Tiêu chuẩn TCVN 11064:2016 Thực phẩm chức năng - Xác định hàm lượng Ephedrine Aglycol

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11064:2016

THỰC PHẨM CHỨC NĂNG - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG EPHEDRINE AGLYCOL - PHƯƠNG PHÁP BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Dietary supplements - Determination of flavonol aglycones content by high performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 11064:2016 được xây dựng trên cơ sở AOAC 2006.07 Flavonol aglycones in ginkgo biloba dietary supplement crude materials and finished products. High-performance liquid chromatography,

TCVN 11064:2016 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM CHỨC NĂNG - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG EPHEDRINE AGLYCOL - PHƯƠNG PHÁP BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Dietary supplements - Determination of flavonol aglycones content by high performance liquid chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV để xác định hàm lượng các flavonol aglycon (bao gồm quercetin, kaempferol và isorhamnetin) trong các dạng nguyên liệu thô, dịch chiết từ cây bạch quả (Ginkgo biloba L.) và các sản phẩm thực phẩm chức năng.

2  Nguyên tắc

Sau khi thủy phân các flavonol glycosid bằng axit clohydric ở 90 °C, các flavonol aglycon được tách trên HPLC và xác định bằng detector UV tại bước sóng 370 nm, sử dụng chất chuẩn ngoại tương ứng. Sử dụng các hệ số chuyển đổi để tính hàm lượng tổng flavonol glycosid (bao gồm quercetin, kaempferol và isorhamnetin).

3  Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng phải là nước đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

CẢNH BÁO: Công việc phân tích phải được tiến hành trong môi trường phòng thử nghiệm phù hợp, được trang bị bảo hộ cá nhân (ví dụ: kính bảo hộ, quần áo bảo hộ lao động, găng tay).

3.1  Metanol.

3.2  Etanol.

3.3  Dimetyl sulfoxid (DMSO).

3.4  Axit phosphoric, 85 %.

3.5  Axit clohydric (HCl), 37%, tinh khiết, chứa lượng vết kim loại.

3.6  Pha động, hỗn hợp metanol: axit phosphoric 0,85 % (tỷ lệ thể tích 1:1).

Chuyển 500 ml metanol vào ống đong chia vạch 500 ml (4.14). Lấy khoảng 250 ml nước vào một ống đong chia vạch 500 ml khác, thêm 5 ml axit phosphoric (3.4) và thêm nước đến vạch. Trộn hai dung môi trong hai ống đong vào bình chứa 1 lít, loại khí trước khi dùng.

3.7  Dung môi chiết, hỗn hợp etanol - nước - axit clohydric (tỷ lệ thể tích 50 : 20 : 8)

Dùng ống đong chia vạch (4.14), lấy 40 ml nước cho vào bình nón 200 ml, thêm 100 ml etanol, sau đó thêm cẩn thận 16 ml axit clohydric (3.5) vào hỗn hợp trên, trộn kỹ.

3.8  Chất chuẩn

3.8.1  Quercetin ngậm hai phân tử nước[1]

3.8.2  Kaempferol¹⁾

3.8.3  lsorhamnetin¹⁾

3.9  Dung dịch chuẩn

3.9.1  Dung dịch chuẩn gốc

Cân chính xác 21 mg ± 0,06 mg quercetin ngậm hai phân tử nước (3.8.1), khoảng 19 mg kaempferol (3.8.2) và 5,0 mg ± 0,02 mg isorhamnetin (3.8.3) cho vào bình định mức 50 ml (4.8). Thêm vào khoảng 10 ml DMSO (3.3), rung siêu âm ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 1 min đến 5 min để hòa tan, thêm metanol (3.1) đến vạch rồi trộn kỹ bằng cách đảo chiều.

Dung dịch thu được có nồng độ quercetin khoảng 0,33 mg/ml, nồng độ kaempferol khoảng 0,34 mg/ml, nồng độ isorhamnetin khoảng 0,09 mg/ml. Các dung dịch chuẩn gốc này có thể ổn định 6 tháng trong lọ kín và để ở tủ đông.

3.9.2  Dung dịch chuẩn làm việc

Dùng pipet (4.7) lấy chính xác các thể tích khác nhau của dung dịch chuẩn gốc (3.9.1) cho vào bình định mức phù hợp theo Bảng 1. Pha loãng bằng metanol đến vạch, trộn kỹ.

Bảng 1 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc

Bảo quản ở 4 °C và đưa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, được trang bị bơm, bộ bơm mẫu tự động, bộ điều nhiệt cho cột, detector UV và máy tính phân tích dữ liệu.

4.2  Cột phân tích HPLC, Phenomenex Prodigy®[2] ODS 100 Å (kích thước 4,6 mm x 250 mm; 5 μm).

CHÚ THÍCH: Chiều dài và đường kính của cột có thể được thay đổi theo kỹ thuật sử dụng HPLC.

