Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12613:2019 Thực phẩm - Phương pháp phát hiện sinh vật biến đổi gen

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12613:2019

ISO 21570:2005

THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN ĐỊNH LƯỢNG AXIT NUCLEIC

Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods

Lời nói đầu

TCVN 12613:2019 hoàn toàn tương đương với ISO 21570:2005 và Sửa đổi 1:2013;

TCVN 12613:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Việc nghiên cứu các thành phần có nguồn gốc biến đổi gen được thực hiện bằng các phương pháp với các bước liên tục (hoặc đồng thời). Sau khi thu thập mẫu, axit nucleic được chiết ra khỏi phần mẫu thử. Axit nucleic chiết được có thể phải làm sạch tiếp, đồng thời hoặc sau quá trình chiết. Sau đó, các axit nucleic được định lượng (nếu cần), được pha loãng (nếu cần) và được phân tích (theo PCR). Những bước này được mô tả chi tiết trong tiêu chuẩn này và trong các tiêu chuẩn sau:

TCVN 7605 (ISO 21569) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định tính axit nucleic

TCVN 12613 (ISO 21570) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định lượng axit nucleic.

Các thông tin về yêu cầu chung và định nghĩa kể cả các bước nói trên được nêu trong:

TCVN 7608 (ISO 24276) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa.

THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỂ PHÁT HIỆN SINH VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN - PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN ĐỊNH LƯỢNG AXIT NUCLEIC

Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này cung cấp khung tổng thể các phương pháp định lượng để phát hiện các sinh vật biến đổi gen (GMO) trong thực phẩm bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

Tiêu chuẩn này xác định các yêu cầu chung cho phương pháp khuếch đại đặc hiệu các trình tự ADN đích, để định lượng tương đối hàm lượng ADN có nguồn gốc GMO và để xác nhận danh tính trình tự ADN được khuếch đại.

Các hướng dẫn, các yêu cầu tối thiểu và tiêu chí thực hiện được quy định trong tiêu chuẩn này là để đảm bảo các kết quả thu được từ các phòng thử nghiệm khác nhau là chính xác, lặp lại và so sánh được.

Tiêu chuẩn này được thiết lập cho các nền mẫu thực phẩm, nhưng cũng có thể được áp dụng cho các nền mẫu khác, ví dụ, thức ăn chăn nuôi và các mẫu thực vật lấy ngoài môi trường.

Các ví dụ cụ thể của các phương pháp được nêu ra trong các Phụ lục A đến Phụ lục D.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định tính axit nucleic

TCVN 7606 (ISO 21571), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Tách chiết axit nucleic

TCVN 7608 (ISO 24276), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa

TCVN 8891 (ISO Guide 32), Hiệu chuẩn trong hóa phân tích và sử dụng mẫu chuẩn được chứng nhận.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa trong TCVN 7608 (ISO 24276).

4  Nguyên tắc

4.1  Khái quát

Phép phân tích định lượng bao gồm định lượng các trình tự ADN đích trong mẫu thử nghiệm. Mỗi phương pháp quy định các trình tự đích cụ thể.

Phép phân tích định lượng có thể được tiến hành bằng phương pháp PCR cạnh tranh ^[1],[2] hoặc phương pháp PCR tức thời (real-time PCR)^[3],[4].

Phép phân tích định lượng phải thể hiện rõ số lượng yếu tố gen đích, liên quan đến số lượng các phép kiểm chứng, hiệu chuẩn thích hợp và tham chiếu (chuẩn) đặc hiệu nằm trong dải động học của phương pháp phân tích được sử dụng và phần mẫu thử được phân tích.

Phép phân tích nói chung bao gồm:

- Khuếch đại của một hay nhiều trình tự đích đặc hiệu,

- Phát hiện và khẳng định tính đặc hiệu của các sản phẩm PCR, và

- Định lượng các đoạn khuếch đại so với các chất chuẩn.

CHÚ THÍCH  Trong trường hợp phân tích real-time PCR, việc khuếch đại, phát hiện và khẳng định xảy ra đồng thời.

4.2  Khuếch đại, phát hiện và khẳng định các sản phẩm PCR

Xem TCVN 7605 (ISO 21569) về nguyên tắc khuếch đại, phát hiện và khẳng định các trình tự ADN.

4.3  Định lượng các sản phẩm PCR

Các nguyên tắc định lượng thường là để xác định tỉ lệ (thể hiện là phần trăm) của hai trình tự ADN đích; ví dụ: một trình tự đại diện cho sinh vật biến đổi gen quan tâm và một trình tự đặc hiệu-taxon đích (nội sinh). Tuy nhiên trong một số trường hợp, việc định lượng cũng có thể được tiến hành với một lượng nền mẫu thực phẩm cụ thể (ví dụ khi phát hiện vi sinh vật biến đổi gen trong thực phẩm).

Các chất chuẩn (các vật liệu chuẩn) được sử dụng để định lượng phải là những mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM), nếu có sẵn. Nếu không có sẵn, nên sử dụng các mẫu chuẩn thích hợp khác. Ví dụ được nêu trong tham khảo ^[5]. Thông tin về các nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và độ không đảm bảo đo đã được thu thập từ các nghiên cứu quốc tế ^{[6], [7], [8], [9]}.

5  Thuốc thử

Tất cả các thuốc thử và các vật liệu được sử dụng trong phân tích phải giống nhau, hoặc tương đương theo quy định trong phương pháp này. Mặt khác, tất cả các thuốc thử và các vật liệu phải là loại dùng cho sinh học phân tử. Các thuốc thử phải được bảo quản và sử dụng theo khuyến cáo của nhà cung cấp hoặc theo các quy định đảm bảo chất lượng phòng thử nghiệm. Đối với danh mục các thuốc thử, xem phụ lục cụ thể.

6  Thiết bị, dụng cụ

Xem Phụ lục A đến Phụ lục D và TCVN 7608 (ISO 24276).

7  Hướng dẫn liên quan đến quy trình

7.1  Tổng quan

Những lưu ý chung về khuếch đại PCR để phát hiện GMO được nêu ra trong TCVN 7605 (ISO 21569).

Phụ lục A đến Phụ lục D quy định các phương pháp PCR phát hiện cùng với những chi tiết về phạm vi áp dụng. Các đặc tính hiệu năng của từng phương pháp được mô tả chi tiết.

Nồng độ của trình tự ADN quan tâm cần nằm trong dải động học của phương pháp.

CHÚ THÍCH: Cần thực hiện theo dõi đặc hiệu taxon đích để xác định khuôn mẫu ADN có đủ về chất lượng hay không (chiều dài và tính toàn vẹn cấu trúc), độ tinh khiết và chất lượng để cho phép phát hiện và định lượng GMO theo taxon đích. Điều này có thể liên quan đặc biệt khi ADN được chiết từ nền mẫu hỗn hợp hoặc nền mẫu đã qua nhiều khâu xử lý.

ADN đã chiết ra khỏi phần mẫu thử cần được phân tích ít nhất 2 lần lặp lại.

Thử nghiệm phải bao gồm các phép kiểm chứng thích hợp, xem Bảng 1 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

7.2  Sự ổn định trình tự đích

Sự ổn định về số lượng bản sao và alen của trình tự đích cần được xem xét đối với các giống có các nguồn gốc phát sinh loài và nguồn gốc địa lý khác nhau.

7.3  Hiệu chuẩn phép phân tích

Phải áp dụng số lượng các điểm chuẩn thích hợp và lặp lại trên toàn dải định lượng (ví dụ: 4 điểm hiệu chuẩn với 2 lần lặp lại (tổng 4x2 giá trị) hoặc sáu điểm hiệu chuẩn với mỗi phép đo tại một điểm đo (tổng cộng là 6 giá trị). Chất lượng hiệu chuẩn ảnh hưởng đến độ không đảm bảo đo ^[9].

