Tiêu chuẩn TCVN 13637:2023 Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Hướng dẫn chung về kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13637:2023

ISO 21148:2017

MỸ PHẨM - VI SINH VẬT - HƯỚNG DẪN CHUNG VỀ KIỂM TRA CHỈ TIÊU VI SINH VẬT

Cosmetics - Microbiology - General instructions for microbiological examination

Lời nói đầu

TCVN 13637:2023 hoàn toàn tương đương với ISO 21148:2017.

TCVN 13637:2023 do Viện Kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Tiêu chuẩn này được xây dựng nhằm chuẩn hóa các kỹ thuật chung được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để tiến hành kiểm tra vi sinh vật trong mỹ phẩm nhằm đạt được kết quả đồng nhất giữa các phòng thí nghiệm và bảo vệ nhân viên phòng thí nghiệm tránh khỏi các nguy cơ lây nhiễm.

Khi tiến hành kiểm tra vi sinh đối với các sản phẩm mỹ phẩm, cần lưu ý:

- Chỉ vi sinh vật có mặt trong mẫu mới được phân lập hoặc định lượng

- Không làm phát tán vi sinh vật ra môi trường xung quanh.

Để đạt được điều này, cần phải chú ý đến vệ sinh cá nhân và sử dụng các kỹ thuật làm việc đảm bảo loại trừ tạp nhiễm từ bên ngoài.

Vì trong tài liệu này chỉ có thể đưa ra một số ví dụ về các biện pháp phòng ngừa cần thực hiện trong quá trình kiểm tra vi sinh, nên cần nắm vững kiến thức về vi sinh vật và các kỹ thuật vi sinh. Các phân tích phải được tiến hành càng chính xác càng tốt, bao gồm cả việc tính toán số lượng vi sinh vật.

Có nhiều thao tác có thể gây nhiễm chéo và các kết quả của kiểm nghiệm viên phải thường xuyên được đánh giá độ chính xác. Cần phải thực hiện các biện pháp phòng ngừa để đảm bảo cho độ tái lặp của kết quả. Tài liệu này cung cấp các biện pháp chính cần thực hiện khi chuẩn bị, khử khuẩn và bảo quản phương tiện và thiết bị dùng trong thử nghiệm vi sinh.

Các khuyến nghị trong tài liệu này cho phép xác định số lượng và phát hiện các vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt.

Các khuyến nghị có thể áp dụng để khẳng định sự không có mặt các vi sinh vật đặc thù cần quan tâm trong sản phẩm mỹ phẩm.

Các phương pháp thử nghiệm được trình bày trong các tiêu chuẩn riêng. Các phương pháp thay thế có thể được sử dụng nếu được chứng minh là tương đương với phương pháp chuẩn đã được chứng minh là phù hợp. Việc lựa chọn một phương pháp cụ thể hoặc kết hợp các phương pháp được đề cập trong các tiêu chuẩn phụ thuộc vào mục đích thử nghiệm và người thực hiện sẽ quyết định phương pháp tiếp cận nào là tốt nhất.

MỸ PHẨM - VI SINH VẬT - HƯỚNG DẪN CHUNG VỀ KIỂM TRA CHỈ TIÊU VI SINH VẬT

Cosmetics - Microbiology - General instructions for microbiological examination

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra hướng dẫn chung về kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật trong mỹ phẩm, nhằm đảm bảo chất lượng và độ an toàn của mỹ phẩm, cùng với việc đánh giá rủi ro (ví dụ, hoạt độ nước thấp, nồng độ cồn, giá trị pH cực đoan, v.v...).

Do có rất nhiều dạng sản phẩm mỹ phẩm nên trong phạm vi áp dụng, phương pháp này có thể không phù hợp với một số sản phẩm cụ thể (ví dụ như các sản phẩm không thấm nước).

2  Tài liệu viện dẫn

Tiêu chuẩn này không đưa ra tài liệu viện dẫn

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau.

3.1

Sản phẩm (product)

Phần sản phẩm mỹ phẩm xác định nhận được trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm.

3.2

Mẫu (sample)

Một phần của sản phẩm mỹ phẩm (3.1) (ít nhất là 1 g hoặc 1 ml) được dùng để chuẩn bị hỗn dịch ban đầu (3.3).

3.3

Hỗn dịch ban đầu (initial suspension)

Hỗn dịch hay dung dịch của mẫu (3.2) trong thể tích nhất định của môi trường tăng sinh lỏng phù hợp.

3.4

Mẫu pha loãng (sample dilution)

Mẫu được pha loãng từ hỗn dịch mẫu ban đầu (3.3).

4  Phòng thử nghiệm

4.1  Khu vực thử nghiệm

Các khu vực được yêu cầu cho hoạt động cụ thể của một phòng thử nghiệm vi sinh như sau:

- Nhận, bảo quản, chuẩn bị và xử lý mẫu;

- Chuẩn bị và tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy, dụng cụ và dụng cụ thủy tinh;

- Thử nghiệm: cân, pha loãng, cấy chủng, nuôi cấy, ủ, bảo quản chủng vi sinh, v.v...;

- Khử nhiễm và làm sạch các dụng cụ, dụng cụ thủy tinh và xử lý rác thải thử nghiệm.

4.2  Các khu vực phụ trợ

Các khu vực này bao gồm:

- Lối vào, hành lang, cầu thang, thang máy;

- Khu vực hành chính (ví dụ khu thư ký, văn phòng, phòng tài liệu, v.v...);

- Phòng thay đồ và nhà vệ sinh;

- Phòng lưu trữ;

- Kho.

4.3  Vị trí phòng thử nghiệm

Môi trường cho thử nghiệm vi sinh không được ảnh hưởng tới độ tin cậy của thử nghiệm.

Cẩn thận trọng khi xác định vị trí phòng thử nghiệm để tránh rủi ro lây nhiễm chéo.

Cẩn thận trọng để tránh các điều kiện khắc nhiệt như nhiệt độ, độ ẩm cao, bụi, ồn, rung, tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng, v.v...

Diện tích bề mặt phải đủ rộng để khu vực làm việc sạch sẽ và ngăn nắp.

Trong quá trình thử nghiệm, cần chú ý hạn chế sự ra vào khu vực thử nghiệm, chỉ cho phép những người tiến hành thử nghiệm ra vào.

Các phòng riêng biệt và / hoặc khu vực riêng biệt và / hoặc dụng cụ chứa chuyên dụng phải được cung cấp cho các mục sau:

4.4  Trang thiết bị của phòng thử nghiệm

4.4.1  Phòng thử nghiệm phải được lắp đặt theo hướng nhằm mục đích giảm thiểu tối đa rủi ro nhiễm bẩn do bụi và các vi sinh vật khác:

- Tường, trần và sàn nhà phải nhẵn, không rỗ, dễ làm sạch và chịu được các chất tẩy rửa và các chất khử khuẩn được sử dụng trong phòng thí nghiệm;

- Không để các đường ống dẫn chất lỏng đi ngang qua cơ sở thử nghiệm trừ khi chúng được bọc kín;

- Hệ thống bảo vệ chống bức xạ mặt trời có thể lắp đặt bên ngoài cửa sổ;

- Cửa sổ và cửa ra vào có thể đóng khi đang thử nghiệm để tránh gió lùa. Hơn nữa, chúng phải được thiết kế sao cho tránh tạo các bẫy bụi và dễ lau rửa.