4.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

4.4  Màng lọc nylon 0,45 μm.

4.5  Bể rung siêu âm, có hoặc không có bộ điều nhiệt.

4.6  Sàng, cỡ lỗ 60.

4.7  Pipet tự động, loại 0,1; 0,25; 1,0 và 2,5 ml.

4.8  Bình định mức, loại A, dung tích 5, 10, 25 và 50 ml.

4.9  Pipet thủy tinh, với các dung tích khác nhau.

4.10  Ống nghiệm, 30 ml, có nắp đậy kín.

4.11  Màng lọc, màng PVDF, 0,45 μm.

4.12  Xyranh, dung tích 3 ml.

4.13  Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ từ 80 °C đến 100°C.

4.14  Ống đong chia vạch.

4.15  Chày và cối.

4.16  Lọ đựng mẫu cho HPLC, loại 2 ml.

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị dung dịch thử

6.1.1  Đối với mẫu chứa nguyên liệu thô (lá bạch quả khô)

Cân 200 mg ± 5,0 mg mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống nghiệm trong 30 ml có nắp đậy kín (4.10) , thêm 12 ml dung môi chiết (3.7) và rung siêu âm ống nghiệm trong 5 min. Đậy kín ống nghiệm, thủy phân trong tủ sấy (4.13) ở nhiệt độ 90 °C ± 2 °C trong 60 min ± 3 min. Lấy ống nghiệm ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Gạn toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml (4.8), rửa ống nghiệm, thêm metanol (3.1) đến vạch rồi trộn đều. Lọc một phần dịch qua màng lọc PVDF 0,45 μm (4.11) vào lọ đựng mẫu (4.16).

6.1.2  Đối với mẫu dịch chiết bạch quả dạng bột khô

Cân 15 mg ± 1,5 mg mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống nghiệm trong 30 ml có nắp đậy kín (4.10) , thêm 5 ml dung môi chiết (3.7), rung siêu âm ống nghiệm trong 5 min. Đậy kín ống nghiệm, thủy phân trong tủ sấy (4.13) tại 90 °C ± 2 °C trong 60 min ± 3 min. Lấy ống nghiệm ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Gạn toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 10 ml (4.8), rửa ống nghiệm và thêm metanol (3.1) đến vạch. Lắc đều, lọc một phần dịch qua màng lọc PVDF 0,45 μm (4.11) vào lọ đựng mẫu (4.16).

6.1.3  Đối với mẫu viên nang cứng

Lấy 5 viên, lấy toàn bộ phần mẫu bên trong nang, cân lại khối lượng vỏ và tính khối lượng trung bình mỗi viên. Nếu cần, nghiền bằng chày và cối để tạo thành dạng bột có thể lọt qua sàng cỡ lỗ 60 (4.6).

Cân từ 15 mg ± 1,5 mg đến 600 mg ± 1,5 mg mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống nghiệm trong 30 ml có nắp đậy kín (4.10), thêm 5 ml dung môi chiết (3.7), rung siêu âm ống nghiệm trong 5 min. Đậy kín ống nghiệm, thủy phân trong tủ sấy (4.13) tại 90 °C ± 2°C trong 60 min ± 3 min. Lấy ống nghiệm ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Gạn toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 10 ml (4.8), rửa ống nghiệm và thêm metanol (3.1) đến vạch. Lắc đều, lọc một phần dịch qua màng lọc PVDF 0,45 μm (4.11) vào lọ đựng mẫu (4.16).

CHÚ Ý: Tham khảo Bảng 2 để lấy lượng mẫu cho phù hợp với nền sản phẩm.

6.1.4  Đối với mẫu viên nén

Lấy 5 viên, tính khối lượng trung bình mỗi viên. Nghiền bằng chày và cối (4.15) để tạo thành dạng bột có thể lọt qua sàng cỡ lỗ 60 (4.6). Chuyển mẫu đã nghiền vào bình chứa có nắp vặn và lắc đều.

Cân từ 15 mg ± 1,5 mg đến 600 mg ± 1,5 mg mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống nghiệm trong 30 ml có nắp đậy kín (4.10), thêm 5 ml dung môi chiết (3.7), rung siêu âm ống nghiệm trong 5 min. Đậy kín ống nghiệm, thủy phân trong tủ sấy (4.13) tại 90 °C ± 2 °C trong 60 min ± 3 min. Lấy ống nghiệm ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Gạn toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 10 ml (4.8), rửa ống nghiệm và thêm metanol (3.1) đến vạch. Lắc đều, lọc một phần dịch qua màng lọc PVDF 0,45 μm (4.11) vào lọ đựng mẫu (4.16).

CHÚ Ý: Tham khảo Bảng 2 để lấy lượng mẫu cho phù hợp với nền sản phẩm.

6.1.5  Đối với mẫu viên nang mềm

Cân một viên cho vào ống nghiệm trong 30 ml có nắp đậy kín, thêm 10 ml dịch chiết, lắc đều, rung siêu âm ống nghiệm trong 40 min đến 60 min (điều chỉnh thời gian để hòa tan hoàn toàn mẫu, nếu cần). Đậy kín ống nghiệm, thủy phân trong tủ sấy (4.13) tại 90 °C ± 2 °C trong 60 min ± 3 min. Lấy ống nghiệm ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Gạn toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 10 ml (4.8), rửa ống nghiệm và thêm metanol (3.1) đến vạch. Lắc đều, lọc một phần dịch qua màng lọc PVDF 0,45 μm (4.11) vào lọ đựng mẫu (4.16).

