Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14262:2024 Phân bón - Định lượng Lactobacillus plantarum/Lactobacillus acidophilus bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và real-time PCR

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14262:2024

PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG LACTOBACILLUS PLANTARUM / LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ REAL-TIME PCR

Fertilizer - Enumeration of Lactobacillus plantarum / Lactobacillus acidophilus - The plate count and real-time PCR method

Lời nói đầu

TCVN 14262:2024 do Trường Đại học Khoa học Tự nhiên biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ thẩm định, công bố.

PHÂN BÓN - ĐỊNH LƯỢNG LACTOBACILLUS PLANTARUM / LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ REAL-TIME PCR

Fertilizer - Enumeration of Lactobacillus plantarum / Lactobacillus acidophilus - The plate count and real-time PCR method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Lactobacillus plantarum / Lactobacillus acidophilus trong phân bón và nguyên liệu sản xuất phân bón bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và real-time PCR. Tiêu chuẩn này sử dụng quy trình real-time PCR cho phép thử khẳng định L. plantarum /L. acidophilus.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6166, Phân bón vi sinh vật cố định nitơ.

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 7682 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phản ứng chuỗi Polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính.

TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước. Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

TCVN 11133 (ISO 22119), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (PCR real-time) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung.

TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Định nghĩa và yêu cầu chung.

TCVN 11925 (ISO 20837), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm. Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính.

TCVN 12105, Phân bón vi sinh vật. Lấy mẫu.

TCVN 13637 (ISO 21148), Mỹ phẩm. Vi sinh vật. Hướng dẫn chung về kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau:

3.1

Khuẩn lạc L. plantarum / L. acidophilus giả định (Putative L. plantarum /L. acidophilus CFU - PLC) khuẩn lạc mang các đặc điểm phù hợp với các mô tả (8.2) về khuẩn lạc của L. plantarum/L. acidophilus trên môi trường mMRS - BPB, khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này và chưa qua phép thử khẳng định.

3.2

Phép thử khẳng định L. plantarum /L. acidophilus (L. plantarum /L. acidophilus confirmation) phương pháp xác định khuẩn lạc L. plantarum /L. acidophilus giả định (3.1) là đúng hay sai, khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

3.3

Lactobacillus plantarum / Lactobacillus acidophilus

vi khuẩn hình thành khuẩn lạc L. plantarum /L. acidophilus giả định trên môi trường mMRS - BPB và được khẳng định đúng với phép thử khẳng định L. plantarum /L. acidophilus, khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

3.4

Real-time PCR

phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực cho phép theo dõi sự gia tăng và định lượng DNA mục tiêu trong mẫu thử trong suốt thời gian thực tế diễn ra phản ứng nhờ vào công nghệ phát huỳnh quang.

3.5

Định lượng L. plantarum / L. acidophilus (L. plantarum /L. acidophilus enumeration) xác định số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc L. plantarum / L. acidophilus (3.3) có trong một khối lượng hoặc thể tích cụ thể của phân bón, nguyên liệu sản xuất phân bón, khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

3.6

Giá trị chu kỳ ngưỡng (Threshold cycle value - Ct)

giá trị chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang được tạo ra vượt qua ngưỡng huỳnh quang nền, trong quy trình real-time PCR (phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực).

3.7

Đường cong nóng chảy (Melting curve)

đồ thị biểu diễn sự thay đổi của nhiệt độ trong các bước của quy trình real-time PCR. Đỉnh cao nhất của đường cong nóng chảy thể hiện giá trị Tm, đại diện cho mẫu nghiên cứu.

3.8

Giá trị Tm (Tm value)

điểm nhiệt độ mà tại đó 50 % sợi đôi ADN phân tách nhau và tạo thành sợi đơn.