4.4.2  Nhiệt độ và chất lượng không khí (nồng độ vi sinh, độ ẩm, tốc độ phát tán bụi, v.v...) cần phù hợp với từng thử nghiệm.

Do đó, có thể sử dụng hệ thống cấp khí sạch hoặc tủ an toàn sinh học cho mục đích này.

4.4.3  Bàn ghế và nội thất trong phòng thí nghiệm phải được làm bằng vật liệu nhẵn, không thấm nước, không xốp, dễ làm sạch và khử khuẩn. Các nóc tủ, thiết bị cần đủ thấp để có thể dễ dàng vệ sinh

Có thể sử dụng đồ nội thất có chân không cố định để thuận tiện cho việc vệ sinh sàn nhà.

Các tài liệu hoặc sách không thường xuyên sử dụng được giữ bên ngoài khu vực thử nghiệm.

4.5  Bảo trì

Mặt sàn, tường, trần, mặt bàn và các trang thiết bị phòng thử nghiệm phải được bảo trì trong trạng thái tốt nhằm tránh nứt rạn dẫn đến bụi bẩn có thể tích tụ tạo ra nguồn lây nhiễm.

Thường xuyên lau rửa và khử khuẩn để giữ phòng thí nghiệm luôn trong trạng thái thích hợp để tiến hành thử nghiệm.

Hệ thống thông gió và các bộ lọc cần được bảo dưỡng thường xuyên và thay các bộ lọc khi cần thiết.

5  Thiết bị

5.1  Quy định chung

Nói chung, tất cả các thiết bị cần giữ sạch sẽ và trong điều kiện làm việc tốt.

Các hoạt động bảo trì phải được giám sát. Dụng cụ và thiết bị đo lường phải được kiểm tra định kỳ theo một thời gian biểu thích hợp, kết quả được ghi nhận và lưu giữ.

5.2  Tủ cấy sinh học

Tủ cấy vi sinh gồm hai loại:

a) Tủ được cấp khí sạch, nhằm mục đích bảo vệ sản phẩm tránh bị tạp nhiễm và hạn chế tạp nhiễm bởi người vận hành;

b) Tủ an toàn sinh học nhằm mục đích bảo vệ sản phẩm tránh bị tạp nhiễm, đồng thời bảo vệ người vận hành và môi trường.

Hai loại tủ này đều có thể sử dụng. Tủ an toàn sinh học nên được sử dụng trong tất cả các công việc có nguy cơ rủi ro với người vận hành.

Tủ cấy vi sinh là khu vực làm việc không bụi được bảo vệ bằng luồng khí thổi thẳng đứng. Trong thử nghiệm vi sinh, khi lọc vi sinh vật trên màng lọc cần phải thực hiện trong tủ an toàn sinh học.

5.3  Cân

Phòng thí nghiệm vi sinh phải được trang bị cân có dải đo và độ chính xác phù hợp với nhiều sản phẩm khác nhau.

Nhìn chung, độ chính xác của cân dùng để cân mẫu, môi trường và thuốc thử là ± 0,01 g.

5.4  Thiết bị đồng nhất

Thiết bị này (ví dụ thiết bị trộn, stomacher, v.v...) có thể sử dụng để chuẩn bị hỗn dịch ban đầu cho thử nghiệm các mẫu không ở dạng lỏng.

5.5  Máy đo pH

Thiết bị đo pH phải có khả năng đo chính xác tới ± 0,1 đơn vị pH và độ phân giải là 0,01 đơn vị pH.

5.6  Nồi hấp

Nồi hấp cần phải ở điều kiện làm việc tốt và được hiệu chuẩn định kỳ bởi cơ quan có năng lực theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và kết quả kiểm tra phải được ghi lại và lưu giữ.

Không được sử dụng nồi hấp để tiệt khuẩn đồng thời dụng cụ sạch và khử nhiễm các vật liệu đã sử dụng. Nên dùng hai nồi hấp riêng cho hai quá trình trên nếu có thể.

5.7  Tủ ấm

Tủ ấm cần có hệ thống điều chỉnh để giữ nhiệt độ ổn định và đồng đều trong lòng tủ.

Nếu nhiệt độ môi trường gần bằng hoặc cao hơn nhiệt độ của tủ ấm, thì cần phải bố trí một hệ thống làm mát.

Nên bảo vệ tủ ấm tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp.

Nếu có thể, không nên chất đầy tủ ấm chỉ trong một lần vì môi trường nuôi cấy sẽ mất nhiều thời gian để cân bằng nhiệt độ, dù là bất kỳ loại tủ ấm nào được sử dụng (đối lưu khí cưỡng bức hoặc cách khác). Nhiệt độ phải được kiểm tra và ghi lại ít nhất mỗi ngày làm việc.

5.8  Bể ổn nhiệt

Bể ổn nhiệt có hai loại:

- Bể ổn nhiệt điều chỉnh tự động, thích hợp ủ môi trường nuôi cấy, cho các thử nghiệm định danh, v.v...;

- Bể cách thủy để giữ môi trường thạch vô khuẩn ở trạng thái lỏng để dùng cho thử nghiệm.

- Nhiệt độ và độ chính xác nhiệt độ được quy định trong từng phương pháp áp dụng.

5.9  Tủ lạnh hoặc phòng bảo quản lạnh

Nhiệt độ phải từ 5 °C ± 3 °C, trừ khi có quy định khác.

5.10  Tủ đông

Nhiệt độ phải dưới -18 °C, trừ khi có quy định khác.

5.11  Tủ sấy tiệt khuẩn

Tủ sấy tiệt khuẩn cho phép diệt các vi sinh vật bằng nhiệt khô.

Nhiệt độ phải được phân bố đều trong tủ.

- Tủ sấy phải được trang bị:

- Một bộ ổn nhiệt;

- Một nhiệt kế hoặc một dụng cụ đo nhiệt thích hợp;

- Một đồng hồ hoặc bộ phận đặt chương trình / thời gian.

5.12  Thiết bị đếm khuẩn lạc

Thiết bị đếm khuẩn lạc có thể được sử dụng.

5.13  Các thiết bị khác

CẢNH BÁO - Các dụng cụ thủy tinh có độ chính xác cao không được tiệt khuẩn trong tủ sấy tiệt khuẩn.

