

Cân khoảng 25 mg metyl este axit linolelaidic (C18:2 all trans-9,12 hoặc n-6 trans), 25 mg metyl este axit linoleic (C18:2 all cis-9,12 hoặc n-6), 25 mg metyl este axit gamma-linoleic (C18:3 all cis-9,12 hoặc n-6), 25 mg metyl este axit linolenic (C18:3 all cis-12,15 hoặc n-3), 25 mg metyl este axit cis-11,14- eicosadienoic (C20:2 all cis-11,14 hoặc n-6), 25 mg metyl este axit cis-8,11,14-eicosatrienoic (C20:3 all cis-8,11,14 hoặc n-6), 25 mg metyl este axit cis-11,14,17-eicosatrienoic (C20:3 all cis-11,14, 17 hoặc n-3), 25 mg metyl este axit arachidonic (C20:4 all cis-5,8,11,14 hoặc n-6), 25 mg metyl este axit cis- 13,16-docosadienoic (C22:2 cis-13,16 hoặc n-6), 25 mg metyl este axit cis-5,8,11,14,17- eicosapentaenoic (C20:5 all cis-5,8,11,14,17 hoặc n-3) và 25 mg metyl este axit cis-4,7,10,13,16,19- docosahexaenoic (C22:6 cis-4,7,10,13,16,19 hoặc n-3), cân chính xác đến 0,1 mg. Cho vào bình định mức 100 ml, thêm n-hexan đến vạch.

5.18.1.5  Chuẩn bị dung dịch chuẩn hiệu chuẩn FAME

Dùng pipet lấy 25,0 ml dung dịch gốc chuẩn hiệu chuẩn 1 (5.18.1.2), 25,0 ml dung dịch gốc chuẩn hiệu chuẩn 2 (5.18.1.3) và 25,0 ml dung dịch gốc chuẩn hiệu chuẩn 3 (5.18.1.4). Cho vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm n-hexan đến vạch. Pha loãng phù hợp với loại bơm được sử dụng.

Dung dịch này bền trong khoảng sáu tháng khi bảo quản nơi tối ở -20 °C. Để tránh nhiễm bẩn dung dịch chuẩn, phân phối dung dịch vào các lọ khác nhau (sẵn sàng để bơm) và bảo quản chúng ở -20 °C trước khi sử dụng. Sử dụng lọ dùng một lần, sau đó loại bỏ.

5.18.2  Chuẩn bị từ hỗn hợp chất chuẩn FAME định lượng

5.18.2.1  Hỗn hợp chất chuẩn FAME định lượng

Hỗn hợp chất chuẩn FAME định lượng: Nu-Check-Prep, Số GLC Cat.- Nestle-362).

Hỗn hợp chuẩn hiệu chuẩn FAME được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phần trăm khối lượng của mỗi thành phần được chỉ ra trong chứng chỉ kèm theo. Mỗi ống chứa khoảng 100 mg hỗn hợp chuẩn hiệu chuẩn FAME. Tất cả các chất chuẩn FAME riêng lẻ được phân phối theo tỷ lệ bằng nhau trong hỗn hợp chuẩn, ngoại trừ metyl este của axit palmitic (C16:0) được bổ sung với lượng gấp đôi.

5.18.2.2  Chuẩn bị hỗn hợp chuẩn hiệu chuẩn FAME

Trước khi sử dụng, để ống cân bằng đến nhiệt độ phòng (tối đa 25 °C) ở nơi tối mà không cần đun nóng. Cắt ống bằng dao thủy tinh, sử dụng pipet Pasteur, chuyển nhanh lượng trong ống vào bình định mức 50 ml đã cân bì trước, cân và thêm n-hexan đến vạch. Pha loãng phù hợp với loại bơm được sử dụng.

Dung dịch này bền trong khoảng sáu tháng khi bảo quản nơi tối ở -20 °C. Để tránh nhiễm bẩn dung dịch chuẩn, phân phối dung dịch vào các lọ nhỏ (vial) khác nhau (sẵn sàng để bơm) và bảo quản chúng ở -20 °C trước khi sử dụng. Sử dụng vial dùng một lần, sau đó loại bỏ.

6  Thiết bị, dụng cụ

CẢNH BÁO - Phép xác định liên quan đến việc sử dụng các dung môi dễ cháy và dễ bay hơi, do vậy tất cả các thiết bị điện được sử dụng phải tuân thủ quy định liên quan đến các mối nguy khi sử dụng các dung môi đó.

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg, đọc được đến 0,1 mg.

6.2  Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml và 500 ml.

6.3  Pipet định mức, một vạch, dung tích 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml và 50 ml, cấp AS của TCVN 7153 (ISO 1042).

6.4  Pipet định mức, hai vạch, dung tích 2 ml và 5 ml, cấp AS của TCVN 7153 (ISO 1042).

6.5  Micropipet, dung tích 200 μl.

6.6  Bộ phân phối, dung tích 2 ml, 5 ml và 10 ml.

6.7  Ống nghiệm, đường kính 26 mm, dài 100 mm, có nắp vặn với lớp lót bằng PTFE.

6.8  Máy trộn ống nghiệm vortex-genie, hoặc loại tương đương.

6.9  Máy ly tâm phòng thử nghiệm, được trang bị bộ chuyển đổi phù hợp với các ống nghiệm có đường kính ngoài 26 mm.

6.10  Máy sắc ký khí-lỏng, được trang bị detector ion hóa ngọn lửa và bộ bơm phân dòng/không phân dòng hoặc trên cột. Sử dụng hệ thống tích phân và bộ lấy mẫu tự động tốt hơn là vi tính hóa.

Sử dụng nắp và dụng cụ thủy tinh sạch để tránh nhiễm bẩn trong sắc ký đồ FAME.

6.10.1  Khí mang, hydro hoặc heli, độ tinh khiết ≥ 99,9997 %.

CHÚ THÍCH: Việc sử dụng hydro hoặc heli làm khí mang chủ yếu ảnh hưởng đến thời gian sắc ký (nghĩa là tăng thời gian từ 10 min đến 15 min với heli) nhưng không ảnh hưởng đáng kể đến độ phân giải sắc ký với các điều kiện tối ưu hóa.