4  Nguyên tắc

Định lượng L. plantarum/L. acidophilus trong phân bón, nguyên liệu sản xuất phân bón bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và khẳng định bằng kỹ thuật real-time PCR với quy trình như sau:

- Đếm số lượng khuẩn lạc L. plantarum /L. acidophilus giả định PLC, trên đĩa thạch mMRS - BPB và nhuộm Gram (đối với L. plantarum);

- Thực hiện phép thử khẳng định khuẩn lạc L. plantarum /L. acidophilus;

- Khẳng định số lượng khuẩn lạc đúng L. plantarum /L. acidophilus (3.3) dựa theo giá trị Ct;

- Từ số lượng khuẩn lạc đã khẳng định, áp dụng công thức tính để định lượng L. plantarum / L. acidophilus.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm vi sinh và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Thiết bị

5.1.1  Tủ cấy vô trùng, tủ cấy vi sinh, luồng không khí thổi theo chiều dọc.

5.1.2  Nồi hấp áp lực, có nhiệt độ hơi nước bão hòa trong buồng có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 °C ± 3 °C tương ứng áp suất tối thiểu 101,3 kPa.

5.1.3  Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến 0,01 g.

5.1.4  Tủ ấm, thông gió đối lưu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 40 °C, độ chính xác đến 1 °C.

5.1.5  Tủ lạnh, với ngăn đông duy trì nhiệt độ ổn định ở âm 20 °C ± 1 °C và ngăn lạnh duy trì nhiệt độ ổn định ở 4 °C ± 1 °C.

5.1.6  Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh tự động về nhiệt độ từ 0 °C đến 100 °C, độ chính xác đến 1 °C.

5.1.7  Máy trộn mẫu (máy vortex), có khả năng khuấy trộn mẫu đồng đều.

5.1.8  Máy quang phổ, định lượng ADN/ARN có phạm vi bước sóng từ 200 nm đến 850 nm, độ chính xác bước sóng 1 nm.

5.1.9  Máy đo pH, có độ chính xác đến ± 0,01 đơn vị pH ở nhiệt độ phòng.

5.1.10  Máy chu trình nhiệt (máy real-time PCR), phần nhiệt với khả năng luân nhiệt ở nhiệt độ khác nhau trong phạm vi từ 4 °C đến 115 °C một cách chính xác và quá trình luân nhiệt này được lặp đi lặp lại từ 30 đến 45 chu kỳ. Phần quang dùng để ghi nhận (detector) nhiều tín hiệu quang phát ra cùng lúc.

5.1.11  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

5.1.12  Bình nuôi kị khí, hoặc túi kị khí tạo không khí thích hợp để nuôi cấy vi sinh vật kị khí.

5.1.13  Kính hiển vi quang học, có vật kính dầu độ phóng đại 100 X.

5.2  Dụng cụ

5.2.1  Ống ly tâm, 1,5 mL.

5.2.2  Bộ Pipet, cho các kích cỡ từ 1 μL đến 10 μL, 20 μL đến 200 μL, 100 μL đến 1000 μL

5.2.3  Đầu côn, 1 mL; 200 μL; 20 μL; 10 μL.

5.2.4  Ống real-time PCR, thể tích từ 100 μL đến 200 μL.

5.2.5  Bình thủy tinh có nút vặn, thể tích phù hợp (100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL).

5.2.6  Bình định mức, 500 mL, 1000 mL.

5.2.7  Que cấy vi sinh, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo hoặc bằng thép.

5.2.8  Ống falcon, có nắp vặn, vô trùng và có dung tích 50 ml.

5.2.9  Đĩa Petri, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

5.2.10  Đèn cồn

5.2.11  Khay đá, giữ lạnh mẫu.

5.2.12  Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo hoặc bằng thép.

6  Môi trường, thuốc thử và vật liệu thử

6.1  Yêu cầu chung

Nước, thuốc thử và vật liệu thử cho quy trình nuôi cấy vi sinh và real-time PCR theo TCVN 8128 (ISO 11133) và TCVN 11133 (ISO 22119).