Các dụng cụ và thiết bị khác sử dụng mỗi ngày bao gồm:

a) Dụng cụ lọc;

b) Bình chứa thủy tinh hoặc nhựa (ống nghiệm, bình, chai);

c) Đĩa petri thủy tinh hoặc nhựa (đường kính phổ biến 85 mm và 100 mm);

d) Pipet thủy tinh hoặc nhựa (10 ml, 2 ml, 1 ml), pipet tự động;

e) Thiết bị lấy mẫu;

f) Que cấy thẳng và que cấy vòng (bằng niken/crom, platin/iridium hoặc nhựa sử dụng một lần, v.v...);

g) Kính hiển vi quang học;

h) Đèn gas hoặc lò đốt que cấy;

i) Dụng cụ phân phối môi trường nuôi cấy và thuốc thử;

j) Máy khuấy cơ học.

Nếu phương pháp màng lọc được sử dụng, thiết bị bao gồm:

- Một hệ thống lọc hoặc bộ phễu lọc được làm bằng chất liệu thích hợp, với bộ phận chứa ít nhất 50 ml và thích hợp cho việc sử dụng các màng lọc có đường kính từ 47 mm đến 50 mm và kích thước lỗ lọc không quá 0,45 μm;

- Vật liệu màng lọc được lựa chọn sao vi khuẩn không bị ảnh hưởng bởi các thành phần dư của mẫu cần được kiểm tra;

- Một bơm chân không hỗ trợ cho tốc độ lọc phù hợp (thiết bị phải được thiết lập để có thể lọc được 100 ml chất lòng trong ít hơn 2 min).

6  Chủng vi sinh vật

Chủng vi sinh vật cần cho đánh giá sự phù hợp của phương pháp được quy định trong mỗi phương pháp áp dụng.

7  Nhân sự

7.1  Năng lực

Tất cả nhân viên làm việc trong một phòng thí nghiệm vi sinh phải được đào tạo đầy đủ để hoàn thành công việc được giao phó.

Nhân viên thực hiện các thử nghiệm phải có kiến thức tốt và kinh nghiệm thực tế về các kỹ thuật vi sinh vật và các vi sinh vật tìm kiếm. Nhân viên có thể đánh giá độ chính xác và độ đúng để thu được một kết quả có thể chấp nhận được.

7.2  Vệ sinh

Về lĩnh vực vệ sinh cá nhân, phải tuân thủ các lưu ý sau để tránh làm nhiễm bẩn mẫu thử và môi trường nuôi cấy, đồng thời cũng để tránh nguy cơ lây nhiễm sang con người:

- Phải mặc áo choàng phòng thí nghiệm sáng màu, sạch và trong trạng thái tốt, được sản xuất từ loại sợi hạn chế được nguy cơ cháy, không mang quần áo ra khỏi khu vực làm việc;

- Giữ móng tay sạch, nhẵn nhụi, tốt nhất là cắt ngắn;

- Rửa tay trước và sau khi thử nghiệm vi sinh và ngay sau khi đi vệ sinh hoặc ăn; làm khô tay bằng khăn giấy hoặc khăn tay một lần;

- Tránh nói, ho, v.v... khi đang thao tác cầy truyền;

- Không hút thuốc, uống nước hoặc ăn trong khu vực thử nghiệm;

- Không để thực phẩm trong tủ lạnh chuyên dụng của phòng thí nghiệm;

- Đặc biệt lưu ý khi người bị nhiễm khuẩn da hoặc đang bị ốm có thể lây nhiễm vi sinh vật sang mẫu thử và có thể làm sai lệch kết quả.

8  Chuẩn bị dụng cụ và dụng cụ thủy tinh

8.1  Chuẩn bị

Dụng cụ và dụng cụ thủy tinh dùng trong thử nghiệm vi sinh phải đảm bảo sạch và / hoặc vô khuẩn cho đến khi sử dụng.

Đậy nút ống nghiệm và nắp chai bằng vật liệu thích hợp trước khi tiệt khuẩn.

Nút pipet bằng bông hoặc bất kỳ vật liệu thích hợp nào khác.

Nếu cần thiết, dụng cụ và dụng cụ thủy tinh đã tiệt khuẩn phải được đặt trong các thùng chứa đặc biệt hoặc được gói trong một vật liệu thích hợp (ví dụ giấy đặc biệt, nhôm, v.v...).

8.2  Tiệt khuẩn

8.2.1  Tiệt khuẩn bằng nhiệt khô

Tiệt khuẩn trong tủ sấy ít nhất 1 h ở 170 °C đến 180 °C hoặc có thể sử dụng chương trình kết hợp nhiệt độ và thời gian khác đã được thẩm định.

Có thể dùng các loại chỉ thị để đảm bảo rằng việc tiệt khuẩn đã đạt được.

8.2.2  Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Tiệt khuẩn ở nhiệt độ tối thiểu 121 °C trong ít nhất 15 min. Các chất chỉ thị có thể được sử dụng để đảm bảo rằng việc tiệt khuẩn đã đạt được.

8.3  Dụng cụ sử dụng một lần

Dụng cụ sử dụng một lần có thể dùng tương tự như các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần (đĩa petri, pipet, ống, v.v...) nếu chúng có chất lượng tương đương.

Trong trường hợp này, liên hệ với nhà sản xuất để xác định các dụng cụ và dụng cụ thủy tinh cần phù hợp để sử dụng trong vi sinh (đặc biệt là độ vô khuẩn) và vật liệu đó không chứa các chất ức chế sự phát triển của vi sinh vật.

Dụng cụ sử dụng một lần sẽ được tiệt khuẩn trước khi thải bỏ. Ngoài phương pháp được mô tả trong 8.6, và phụ thuộc vào quy định của quốc gia, có thể sử dụng lò đốt. Nếu có lò đốt tại cơ sở, việc khử nhiễm và thải bỏ có thể đạt được đồng thời.

8.4  Bảo quản dụng cụ và dụng cụ thủy tinh sạch

Dụng cụ và dụng cụ thủy tinh sạch phải được bảo vệ chống lại sự tạp nhiễm từ bên ngoài trong quá trình bảo quản và được bảo quản trong điều kiện tốt để duy trì độ sạch của dụng cụ.

8.5  Bảo quản dụng cụ và dụng cụ thủy tinh vô khuẩn

Trước khi sử dụng, dụng cụ và dụng cụ thủy tinh phải được bảo quản trong điều kiện đảm bảo độ vô khuẩn. Dụng cụ sử dụng một lần và dụng cụ thủy tinh phải được bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất, không được làm hỏng bao bì; dụng cụ và dụng cụ thủy tinh do phòng thí nghiệm tự chuẩn bị phải được bảo quản trong dụng cụ chứa sạch.

Khi tiệt khuẩn dụng cụ và dụng cụ thủy tinh dùng cho thử nghiệm vi sinh, thời hạn sử dụng (hoặc ngày sản xuất) phải ghi ngay trên mỗi bao bì. Dụng cụ và dụng cụ thủy tinh có thể được bảo quản trong vòng 3 tháng trước khi sử dụng, trừ khi có quy định khác.

8.6  Xử lý vật liệu nhiễm vi sinh vật

Sau khi sử dụng (môi trường chứa vi sinh vật hoặc vật liệu nhiễm vi sinh vật), dụng cụ, dụng cụ thủy tinh và vật liệu chứa trong chúng phải được xử lý để diệt vi sinh vật, trước khi làm vệ sinh hoặc thải bỏ, bất kể loại vi sinh vật nào.