Các khí khác cần cho detector (FID) không được có tạp chất hữu cơ (tức là CnHm dưới 1 ppm) và có độ tinh khiết ít nhất là ≥ 99,995 %. Có thể sử dụng khí tổng hợp hoặc khí nén. Có thể sử dụng máy tạo khí.

6.10.2  Cột mao quản, được liên kết với pha xyanopropyl-polysiloxan hoặc tương đương (chiều dài 100 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày màng 0,2 micron), rửa giải các FAME đầu tiên bằng chiều dài chuỗi cacbon và thứ hai bằng số liên kết đôi.

Các vết oxy và độ ẩm sẽ làm hỏng pha phân cực của cột. Nếu không có khí tinh khiết, thì sử dụng thiết bị lọc làm sạch khí.

6.10.3  Detector ion hóa ngọn lửa, có khả năng được gia nhiệt đến nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cuối cùng của lò cột là 50 °C.

6.10.4  Bộ bơm phân dòng/không phân dòng, có khả năng gia nhiệt đến nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cuối cùng của lò cột là 30 °C.

6.10.5  Bộ bơm trên cột, có khả năng không được làm nóng (lạnh), hoặc được làm nóng đến nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cuối cùng của lò cột là 30 °C.

CHÚ THÍCH: Việc lắp đặt bộ bơm duy nhất (tức là có phân dòng/ không phân dòng hoặc trên cột) trên thiết bị GC là đủ.

6.10.6  Xyranh bơm, dung tích 10 μl.

6.10.7  Hệ thống tích phân.

6.11  Điều kiện sắc ký khí

Nhiệt độ lò và dòng khí mang phụ thuộc vào cột được chọn và khí mang được sử dụng (tức là hydro hoặc heli). Trong mọi trường hợp, các điều kiện đã chọn phải tạo ra sự phân tách giữa vùng cis và vùng trans đối với C18:1, C18:2, C18:3 và axit linoleic cộng hợp (CLA), được nêu trong Phụ lục B, Hình B.1, Hình B.2 và Hình B.3.

Các ví dụ trong 6.11.1 và 6.11.2 liệt kê các điều kiện áp dụng để phân tách/nhận diện chính xác cis và trans.

6.11.1  Ví dụ 1 - Chế độ bơm phân dòng

- Cột: dài 100 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày màng 0,2 μm, cột mao quản silica nung chảy.

- Pha tĩnh: cyanopropyl-polysiloxan.

- Loại khí mang: heli.

- Áp suất khí mang đầu cột: 225 kPa (từ 175 kPa đến 225 kPa).

- Phân dòng: 25,5 ml/min.

- Tỷ lệ phân dòng: 10:1.

- Nhiệt độ bơm: 250 °C.

- Nhiệt độ detector: 275 °C.

- Chương trình nhiệt độ cột: nhiệt độ ban đầu 60 °C, duy trì trong 5 min, tăng ở tốc độ 15 °C/min đến 165 °C, duy trì ở nhiệt độ này trong 1 min và sau đó tăng lên với tốc độ 2 °C/min đến 225 °C trong 20 min.

- Lượng mẫu được bơm: 1,0 μl.

Ví dụ về hồ sơ GC đầy đủ thu được với các điều kiện này được nêu trong Phụ lục B, Hình B.4.

6.11.2  Ví dụ 2 - Chế độ bơm trên cột

- Cột: dài 100 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày màng 0,2 μm, cột mao quản silica nung chảy.

- Pha tĩnh: cyanopropyl-polysiloxan.

- Loại khí mang: hydro.

- Áp suất khí mang đầu cột: 210 kPa (từ 175 kPa đến 225 kPa).

- Nhiệt độ bơm: lạnh.

- Nhiệt độ detector: 275 °C.

- Chương trình nhiệt độ cột: nhiệt độ ban đầu 60 °C, duy trì trong 5 min, tăng ở tốc độ 15 °C/min đến 165 °C, duy trì ở nhiệt độ này trong 1 min và sau đó tăng lên với tốc độ 2 °C/min đến 225 °C trong 17 min.

- Lượng mẫu bơm: 1,0 μl.

Ví dụ về hồ sơ GC đầy đủ thu được với các điều kiện này được nêu trong Phụ lục B, Hình B.5.

6.12  Độ phân giải giữa C18:1 cis và trans

Để định lượng chính xác C18:1 TFA (mức ≥ 0,5 g/100 g chất béo), cần có độ phân giải đủ giữa C18:1 trans-13/14 và C18:1 cis-9 (axit oleic). Độ phân giải được xác định bằng cách bơm một lượng dung dịch hỗn hợp chuẩn đồng phân cis và trans C18:1 FAME (5.17).

Bơm 1,0 μl dung dịch hiệu chuẩn (5.13) vào máy sắc ký khí. Xác định chiều rộng pic ở nửa chiều cao và khoảng cách giữa bên trái của sắc ký đồ và đỉnh của pic đối với C18:1 trans-13/14 và C18:1 cis-9 (metyl este axit oleic). Độ phân giải R được tính bằng cách sử dụng Công thức (1):

Trong đó:

t_R1  là khoảng cách giữa bên trái của sắc ký đồ và đỉnh của pic 1 (C18:1 trans-13/14), tính bằng xentimet (cm);

t_R2  là khoảng cách giữa bên trái của sắc ký đồ và đỉnh của pic 2 (C18:1 cis-9), tính bằng xentimet (cm);

( là chiều rộng pic bằng nửa chiều cao của pic 1 (C18:1 trans-13/14), tính bằng xentimet (cm);

 ) là chiều rộng pic bằng nửa chiều cao của pic 2 (C18:1 cis-9), tính bằng xentimet (cm).

Độ phân giải là đủ khi tiêu chí R ≥ 1,00 ± 5 % (xem Phụ lục B, Hình B.3).