Khuyến nghị sử dụng thuốc thử thương mại cho quy trình real-time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green (SYBR Green Master Mix)[1]. Việc pha chế, bảo quản và sử dụng thuốc thử phải tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.2  Môi trường thạch mMRS - BPB (De Man Rogosa Sharpe - bromophenol blue agar)

6.2.1 Thành phần

Thành phần môi trường mMRS - BPB để nuôi cấy L. plantarum /L. acidophilus bao gồm:

pH 6,5 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng (25 °C)

6.2.2  Chuẩn bị

Cân và hòa tan các thành phần trong nước theo thứ tự đã liệt kê tại 6.2.1;

Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, dung dịch có pH là 6,5 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần;

Phân phối môi trường với lượng thích hợp vào các bình thủy tinh (5.2.5). Không vặn chặt nắp bình thủy tinh. Khử trùng 15 phút, trong nồi hấp áp lực (5.1.2) ở 121 °C;

Sau khi khử trùng, làm nguội trong khoảng từ 44 °C đến 47 °C; phân phối lượng khoảng từ 18 mL đến 20 mL môi trường vào các đĩa Petri (5 2.9) đã được chuẩn bị và để cho đông đặc. Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy vô trùng (5.1.1);

Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng (đảm bảo không có các giọt nước trên bề mặt môi trường) bằng cách lật úp các đĩa thạch và để trong tủ ấm (5.1.4) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 35 °C trong 25 min đến 30 min hoặc để qua đêm.

6.3  Dung dịch pha loãng

Chuẩn bị dung dịch pha loãng Natri clorua (NaCl) từ 0,85 % đến 0,9 % theo TCVN 6166.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng dung dịch NaCl 0.9 % thương mại có sẵn.

6.4  Hóa chất nhuộm Gram

Bộ thuốc nhuộm Gram cho vi khuẩn của các hãng được cung cấp trên thị trường. Tùy thuộc vào điều kiện thực tế để lựa chọn hóa chất phù hợp và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoặc làm theo mô tả trong TCVN 13637:2023 (ISO 21148).

6.5  Cặp mồi real-time PCR

Cặp mồi được thiết kế và kiểm tra tính đặc hiệu theo TCVN 7682 (ISO 20838).

Cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn ADN dài 142 bp sử dụng cho phép thử khẳng định L. plantarum và cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn ADN dài 75 bp sử dụng cho phép thử khẳng định L. acidophilus (3.2) bằng quy trình real-time PCR, với trình tự mồi (5' - 3') được thể hiện trong Bảng 1.

Bảng 1 - Danh sách mồi đặc hiệu phát hiện L. plantarum /L. acidophilus

6.6  Vật liệu ADN

Vật liệu ADN sử dụng trong phép thử khẳng định L. plantarum/L. acidophilus (3.2) bao gồm ADN đối chứng dương (Positive control - PC), ADN đối chứng âm (Negative control - NC) và ADN từ khuẩn lạc L. plantarum /L. acidophilus giả định (mẫu thử - Testing colony - TC).

6.6.1  Đối chứng dương

Chủng chuẩn L. plantarum tiếp nhận từ bộ sưu tập chủng của Liên đoàn thế giới các Bảo tàng giống vi sinh vật (WFCC) hoặc Tổ chức Bảo tàng giống vi sinh vật châu Âu (ECCO) theo TCVN 8128 (ISO 11133).

CHÚ THÍCH 1: Chủng chuẩn L. plantarum được ghi nhận trên Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Mỹ (NCBI) bao gồm ATCC:14917, CCUG:30503, CIP:103151, DSM:20174, IFO:15891, JCM:1149, BCCM/LMG:6907, NBRC: 15891, NCIMB:11974, NRRLB-4496, CGMCC:1.2437, NCTC:13644, CECT748, BCCM/LMG:6907.

Chủng chuẩn L. acidophilus tiếp nhận từ bộ sưu tập chủng của Liên đoàn thế giới các Bảo tàng giống vi sinh vật (WFCC) hoặc Tổ chức Bảo tàng giống vi sinh vật châu Âu (ECCO) theo TCVN 8128 (ISO 11133).

CHÚ THÍCH 2: Chủng chuẩn L. acidophilus được ghi nhận trên Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia Mỹ (NCBI) bao gồm DSM:20079, ATCC:4356, NCDO:1748, NCIB:8690, WDCM:00098, CCUG:5917, IFO:13951, CCM:4833, JCM:1132, BCRC:10695, CECT:903, CGMCC:1.1878, CIP:76.13, HAMBL84, KCTC:3111, KCTC:3164, LMG:13550, LMG:9433, NBRC:13951, NCCB:98067, NCFB:1748, NCIMB:8690, NCTC:12980, NRIC:1547, NRRLB- 23431, NRRLB-4239, NRRLB-4495, VKM:B-1660, VPI:6032, VTT:E-96276, IID:893, IMET:10710, PCM:249.