Để thay thế cho các vật liệu so sánh chuẩn là ADN bộ gen, ví dụ, có thể thay bằng dãy plasmid pha loãng hoặc các sợi đôi ADN tổng hợp chứa trình tự đích, miễn là nó được chứng minh tương đương về hiệu năng so với ADN bộ gen của mẫu chuẩn và ADN bộ gen được tách ra từ mẫu phân tích.

7.4  Các xem xét định lượng

Các phương pháp PCR cần được thiết kế phù hợp để giảm thiểu sự biến thiên.

CHÚ THÍCH: Tùy thuộc vào phương pháp sử dụng và/hoặc vật liệu được phân tích, sự có mặt của nhiều gen chuyển có thể dẫn tới sự ước lượng cao hơn hàm lượng GMO thực có.

Đối với phép xác định giới hạn định lượng (LOQ), xem TCVN 7608 (ISO 24276).

Việc tính hàm lượng GMO dựa vào số lượng bản sao của các trình tự đích trên bộ gen đơn bội bị ảnh hưởng bởi sự đồng hợp tử và dị hợp tử của loài khảo sát. Chi tiết, xem Phụ lục A đến Phụ lục D.

Việc sử dụng phương pháp ΔΔCt (chu kì ngưỡng) chỉ có giá trị khi các hiệu quả khuếch đại của thử nghiệm đặc hiệu taxon đích và thử nghiệm đặc hiệu GMO là tương tự nhau.

7.5  Yêu cầu đảm bảo chất lượng

Tính nhất quán giữa các phép đo nhằm đạt được các ước lượng tin cậy về số lượng trình tự đích. Tuy nhiên, cần thiết lập độ lệch chuẩn tương đối lặp lại của phương pháp để xem xét các giá trị đo có nhất quán hay không [xem chi tiết bộ TCVN 6910 (ISO 5725)]. Để tính toán độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, số lượng các phép đo riêng rẽ trên từng mẫu phòng thử nghiệm có thể vượt quá khả năng về chi phí có thể chấp nhận được. Do đó, nếu một ADN có nguồn gốc GMO xác định được báo cáo lại (theo phần trăm), thì một giải pháp linh hoạt được yêu cầu như sau:

a) tính nhất quán của một phần mẫu thử

- thông qua loại bỏ các phép đo < LOQ, và

- thông qua độ lệch cực đại quan sát được giữa các độ pha loãng của các phép đo riêng rẽ bằng giá trị dự kiến từ hệ số pha loãng tương ứng ± 33 %;

b) tính nhất quán giữa các phần mẫu thử

- nồng độ ADN có nguồn gốc GMO từ a) được ước tính tương đối cho mỗi phần thử nghiệm phải nằm trong khoảng -50 % đến +100 % giá trị định lượng ước tính (bằng ΔCt của 1 lần chạy real-time PCR) (nghĩa là: đối với 2 phần mẫu thử, các giá trị đo 1,0 % và 2,0 % là có thể chấp nhận và các giá trị đo 0,9 % và 2,1 % là không được chấp nhận).

Để đảm bảo tính chính xác của các phép đo, mẫu chuẩn (RM), tốt nhất là mẫu chuẩn đã được chứng nhận (CRM), để định lượng các dòng có liên quan, với một mức độ thích hợp của độ tin cậy đo lường và với nền mẫu phù hợp tương tự phải được chọn và phân tích. Trong trường hợp không có CRM, mẫu chuẩn nội bộ có thể được chuẩn bị theo quy trình đã được chứng minh sự ổn định, tính đồng nhất và có thể truy xuất nguồn gốc, bảo đảm không có độ chệch. Độ không đảm bảo của phép định lượng được phải đáp ứng độ không đảm bảo đo của chất chuẩn [xem TCVN 8891 (ISO Guide 32)].

8  Diễn giải kết quả

Kết quả PCR sẽ là a) hoặc b):

a) Phù hợp cho định lượng trình tự đích được cung cấp:

- kết quả dương tính theo TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005, 8.1);

- sự ức chế phản ứng có thể quan sát được là không đáng kể;

- phép phân tích có một giá trị đo rõ ràng;

- hàm lượng trình tự đích nằm trong dải động học của phương pháp;

- phép phân tích được hiệu chuẩn (xem 7.3), hoặc

b) Không phù hợp cho định lượng trình tự đích nếu các điều kiện nêu ra ở a) không được đáp ứng.

Diễn giải các kết quả của độ đảm bảo đo trong cùng một phần thử nghiệm: trong trường hợp các kết quả +/- ở hai lần lặp lại, PCR lặp lại 2 lần cho phần thử nghiệm. Nếu hai lần lặp lại mới này cho kết quả +/- hoặc -/-, các phần thử nghiệm được coi là âm tính.

Diễn giải các kết quả độ không đảm bảo đo giữa hai phần thử nghiệm: trong trường hợp các kết quả +/- ở hai phần mẫu thử của một mẫu, cần tiến hành chiết tách và phân tích hai phần thử nghiệm mới. Nếu các kết quả vẫn là +/-, mẫu được coi là âm tính theo 6.3 của TCVN 7608 (ISO 24276).

Độ không đảm bảo đo phải đủ nhỏ để cho phép các phòng thử nghiệm đưa ra các kết luận thích hợp.

Phụ lục A đến Phụ lục D quy định phép đo số lượng ADN đích. Các giá trị định lượng này có thể được sử dụng để tính toán hàm lượng GMO. Xem xét các yếu tố sinh học phù hợp ở các phép tính này, ví dụ: sự đồng hợp tử hoặc dị hợp của các trình tự đích.

Nếu hàm lượng trình tự đích biến đổi gen (GM) hoặc hàm lượng trình tự đích đặc hiệu taxon thấp hơn giới hạn định lượng, thì kết quả cần phải được biểu thị dưới dạng định tính.

CHÚ THÍCH: Việc tuyên bố hàm lượng ADN có nguồn gốc GMO dưới LOQ thực tế kèm theo đặc điểm kỹ thuật của LOQ được xem là biểu thị kết quả định tính.

9  Biểu thị kết quả

Kết quả phải nêu rõ số lượng trình tự đích GM so với trình tự đặc hiệu taxon đích. Các kết quả cần cung cấp các giá trị về độ không đảm bảo đo như độ lệch chuẩn hoặc hệ số biến thiên. Ngoài ra, cần báo cáo LOD và LOQ của phương pháp và LOD, LOQ thực tế. Kết quả chỉ rõ cần báo cáo các đích GMO. Trong trường hợp phân tích sàng lọc định lượng đối với các nền mẫu phức tạp, có thể xuất hiện các tín hiệu GMO từ các taxon không phải đích.

Trình tự đích có thể phát hiện được hoặc không phát hiện được hoặc số lượng ít nhất của một trong hai trình tự (trình tự đặc hiệu taxon đích và/hoặc trình tự đích biến đổi gen) dưới giới hạn định lượng. Bảng 1 mô tả 4 trường hợp khác nhau và biểu thị kết quả tương ứng cần được ghi vào báo cáo thử nghiệm.

Các hàm lượng ADN có nguồn gốc GMO cũng có thể được báo cáo lớn hơn hoặc nhỏ hơn một giá trị cụ thể, có tính đến độ không đảm bảo đo.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải phù hợp với TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN 7605 (ISO 21569) và phải có ít nhất các thông tin sau:

a) LOQ của phương pháp và nền mẫu đã dùng để thiết lập LOQ;

b) LOQ thực tế;

c) viện dẫn phương pháp đã được sử dụng để tách chiết ADN;

d) viện dẫn các phương pháp đã được sử dụng để khuếch đại các trình tự đích ADN;

e) mẫu chuẩn đã sử dụng;

f) các kết quả biểu thị theo quy định tại Điều 9

g) các đích PCR là “đặc hiệu sự kiện”, hoặc “đặc hiệu cấu trúc” hoặc “sàng lọc”

h) định nghĩa độ không đảm bảo đo được sử dụng.