CHÚ THÍCH  Trong trường hợp độ phân giải không đủ, nhưng R gần với giá trị đích, thì việc điều chỉnh tốt các điều kiện sắc ký (nghĩa là điều chỉnh nhẹ áp suất/lưu lượng khí mang, hoặc chương trình nhiệt độ lò) có thể cho giá trị R có thể chấp nhận được.

7  Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

8  Chuẩn bị mẫu thử

8.1  Sữa dạng lỏng, sữa bột và thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh có hàm lượng chất béo ≥ 1,5 % phần khối lượng

Đưa mẫu về nhiệt độ phòng và lắc mạnh trước khi sử dụng. Đảm bảo mẫu đồng nhất (nghĩa là trộn đều).

8.2  Sữa dạng lỏng, sữa bột và thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh có hàm lượng chất béo < 1,5 % phần khối lượng

Đưa mẫu về nhiệt độ phòng và lắc mạnh trước khi sử dụng. Đảm bảo mẫu đồng nhất (nghĩa là trộn đều).

Chiết chất béo theo TCVN 8103 (ISO 14156), chú ý làm bay hơi hoàn toàn dung môi chiết bằng cách đun nóng đến nhiệt độ không quá 40 °C để tránh phân hủy axit béo không bão hòa đa chuỗi dài (LC-PUFA).

CHÚ THÍCH: Xem thêm TCVN 6508 (ISO 1211), TCVN 8109 (ISO 1737), TCVN 8901 (ISO 8381) và TCVN 6688-1 (ISO 8262-1) để có hướng dẫn hữu ích về các phương pháp chiết chất béo.

8.3  Phomat

Đưa mẫu về nhiệt độ phòng. Đảm bảo mẫu đồng nhất (nghĩa là trộn đều).

Chiết lấy chất béo theo TCVN 8181 (ISO 1735) cẩn thận để loại bỏ hoàn toàn dung môi chiết bằng cách đun nóng chất béo đến nhiệt độ không quá 60 °C.

Xác định độ axit của chất béo theo TCVN 6510 (ISO 1740) (tiêu chí chấp nhận ≤ 1 mmol/100 g chất béo).

CHÚ THÍCH Khi có natri metoxit metanol, các axit béo tự do không được chuyển thành metyl este (FAME). Trong trường hợp có độ axit cao hơn (tức là axit béo tự do), các axit béo này không được định lượng bằng các axit khác.

9  Cách tiến hành

9.1  Phần mẫu thử

Cho vào ống ly tâm dung tích 25 ml có nắp vặn, cân chính xác đến 0,1 mg một lượng mẫu (8.1) tương đương để có khoảng 50 mg chất béo trong ống. (Ví dụ, đối với mẫu chứa 26 g chất béo trên 100 g sản phẩm, khối lượng mẫu tương ứng là khoảng 190 mg).

CHÚ THÍCH 1: Để phân tích axit béo trên chất béo chiết từ thực phẩm, cần có cùng một lượng mẫu chất béo (nghĩa là khoảng 50 mg).

Đối với mẫu dạng bột, dùng micropipet thêm 2,0 ml nước. Đối với mẫu dạng lỏng thì không cần thêm nước. Đậy ống, sau đó hòa tan nhẹ bằng máy trộn Vortex. Chờ trong 15 min ở nhiệt độ phòng.

Đối với chất béo được chiết từ sản phẩm (8.2 và 8.3), cân 50 mg chất béo đã tan chảy, chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly tâm 25 ml. Không cần thêm nước để phân tích axit béo.

Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch nội chuẩn (5.12). Dùng pipet thêm 5 ml dung dịch natri metoxit metanolic 5 % (khối lượng/ thể tích) (5.5). Thời gian chuyển este hóa bắt đầu khi nhỏ thêm giọt thuốc thử đầu tiên. Đậy kín ống và lắc đều trong 10 s bằng máy trộn Vortex.

Mở ống và thêm 2 ml n-hexan sau khi bắt đầu 180 s. Sau thời gian bắt đầu 210 s, thêm 10 ml dinatri hydro xitrat và dung dịch nước natri clorua (5,8). Thời gian chuyển este hóa dừng lại sau khi thêm đến giọt dung dịch trung hòa cuối cùng. Khuấy nhẹ bằng máy trộn Vortex trong 30 s. Thời gian chuyển este hóa không được quá 240 s từ khi cho dung dịch đầu tiên vào mẫu.

CHÚ THÍCH 2: Điều quan trọng là cần chú ý thời gian chuyển este hóa (240 s). Số lượng ống không được vượt quá sáu ống cùng một lúc trong các điều kiện này. Hệ thống phân phối nhanh (bộ phân phối) có thể được sử dụng để thêm thuốc thử, nhưng không được sử dụng để bổ sung dung dịch nội chuẩn yêu cầu độ chụm cao.

Ly tâm ống ở 1 750 r/min (hoặc tương đương với g = 375 ± 25) trong 5 min.

Dùng pipet lấy 200 μl phần nổi phía trên cho vào bình định mức 10 ml và thêm n-hexan đến vạch.

CHÚ THÍCH 3: Hệ số pha loãng chỉ được tính đối với bơm trên cột và/hoặc bơm không phân dòng. Khi sử dụng bơm phân dòng, cần giảm độ pha loãng để thu được độ đáp ứng của các pic mong muốn theo tỷ lệ phân tách được sử dụng (đặc biệt chú ý để có mức phát hiện đủ và chính xác đối với các pic nhỏ). Dung dịch bền trong hai ngày khi bảo quản nơi tối ở 4 °C.

CHÚ THÍCH 4: Trên sắc ký đồ của mẫu, đôi khi có thể thấy “phần nhô" trên đường nền giữa pic dung môi và dung dịch rửa giải C6:0; hiện tượng này là do có thể có các vết nước bị thu giữ bởi dung môi MTBE trong quá trình chuẩn bị mẫu. Có thể dễ dàng loại bỏ “phần nhô” khỏi sắc ký đồ GC bằng cách thêm vài mg CaCb vào dung dịch mẫu đã pha loãng trước khi bơm GC.