Tùy theo tính chất của vật liệu, khử nhiễm (11.1), tiệt khuẩn (8.2) hoặc đốt các vật liệu dùng một lần (8.3) có thể sử dụng.

8.7  Rửa

Rửa dụng cụ và dụng cụ thủy tinh sau khi chúng đã được xử lý (8.6).

Loại bỏ hết các vật chất chứa trong dụng cụ.

Trước khi rửa, tháo nút hoặc nắp, nếu thích hợp.

Rửa sạch chất tẩy rửa dưới vòi nước. Tráng sạch dụng cụ bằng nước phù hợp (9.2).

Trong trường hợp không có bất kỳ sản phẩm thương mại nào, có thể sử dụng dịch natri cacbonat 0,125 % (theo khối lượng), sau đó tiếp tục ngâm trong acid loãng (ví dụ Acid hydroclorid 0,1 mol/l).

Có thể sử dụng các thiết bị rửa dụng cụ và dụng cụ thủy tinh (ví dụ như máy rửa pipet, máy rửa chén, bể siêu âm, v.v...).

9  Chuẩn bị và tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy và thuốc thử

9.1  Quy định chung

Sự chuẩn bị đúng môi trường nuôi cấy là một trong những bước cơ bản trong thử nghiệm vi sinh vật nên cần đặc biệt chú ý.

9.2  Nước

CẢNH BÁO - Nước được xử lý qua một bộ trao đổi ion (khử ion) có thẻ có hàm lượng vi sinh cao. Do đó không nên sử dụng nước mà không chắc chắn được hàm lượng vi sinh vật trong nước ở mức thấp. Tham khảo ý kiến nhà sản xuất để có cách tốt nhất giảm số lượng sinh vật. Nước khử ion bị ô nhiễm nặng đã được lọc tiệt khuẩn vẫn có thể chứa các chất ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật.

Sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, ví dụ nước tinh khiết hoặc nước khử ion. Nếu nước cất được sản xuất từ nước khử clo, cần trung hòa clo trước khi chưng cất.

Nước phải được chứa trong các thùng chứa bằng vật liệu trơ (ví dụ bình thủy tinh trung tính, polyethylene, v.v...).

9.3  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

9.3.1  Quy định chung

Có hai cách để chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

- Từ các thành phần cơ bản, khô hoặc không;

- Từ môi trường khô hoàn chỉnh.

Cần tuân thủ các điều kiện bảo quản và hạn sử dụng của nhà sản xuất.

Không sử dụng môi trường nuôi cấy hết hạn sử dụng.

Môi trường nuôi cấy khô cần tránh bị ảnh hưởng bởi độ ẩm của môi trường trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng.

9.3.2  Hòa môi trường vào nước

Thực hiện theo khuyến nghị của nhà sản xuất.

9.3.3  Đo pH

Đo pH bằng máy đo pH (5.5) và điều chỉnh nếu cần thiết để sau khi tiệt khuẩn và làm mát đến nhiệt độ phòng, môi trường ở pH cần thiết ± 0,2, trừ khi có quy định khác.

CHÚ Ý - Việc điều chỉnh pH được thực hiện bằng dung dịch natri hydroxyd (NaOH) khoảng 40 g/l (khoảng 1 mol/l) hoặc dung dịch acid hydroclorid (HCl) khoảng 36,5 g/l (khoảng 1 mol/l).

9.3.4  Phân phối môi trường

Phân phối môi trường vào bình chứa thích hợp, bằng tay hoặc sử dụng thiết bị tự động.

9.4  Tiệt khuẩn

9.4.1  Quy định chung

Tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy và thuốc thử có thể được thực hiện bằng các kỹ thuật khác nhau, bao gồm:

- Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm;

- Tiệt khuẩn bằng cách lọc.

Tùy theo kỹ thuật được sử dụng, môi trường đã được tiệt khuẩn cần được theo dõi, đặc biệt đối với chỉ tiêu pH, màu sắc, độ vô khuẩn và đánh giá hiệu năng.

9.4.2  Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Sử dụng nồi hấp (5.6) để tiệt khuẩn. Theo quy định chung, điều kiện hấp tiệt khuẩn là nhiệt độ tối thiểu 121 °C trong ít nhất 15 min. Có thể điều chỉnh thông số tiệt khuẩn khi cần thiết để phù hợp với thể tích và số lượng bình chứa, sơ đồ mẻ hấp và loại môi trường.

Quy trình tiệt khuẩn phải được kiểm tra bằng các phương pháp thích hợp.

9.4.3  Tiệt khuẩn bằng phương pháp lọc

Việc tiệt khuẩn bằng phương pháp lọc có thể được thực hiện với sự hỗ trợ bởi bơm chân không hoặc ở điều kiện áp suất.

Sử dụng màng lọc vô khuẩn có đường kính lỗ lọc là 0,22 μm (trừ trường hợp nhất định, có thể sử dụng màng lọc 0,45 μm). Tham khảo hướng dẫn của nhà sản xuất về việc sử dụng vật liệu lọc hoặc màng lọc đã được vô khuẩn.

Tiệt khuẩn các thành phần khác nhau của dụng cụ lọc, lắp ráp hoặc không, hấp tiệt khuẩn ở 121°C trong 15 min. Nếu cần thiết, việc lắp ráp có thể thực hiện trong tủ vi sinh sau khi hấp. Có thể mua bộ dụng cụ vô khuẩn có sẵn trên thị trường.

9.5  Bảo quản

9.5.1  Quy định chung

Mỗi bao bì của chai, ống nghiệm và đĩa Petri phải được dán nhãn, có đầy đủ các thông tin sau:

- Tên môi trường;

- Ngày chuẩn bị và / hoặc hạn sử dụng.

9.5.2  Môi trường nuôi cấy và thuốc thử do phòng thí nghiệm tự chuẩn bị

Môi trường nuôi cấy được phân phối trong ống nghiệm hoặc chai và thuốc thử chưa sử dụng ngay cần tránh ánh sáng và bay hơi bằng cách sử dụng các nút đậy hoặc nút xoáy.

Môi trường nuôi cấy và thuốc thử phải được bảo quản trong điều kiện không làm thay đổi thành phần của chúng.

Không sử dụng môi trường đã bị vón cục.

Trước khi sử dụng, nhiệt độ của môi trường nuôi cấy cần cân bằng với nhiệt độ của phòng thí nghiệm, trừ khi có quy định khác.

VÍ DỤ: Môi trường TSA, được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm, được giữ trong bình và bảo quản trong bóng tối, thường là không quá 2 tháng, trừ khi có quy định khác.

9.5.3  Môi trường nuôi cấy và thuốc thử pha sẵn

Cần tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất:

- Hạn sử dụng;

- Nhiệt độ và điều kiện bảo quản;

- Điều kiện sử dụng (pH, v.v...);

- Kiểm soát chất lượng.