CHÚ THÍCH: Đối với g) hoặc h) các thông tin số có thể ở tài liệu khác (ví dụ: xem xét hợp đồng, bảng dữ liệu kỹ thuật).

Bảng 1 - Biểu thị kết quả

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các phương pháp đặc hiệu taxon-đích

A.1  Phương pháp đặc hiệu taxon đích để định lượng tuyệt đối ADN gen adh1 của ngô sử dụng real-time PCR

A.1.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và định lượng gen adh1 (mã hóa alcohol dehydrogenase 1) ở ngô (Zea mays) đặc hiệu taxon để xác định hàm lượng ADN ngô, hoặc để kiểm tra sự có mặt/ không có mặt các chất ức chế PCR có thể phát hiện được trong các dung dịch ADN tách chiết từ các sản phẩm có chứa ADN có nguồn gốc từ ngô, ví dụ: thực phẩm.

Các hạn chế, xem A.1.8.

A.1.2  Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng

A. 1.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được tối ưu cho ADN được tách chiết từ ngô hạt nghiền tinh khiết, lá ngô và các mẫu chuẩn được chứng nhận (dãy IRMM-411, IRMM-412, IRMM-413^[10])^[11].

Kiểm tra độ tái lập của phương pháp trong một thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết (U1 tới U6) gồm có ADN ngô hoang dại với số bản sao tương ứng khác nhau của trình tự đích (xem A.1.2.2), và trong các thử nghiệm cộng tác khác kết hợp với các phương pháp đặc hiệu cho các sự kiện ngô biến đổi gen, ví dụ Bt11 (xem D.1).

Số bản sao của trình tự đích trên mỗi bộ gen đơn bội được ước tính là 1^[11].

Tính ổn định alen (allelic) của trình tự đích đã được thiết lập^[11].

A.1.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Phương pháp đã được xác nhận giá trị sử dụng trong một thử nghiệm cộng tác do Trung tâm Nghiên cứu chung của Ủy ban Châu Âu (EC-JRC), Viện Sức khỏe và Bảo vệ Người tiêu dùng (IHCP) tổ chức, phù hợp với các quy định được hài hòa ở cấp quốc tế ^[12].

Sáu mẫu ADN (S1-S6) của ngô hoang dại được tách chiết từ lá ^[13] chứa các số bản sao biết trước (183 486, 61 162, 20 387, 6 796, 2 265, 755) của các bộ gen ngô đơn bội được sử dụng để thiết lập đường chuẩn để định lượng tuyệt đối các bộ gen ngô đơn bội trong các mẫu chưa biết, số lượng bản sao tuyệt đối trong các mẫu đã biết được xác định bằng cách chia khối lượng ADN trong mẫu (được xác định bởi định lượng huỳnh quang của sợi đôi ADN với PicoGreen, Molecular Probes, Cat. Number P-7589) cho giá trị 1C trung bình được công bố ở các bộ gen ngô (2 725 pg) ^[14].

Sáu mẫu (U1-U6) của ADN ngô dại (được tách chiết từ lá ^[13]) được sử dụng làm các mẫu chưa biết. Các số bản sao dự kiến trong các mẫu chưa biết đã được xác định theo cùng một cách giống như xác định cho các mẫu đã biết.

Các kết quả xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trong thử nghiệm cộng tác được tóm tắt trong Bảng A.1.

Phương pháp cũng được xác nhận giá trị sử dụng kết hợp với các phương pháp đặc hiệu-sự kiện cho một vài loại ngô biến đổi gen, ví dụ: ngô ngọt Bt11. Xem các Tài liệu tham khảo ^[15] và ^[16] và D.1 để biết chi tiết trong thử nghiệm kết hợp (định lượng tương đối).

Bảng A.1 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

A.1.2.3  Đặc hiệu phân tử

A.1.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được thiết kế dựa vào một phần của trình tự được mô tả trong EMBL/GenBank/DDBJ2) mã số tiếp cận X04050. Trình tự này là duy nhất đối với Zea mays (ngô/ngũ cốc) và phân loài Zea mays subsp. diploperennis (teosinte)^[11].

A.1.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua một tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ ²⁾ sử dụng các trình tự nucleotit làm các trình tự truy vấn với chương trình BLASTN ²⁾ tại địa chỉ http://www.ncbi.nlm.gov.blast/ (ngày 9 tháng 10 năm 2003). Kết quả của việc tìm kiếm đã xác nhận sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

A.1.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Độ đặc hiệu của phương pháp đã được kiểm tra đối với một dải rộng các loài không phải đích và 20 dòng ngô khác nhau đại diện cho các mẫu đa dạng về phát sinh loài và địa lý ^[11]. Không có phản ứng chéo nào được quan sát thấy với các loài không phải đích (trừ teosinte Zea mays subsp diploperennis, tổ tiên hoang dại của ngô trồng) ^[11],[17]. Số bản sao và độ ổn định alen của trình tự đích qua các dòng ngô khác nhau đã được thiết lập^[11].

A.1.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa được thực hiện đối với hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM 7700^® 3) và hóa chất TaqMan^{® 3)}. Thiết kế mồi và đoạn dò được thực hiện với phần mềm Express Primer^® (Applied Biosystem)³⁾.

A.1.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, LOD tuyệt đối là 10 bản sao của trình tự đích ^[11].

Số lượng bản sao thấp nhất của trình tự đích trong thử nghiệm cộng tác là 7 399.

A.1.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, LOQ tuyệt đối là 100 bản sao của trình tự đích^[11].

Số lượng bản sao thấp nhất của trình tự đích trong thử nghiệm cộng tác là 7 399.

A.1.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

A.1.4  Nguyên tắc

Đoạn ADN của gen adh1 có chiều dài 134 bp được khuếch đại sử dụng hai mồi đặc hiệu adh1 của ngô (xem Bảng A.2). Các sản phẩm PCR tích lũy đo được ở cuối mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu- adh1 của ngô (ADH1-MDO, xem Bảng A.2) được đánh dấu với 2 thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^{® 3)} đã được sử dụng.

Tín hiệu huỳnh quang đo được vượt qua giá trị ngưỡng, được xác định bởi người phân tích sau một số chu trình nhất định. Con số này được gọi là giá trị Ct. Để định lượng tổng số ADN-adh1 của ngô trong một mẫu chưa biết, giá trị Ct được chuyển đổi thành giá trị số bản sao tương ứng bằng cách so sánh với đường chuẩn có giá trị Ct được kiên kết trực tiếp với các số bản sao đã biết (phân tích hồi quy).

A.1.5  Thuốc thử

A.1.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử đã sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276)

A.1.5.2  Nước.

A.1.5.3  Dung dịch đệm PCR (không có MgCI₂), 10 x.

A.1.5.4  Dung dịch MgCI₂, c(MgCI₂) = 25 mmol/l.

A.1.5.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (cho mỗi loại).

A.1.5.6  Các oligonucleotit

Chi tiết của các oligonucleotit được liệt kê trong Bảng A.2.

Bảng A.2 - Các oligonucleotit

Chiều dài của đoạn gen được khuếch đại adh1 là 134 bp.

A.1.5.7  Enzym ADN polymerase chịu nhiệt

Enzym ADN Polymerase của AmpliTaq Gold^{® 4)}.

A.1.5.8  Uracil W-glycosylase (tùy chọn).