9.2  Xác định định lượng

9.2.1  Xác định các hệ số đáp ứng

Bơm ba lần, mỗi lần 1 μl dung dịch hiệu chuẩn (xem 5.18.1.5 hoặc 5.18.2.2).

9.2.2  Xác định phần mẫu thử

Bơm 1 μl phần mẫu thử (9,1) vào máy sắc ký khí áp dụng cùng các điều kiện như khi sử dụng với dung dịch chuẩn hiệu chuẩn FAME.

9.2.3  Nhận biết axit béo

Nhận biết các axit béo trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic tương ứng trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (5.18) với thời gian lưu của hỗn hợp chuẩn chứa tất cả các đồng phân TFA và CLA (xem 5.13 và 5.17).

C18:1 TFA

Nhận biết và nhóm tất cả các đồng phân trans của C18:1 (bao gồm cả diện tích pic của C18:1 trans-16 được rửa giải trong vùng cis C18:1 của sắc ký đồ ngay sau C18:1 cis-9 hoặc n-9) phù hợp với Phụ lục B, Hình B.1 hoặc B.2.

CHÚ THÍCH 1  Khi có mặt chất béo sữa, hai đồng phân trans của C18:1 được rửa giải trong vùng C18:1 cis của sắc ký đồ (C18:1 trans-15 và C18:1 trans-16), nhưng chỉ một đồng phân được phân giải (C18:1 trans-16) với cột mao quản dài 100 m. Đồng phân thứ hai (C18:1 trans-15) thường được phù lên pic axit oleic (C18:1 cis-9) và diện tích chỉ có thể định lượng được bằng cách sử dụng sự phân tách sơ bộ (tức là TLC A⁺, HPLC A⁺) tiếp theo phân tích bằng sắc ký khí mao quản. Theo những phát hiện gần đây, đã được chứng minh rằng không có sự khác biệt đáng kể trong tổng lượng TFA C18:1 khi diện tích pic của C18:1 trans-15 (pic chưa được phân giải) bị loại trừ khỏi tổng khi so sánh với kết quả thu được sau kỹ thuật tách sơ bộ tiếp theo bằng phân tích sắc ký khí-lỏng mao quản. Một phần của hiện tượng này được giải thích là do sự có mặt của một số đồng phân C18:1 cis (tức là cis-6-8), rửa giải với vùng C18:1 trans và do đó được thêm gián tiếp vào tổng C18:1 TFA. Sự đóng góp của các đồng phân này vào tổng C18:1 TFA bù đắp thực tế là C18:1 trans-15 không được tính đến.

C18:2 TFA

Nhận biết và nhóm tất cả các đồng phân trans của axit linoleic (xem Phụ lục B, Hình B.1, B.2 và B.6). Đối với tổng TFA của C18:2, bao gồm tất cả các đồng phân trans có trong mẫu chất béo sữa như nêu trong Hình B.1 và B.2.

C18:3 TFA

Nhận biết và nhóm tất cả TFA của axit linolenic (xem Phụ lục B, Hình B.1, B.2 và B.6).

CHÚ THÍCH 2 Khi có mặt chất béo sữa và/hoặc dầu cá trong mẫu, đồng phân khác của C20:1 rửa giải ngay trước C20:1 cis-11 (hoặc n-9). Tùy thuộc vào độ phân giải cột, thời gian lưu của axit béo này cũng có thể tương ứng với đồng phân trans của C18:3 (nghĩa là C18:3 CIS-9, trans-12, cis-15 hoặc C18:3 trans-9, cis-12, cis-15). Khi chỉ có một pic trong vùng tương ứng của C18:3 TFA, việc nhận biết đúng tương ứng với đồng phân C20:1. Khi gặp hai, ba hoặc bốn pic trong vùng tương ứng với C18:3 TFA, từng diện tích pic bao gồm trong tổng diện tích của C18:3 TFA (xem thứ tự rửa giải và quy tắc hình thành bên dưới). Độ nhiễu cũng có thể quan sát được giữa các đồng phân C18:3 TFA (nghĩa là C18:3 cis-9, cis-12, trans-15; cis-9, trans-12, cis-15; hoặc trans-9, cis-12, cis-15) và C20:1 cis-11 (hoặc n-9). C20:1 cis-11 (hoặc n-9) có thể rữa giải bằng C18:3 cis-9, trans-M, cis-15 (đồng phân phụ C18:3 trans), nhưng đóng góp vào tổng C18:3 TFA không đáng kể. Tuy nhiên, nếu C20:1 cis-11 (hoặc n-9) cho thấy sự giao thoa với C18:3 cis-9, cis-12, trans-12 hoặc với C18:3 trans-9, cis-12, cis-15 thì điều kiện sắc ký có thể được sửa đổi để có đủ độ phân tách. Độ nhiễu cũng có thể quan sát được khi tỷ lệ sai số giữa C18:3 cis-9, cis-12, trans-15 và C18:3 trans-9, cis-12, cis-15 (tỷ lệ giữa các đồng phân này luôn gần bằng 5:4).

CHÚ THÍCH 3  Động học hình thành đồng phân C18:3 trans trong dầu tinh luyện và khử mùi đã được phân tích bằng cách sử dụng cột mao quản phân cực cao và được mô tả kỹ trong tiêu chuẩn này. Có thể được sử dụng như một công cụ xác nhận để kiểm tra sự có mặt của các đồng phân C18:3 trans. Thông thường cho thấy số lượng tối đa đồng phân trans của C18:3 là 4.

Trường hợp 1 - Không có mặt các đồng phân C18:3 TFA

Không có pic (nếu chỉ phát hiện thấy một pic; xem nhận xét ở trên về sự có mặt của một đồng phân C20:1 khác trong sữa). Không có mặt của đồng phân trans C18:3 duy nhất.