9.6  Đun chảy môi trường nuôi cấy thạch

Đun chảy môi trường nuôi cấy bằng cách đun cách thủy hoặc bằng quá trình khác cho hiệu quả tương tự (ví dụ, hấp hơi nước).

Tránh để quá nhiệt độ và lấy môi trường nuôi cấy ra ngay khi đã tan chảy. Giữ môi trường nuôi cấy ở trạng thái lỏng trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ không quá 48 °C cho đến khi sử dụng. Không để môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ cao hơn 48 °C. Tốt nhất là không giữ môi trường đã nóng chảy quá 8 h. Trong trường hợp môi trường nuôi cấy nhạy cảm đặc biệt, rút ngắn thời gian đun chảy.

Môi trường đun chảy nhưng chưa sử dụng đến không được làm đông đặc lại để sử dụng tiếp.

9.7  Chuẩn bị đĩa Petri

Đổ môi trường nuôi cấy đã đun chảy vào từng đĩa Petri vô khuẩn để đạt được độ dày ít nhất 3 mm + 4 mm (ví dụ: đối với các đĩa có đường kính 90 mm, cần 15 ml đến 20 ml môi trường thạch).

Đặt các đĩa Petri lên một bề mặt nằm ngang, mát để môi trường nguội và đông đặc.

Đĩa Petri đã chuẩn bị có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản trong điều kiện thích hợp (trong tối, nhiệt độ và thời gian thích hợp) không làm thay đổi thành phần của chủng. Nhãn trên các đĩa petri ghi theo mô tả mục 9.5.

Nếu cần có thể làm khô đĩa trước khi sử dụng.

Bảo quản và sử dụng các đĩa môi trường pha sẵn có trên thị trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

10  Mẫu phòng thí nghiệm

10.1  Quy định chung

Sản phẩm và mẫu được định nghĩa theo 3.1 và 3.2.

10.2  Lấy mẫu sản phẩm mỹ phẩm

Quan trọng là sản phẩm mà phòng thí nghiệm nhận được phải đại diện cho sản phẩm mỹ phẩm và không bị hư hỏng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu phải được thực hiện theo các văn bản thích hợp, cụ thể. Nếu không có văn bản cụ thể, khuyến nghị các bên liên quan phải thỏa thuận về vấn đề này.

10.3  Vận chuyển

Trong quá trình vận chuyển đến phòng thí nghiệm, sản phẩm để thử nghiệm phải được giữ trong các điều kiện hạn chế tối đa sự thay đổi về số lượng vi sinh vật.

10.4  Tiếp nhận và bảo quản

Nhân viên phòng thí nghiệm kiểm tra tình trạng của sản phẩm khi tiếp nhận và xác nhận điều kiện và số lượng là phù hợp. Nếu tình trạng của sản phẩm không đảm bảo hoặc nếu số lượng không đủ, phòng thí nghiệm không thể thực hiện các thử nghiệm như yêu cầu.

Tuy nhiên, trong trường hợp đặc biệt nếu việc thử nghiệm được hoàn thành, nhân viên phải ghi lại tình trạng của sản phẩm và lý do thử nghiệm.

Các sản phẩm được phép đưa vào phòng thí nghiệm phải được ghi chép đầy đủ sao cho kiểm soát được suốt quá trình cho đến khi viết báo cáo thử nghiệm.

Cần lưu ý những thông tin sau đây:

- Ngày nhận.

- Chi tiết việc lấy mẫu (ngày và thời gian lấy mẫu, các điều kiện lấy mẫu,..);

- Tên, tài liệu quy chuẩn, nguồn gốc và yêu cầu của khách hàng;

- Đặc điểm của sản phẩm.

Nếu cần thiết, bảo quản sản phẩm để kiểm tra ở nhiệt độ phòng. Không ủ, giữ lạnh hoặc đóng băng các sản phẩm và mẫu trước hoặc sau khi phân tích.

10.5  Xử lý sản phẩm và mẫu

- Để tránh lây nhiễm từ môi trường, sản phẩm và mẫu càn xử lý theo đúng quy trình để tránh tất cả các nguy cơ lây nhiễm. Để đạt được điều này, cần thực hiện các kỹ thuật vô khuẩn, ví dụ:

- Tất cả dụng cụ dùng để mờ bao bì phải vô khuẩn;

- Dụng cụ sử dụng để lấy mẫu ra khỏi sản phẩm phải vô khuẩn;

- Nếu cần thiết, vệ sinh bao bì và nắp đậy bằng phương pháp thích hợp.

10.6  Lưu và hủy các sản phẩm

Ngoại trừ các trường hợp đặc biệt, giữ các mẫu phòng thử nghiệm cho đến khi thu được tất cả các kết quả, hoặc lâu hơn nếu cần.

Hủy bỏ sản phẩm đã lấy mẫu, trừ khi thấy cần xử lý như vật liệu bị ô nhiễm (8.6) do bản chất và mức độ ô nhiễm của mẫu.

11  Thực hành vi sinh

11.1  Các biện pháp giữ vệ sinh trong quá trình thử nghiệm

Chú ý tiến hành công việc trong các điều kiện vô khuẩn, ví dụ như:

a) Đảm bảo khu vực làm việc sạch và không có gió lùa (cửa chỉnh và cửa sổ phải đóng lại);

b) Trước và sau khi làm việc, khử nhiễm bề mặt làm việc bằng chất sát khuẩn thích hợp;

c) Trước khi tiến hành công việc, phải đảm bảo các thứ cần thiết đã được chuẩn bị sẵn;

d) Trong trường hợp công việc được tiến hành trong tủ cấy vi sinh, sử dụng găng tay vô khuẩn hoặc sát khuẩn tay trước khi bắt đầu làm việc;

e) Khi không làm việc trong tủ cấy vi sinh, mở vật chứa mẫu ở gần một ngọn lửa, giữ chúng ở vị trí nghiêng nhất có thể;

f) Thực hiện công việc nhanh nhất có thể, không thực hiện bất kỳ thao tác không cần thiết;

g) Nếu không sử dụng hết pipet, đĩa petri sử dụng một lần v.v... thì cần đảm bảo bao gói được đóng kín sau khi lấy dụng cụ ra;

h) Tiệt khuẩn que cấy thẳng và vòng, vv... trước và sau khi sử dụng bằng cách đốt trên ngọn lửa; để tránh phát tán các chất và vi sinh vật nên sử dụng lò đốt dây điện bất cứ khi nào có thể hoặc sử dụng các que cấy thẳng và vòng dùng một lần;

i) Ngâm pipet, thìa, vv... trong các thùng chứa chất khử khuẩn thích hợp (ví dụ như dung dịch natri hypochlorit cho pipet) trước khi xử lý (8.6);

j) Đặt thiết bị tái sử dụng có chứa vi sinh vật vào các thùng chứa trước khi tiệt khuẩn và rửa;

k) Đặt dụng cụ dùng một lần trong bình chứa thích hợp trước khi tiệt khuẩn hoặc đốt (8.6);

I) Lau sạch ngay các chất lỏng bị đổ bằng khăn bông hoặc vật liệu thích hợp khác đã tẩm chất khử khuẩn thích hợp rồi làm sạch và khử nhiễm bề mặt làm việc trước khi tiếp tục.