A.1.5.9  Hỗn hợp phản ứng khuếch đại

Chi tiết của hỗn hợp phản ứng khuếch đại được liệt kê trong Bảng A.3.

Bảng A.3 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng

A.1.6  Thiết bị, dụng cụ

A. 1.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

A.1.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ nhiệt độ-thời gian quy định được thử nghiệm ban đầu với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS (Applied Biosystems) 5). Các thiết bị phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp với các điều kiện phản ứng.

A.1.6.3  Các ống phản ứng

Các ống phản ứng phải phù hợp với quá trình khuếch đại PCR trong máy chu trình nhiệt real-time, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^® hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystem)⁵⁾.

A.1.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

A.1.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị phản ứng PCR cho trình tự đích gen đối chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt trừ khi có quy định khác trong các phụ lục đặc hiệu-đích GM liên quan.

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR 25 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với thuốc thử như được liệt kê trong Bảng A.3.

A.1.7.2  Các kiểm chứng PCR

Nếu các kiểm chứng không mang lại các kết quả dự kiến, phải hủy bỏ các kết quả thử nghiệm và phải tiến hành phân tích lại.

ADN bộ gen tinh sạch, chất lượng cao được tách chiết từ ngô (ví dụ: một CRM từ JRC, IRMM ⁵⁾) có thể được sử dụng^[13] làm kiểm chứng dương/vật liệu so sánh chuẩn. Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm như được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

A.1.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ được nêu trong Bảng A.4 được tối ưu hóa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 (Applied Biosysytem)⁵⁾. Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng, chương trình thời gian-nhiệt độ được sử dụng với ADN polymerase của AmpliTaq Gold^{® 5)}. Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu sự điều chỉnh phù hợp cụ thể. Nhiệt độ và thời gian yêu cầu để hoạt hóa enzyme phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng. Bảng A.4 nêu ra các điều kiện phản ứng.

Bảng A.4 - Quy trình: Các điều kiện phản ứng

A.1.8  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Sự có mặt của các chất ức chế PCR có thể tác động lớn đến độ chính xác của số bản sao adh1 được ước tính trong các mẫu phân tích. Vì vậy, cần khẳng định sự không có mặt của các chất ức chế PCR có thể phát hiện được [xem Phụ lục A của TCVN 7606 (ISO 21571)], ví dụ bằng cách thiết lập các dãy pha loãng của ADN khuôn và kiểm tra sự phù hợp giữa các dãy pha loãng và các khác biệt trong các giá trị Ct (chu kì ngưỡng) (ví dụ: một Ct tương ứng với gấp đôi nồng độ khuôn).

Đối với việc sử dụng phương pháp này, khi kết hợp với một phương pháp để định lượng ADN có nguồn gốc GMO, điều quan trọng là lượng tuyệt đối của ADN khuôn (ng) phải giống nhau cho cả phản ứng PCR adh1 và PCR đặc hiệu GMO. Nếu không, số bản sao tuyệt đối của các phản ứng không trực tiếp so sánh được và do đó cần phải điều chỉnh số bản sao tương ứng. Nếu không, sẽ không tính được nồng độ GMO tương đối.

A.1.9  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Các điểm chuẩn được tạo ra với các lượng xác định ADN trong các số bản sao tuyệt đối của ADN bộ gen ngô đơn bội có chứa trình tự đích.

Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ đồ thị các giá trị Ct đối với logarit số bản sao đích của các điểm chuẩn. Điều này có thể thực hiện được, ví dụ, sử dụng bảng tính trong Microsoft Excel 6), hoặc sử dụng trực tiếp bằng các tùy chọn sẵn có của phần mềm hệ thống phát hiện trình tự.

Đường chuẩn được sử dụng để xác định các số bản sao ADN tuyệt đối của ngô đơn bội ở các mẫu chưa biết. Cho dù ADN mẫu có thể bị phân hủy bởi quá trình chế biến thực phẩm hoặc có thể chứa các thành phần khác với ngô, điều này không ảnh hưởng đến số lượng các bản sao bộ gen đơn bội tính được của các mẫu chưa biết.

A.2  Phương pháp đặc hiệu taxon đích để phát hiện ADN có nguồn gốc từ gạo

A.2.1  Nguyên tắc

Gen SPS ở gạo phù hợp dùng làm gen nội chuẩn trong việc định lượng và xác định gạo GM (Tài liệu tham khảo [59]). Phòng thử nghiệm phát hiện GMO Trường Đại học Tổng hợp JiaoTong (GMDL-SJTU) đã tổ chức thử nghiệm cộng tác để xác nhận khả năng áp dụng của gen sucrose phosphate synthase (SPS) ở gạo làm gen nội chuẩn để phân tích định lượng gạo biến đổi gen và không biến đổi gen. Mười hai phòng thử nghiệm đến từ Tây Ban Nha, Hàn Quốc, Lihuania, Slovenia, Nhật Bản, Ý và Trung Quốc tham gia vào nghiên cứu này.

Quy trình tiến hành nghiên cứu cộng tác bao gồm các mô-đun sau.

Real-time PCR định lượng các mẫu ADN gạo (mẫu mù) sử dụng để dựng đường chuẩn

Real-time PCR định lượng các mẫu ADN gạo (mẫu mù) sử dụng đường chuẩn đã dựng.

Thử nghiệm liên phòng được tiến hành phù hợp với các hướng dẫn quốc tế được chấp nhận sau đây:

- TCVN 6910 (ISO 5725);^[51]-[56]

- Quy trình chính thức của IUPAC về thiết kế, tiến hành và diễn giải kết quả nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp

Các kết quả nghiên cứu liên phòng cũng như các protocol liên quan được trình bày trong A.2.3.3

A.2.2  Phạm vi áp dụng

Phương pháp được tối ưu cho gạo hạt và các sản phẩm đã qua chế biến chứa hỗn hợp gạo và các nền mẫu khác, ví dụ: ngô và đậu tương. Khả năng áp dụng của gen SPS được kiểm tra thông qua các thử nghiệm cộng tác sử dụng mẫu ADN chiết tách từ gạo hạt.

A.2.3  Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và các tiêu chí thực hiện

A.2.3.1  Độ vững của phương pháp

Độ vững của phương pháp real-time PCR định lượng gen SPS được thử nghiệm bởi tổ chức phát triển phương pháp với các chương trình thời gian-nhiệt độ khác nhau (hai bước và ba bước) và trên ba mẫu ADN khác nhau chứa tổng số ADN gạo biết trước (10 ng, 1 ng, 0,1 ng mẫu ADN bộ gen gạo). Mỗi mẫu được thử nghiệm 3 lần lặp lại. Phương pháp real-time PCR có độ mạnh mong muốn và được tiến hành tốt ở các chương trình thời gian-nhiệt độ khác nhau ở ba nồng độ ADN gạo khác nhau.

Phương pháp PCR định lượng gen SPS cũng được thử nghiệm trên các thiết bị real-time PCR khác nhau (Rotor gen 3000A,¹⁾ Corbett Research và ABI7700,¹⁾ Applied Biosystems), với ba thể tích phản ứng khác nhau (20 μl, 25 μl, và 30 μl; mỗi thể tích lặp lại ba lần). Phương pháp real-time PCR định lượng có độ mạnh phù hợp, hoạt động tốt trên các thiết bị real-time PCR khác nhau với các thể tích phản ứng khác nhau.

A.2.3.2  Thử nghiệm nội bộ

Để chuẩn bị mẫu, tất cả các mẫu ADN được chiết tách bằng phương pháp cetyl(trimethyl) ammonium bromide (CTAB) được chấp nhận bởi TCVN 7606 (ISO 21571). Tiến hành định lượng tổng số ADN chiết tách bằng cách sử dụng phương pháp quang phổ được chấp nhận trong B.1 của TCVN 7606 (ISO 21571),. Sau khi định lượng ADN, tiến hành phân tích real-time PCR định lượng để cung cấp dữ liệu về sự ức chế phản ứng PCR có thể xảy ra.