6.6.2  Đối chứng âm

Nước không chứa ADN/ARN hoặc ADN của các chủng không thuộc loài L. plantarum/L. acidophilus.

6.7  Thuốc thử để ngăn ngừa lây nhiễm chéo

Thuốc thử ngăn ngừa nhiễm chéo theo TCVN 7682:2007 (ISO 20838).

7  Lấy mẫu

Lấy mẫu phân bón vi sinh vật theo TCVN 12105. Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

8  Cách tiến hành

8.1. Pha loãng mẫu thử và cấy trải trên đĩa thạch

Thực hiện pha loãng mẫu thử và cấy trải dung dịch mẫu đã pha loãng trên đĩa thạch mMRS - BPB theo TCVN 6166, rồi chuyển các đĩa này vào bình nuôi kị khí (5.1.12) sau đó đặt trong tủ ấm (5.1.4) ở 37 °C ± 1 °C. Kiểm tra các đĩa nuôi cấy sau mỗi 24 h (trong 03 ngày), cho đến khi không thấy xuất hiện khuẩn lạc mới. Giữ lại các đĩa nuôi cấy có chứa ít hơn 200 khuẩn lạc để thực hiện việc nhận diện, đếm khuẩn lạc L. plantarum / L. acidophilus giả định (PLC) và thực hiện phép thử khẳng định L. plantarum / L. acidophilus.

8.2  Đếm khuẩn lạc L. plantarum / L. acidophilus giả định

Đĩa nuôi cấy được giữ lại (8.1) đạt yêu cầu cho công tác định lượng L. plantarum / L. acidophilus là đĩa có chứa các PLC (3.1) tách rời nhau (Phụ lục A.1).

Trong đĩa nuôi cấy có thể xuất hiện các khuẩn lạc mọc lan không mang các đặc điểm như mô tả cho L. plantarum /L. acidophilus (8.2). Nếu số khuẩn lạc mọc lan ít hơn một phần tư đĩa, thì đếm PLC trên phần đĩa không bị ảnh hưởng và tính bằng cách ngoại suy số đếm lý thuyết của các PLC cho toàn bộ đĩa. Nếu số khuẩn lạc mọc lan nhiều hơn một phần tư đĩa, thì không đếm PLC trên đĩa này.

Thực hiện đếm tất cả PLC trong các đĩa nuôi cấy giữ lại (8.1), ở 02 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng đếm trên 02 đĩa. Ưu tiên đếm từ đĩa có độ pha loãng thấp nhất và có tối thiểu 05 PLC.

8.3  Phép thử khẳng định L. plantarum /L. acidophilus

8.3.1  Nhận diện khuẩn lạc nghi ngờ

Khuẩn lạc L. plantarum nghi ngờ trên môi trường mMRS - BPB có hình tròn, bề mặt trơn nhẵn cao ở giữa tạo tâm tròn, viền tròn đều, có tâm màu xanh dương đậm, viền trắng đến xám, kích thước khoảng từ 06 mm đến 15 mm sau 48h nuôi cấy.

Khuẩn lạc L. acidophilus nghi ngờ trên môi trường mMRS - BPB có khuẩn lạc màu xanh xám, bề mặt phẳng trơn nhẵn, viền không đều, kích thước khoảng từ 02 mm đến 03 mm sau 48h nuôi cấy.

CHÚ THÍCH: Khuẩn lạc của L. plantarum và khuẩn lạc của Pediococcus pentosaceus có hình thái tương đối giống nhau. Có thể phân biệt được 2 loài trên bằng phương pháp nhuộm Gram (L. plantarum có dạng hình que, P. pentosaceus có dạng hình cầu).

8.3.2  Nhuộm Gram đối với L. plantarum

Thực hiện nhuộm Gram và quan sát tế bào vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi. Chỉ giữ lại những khuẩn lạc nghi ngờ là trực khuẩn Gram (+), có màu xanh, dạng hình que riêng rẽ và không sinh bào tử để thực hiện 8.3.4.