Việc thao tác với các sản phẩm và các môi trường có khả năng chứa vi khuẩn gây bệnh yêu cầu các biện pháp phòng ngừa đặc biệt. Những điều sau đây được khuyến cáo:

- Tất cả các thao tác cần thiết để tiến hành thử nghiệm cần thực hiện trong tủ cấy vi sinh;

- Sử dụng pipet tự động (cấm hút pipet bằng miệng ).

CHÚ THÍCH: Khí dung là nguyên nhân chính gây nhiễm bẩn môi trường và nhiễm khuẩn. Khí dung có thể được hình thành từ:

- Khi sử dụng bộ lắc, ống tiêm, v.v...;

- Khi làm rỗng pipet bằng cách thổi;

- Khi tiệt khuẩn que cấy ướt;

Vì vậy, cần hạn chế sự hình thành khí dung.

11.2  Chuẩn bị hỗn dịch ban đầu và các mẫu pha loãng

11.2.1  Quy định chung

Trong trường hợp chuẩn bị hỗn dịch ban đầu và các mẫu pha loãng, thời gian từ khi kết thúc việc chuẩn bị đến khi cấy vào môi trường nuôi cấy không được vượt quá 45 min, trừ khi có quy định riêng trong tiêu chuẩn cụ thể.

Hỗn dịch ban đầu được chuẩn bị từ ít nhất 1 g hoặc 1 ml hỗn hợp sản phẩm đồng nhất trong điều kiện thử nghiệm.

Ghi lại khối lượng hoặc thể tích chính xác của mẫu, S.

11.2.2  Sản phẩm phân tán được trong nước

Chuyển mẫu S của sản phẩm vào vật chứa thích hợp và pha loãng theo tiêu chuẩn áp dụng.

Ghi lại hệ số pha loãng, d.

11.2.3  Sản phẩm không phân tán được trong nước

Chuyển mẫu S của sản phẩm vào vật chứa thích hợp có chứa một lượng chất hòa tan thích hợp (ví dụ polysorbate 80) và pha loãng theo tiêu chuẩn áp dụng.

Ghi lại hệ số pha loãng, d.

11.3  Phương pháp đếm

Thực hiện theo các yêu cầu của phương pháp chuẩn được áp dụng. Để biết thông tin, xem Phụ lục B.

11.4  Phương pháp phát hiện

Thực hiện theo các yêu cầu của phương pháp chuẩn được áp dụng.

12  Biểu thị kết quả

Thực hiện theo các yêu cầu của phương pháp chuẩn được áp dụng.

13  Trung hòa tính kháng vi sinh vật của sản phẩm

Trước khi phát hiện hoặc đếm các vi sinh vật trong một sản phẩm mỹ phẩm, cần trung hòa khả năng ức chế vi sinh vật của mẫu thử. Trong tất cả các trường hợp và với bất kỳ phương pháp nào, việc trung hòa tính kháng vi sinh vật của sản phẩm phải được kiểm tra và thực hiện.

Các thông số kỹ thuật của phương pháp tiêu chuẩn phải được áp dụng và tuân thủ.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các kỹ thuật định danh cơ bản

A.1  Chuẩn bị chủng thuần khiết

A.1.1  Quy định chung

Chuẩn bị một chủng thuần khiết bằng cách chọn một khuẩn lạc trên hoặc trong môi trường thạch đã được cấy một thể tích mẫu thử pha loãng hoặc chủng vi sinh.

Sau đó nuôi cấy khuẩn lạc đã chọn trong môi trường thạch không chọn lọc. Sau khi ủ, chọn một khuẩn lạc riêng lẻ nhất. Lặp lại thao tác nếu cần.

Sử dụng các kỹ thuật trải được mô tả trong mục A.1.2. Có thể sử dụng phương pháp khác trong một số trường hợp cụ thể.

A.1.2  Kỹ thuật cấy trải

A.1.2.1  Quy định chung

Lấy một lượng nhỏ từ bề mặt của một khuẩn lạc riêng lẻ bằng que cấy vòng vô khuẩn. Sau đó ria trực tiếp các tế bào có trong vòng que cấy (A.1.2.2) hoặc sau khi tạo hỗn dịch của các tế bào này (A.1.2.3).

A.1.2.2  Phương pháp trực tiếp:

Sử dụng que cấy vòng, cấy ria theo đường sát nhau một phần ba diện tích bề mặt môi trường thạch. Tiệt khuẩn và làm mát que cấy. Từ rìa của khu vực đã ria chủng, tạo một đường cấy khác, ít gần nhau hơn so với vệt ria đầu tiên. Lặp lại thao tác trên diện tích bề mặt còn lại với khoảng cách đường ria xa hơn. (hình A.1).

Hình A.1 - Ví dụ của kỹ thuật trải: Phương pháp trực tiếp

A.1.2.3  Phương pháp pha loãng

Phân tán các tế bào trong 1 ml đến 2 ml dung dịch pha loãng đã chọn, chạm vòng que cấy vào thành ống nghiệm ở bề mặt của chất lỏng, sau đó trộn đều.

Tiệt khuẩn và làm mát que cấy. Sử dụng que cấy vòng lấy một phần nhỏ dung dịch vi khuẩn và tiến hành như đã nêu trong mục A.1.2.2.

A.1.3  Ủ

Lật ngược các đĩa Petri đã cấy chủng, ủ trong tủ ấm với thời gian, nhiệt độ đã chọn.

A.1.4  Lựa chọn

Sau khi ủ, lựa chọn một khuẩn lạc riêng lẻ từ đĩa, để ria tiếp hoặc để thực hiện các thử nghiệm.

Nếu có thể, các thử nghiệm cuối cùng nên được thực hiện với các tế bào từ một khuẩn lạc riêng lẻ duy nhất. Nếu lượng tế bào trong một khuẩn lạc không đủ, trước tiên nên nuôi cấy trong một môi trường lỏng hoặc trên môi trường thạch, sau đó có thể sử dụng chủng này để thực hiện các thử nghiệm.

A.2  Nhuộm Gram (kỹ thuật Hucker cải tiến)

A.2.1  Quy định chung

Việc nhuộm màu các tế bào vi khuẩn này cho phép mô tả được hình thái của vi khuẩn và phân loại chúng thành hai nhóm theo chức năng, chúng có thể hay không thể giữ được màu tím của thuốc nhuộm tím tinh thể trong các điều kiện thử nghiệm. Các kết quả phân loại này phần lớn dựa trên sự khác nhau về cấu trúc thành tế bào của hai nhóm và là điểm khác biệt chính giữa hai nhóm. Có một số cách để tiến hành nhuộm Gram, nhưng tất cả đều theo các trình tự dưới đây.