Phương pháp PCR gen SPS đã được thử nghiệm bởi ba nhà nghiên cứu sử dụng ADN bộ gen gạo và cho ra các kết quả thỏa đáng; đặc biệt trong PCR định lượng, độ chệch thấp hơn 25 % trong dải động học của phương pháp (tức là 0,05 ng đến 1,00 ng).

A.2.3.3  Thử nghiệm cộng tác.

Dựng đường chuẫn bằng cách sử dụng các mẫu ADN pha loãng liên tục do GMDL-SJTU chiết tách từ 4 giống gạo bằng phương pháp PCR định lượng. Hiệu năng PCR của phương pháp PCR gen SPS từ 0,846 3 đến 1,223 3 được tính từ độ dốc của đường chuẩn là (10^-1/a-1) x 100, trong đó a là độ dốc, và độ tuyến tính (hệ số hồi quy, ) trung bình là 0,997.

Các kết quả của 8 mẫu ADN mù được báo cáo trong Bảng A.5. Chúng được đánh giá dựa trên các tiêu chí chấp nhận phương pháp và các yêu cầu tiến hành phương pháp, được thiết lập bởi mạng lưới các phòng thử nghiệm GMO Châu Âu (ENGL) và được thông qua bởi Phòng thử nghiệm Chuẩn Châu Âu về Thực phẩm và Thức ăn chăn nuôi GM (EU-RL GMFF) (Tài liệu tham khảo [60]). Trong Bảng A.5, báo cáo ước lượng độ lặp lại và độ tái lập cho mỗi nồng độ gạo, sau khi xác định và loại bỏ các số lạc bằng kiểm tra Cochran.

Bảng A.5 - Các kết quả real-time PCR định lượng

A.2.3.4  Chọn lọc phân tử

A.2.3.4.1  Yêu cầu chung

Các mồi và đoạn dò đích SPS có độ dài ADN 81 bp được nêu ra trong Bảng A.6.

Bảng A.6 - Trình tự oligonucleotit của các mồi và đoạn dò

A.2.3.4.2  Thực nghiệm

Các mẫu ADN chiết tách từ 11 mẫu thực vật khác nhau (bao gồm gạo) được phân tích bằng phương pháp PCR gen SPS. Trong số 11 mẫu, chỉ có mẫu ADN gạo cho các kết quả dương tính. Mười mẫu mẫu khác (tre, có lông xanh, gạo mạch, gạo mì, kê vàng, cải dầu, cà chua, khoai tây, đậu tương và Arabidopsis) cho các kết quả âm tính.

Các mẫu ADN chiết tách từ 12 giống gạo khác nhau được phân tích bằng phương pháp PCR đặc hiệu được phát triển để phát hiện gen SPS. Tất cả 12 mẫu đều cho các kết quả dương tính.

A.2.3.4.3  Lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò của gen SPS được đánh giá thông qua tìm kiếm sự tương đồng tại cơ sở dữ liệu BLASTN 2.0MP-WashU programme (Tài liệu tham khảo [64], ngày tìm kiếm: 09-01-2010). Trình tự 81 bp được sử dụng làm truy vấn là một phần trình tự của mã số tiếp cận NCBI U33175 (nucleotit từ 1055-1135). Các kết quả tìm kiếm đã xác nhận sự đồng dạng hoàn toàn của trình tự truy vấn với trình tự gen SPS của gạo, và không có sự tương đồng với các gen khác và loài khác.

A.2.4  Nguyên tắc

Đoạn 81 bp của gen SPS được khuếch đại bằng cách sử dụng hai mồi đặc hiệu sps ở gạo. Đo sản phẩm PCR tích lũy cuối mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu sps ở gạo được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang (xem Bảng A.6). Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^®1) được sử dụng. Tín hiệu huỳnh quang được đo vượt qua giá trị ngưỡng, được xác định bởi người phân tích sau một số chu kì nhất định, số này được gọi là giá trị Ct. Để định lượng tổng số ADN sps ở gạo trong mẫu chưa biết, giá trị Ct được chuyển đổi thành giá trị số bản sao tương ứng bằng cách so sánh với đường chuẩn mà giá trị Ct liên kết trực tiếp với các số bản sao đã biết (phân tích hồi quy).

A.2.5  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong Điều này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa của TCVN 6910-1 (ISO 5725-1)^[51] và TCVN 7608 (ISO 24276).

A.2.6  Số lượng và loại mẫu

Các mẫu ADN chiết tách từ bốn giống gạo, được sử dụng để dựng các đường chuẩn trong nghiên cứu cộng tác này. Sau đó, tám mẫu mù được phân tích bằng cách sử dụng bốn đường chuẩn đã dựng.

Các phòng thử nghiệm tham gia đã nhận các mẫu sau.

- 4 mẫu ADN từ các giống gạo khác nhau (3M, giống Indica từ Hoa Kỳ; Balilla, giống Japonica từ Ý; Guangluai, giống Indica từ Miền Nam Trung Quốc, và Shennong265, giống Japonica Trung Quốc), 50 ng/μl, mỗi mẫu 30 μl. ADN của mỗi giống gạo được pha loãng và sử dụng để dựng đường chuẩn tương ứng.

- 8 mẫu ADN mù từ 4 giống gạo khác nhau có các nồng độ khác nhau (0 ng/μl đến ~ 50 ng/μl), mỗi mẫu 50 μl.

- Kiểm chứng âm ADN đích (dán nhãn N): ADN tinh trùng cá hồi (20 ng/μl).

- Kiểm chứng dương ADN đích (dán nhãn P): ADN bộ gen (20 ng/μl) (Guangluai4). Tất cả các mẫu ADN được tinh sạch bằng phương pháp CTAB bởi GMDL-SJTU. Kiểm soát các đích ADN âm tính và dương tính sử dụng cho mỗi khay PCR.

- Các mồi và đoạn dò của hệ thống PCR gen SPS (xem Bảng A.6) và các thuốc thử phản ứng như sau:

- hỗn hợp gốc PCR (real-time) (1 ml x 6);

- dung dịch pha loãng ADN (0,1 x TE, 1,2 ml).

A.2.7  Giới hạn định lượng (LOQ) và phạm vi áp dụng

Theo phương pháp, LOQ tuyệt đối của phương pháp là 0,01 ng/μl. LOQ tương đối của PCR định lượng không được đánh giá trong thử nghiệm cộng tác.

A.2.8  Ước tính độ không đảm bảo đo

Công bố độ không đảm bảo đo chung của phương pháp từ các kết quả của thử nghiệm cộng tác (xem Bảng A.5).

A.2.9  Các yếu tố gây nhiễu

Quan trọng nhất đối với độ nhạy của phương pháp là tổng số và khả năng khuếch đại axit nucleic dùng làm khuôn mẫu cho real-time PCR. Ngoài điểm tổng quát này, không có các yếu tố gây nhiễu cụ thể nào được nêu ra ở phương pháp này.

A.2.10  Các điều kiện vật lý và môi trường

Các quy trình yêu cầu điều kiện vô trùng khi tiến hành công việc.

Duy trì chặt chẽ các khu vực làm việc tách biệt để chiết tách ADN, chuẩn bị PCR và khuếch đại.

Bất kỳ ADN tồn dư trên thiết bị cần phải được loại bỏ trước khi sử dụng.

Để tránh ô nhiễm, cần sử dụng đầu hút lọc (A.2.11.6) để ngăn ngừa khí dung.