8.3.3  Tách chiết ADN từ khuẩn lạc

Phương pháp này áp dụng cho tách chiết ADN vi khuẩn từ khuẩn lạc với đối chứng dương (6.6.1), đối chứng âm (6.6.2) và các khuẩn lạc L. plantarum /L. acidophilus giả định. Để ngăn ngừa nhiễm chéo, không thực hiện tách chiết ADN của đối chứng dương (6.6.1), đối chứng âm (6.6.2) và PLC (3.1) cùng thời điểm.

Các khuẩn lạc, mọc riêng rẽ trên đĩa nuôi cấy, được lấy bằng que cấy vi sinh (5.2.7), hoà tan khuẩn lạc trong 100 μL dung dịch pha loãng (6.2). Dùng máy trộn mẫu (5.1.7), trộn đều, mạnh, tạo huyền phù tế bào vi khuẩn. Sau đó thực hiện tiếp quy trình tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt theo TCVN 11925 (ISO 20837). Định lượng ADN và kiểm tra độ tinh sạch theo TCVN 11925 (ISO 20837).

ADN sau tách chiết bắt buộc bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh (5.1.5) trong 24 h nếu sử dụng ngay cho phép thử khẳng định L. plantarum / L. acidophilus, hoặc lưu trong ngăn đông tủ lạnh (5.1.5) nếu chưa thực hiện phản ứng ngay.

8.3.4  Quy trình real-time PCR

Trên mỗi đĩa đã đếm PLC, chọn 05 khuẩn lạc có hình thái khuẩn lạc điển hình của L. plantarum như mô tả ở Điều 8.2 và 8.3.2 để tách chiết ADN theo quy trình được mô tả ở Điều 8.3.3.

Trên mỗi đĩa đã đếm PLC, chọn 05 khuẩn lạc có hình thái khuẩn lạc điển hình của L. acidophilus như mô tả ở 8.2 để tách chiết ADN theo quy trình được mô tả ở Điều 8.3.3.

Thuốc thử và vật liệu cho quy trình real-time PCR cần được rã đông hoàn toàn và giữ trong khay đá lạnh. Mỗi quy trình real-time PCR, ngoài mẫu TC, cần tiến hành song song 01 mẫu PC (6.6.1), 01 NC (6.6.2), và 01 mẫu nước không chứa ADN/ARN (Bảng 2).

Bảng 2 - Hỗn hợp thuốc thử cho một mẫu tham gia quy trình real-time PCR khẳng định khuẩn lạc L. plantarum

Bảng 3 - Hỗn hợp thuốc thử cho một mẫu tham gia quy trình real-time PCR khẳng định khuẩn lạc L. acidophilus

Đặt các ống real-time PCR đã hoàn thành bổ sung hỗn hợp thuốc thử vào máy chu trình nhiệt (7.2.1 TCVN 11133) và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt, với 40 chu kỳ, theo hướng dẫn của nhà sản xuất thuốc thử SYBR Green Master Mix. Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi đặc hiệu trong phép thử này là 60 °C.

CHÚ THÍCH: Tham khảo Bảng 4 cho quy trình real-time PCR với chu trình nhiệt có phân tích đường cong nóng chảy

Bảng 4 - Chu trình nhiệt cho quy trình real-time PCR có phân tích đường cong nóng chảy

8.3.5  Phân tích kết quả

Quy trình real-time PCR đạt yêu cầu khi mẫu PC (6.5.1) cho giá trị Ct ≤ 28, mẫu NC (6.5.2) và mẫu nước cho giá trị Ct > 30 hoặc không có giá trị Ct.

Với mẫu TC có giá trị Ct ≤ 28, khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là L. plantarum và L. acidophilus (3.3).

Với mẫu TC có giá trị Ct > 30 hoặc không có giá trị Ct, khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là không phải L. plantarum và L. acidophilus.

Với mẫu thử có giá trị 28 < Ct ≤ 30, mẫu thử cần được kiểm tra lại nồng độ ADN, và cần thực hiện lại quy trình real-time PCR với chu trình nhiệt có phân tích đường cong nóng chảy theo hướng dẫn của nhà sản xuất thuốc thử SYBR Green Master Mix.