6.1.6  Đối với mẫu dịch chiết lỏng

Lấy 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm trong 30 ml có nắp đậy kín, thêm 5 ml dịch chiết, lắc đều. Đậy kín ống nghiệm, thủy phân trong tủ sấy (4.13) tại 90 °C ± 2°C trong 60 min ± 3 min. Lấy ống nghiệm ra và để nguội đến nhiệt độ phòng. Gạn toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 10 ml (4.8), rửa ống nghiệm và thêm metanol (3.1) đến vạch. Lắc đều, lọc một phần dịch qua màng lọc PVDF 0,45 μm (4.11) vào lọ đựng mẫu (4.16).

CHÚ Ý: Kết quả đánh giá độ vững trong quá trình thẩm định nội bộ phòng thử nghiệm cho thấy hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến kết quả là khối lượng mẫu và thể tích thủy phân. Để đảm bảo kết quả đúng, cần thực hiện theo hướng dẫn chuẩn bị mẫu ở Bảng 2.

Bảng 2 - Chuẩn bị mẫu thử

6.2  Xác định bằng HPLC

6.2.1  Điều kiện vận hành HPLC

- Pha động: hỗn hợp metanol: axit phosphoric 0,85 % (3.6). Chạy theo chế độ đẳng dòng;

- Detector; UV-Vis ở bước sóng 370 nm;

- Thể tích mẫu bơm: 10 pl;

- Tốc độ dòng: 1,0ml/min;

- Nhiệt độ buồng cột: 35 °C;

- Thời gian chạy: 35 min.

CHÚ THÍCH: Các thông số về tỷ lệ pha động, thể tích mẫu bơm, tốc độ dòng, nhiệt độ buồng cột có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.

6.2.2  Dựng đường chuẩn

Sau khi thiết bị đã ổn định, tiến hành bơm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc (3.9.2) lên phân tích trên hệ thống HPLC.

Xác định diện tích hoặc chiều cao pic của các chuẩn trên sắc đồ, dựng đường chuẩn dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic của mỗi flavonol aglycon với nồng độ chuẩn làm việc tương ứng.

6.3  Phân tích mẫu thử

Bơm mẫu thử với cùng điều kiện như bơm chuẩn, xác định diện tích hoặc chiều cao pic.

Dựa vào đường chuẩn, xác định hàm lượng các flavonol aglycon có trong mẫu thử.

Nếu diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu lớn hơn diện tích pic hoặc chiều cao pic của chuẩn cao nhất, thì phải tiến hành pha loãng mẫu và bơm lại.

Thứ tự chạy mẫu thử, có thể chạy theo thứ tự như ví dụ sau:

- Mẫu thử tính thích hợp của hệ thống

- Mẫu trắng thuốc thử

- Điểm bắt đầu đường chuẩn

- Mẫu trắng thuốc thử

- Mẫu thử từ 1 đến 12

- Mẫu trắng thuốc thử

- Điểm giữa đường chuẩn

- Mẫu trắng thuốc thử

- Mẫu thử từ 13 đến 24

- Mẫu trắng thuốc thử

- Điểm cuối đường chuẩn

- Mẫu trắng thuốc thử.

7  Tính kết quả

7.1  Hàm lượng mỗi flavonol aglycon

Tính hàm lượng mỗi flavonol aglycon trong mẫu thử, X₁, bằng microgram trên gam (μg/g), theo Công thức (1):

trong đó:

C là nồng độ mỗi flavonol aglycon trong dịch chiết, xác định được từ đường chuẩn, tính bằng microgram trên mililit (μg/ml);

V là thể tích dung môi chiết mẫu, tính bằng mililit (ml);

1 000 là hệ số chuyển đổi từ gam sang miligam;

w là khối lượng mẫu thử, tính bằng miligam (mg).

Tính hàm lượng mỗi flavonol aglycon trong mẫu thử dạng viên, X_1T, bằng microgram trong mỗi viên, theo Công thức (2):

trong đó:

C, V, w xem Công thức (1);

T là khối lượng trung bình mỗi viên, tính bằng miligam (mg).

7.2  Hàm lượng flavonol glycosid

Tính hàm lượng mỗi flavonol glycosid trong mẫu thử, X₂, bằng microgram trên gam (μg/g), theo Công thức (3):

Tính hàm lượng mỗi flavonol glycosid trong mẫu thử dạng viên, X_1T, tính bằng microgram trong mỗi viên, theo Công thức (4):

trong đó:

X₁ và X_1T xem 7.1;

F là hệ số quy đổi từ flavonol aglycon sang flavonol glycosid (2,504 với quercetin, 2,588 với kaempferol và 2,437 đối với isorhamnetin).

Hàm lượng flavonol glycosid tổng số bằng tổng hàm lượng các flavonol glycosid.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được; nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Kết quả thử liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định flavonol glycosid tổng số

Bảng A.2 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định quercetin

Bảng A.3 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định kaempferol

Bảng A.4 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định isorhamnetin