Chỉ sử dụng găng tay không bột (A.2.11.8) và thường xuyên thay mới găng tay.

Làm sạch định kỳ thiết bị và bàn thí nghiệm với dung dịch natri hypochlorit (10 % clo hoạt động).

Các pipet cần được hiệu chỉnh thường xuyên, nếu cần.

A.2.11  Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau.

A.2.11.1  Máy li tâm.

A.2.11.2  Tủ đông, duy trì ở âm 20 °C và tủ lạnh duy trì ở 4 °C.

A.2.11.3  Micropipet.

A.2.11.4  Máy vortex.

A.2.11.5  Ống nghiệm, dung tích 0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.

A.2.11.6  Đầu hút và đầu hút lọc cho micropipet.

A.2.11.7  Giá, để các ống phản ứng.

A.2.11.8  Găng tay vinyl hoặc latex.

A.2.11.9  Máy hút chân không, phù hợp để làm khô các hạt ADN, tùy chọn.

A.2.11.10  Hệ thống real-time PCR với các lọ nhựa phản ứng phù hợp để đo huỳnh quang.

A.2.11.11  Phần mềm: Hệ thống phát hiện trình tự ¹⁾ phiên bản 1.7 (Applied Biosystems Part No 4311876¹⁾) hoặc các phiên bản tương đương.

A.2.11.12  Các khay phản ứng quang học 96 giếng, MicroAmp^{® 1)} (Applied Biosystems Part No N801-0560¹⁾).

A.2.11.13  Miếng phủ quang học, MicroAmp^®1) (Applied Biosystems Part No 4311971¹⁾).

A.2.11.14  Các nắp quang học, MicroAmp^®1) (Applied Biosystems Part No 801-0935¹⁾).

A.2.12  Vật liệu và thuốc thử

A.2.12.1  Yêu cầu chung

Trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng thuốc thử phù hợp với các đặc điểm kỹ thuật của TCVN 7608 (ISO 24276) và dùng nước cất hoặc nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

A.2.12.2  Chiết tách ADN

A.2.12.2.1  Cetyltrimethylammonium bromua (CTAB), cấp độ siêu tinh khiết.

A.2.12.2.2  Tris-(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (tris), cấp độ sinh học phân tử.

A.2.12.2.3  Muối ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA), ít nhất 99,9 % phần khối lượng.

A.2.12.2.4  Etanol, φ[CH₃CH₂OH], ít nhất 96 % phần thể tích.

A.2.12.2.5  Isopropanol, φ[CH₃CH(OH)CH₃], ít nhất 99,7 % phần thể tích.

A.2.12.2.6  Chloroform, φ(CHCI₃), ít nhất 99 % phần thể tích.

A.2.12.2.7  Natri clorua, w(NaCI), ít nhất 99 % phần khối lượng

A.2.12.2.8  Natri hydroxit, khan, w(NaOH), ít nhất 98 % phần khối lượng.

A.2.12.2.9  Dung dịch RNase A, 10 mg/ml.

A.2.12.2.10  Dung dịch Proteinase K, 20 mg/ml.

A.2.12.2.11  Đệm pha loãng: tris (A.2.12.2.2), 10 mmol/l, pH 9,0.

A.2.12.2.12  Axit clohydric,

A.2.12.2.13  ADN tinh hoàn cá trích, ADN tuyến ức bê, hoặc Lambda ADN.

A.2.12.3  Real-time PCR định lượng.

TaqMan^®1) universal PCR master mix (1x) hoặc tương đương phù hợp.

A.2.13  Thu thập mẫu, vận chuyển, bảo quản và lưu mẫu

Dung dịch ADN có thể được giữ ở 4 °C trong tối đa 1 tuần, hoặc ở âm 20 °C để lưu trữ lâu hơn (A.2.11.2). Để chuẩn bị cho real-time PCR định lượng, thuốc thử PCR phải được rã đông ở 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.

A.2.14  Chuẩn bị mẫu thử

Đảm bảo rằng mẫu thử nghiệm là đại diện cho mẫu phòng thử nghiệm, ví dụ: bằng cách nghiền hoặc đồng nhất. Các bước đo và thao tác được tiến hành như mô tả chi tiết trong TCVN 7606 (ISO 21571). Đối với nghiên cứu cộng tác, tổng cộng 1 g mì gạo nghiền đã được sử dụng.

A.2.15  Hiệu chuẩn thiết bị

Các thiết bị, ví dụ: máy chu trình nhiệt và pipet phải được hiệu chuẩn, ví dụ: theo TCVN ISO/IEC 17025^[61]

A.2.16  Các bước phân tích

A.2.16.1  Yêu cầu chung

A.2.16.1.1  Chuẩn bị ADN để dựng đường chuẩn

Mỗi mẫu ADN gạo có nồng độ 50 ng/μl được pha loãng thành 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl, 0,002 ng/μl sử dụng dung dịch pha loãng ADN được cung cấp bởi tổ chức phát triển phương pháp và real-time PCR dựng đường chuẩn bằng cách sử dụng 5 μl mỗi mẫu ADN pha loãng.

Đối với các yêu cầu cụ thể, xem TCVN 7606 (ISO 21571).

A.2.16.1.2  Thuốc thử PCR

A.2.16.1.3  Hỗn hợp gốc PCR

Xem A.2.12.3

A.2.16.1.4  Mồi và đoạn dò

Xem Bảng A.6.

A.2.16.2  Quy trình

A.2.16.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp PCR định lượng gen gạo SPS có tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là 25 μl.

Rã đông, trộn nhẹ nhàng và li tâm hỗn hợp gốc real-time PCR định lượng và các mẫu ADN cần phải phân tích. Giữ các thuốc thử rã đông ở nhiệt độ 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.

Phân phối 20 μl hỗn hợp gốc PCR vào mỗi ống phản ứng PCR 200 μl (A.2.11.5). Thêm 5 μl các mẫu dung dịch ADN, kiểm chứng dương gạo, kiểm chứng âm và kiểm chứng trắng (H₂O) vào các ống, tương ứng.

Trộn nhẹ nhàng các ống PCR và li tâm trong máy li tâm (A.2.11.1) ở 1000g trong 10 s.

Chạy PCR với điều kiện chu trình real-time PCR định lượng.

A.2.16.2.2  Kiểm chứng PCR

Xem A.2.6.

A.2.16.2.3  Chuẩn bị các chuẩn

Dựng các đường chuẩn bằng cách vẽ các giá trị Ct đối với logarit số lượng ADN đích, bằng nanogam. Thực hiện bằng cách sử dụng bảng tính [ví dụ: Microsoft Excel] hoặc trực tiếp bằng các tùy chọn sẵn có với phần mềm hệ thống phát hiện trình tự (A.2.11.11).

Khối lượng tính bằng nanogam, đo cho các mẫu ADN chưa biết có được bằng phép nội suy từ đường chuẩn.

A.2.16.2.4  Chương trình thời gian-nhiệt độ (PCR)

Phép thử PCR đã được tối ưu để sử dụng cho hệ thống phát hiện trình tự ABI Prism^®1) 7700 và hệ thống real-time PCR Rotor Gene 3000A¹⁾ (A.2.11.10). Có thể sử dụng các hệ thống phát hiện trình tự khác. Trong những trường hợp này, các điều kiện có thể cần phải điều chỉnh. Chương trình thời gian- nhiệt độ cho real-time PCR định lượng được nêu ra trong Bảng A.7.

Bảng A.7 - Chương trình thời gian-nhiệt độ cho real-time PCR định lượng

A.2.16.2.5  Chấp nhận hoặc từ chối các tiêu chí

A.2.16.2.5.1  Chấp nhận và tiến hành các tiêu chuẩn mô tả trong Tài liệu tham khảo [60].