Trường hợp 2 - Có mặt của hai đồng phân C18:3 TFA (C18:3 cis-9, cis-12, trans-15 và C18:3 trans- 9, cis-12, cis-15)

Diện tích pic của C18:3 trans-9, cis-12, cis-15 xấp xỉ 80 % diện tích pic của C18:3 cis-9, cis 12, trans-15 (hoặc tỷ lệ 5:4). Tỷ lệ này luôn không đổi khi có mặt các đồng phân C18:3 trans khác.

Trường hợp 3 - Có mặt của ba đồng phân C18:3 TFA (C18:3 cis-9, cis-12, trans-15; C18:3 cis-9, trans-12, cis-15; và C18:3 trans-9, cis-12, cis-15).

Tương tự như mô tả ở trên đối với trường hợp 2 (hai đồng phân), nhưng với sự có mặt của C18:3 cis-9, trans-12, cis-15. Diện tích pic của đồng phân trans luôn nhỏ và đôi khi thấp hơn giới hạn định lượng (LOQ). Trong trường hợp đồng rửa giải đồng phân trans với C20:1 cis-11 (n-9) hoặc với đồng phân C20:1 khác, đóng góp trên tổng C18:3 TFA là không đáng kể.

Trường hợp 4 - Có mặt của bốn đồng phân C18:3 TFA (C18:3 trans-9, cis-12, trans-15; C18:3 cis-9, cis-12, trans-15; C18:3 cis-9, trans-12, cis-15; và C18:3 trans-9, cis-12, cis-15).

Tương tự như mô tả ở trên đối với trường hợp 3 (ba đồng phân trans), nhưng với C18:3 trans-9, cis-12, trans-15. Đồng phân này được hình thành do sự phân hủy một phần của C18:3 cis-9, cis-12, trans-15 và C18:3 trans-9, cis-12, cis-15 (hai đồng phân C18:3 trans đầu tiên xảy ra trong dầu thực vật khử mùi). Khi số lượng ≥ 50 % diện tích pic của C18:3 cis-9, cis-12, trans-15), có thể nghi ngờ sự có mặt của các đồng phân C18:3 trans khác và cho thấy điều kiện khử mùi dầu bất thường (tức là nhiệt độ cao và/hoặc thời gian). Xem thêm Phụ lục B, Hình B.6, cho thấy ví dụ thực tế về một mẫu thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh có chứa C18:2 TFA và C18:3 TFA có nguồn gốc từ dầu thực vật đã được khử mùi.

Có thể khẳng định sự có mặt của các đồng phân C18:3 trans khác bằng cách bơm hỗn hợp chuẩn định tính (5.17).

Sử dụng các thuật ngữ sau để thể hiện kết quả TFA:

- C18:1 TFA là tổng các đồng phân vị trí trans từ C18:1;

- C18:2 TFA là tổng số đồng phân trans từ C18:2 (axit linoleic) trong dầu khử mùi (tức là C18:2 trans-9, trans-12, cis-9, trans-12 và trans-9, cis-12) và trong chất béo sữa (tức là C18:2 cis-9, trans-13, C18:2 trans-8, cis-12 và C18:2 trans-11, cis-15);

- C18:3 TFA là tổng số đồng phân trans từ C18:3 (axit linolenic) trong dầu thực vật đã khử mùi (trans-9, cis-12, trans-15, cis-9, cis-12, trans-15, cis-9, trans-12, cis-15 và trans-9, cis-12, cis-15);

- tổng TFA là tổng của C18:1 TFA, C18:2 TFA và C18:3 TFA.

CHÚ THÍCH 4  Phương pháp này nhằm định lượng tất cả TFA trong thực phẩm (nghĩa là những thực phẩm có nguồn gốc từ động vật nhai lại, quá trình hydro hóa và/hoặc khử mùi dầu). Phương pháp này không nhằm mục đích xác định nguồn gốc của C18:1 TFA và C18:2 TFA (tức là TFA tự nhiên so với TFA công nghiệp) trong thực phẩm phức hợp chứa TFA có nguồn gốc khác nhau (tức là chất béo từ động vật nhai lại, dầu thực vật đã được hydro hóa và đã khử mùi). Có thể ước tính bằng cách sử dụng phân bố và/hoặc tỷ lệ đồng phân C18:1 trans (nghĩa là C18:1 trans-9 và C18:1 trans-11), từ sự có mặt của C18:2 TFA và C18:3 TFA có nguồn gốc từ quá trình khử mùi dầu và cũng bằng cách xem xét sự phân bố/độ nhiễu của một số axit béo theo profile axit béo đầy đủ. Việc định lượng TFA có nguồn gốc khác nhau thì thành phần sẽ chính xác hơn.

CHÚ THÍCH 5  Axit béo mạch nhánh (nghĩa là axit béo phân nhánh bão hòa iso và anfe/so-metyl-nhánh) cũng có trong chất béo sữa và rửa giải bằng các axit béo hiện tại khác. Trong chất béo sữa nguyên chất, các axit béo phân nhánh thường gặp nhất có 14 đến 17 nguyên tử cacbon trong chuỗi và chiếm từ 1 % đến 2 % thành phần chất béo sữa. Do đó, loại axit béo này không được xem xét trong tiêu chuẩn. Tuy nhiên, các diện tích pic tương ứng của các axit béo này và/hoặc các axit béo chưa xác định khác, có thể được thêm vào tổng “các axit béo khác” (OFA). Có thể áp dụng hệ số đáp ứng (giá trị trung bình của các hệ số đáp ứng từ C12:0 đến C24:0) để định lượng. Để biết thêm thông tin, xem Phụ lục B, Hình B.7.

10  Tính và biểu thị kết quả

10.1  Tính kết quả

10.1.1  Tính hệ số đáp ứng

Xác định diện tích các pic quy cho mỗi metyl este của axit béo có trong hỗn hợp chất chuẩn hiệu chuẩn được bơm vào (9.2.1) và tính hệ số đáp ứng tương ứng (Rf_i) so với chất nội chuẩn (C11:0) bằng cách sử dụng Công thức (2):

Trong đó:

m'_i  là phần khối lượng của FAME, trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (5.18.1.5 hoặc 5.18.2.2);

A'_o  là diện tích pic của C11:0 trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn;

m'_o  là khối lượng của C11:0 trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn (5.18.1.5 hoặc 5.18.2.2);

A'_i  là diện tích pic của FAME, trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hiệu chuẩn.