A.2.2  Các dung dịch

A.2.2.1  Quy định chung

Có thể dùng các dung dịch thương mại. Trong trường hợp này, phải tuân theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

A.2.2.2  Dung dịch tím tinh thể

A.2.2.2.1  Thành phần

A.2.2.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan tím tinh thể trong ethanol và amoni oxalat trong nước cất. Trộn hai dung dịch và để hỗn hợp ổn định trong 24 h trước khi sử dụng.

A.2.2.3  Dung dịch iod

A.2.2.3.1  Thành phần

A.2.2.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan Kali iodid trong 10 ml nước cất, từ từ thêm từng lượng nhỏ iod vào dung dịch.

Sau khi hòa tan, thêm nước cho đến vạch 100 ml trong bình định mức.

A.2.2.4  Dung dịch Safranin

A.2.2.4.1  Thành phần

A.2.2.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan safranin trong ethanol sau đó trộn với nước cất để được thể tích cuối cùng là 100 ml.

Khi tím tinh thể được sử dụng, sự ổn định của dung dịch cần được kiểm chứng bằng cách trộn một giọt dung dịch tinh thể tím với một giọt dung dịch iod trên mặt lam kính để quan sát phản ứng hóa học. Nếu thấy kết tinh trên mặt kính, không sử dụng dung dịch tím tinh thể.

A.2.2.5  Kỹ thuật nhuộm

Sau khi đã cố định vết vi khuẩn (được chuẩn bị từ dịch nuôi từ 18 h đến 24 h, hoặc từ canh thang đục) trên lam kính (ví dụ với ngọn lửa) thì phủ lên vết này dung dịch tím tinh thể (xem A.2.2.2). Để phản ứng xảy ra trong 1 min.

Rửa nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài s.

Phủ lên lam kính dung dịch iod (A.2.2.3). Để phản ứng xảy ra trong 1 min. Rửa nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài s.

Đổ nhẹ nhàng và liên tục một lớp mỏng dung dịch ethanol (95 %) lên lam kính để nghiêng trong khoảng thời gian không quá 30 s cho đến khi không còn màu tím.

Rửa nhẹ lam kính ở tư thế nghiêng bằng nước để loại bỏ ethanol.

Phủ lên lam kính bằng dung dịch safranin (A.2.2.4) trong 10 s.

Rửa nhẹ lam kính để ở tư thế nghiêng bằng nước trong vài s. Làm khô lam kính.

A.2.2.6  Cách đọc kết quả

Quan sát lam kính dưới kính hiểm vi có độ phóng đại cao (5.13). Các tế bào vi khuẩn có màu xanh hoặc tím là Gram dương; có màu từ hồng thẫm đến đỏ là Gram âm.

Một số loại vi khuẩn thuần chủng có thể có cả tế bào Gram dương và Gram âm trong cùng một thị trường của kính hiển vi.

LƯU Ý: Các tế bào vón đặc có thể cho hình ảnh không đặc trưng.

A.3  Phản ứng catalase

A.3.1  Quy định chung

Việc phát hiện enzyme phân hủy hydrogen peroxid (H₂O₂) để tạo nước và oxy, có thể được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường lỏng, môi trường thạch có cấy vi sinh vật hoặc một khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch.

A.3.2  Từ môi trường lỏng

Thêm vào 1 ml môi trường, 0,5 ml dung dịch hydrogen peroxid 10 thể tích (3 % khối lượng). Quan sát sự xuất hiện của bọt khí oxy (catalase dương tính) hoặc không có bong bóng oxy (catalase âm tính).

A.3.3  Từ môi trường thạch

Nhỏ lên môi trường từ 1 ml đến 2 ml dung dịch hydrogen peroxid 10 % thể tích (3 % khối lượng). Quan sát ngay lập tức và sau 5 s xem có sự hình thành bọt khí oxy hay không.

A.3.4  Từ một khuẩn lạc

Nhỏ riêng hai giọt dung dịch hydrogen peroxid 10 thể tích trên một lam kính.

Chọn một khuẩn lạc bằng que cấy vô khuẩn (bằng thủy tinh hay nhựa) và nhũ hóa nhẹ nhàng nó vào một trong hai giọt. Quan sát ngay sau đó và trong vài min (ít nhất 1 min) có hay không các bọt khí oxy. Trong trường hợp có nghi ngờ, phủ mỗi giọt với một la men và so sánh sự xuất hiện của bọt khí bên dưới hai la men.

Có thể quan sát bằng mắt thường hoặc sử dụng một kính hiển vi có độ phóng đại thấp.

A.4  Phản ứng oxidase

A.4.1  Quy định chung

Việc phát hiện phản ứng oxidase được thực hiện bởi sự thay đổi màu sắc của một hợp chất tại thời điểm quá trình oxy hóa diễn ra dưới tác động của enzym này.

A.4.2  Thuốc thử

A.4.2.1  Thành phần

A.4.2.2  Chuẩn bị

Hoà tan thành phần thuốc thử trong nước lạnh. Chuẩn bị thuốc thử ngay trước khi sử dụng.

Có thể sử dụng đĩa hoặc que thử có sẵn. Trong trường hợp này, thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

A.4.2.3  Kỹ thuật

Làm ướt một miếng giấy lọc bằng thuốc thử. Lấy mẫu vi khuẩn thu được từ môi trường thạch bằng que cấy bạch kim hoặc thủy tinh hoặc nhựa (một dây niken/chrome cho kết quả dương tính giả) và đặt nó lên giấy lọc ẩm.

A.4.2.4  Giải thích kết quả

Trong trường hợp có sự hiện diện của oxidase, màu tím đến tím đỏ xuất hiện trong khoảng thời gian từ 5 s đến 10 s. Nếu màu sắc không thay đổi sau 10 s, thử nghiệm được xem là âm tính.

A.5  Sử dụng bộ kit thử sinh hóa để nhận biết

Các KIT sinh hóa hiện có thể được sử dụng để định danh. Tuy nhiên, tất cả các KIT thương mại hóa đều không có cùng độ tin cậy. Do đó, nên đánh giá hiệu quả của chúng trước khi sử dụng, trừ khi chúng đã được xác nhận bởi nhà sản xuất và / hoặc một tổ chức độc lập.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Các kỹ thuật đếm và cấy trải cơ bản

B.1  Phương pháp đổ đĩa thạch

Chuẩn bị môi trường, các đĩa Petri, dung dịch pha loãng và mẫu pha loãng phải được kiểm tra số lượng tương ứng với kế hoạch sử dụng.

Lấy một lượng thể tích xác định của các mẫu pha loãng cần kiểm tra vào các đĩa Petri (đã dán nhãn). Đổ vào một lượng môi trường theo quy định trong mục 9.7 vào mỗi đĩa petri. Ngay lập tức lắc cẩn thận để tạo sự phân bố đồng nhất của vi sinh vật trong môi trường. Làm mát và đông đặc môi trường bằng cách đặt các đĩa Petri lên bề mặt mát (thời gian đông đặc của thạch không được vượt quá 10 min).