Sử dụng các yêu cầu tiến hành phương pháp để đánh giá các kết quả từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong A.2.16.2.5.2 đến A.2.16.2.5.4.

A.2.16.2.5.2  Dải động học của phương pháp gồm ít nhất năm nồng độ đích có độ pha loãng 1/10. Nồng độ đích dự kiến là ngưỡng liên quan với yêu cầu luật pháp.

A.2.16.2.5.3  Hệ số biến thiên của độ tái lập phải ở mức dưới 35 % nồng độ đích và trên toàn dải động học. C_V,R< 50 % được chấp nhận khi nồng độ dưới 0,2 %.

A.2.16.2.5.4  Độ đúng cần nằm trong khoảng ± 25 % giá trị chuẩn được chấp nhận trên toàn dải động học.

A.2.16.2.6  Xác định

Sử dụng đoạn dò TaqMan^®1) cho phép xác định chính xác các sản phẩm PCR.

A.2.17  Xác định mẫu

Xem A.2.6.

A.2.18  Diễn giải và tính toán các kết quả

Sau khi kết thúc real-time PCR định lượng, định vị ngưỡng trong vùng có dữ liệu khuếch đại song song (giai đoạn PCR theo hàm số mũ - kiểu logarit) và không có hiệu ứng chéo giữa các lần lặp lại của cùng một mẫu. Xác định số chu kì mà tại đó ngưỡng đi qua đường cong khuếch đại đầu tiên và thiết lập đường nền trước giá trị ngưỡng 3 chu kì. Xuất tất cả các dữ liệu cho các tính toán tiếp theo.

Sau khi xác định một giá trị ngưỡng trong giai đoạn khuếch đại logarit như mô tả trên, giá trị Ct của mỗi phản ứng được tính toán bằng cách sử dụng phần mềm thiết bị. Dựng đường chuẩn theo các giá trị Ct ở ngưỡng và theo các giá trị logarit thập phân của lượng ADN khuôn mẫu ban đầu.

Sau đó, sử dụng các đường chuẩn để ước lượng hàm lượng ADN trong mẫu ADN mù bằng cách nội suy từ các đường chuẩn.

A.2.19  Lưu giữ hồ sơ

Lưu trữ hồ sơ phải phù hợp với các yêu cầu của TCVN ISO/IEC 17025 ^[61].

A.2.20  Báo cáo

Báo cáo phải tuân thủ các yêu cầu của TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN ISO/IEC 17025 ^[61].

A.2.21  Các biện pháp an toàn

Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608 (ISO 24276).

A.2.22  Ngăn ngừa ô nhiễm và xử lý chất thải

Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608 (ISO 24276).

A.3  Phương pháp đặc hiệu taxon đích để phát hiện các thành phần có nguồn gốc từ cà chua (Lycopersicon esculentum)

A.3.1  Nguyên tắc

Gen LAT52 mã hoá một protein giàu cysteine, gắn cacbonhydrate, ổn định nhiệt, cần thiết cho sự phát triển của phấn cà chua. Phương pháp phát hiện LAT52 phù hợp dùng làm gen nội chuẩn trong việc xác định và định lượng cà chua GM (Tài liệu tham khảo [62]). Phòng thử nghiệm Phát hiện GMO của Trường Đại học Tổng hợp Jiao Tong Thượng Hải (GMDL-SJTU) đã tổ chức thử nghiệm cộng tác để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phát hiện gen LAT52 ở cà chua làm gen nội chuẩn cho phép phân tích định lượng cà chua biến đổi gen (GM) hoặc không biến đổi gen (non-GM). Nghiên cứu gồm 13 phòng thử nghiệm từ Mỹ, Singapore, Hàn Quốc, Lithuania, Slovenia, Na Uy, Ý và Trung Quốc. Các kết quả có trong Tài liệu tham khảo [63], Phụ lục 1 và 2.

Quy trình nghiên cứu cộng tác bao gồm các mô-đun sau:

- Real-time PCR định lượng để dựng đường chuẩn định lượng bằng cách sử dụng các mẫu ADN cà chua từ bốn giống cà chua khác nhau.

- Real-time PCR định lượng để định lượng các mẫu ADN cà chua làm mù bằng cách sử dụng các đường chuẩn đã được xây dựng.

Thử nghiệm vòng được thực hiện theo các hướng dẫn được quốc tế chấp nhận, bao gồm:

- TCVN 6910 (ISO 5725)^[51]-[56] được xem xét đặc biệt liên quan đến độ chính xác (độ lặp lại và độ tái lập) và độ đúng;

- Quy trình chính thức của IUPAC về thiết kế, tiến hành và diễn giải các nghiên cứu hiệu năng phương pháp (Tài liệu tham khảo [12]).

A.3.2  Phạm vi áp dụng

Phương pháp này dùng cho phát hiện ADN cà chua bằng PCR định lượng.

Phương pháp đã được tối ưu đối với hạt cà chua, quả cà chua, nước sốt cà chua và nước ép cà chua, chứa hỗn hợp cà chua và các nền mẫu khác như ngô và đậu tương. Khả năng áp dụng của gen LAT52 đã được kiểm tra thông qua thử nghiệm cộng tác sử dụng các mẫu ADN chiết tách từ hạt cà chua.

A.3.3  Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và các tiêu chí thực hiện

A.3.3.1  Độ mạnh của phương pháp

Độ mạnh của phương pháp real-time PCR định lượng LAT52 đã được thử nghiệm bởi tổ chức phát triển phương pháp với ba chương trình thời gian-nhiệt độ khác nhau (hai bước và ba bước; với ba nhiệt độ gắn mồi khác nhau, gồm 58 °C, 59 °C và 60 °C), trên ba mẫu ADN khác nhau chứa tổng số ADN cà chua biết trước (10 ng, 1 ng, 0,1 ng các mẫu ADN bộ gen cà chua và mỗi mẫu lặp lại ba lần). Phương pháp real-time PCR định lượng có độ mạnh mong muốn ở các chương trình thời gian-nhiệt độ và ở ba nồng độ mẫu ADN cà chua.

Phương pháp PCR định lượng gen LAT52 cũng được thử nghiệm trên các thiết bị real-time PCR khác nhau [Rotor gene 3000A,¹⁾ Corbett Research và ABI7700¹⁾], với ba thể tích phản ứng khác nhau (20 μl, 25 μl, và 30 μl, và ba lần lặp lại trên một thể tích). Các phương pháp real-time PCR định lượng cho thấy độ mạnh dự kiến phù hợp khi sử dụng với các thiết bị real-time PCR khác nhau với các thể tích phản ứng khác nhau.

A.3.3.2  Thử nghiệm nội bộ

Gen LAT52 của cà chua đã được xác nhận sử dụng làm gen nội chuẩn trong xác định và định lượng cà chua GM (Tài liệu tham khảo [62]). Phương pháp PCR LAT52 cũng được thử nghiệm bởi ba đơn vị của GMDL-SJTU sử dụng ADN bộ gen cà chua và có kết quả khả quan; đặc biệt trong PCR định lượng, độ chệch thấp hơn 25 % trong toàn dải động học (tức là 0,05 ng đến 1,00 ng).

A.3.3.3  Thử nghiệm cộng tác

Các kết quả thử nghiệm cộng tác được tóm tắt và báo cáo trong Tài liệu tham khảo [63], Tóm lại, để chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu cộng tác, tất cả các mẫu ADN được chiết tách bằng GMDL-SJTU sử dụng phương pháp CTAB được thông qua trong A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571). Định lượng quang phổ lượng ADN chiết tách được bằng phương pháp trong B.1 của TCVN 7606 (ISO 21571). Sau khi định lượng ADN, tiến hành phân tích real-time PCR định lượng để cung cấp dữ liệu về sự ức chế PCR có thể xảy ra. Sau đó gửi đến mỗi phòng thử nghiệm tham gia các mẫu ADN đã được chuẩn bị.