Sự thay đổi giữa ba lần bơm là tối ưu khi hệ số biến thiên nhỏ hơn 2 %. Ví dụ về phép tính được nêu trong Phụ lục B, Hình B.8.

CHÚ THÍCH  Các hệ số đáp ứng được tính cho C18:2 cis-9,12 (hoặc n-6) có thể được áp dụng cho C-18:2 CIA (cis-9, trans-11) và được tính cho C18:3 cis-9,12,15 (n-3) có thể áp dụng cho đồng phân C18:3 trans.

10.1.2  Axit béo trong sản phẩm

Phần khối lượng của từng thành phần riêng lẻ, biểu thị bằng g FA_i/100 g sản phẩm trong mẫu thử, được tính theo Công thức (3):

Trong đó:

m_o  là khối lượng của chất nội chuẩn C11:0 được thêm vào dung dịch mẫu, tính bằng miligam (mg);

A_i  là diện tích pic của FAME, trên sắc ký đồ của mẫu;

Rf_i  là hệ số đáp ứng, tính được theo 10.1.1;

S_i(FA)  là hệ số phân cực để chuyển FAME_i thành FA_i (Phụ lục B, Bảng B.1);

A_o  là diện tích pic của chất nội chuẩn C11:0 trên sắc ký đồ của mẫu;

m  là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng miligam (mg).

Ví dụ về phép tính được nêu trong Phụ lục B, Hình B.9.

CHÚ THÍCH 1  Trong trường hợp phân tích axit béo được thực hiện trên chất béo chiết được từ thực phẩm, khối lượng của phần mẫu thử “m” tương ứng với chất béo và không tương ứng với sản phẩm. Do đó, kết quả axit béo được biểu thị bằng g FA/100 g chất béo chứ không phải bằng g FA/100 g sản phẩm với công thức này. Kết quả thu được theo g FA/100 g chất béo có thể được chuyển đổi thành g FA/100 g sản phẩm với giá trị chiết chất béo (g/100 g) xác định được bằng phương pháp chiết thích hợp đã được đánh giá xác nhận. Giá trị chất béo đã công bố có thể không chính xác so với giá trị chiết xuất chất béo và việc sử dụng không được khuyến khích để biểu thị axit béo trong sản phẩm cuối cùng.

CHÚ THÍCH 2  Diện tích pic tương ứng với các axit béo chưa xác định được có thể được tổng hợp và báo cáo là tổng của các axit béo khác. Sự đóng góp của các axit béo này có thể thay đổi từ 0 g/100 g đến 5 g/100 g chất béo (nghĩa là trong chất béo sữa) và do đó có thể đóng góp vào tổng của tất cả các axit béo. Các pic tương ứng với tạp chất (vật liệu và hóa chất, mẫu hoặc có nguồn gốc sắc ký) không được tính vào tổng OFA.

10.1.3  Axit béo trên tổng chất béo

Phần trăm khối lượng từng thành phần riêng lẻ, biểu thị bằng g FA_i/100 g chất béo trong mẫu thử, được tính theo Công thức (4):

Phép tính này chỉ có thể được thực hiện khi hàm lượng chất béo xác định được bằng phương pháp chiết thích hợp đã được đánh giá xác nhận. Không sử dụng giá trị chất béo đã công bố để biểu thị axit béo trên sản phẩm.

10.1.4  Tổng của loại hoặc nhóm axit béo trong 100 g sản phẩm

Phần khối lượng của tất cả các axit béo tương ứng với một loại hoặc một nhóm, theo Phụ lục A, Bảng A.1, tính bằng cách cộng đơn giản các kết quả của từng axit béo riêng lẻ (tính bằng g FA/100 g sản phẩm), được tính theo Công thức (5):

10.1.5  Tổng của loại axit béo hoặc nhóm axit béo trong 100 g chất béo

Phần khối lượng của tất cả các axit béo tương ứng với một loại hoặc một nhóm axit béo, theo Phụ lục A, Bảng A.1, tính bằng cách cộng đơn giản các kết quả của từng axit béo riêng lẻ (tính bằng g FA/100 g chất béo), được tính theo Công thức (6):

10.1.6  Hiệu suất của quá trình chuyển este hóa

Ghi lại diện tích của hai pic nội chuẩn (metyl undecanoat và tritridecanoin) trong các mẫu đã phân tích.

Hiệu suất của quá trình chuyển este hóa, Pt, biểu thị bằng %, tính được từ độ thu hồi tritridecanoin làm chất nội chuẩn thứ hai, được tính theo Công thức (7):

Trong đó:

m_c11 là khối lượng của chất nội chuẩn C-11:0 được thêm vào dung dịch, tính bằng miligam (mg);

A_c13  là diện tích pic của chất nội chuẩn C-13:0 trên sắc ký đồ;

R_c13  là hệ số đáp ứng của C13:0 so với C11:0, tính được theo 10.1.1;

S_c13  là hệ số đo phân vị để chuyển C13:0 FAME thành C13:0 TAG (Phụ lục B, Bảng B.1);

A_c11  là diện tích pic của chất nội chuẩn C-11:0 trên sắc ký đồ;

m_c13  là khối lượng của chất nội chuẩn C13:0 TAG được thêm vào dung dịch, tính bằng miligam (mg),

Hiệu suất của quá trình chuyển este hóa cho thấy giá trị độ thu hồi của tritridecanoin (C13:0 TAG) phải tương đương với 100,0 % ± 2,0 %. Khi hiệu suất của quá trình chuyển este hóa > 102,0 % hoặc < 98,0 %, thì nguồn gốc của vấn đề có thể là:

- chuyển este hóa không hoàn toàn (do thuốc thử/hóa chất);

- sự giảm một phần chất lượng của các chất nội chuẩn, hoặc do độ tinh khiết/độ bền của chúng;

- do ảnh hưởng của nền mẫu.