B.2  Phương pháp cấy trải

Cho các dung dịch cần cấy vào giữa đĩa Petri có chứa môi trường thạch đã dán nhãn (được chuẩn bị theo mục 9.7). Trải đều và nhanh nhất có thể trên bề mặt môi trường bằng cách sử dụng que trải thủy tinh hoặc nhựa dẻo vô khuẩn hoặc xoay đĩa cho đến khi không còn chất lỏng có thể nhìn thấy trên bề mặt thạch.

B.3  Phương pháp lọc qua màng

Chuyển một lượng mẫu phù hợp được chuẩn bị theo hướng dẫn của mỗi phương pháp vào dụng cụ lọc được làm ướt với một lượng nhỏ dung dịch pha loãng vô khuẩn thích hợp, lọc ngay lập tức và rửa theo quy trình thích hợp.

Chuyển màng lọc lên bề mặt môi trường thạch của đĩa petri.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Chuẩn bị và hiệu chỉnh hỗn dịch chủng vi sinh vật

C.1  Nuôi cấy các chủng chuẩn

Để tăng độ lặp lại và độ tái lặp của các kết quả, nên sử dụng chủng vi sinh vật thế hệ thứ ba (ít nhất là thế hệ thứ hai) được nuôi cấy trên môi trường thạch, thu được từ các môi trường nuôi cấy và chuẩn bị theo EN 12353. Khi sử dụng Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, hỗn dịch thu được sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 18 h đến 24 h. Khi sử dụng Candida albicans, nuôi cấy lần đầu hoặc lần hai, ủ trong khoảng từ 36 h đến 48 h là phù hợp.

C.2  Chuẩn bị các hỗn dịch chủng vi sinh vật

Lấy 10 ml chất pha loãng cho vào bình 100 ml vô khuẩn có chứa 5 g hạt thủy tinh. Dùng que cấy vòng thu sinh khối từ môi trường thạch vào dung dịch pha loãng. Nhúng vòng cấy trong chất pha loãng và chà xát nó vào cạnh bình để giải phóng các tế bào. Lắc bình từ 2 min đến 3 min (sử dụng máy lắc cơ học nếu có thể). Hút phần hỗn dịch phía trên (tránh tiếp xúc với hạt thủy tinh) và chuyển vào trong một bình chứa đã vô khuẩn.

C.3  Hiệu chỉnh các hỗn dịch

Điều chỉnh nồng độ tế bào trong hỗn dịch từ 1 x 10⁸ CFU/ ml đến 3 x 10⁸ CFU/ml (với C. albicans từ 1 x 10⁷ CFU/ml đến 3 x 10⁷ CFU/ml) bằng dung dịch pha loãng và theo dữ liệu hiệu chuẩn trong phòng thử nghiệm. Ví dụ, sử dụng máy quang phổ (bước sóng 620 nm ± 20 nm, bước sóng) và cuvet dùng một lần dài 10 mm. Đo độ hấp thu của một phần hỗn dịch nếu cần pha loãng hỗn dịch để độ hấp thụ nằm trong một giá trị xác định. Các giá trị mật độ quang phổ thích hợp được nằm trong khoảng từ 0,150 đến 0,460 tùy theo từng chủng.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1 ] ISO 6887-1, Microbiology of the food chain - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions

[2] ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations

[3] ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water - Preparation, production, storage and performance testing of culture media

[4] ISO/IEC 17025, General requirements for the competence of testing and calibration laboratories

[5] EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics. Preservation of test organisms used for the determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal (including bacteriophages) activity

[6] CTFA, Microbiology Guidelines Toiletry and Fragrance Association, iSBN 1-88261-32-8, 2001

[7] EP, Microbiological Examination of non-sterile products, European Pharmacopoeia, Fourth Edition, 2002

[8] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, U.S. Food and Drug Administration, 1995.

[9] JP 1 4, General Tests - Microbial Limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001

[10] JCIA, Microbial test methods for cosmetics, published by the Japanese Cosmetics Industry Association, 1997

[11] USP 28:2005, Microbial Limit test (61), published by the u.s. Pharmacopoeia, 2005

Mục lục

Lời nói đầu

Lời giới thiệu

1  Phạm vi áp dụng

2  Tài liệu viện dẫn

3  Thuật ngữ và định nghĩa

3.1  Sản phẩm (product)

3.2  Mẫu (sample)

3.3  Hỗn dịch ban đầu (initial suspension)

3.4  Mẫu pha loãng (sample dilution)

4  Phòng thử nghiệm

4.1  Khu vực thử nghiệm

4.2  Các khu vực phụ trợ

4.3  Vị trí phòng thử nghiệm

4.4  Trang thiết bị của phòng thử nghiệm

4.5  Bảo trì

5  Thiết bị

5.1  Quy định chung

5.2  Tủ cấy sinh học

5.3  Cân

5.4  Thiết bị đồng nhất

5.5  Máy đo pH

5.6  Nồi hấp

5.7  Tủ ấm

5.8  Bể ổn nhiệt

5.9  Tủ lạnh hoặc phòng bảo quản lạnh

5.10  Tủ đông

5.11  Tủ sấy tiệt khuẩn

5.12  Thiết bị đếm khuẩn lạc

5.13  Các thiết bị khác

6  Chủng vi sinh vật

7  Nhân sự

7.1  Năng lực

7.2  Vệ sinh

8  Chuẩn bị dụng cụ và dụng cụ thủy tinh

8.1  Chuẩn bị

8.2  Tiệt khuẩn

8.3  Dụng cụ sử dụng một lần

8.4  Bảo quản dụng cụ và dụng cụ thủy tinh sạch

8.5  Bảo quản dụng cụ và dụng cụ thủy tinh vô khuẩn

8.6  Xử lý vật liệu nhiễm vi sinh vật

8.7  Rửa

9  Chuẩn bị và tiệt khuẩn môi trường nuôi cấy và thuốc thử

9.1  Quy định chung

9.2  Nước

9.3  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

9.4  Tiệt khuẩn

9.5  Bảo quản

9.6  Đun chảy môi trường nuôi cấy thạch

9.7  Chuẩn bị đĩa Petri

10  Mẫu phòng thí nghiệm

10.1  Quy định chung

10.2  Lấy mẫu sản phẩm mỹ phẩm

10.3  Vận chuyển

10.4  Tiếp nhận và bảo quản

10.5  Xử lý sản phẩm và mẫu

10.6  Lưu và hủy các sản phẩm

11  Thực hành vi sinh

11.1  Các biện pháp giữ vệ sinh trong quá trình thử nghiệm

11.2  Chuẩn bị hỗn dịch ban đầu và các mẫu pha loãng

11.3  Phương pháp đếm

11.4  Phương pháp phát hiện

12  Biểu thị kết quả

13  Trung hòa tính kháng vi sinh vật của sản phẩm

Phụ lục A (Tham khảo)_Các kỹ thuật định danh cơ bản

Phụ lục B (Tham khảo)_Các kỹ thuật đếm và cấy trải cơ bản

Phụ lục C (Tham khảo)_Chuẩn bị và hiệu chỉnh hỗn dịch chủng vi sinh vật

Thư mục tài liệu tham khảo