Phân tích kết quả quy trình real-time PCR với chu trình nhiệt có phân tích đường cong nóng chảy, nếu giá trị Ct ≤ 30, Tm đạt từ 83,4 °C đến 86 °C đối với L. plantarum và đạt từ 69,4 °C đến 76 °C đối với L. acidophilus, và thể hiện một đỉnh nóng chảy, thì mẫu thử được xác định dương tính, và khuẩn lạc của mẫu thử được khẳng định là L. plantarum /L. acidophilus (3.3) (xem Phụ lục B).

CHÚ THÍCH: Giá trị Tm phụ thuộc vào máy chu trình nhiệt (7.2.1 TCVN 11133) và thuốc thử SYBR Green Master Mix. Tuy nhiên các mẫu thử được khẳng định là L. plantarum / L. acidophilus khi giá trị Ct ≤ 30 và giá trị Tm của mẫu TC và mẫu PC trong cùng một quy trình real-time PCR không khác biệt quá 1 °C.

8.4  Định lượng L. plantarum /L. acidophilus và biểu thị kết quả

Phương pháp định lượng L. plantarum /L. acidophilus được thực hiện theo TCVN 7715-2 (ISO 10272-2) và được tính theo công thức (1):

Trong đó

Kết quả định lượng L. plantarum / L. acidophilus được làm tròn đến một chữ số sau dấu phẩy.

Biểu thị kết quả bằng cách lấy một trong các giá trị từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10x, trong đó x là số mũ của 10. Biểu thị kết quả trong trường hợp số đếm thấp hoặc trường hợp đặc biệt theo quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218).

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm thực hiện theo TCVN 6404 (ISO 7218), bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) các kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Hình ảnh nhận diện L. plantarum và L. acidophilus

Hình A.1. Hình thái khuẩn lạc điển hình của L. plantarum ATCC14917 (A), L. acidophilus ATCC 4356 (B) và hỗn hợp 2 chủng (C) trên cùng môi trường mMRS - BPB

Hình A.2. Hình thái của L. plantarum ATCC14917 (A), L. acidophilus ATCC 4356 (B) và P. pentosaceus H5 (C) trên kính hiển vi

Phụ lục B

(tham khảo)

Một số kết quả phân tích phát hiện dựa trên kỹ thuật real-time PCR

Hình B.1 - Kết quả real-time PCR của các chủng L. plantarum và L. acidophilus khác nhau được thử nghiệm.

CHÚ DẪN

A - Đường cong nóng chảy của L. plantarum ATCC14917 với Tm 83 °C;

B - Đường cong nóng chảy của L. acidophilus ATCC 4356 với Tm 76 °C

Hình B.2 - Đường cong nóng chảy của L. plantarum và L. acidophilus

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Amiri, S., Mohammadi, R., & Nami, Y. (2023). Lactobacillus plantarum ABRIINW. N8 eliminates fungal and bacterial contamination and promotes shoot proliferation and root induction in plant tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 152(2), 417-425.

[2] Raman, J., Kim, J. S., Choi, K. R., Eun, H., Yang, D., Ko, Y. J., & Kim, S. J. (2022).

Application of lactic acid bacteria (LAB) in sustainable agriculture: Advantages and limitations, international Journal of Molecular Sciences, 23(14), 7784.

[3] Wang, S. L., Huang, T. Y., Wang, C. Y., Liang, T. W., Yen, Y. H., & Sakata, Y. (2008). Bioconversion of squid pen by Lactobacillus paracasei subsp paracasei TKU010 for the production of proteases and lettuce growth enhancing biofertilizers. Bioresource technology, 99(13), 5436-5443.

[4] Yunaira, R., & Pato, U. (2020). Hyposensitivity test of Lactobacillus fermentum InaCC B1295 probiotic bacteria on the growth of mustard greens (Brassica junceae L ). In Journal of Physics: Conference Series (Vol. 1655, No. 1, P. 012108). IOP Publishing.

[5] Zheng, J., Wittouck, S., Salvetti, E., Franz, C. M., Harris, H. M., Mattarelli, P.,... & Lebeer, S. (2020). A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 70(4), 2782-2858.