CHÚ THÍCH  Việc phân tích mẫu chuẩn có thể cần cho phép xác định nếu vấn đề bắt nguồn từ thuốc thử và/hoặc hóa chất hoặc từ mẫu đã phân tích.

10.2  Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến ba chữ số thập phân với kết quả được tính bằng g/100 g và biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân với kết quả được tính bằng mg/100 g.

CHÚ THÍCH  Kết quả axit béo được biểu thị bằng g (hoặc mg)/100 g sản phẩm có thể được chuyển thành dạng biểu thị kết quả khác g (hoặc mg) axit béo/100 g chất béo:

- g (hoặc mg) axit béo/100 g bột đã hoàn nguyên (tức là 25 g bột vào 200 g nước), sản phẩm dạng lỏng (tức là thức ăn sẵn), hoặc nồng độ chất lỏng được pha loãng theo khối lượng 1:1.

- g (hoặc mg) axit béo/khẩu phần (theo khối lượng khẩu phần).

11  Độ chụm

11.1  Phép thử liên phòng thử nghiệm

Chi tiết về các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm, được tổ chức và xây dựng phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) về độ chụm của phương pháp, được tóm tắt trong Phụ lục C.

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập được biểu thị cho mức xác suất 95 % và có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã cho.

11.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không được lớn hơn 5 % các trường hợp vượt quá r, nêu trong Phụ lục C, Bảng C.1 và Bảng C.2.

11.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, với những người thực hiện khác nhau, sử dụng thiết bị khác nhau, không được lớn hơn 5 % các trường hợp vượt quá R, nêu trong Phụ lục C, Bảng C.1 và Bảng C.2.

11.4  Giới hạn phát hiện

Trong các điều kiện được mô tả (độ nhạy của detetor, tín hiệu nhiễu, độ pha loãng mẫu, v.v...), giới hạn phát hiện ước tính được biểu thị bằng ba lần độ lệch chuẩn của tín hiệu nền (tín hiệu nền) nằm trong khoảng 0,0003 g/100 g sản phẩm.

11.5  Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng đối với mỗi axit béo là khoảng 0,001 g/100 g sản phẩm. Giới hạn định lượng tương ứng với mức thấp nhất của độ lặp lại tính được với kết quả thỏa mãn.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) tất cả các thông tin cần thiết đề nhận biết đầy đủ về mẫu;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết; viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) phương pháp thử đã sử dụng cùng với viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết về bất kỳ sự cố nào có thể ảnh hưởng đến (các) kết quả thử nghiệm;

e) các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(quy định)

Các nhóm hoặc loại axit béo và các axit béo riêng lẻ

A.1  Nhóm hoặc loại axit béo

A.1.1  Axit béo trans

Axit béo trans (TFA) là tổng các axit béo có chứa một hoặc nhiều liên kết đôi không liên kết trong cấu hình trans (chỉ có C18:1, C18:2 và C18:3 trans được bao gồm trong tổng số).

CHÚ THÍCH  Các đồng phân trans khác có mặt tự nhiên trong chất béo sữa đã được báo cáo (ví dụ: C16:1 trans), nhưng chúng đóng góp không đáng kể vào tổng lượng axit béo trans trong các sản phẩm sữa. Ngoài ra, việc xác định chúng khá phức tạp do các đồng phân này thường xuyên bị ảnh hưởng bởi các đồng phân khác của axit béo (ví dụ: cis, iso và anteiso) và do đó cần phải tách sơ bộ hoặc sử dụng các điều kiện sắc ký cụ thể.

A.1.2  Axit linoleic liên kết

Axit linoleic liên kết (CLA) là tổng của axit octadecadienoic có chứa liên kết đôi liên kết trong cấu hình cis hoặc trans; chủ yếu là axit cis-9, trans-11 octadecadienoic (nghĩa là axit rumenic). CLA không được bao gồm trong tổng các TFA.

A.1.3  Axit béo bão hòa

Axit béo bão hòa (SFA) là tổng của tất cả các axit béo không có liên kết đôi.

A.1.4  Axit béo không bão hòa đơn

Axit béo không bão hòa đơn (MUFA) là tổng tất cả các axit béo có chứa một liên kết đôi ở cấu hình cis.

A.1.5  Axit béo không bão hòa đa

Axit béo không bão hòa đa (PUFA) là tổng tất cả các axit béo có chứa hai hoặc nhiều liên kết đôi ở cấu hình cis.

CHÚ THÍCH LC-PUFA là tên chung để mô tả các axit béo không bão hòa đa chuỗi dài. Các axit béo này cũng được bao gồm trong PUFA (tức là axit arachidonic, eicosapentaenoic và docosahexaenoic).

A.1.6  Axit béo omega-3

Axit béo omega-3 là tổng của axit béo không bão hòa đa cis có liên kết đôi đầu tiên ở cacbon n-3 (ω-3) từ nhóm metyl cuối.

A.1.7  Axit béo omega-6

Axit béo omega-6 là tổng của axit béo không bão hòa đa cis có liên kết đôi đầu tiên ở cacbon n-6 (ω-6) từ nhóm metyl cuối.

A.1.8  Axit béo omega-9

Axit béo omega-9 là tổng của axit béo không bão hòa đa cis có liên kết đôi đầu tiên ở cacbon n-9 (ω-9) từ nhóm metyl cuối.

A.2  Các axit béo riêng lẻ

A.2.1  Axit linoleic

Axit linoleic (LA) là axít béo thiết yếu, axit béo 18 cacbon, chứa hai liên kết đôi ở các nguyên tử cacbon thứ 9 và 12 (C18:2 all cis-9,12), còn có tên là C18:2 n-6 (ω-6).

A.2.2  Axit linolenic

Axit linolenic (ALA) hay axit or-linolenic, là axit béo thiết yếu, axit béo 18 cacbon, chứa ba liên kết đôi ở các nguyên tử cacbon thứ 9, 12 và 15 (C18:3 all cis-9,12,15), còn có tên là C18:3 n-3 (ω-3).

A.2.3  Axit arachidonic

Axit arachidonic (ARA) không phải là axit béo thiết yếu, là axit béo cacbon 20, chứa bốn liên kết đôi ở các nguyên tử cacbon thứ 5, 8, 11 và 14 (C20:4 all cis-5,8,11,14), còn có tên là C20:4 n-6 (ω-6).

A.2.4  Axit eicosapentaenoic

Axit eicosapentaenoic (EPA) là axit béo bán thiết yếu (cần thiết cho phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh), axit béo 20 cacbon, chứa năm liên kết đôi ở các nguyên tử cacbon thứ 5, 8, 11, 14 và 17 (C20:5 all cis- 5,8,11,14,17), còn có tên là C20:5 n-3 (ω-3).

A.2.5  Axit docosahexaenoic

Axit docosahexaenoic (DHA) là axit béo bán thiết yếu (cần thiết cho phụ nữ mang thai và trẻ sơ sinh), là axit béo 22 cacbon, có chứa sáu liên kết đôi ở các nguyên tử cacbon thứ 4, 7, 10, 13, 16 và 19 (C22:6 all cis 4,7,10,13,16,19), còn có tên là C22:6 n-3 (ω-3).

Bảng A.1 - Cấu hình và nhóm axit béo

Table A.1 (kết thúc)

Bảng A.2 - Các từ viết tắt

Phụ lục B

(tham khảo)

Ví dụ về phân tích sắc ký khí-lỏng

Hình B.1 - Ví dụ về sắc ký đồ GC của sản phẩm sữa (hình ảnh phóng to của C18:1 TFA, C18:2 TFA, C18:3 TFA và CLA) sử dụng phương pháp bơm phân dòng

Hình B.2 - Ví dụ về sắc ký đồ GC của sản phẩm sữa (xem phóng to C18:1 TFA, C18:2 TFA, C18:3 TFA và CLA) sử dụng phương pháp bơm trên cột

Hình B.3 - Ví dụ về sắc ký đồ GC (độ phân giải không đủ và đủ giữa đồng phân C18:1 cis và trans)

Hình B.4 - Ví dụ về sắc ký đồ GC (chuẩn GLC-Nestle36) sử dụng chế độ bơm phân dòng

Hình B.5 - Ví dụ về sắc ký đồ GC (chuẩn GLC-Nestle36) sử dụng chế độ bơm trên cột

CHÚ THÍCH Các axit béo không bão hòa đơn và không bão hòa đa được chỉ định đếm từ metyl cacbon đầu đến cacbon cacbonyl (được ký hiệu là n hoặc ω).

Hình B.6 - Ví dụ về sắc ký đồ GC của thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh
(có chứa dầu thực vật đã khử mùi) sử dụng chế độ bơm phân dòng

Hình B.7 - Ví dụ về sắc ký đồ GC (xem phóng to) để nhận biết các axit béo phân nhánh trong các sản phẩm sữa sử dụng chế độ bơm phân dòng

Bảng B.1 - Các yếu tố đo phân tử (Si FA) để chuyển đổi metyl este của axit béo (FAME) thành axit béo (FA)

Hình B.8 - Ví dụ về phép tính các hệ số đáp ứng sử dụng chương trình bảng tính

Hình B.9 - Ví dụ về phép tính axit béo sử dụng chương trình bảng tính

Phụ lục C

(tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp đã được tổ chức từ năm 2013 đến năm 2014 bởi IDF/ISO và AOC/SPIFAN, trong đó 18 phòng thử nghiệm tham gia.^[16] Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã cho.

Các thông tin bổ sung về việc đánh giá xác nhận phương pháp tại http://standards.iso.org/iso/16958. 12 sản phẩm sau đây đã được sử dụng cho thử nghiệm cộng tác:

1. Sữa bột nguyên kem (26,27 % chất béo);

2. Sữa dạng lỏng nguyên chất (3,55 % chất béo);

3. Cream (35,27 % chất béo);

4. Bơ (82,93 % chất béo);

5. Phomat mềm (13,29 % chất béo);

6. Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh (25,67 % chất béo);

7. Thức ăn dinh dưỡng dành cho người lớn (17,44 % chất béo);

8. Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh bổ sung bột đậu nành thủy phân một phần (26,01 % chất béo);

9. Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh bổ sung sữa bột trên nền sữa (28,38 % chất béo);

10. Thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh RTF (dạng lỏng) dựa trên nền sữa (3,57 % chất béo);

11. Thức ăn công thức cho người lớn (dạng lỏng) protein cao (3,58 % chất béo);

12. Thức ăn công thức cho người lớn (dạng lỏng) chất béo cao (8,61 % chất béo).

Các từ viết tắt sau được sử dụng trong các bảng:

s_r  là độ lệch chuẩn lặp lại, tính bằng g/100 g sản phẩm

RSD_r  là độ lệch chuẩn lặp lại tương đối, tính bằng %

r  là độ lặp lại, tính bằng g/100 g sản phẩm

S_R  là độ lệch chuẩn tái lập, tính bằng g/100 g sản phẩm

RSD_R  là độ lệch chuẩn tái lập tương đối, tính bằng %

R  là độ tái lập, tính bằng g/100 g sản phẩm

Bảng C.1 chứa dữ liệu từ nghiên cứu cộng tác, được tính bằng g axit béo/100 g sản phẩm cho nhóm axit béo được đánh dấu (axit béo trans (TFA), axit béo bão hòa (SFA), axit béo không bão hòa đơn (MUFA), axit béo không bão hòa đa (PUFA), omega-3, omega-6 và omega-9) và các axit béo riêng lẻ (axit linoleic (LA), axit α-linolenic (ALA), axit arachidonic (ARA), axit eicosapentaenoic (EPA), axit docosahexaenoic (DHA)).

Bảng C.1 - Dữ liệu về độ chụm đối với nhóm axit béo được dán nhãn

Bảng C.1 (tiếp theo)

Bảng C.1 (tiếp theo)