Dựng các đường chuẩn bằng cách sử dụng các mẫu ADN pha loãng từ bốn giống hạt cả chua bằng phương pháp PCR định lượng: hiệu suất PCR trung bình của phương pháp PCR gen LAT52 là 96,6 %, được tính từ độ dốc của đường chuẩn là (10^-1/a - 1) x 100, a là độ dốc, và độ tuyến tính (hệ số hồi quy, Rc²) trung bình là 0,997.

Các kết quả thử nghiệm cộng tác của tám mẫu ADN làm mù được tóm tắt trong Bảng A.8. Các yêu cầu về tiến hành phương pháp, được thiết lập bởi Mạng lưới các Phòng thử nghiệm GMO Châu Âu (ENGL) và được thông qua bởi các Phòng thử nghiệm Chuẩn Liên minh Châu Âu (EURL) (Tài liệu tham khảo [60]) được sử dụng để đánh giá các dữ liệu này. Sau khi loại bỏ các giá trị số lạc thông qua khoảng tin cậy 95 % theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)^[52] độ lặp lại và độ tái lập của mỗi nồng độ cà chua được nêu trong Bảng A.8.

Bảng A.8 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp real-time PCR gen LAT52

A.3.3.4  Chọn lọc phân tử

A.3.3.4.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này nhằm vào gen LAT52 có mặt ổn định với một bản sao đơn cho mỗi bộ gen đơn bội của các giống cà chua khác nhau. Các mồi và đoạn dò đích của đoạn ADN LAT52 có độ dài 92bp được nêu ra trong Bảng A.9.

Bảng A.9 - Các trình tự mồi và đoạn dò oligonucleotit

A.3.3.4.2  Thực nghiệm

Mẫu ADN chiết tách từ 11 vật liệu thực vật khác nhau (bao gồm cà chua) được phân tích bằng phương pháp PCR gen LAT52 (Tài liệu tham khảo [62]). Trong số 11 mẫu, chỉ có ADN cà chua cho kết quả dương tính, 10 mẫu còn lại, như cà tím, khoai tây, dã yên thảo, ớt, ngô, đậu tương, cải dầu, gạo, thuốc lá và Arabidopsis cho kết quả âm tính.

Các mẫu ADN chiết tách từ 12 giống cà chua khác nhau có nguồn gốc địa lý và phát sinh loài khác nhau, ví dụ: Shengnong 2, Jifan4, Zhongsu5, Yashu6, Jiafen1, Shenfeng2, Hongza9, R144, Nongyou30, Dongnong70, Lichun và Zaokui đã được phân tích bằng PCR gen LAT52 theo phương pháp đã được phát triển. Tất cả 12 mẫu đều cho kết quả dương tính.

A.3.3.4.3  Lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của mồi và đoạn dò LAT52 được phân tích bằng cách tìm kiếm tương đồng bằng chương trình BLASTN 2.0MP-WashU (Tài liệu tham khảo [64], ngày tìm kiếm: 20-01-2010). Trình tự 92 bp của LAT52 được sử dụng làm chuỗi truy vấn là một phần của mã số tiếp cận NCBI X15855 (nucleotit 1385-1476), và kết quả phân tích trên BLAST đã xác nhận sự tương đồng hoàn toàn của trình tự truy vấn với các trình tự gen LAT52 đặc hiệu bao phấn cà chua.

A.3.4  Nguyên tắc

Phương pháp này là một quy trình real-time PCR định lượng sử dụng TaqMan^®1) để định lượng trình tự đích LAT52 ở cà chua. Định lượng các sản phẩm PCR bằng tín hiệu huỳnh quang trong mỗi chu kì PCR bằng cách sử dụng đoạn dò oligonucleotít đặc hiệu LAT52 đánh dấu với hai thuốc nhuộm huỳnh quang: HEX là thuốc nhuộm phát huỳnh quang ở đầu 5' và TAM RA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang ở đầu 3'. Giá trị Ct được sử dụng để tính toán hàm lượng ADN cà chua, và giá trị Ct là chu kì ngưỡng với tín hiệu huỳnh quang quan sát vượt qua một giá trị ngưỡng sau một số chu kì nhất định.

Để định lượng số bản sao gen LAT52 ở cà chua trong mẫu chưa biết, giá trị Ct của mẫu được xác định. Sử dụng bốn điểm chuẩn để dựng đường chuẩn và tính số bản sao tương ứng của các mẫu phân tích ADN.

A.3.5  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong Điều này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa của TCVN 6910-1 (ISO 5725-1)^[51] và TCVN 7608 (ISO 24276).

A.3.6  Số lượng và loại mẫu

Bốn mẫu ADN từ các giống cà chua khác nhau, như R144, Zhongsu5, Zaofeng và Lichun, 50 ng/μl, pha loãng 30 μl mỗi giống để dựng các đường chuẩn.

Tám mẫu ADN cà chua chưa biết từ 4 giống cà chua khác nhau với các nồng độ khác nhau (0 ng/μl đến 50 ng/μl) và các nồng độ GM khác nhau được sử dụng, mỗi mẫu 50 μl.

A.3.7  Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), phạm vi áp dụng

LOQ tuyệt đối của phương pháp PCR định lượng là 0,01 ng mỗi phản ứng, tương ứng với khoảng 11 bản sao ADN bộ gen cà chua đơn bội. LOD của phương pháp PCR định lượng không được đánh giá trong thử nghiệm cộng tác.

A.3.8  Ước tính độ không đảm bảo đo

Công bố độ không đảm bảo đo chung của phương pháp từ các kết quả thử nghiệm cộng tác (xem A.3.3.3).

A.3.9  Các yếu tố gây nhiễu

Các mẫu ADN đã chuẩn bị phải được kiểm tra các chất ức chế PCR trước khi phân tích PCR để tránh kết quả âm tính giả.

A.3.10  Các điều kiện vật lý và môi trường

Các quy trình cần phải thực hiện trong điều kiện vô trùng.

Duy trì các không gian làm việc riêng biệt cho việc chiết tách ADN, chuẩn bị PCR và khuếch đại.

Bất kỳ ADN tồn dư cần phải loại bỏ khỏi thiết bị trước khi sử dụng.

Để tránh ô nhiễm, sử dụng đầu hút lọc (A.3.11.6) để bảo vệ khỏi khí dung.

Chỉ sử dụng găng tay không bột (A.3.11.8) và thường xuyên thay mới.

Bàn thí nghiệm và thiết bị cần phải được làm sạch định kỳ bằng dung dịch natri hypochlorite (Clo hoạt động 10 %) (thuốc tẩy).

Pipet nên được kiểm tra độ chính xác và thường xuyên hiệu chỉnh.

A.3.11  Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị thông thường phòng thử nghiệm, cụ thể như sau.

A.3.11.1  Máy li tâm.

A.3.11.2  Tủ đông bảo quản ở âm 20 °C và tủ lạnh duy trì ở 4 °C.

A.3.11.3  Micropipet.

A.3.11.4  Máy vortex.

A.3.11.5  Ống nghiệm, dung tích 0,2 ml, 1,5 ml, 2,0 ml.

A.3.11.6  Đầu hút và đầu hút lọc cho micropipet.

A.3.11.7  Giá để các ống phản ứng.

A.3.11.8  Găng tay vinyl hoặc latex.

A.3.11.9  Máy hút chân không phù hợp để làm khô hạt ADN, tùy chọn.

A.3.11.10  Thiết bị real-time PCR.

A.3.11.11  Các ống phản ứng real-time PCR hoặc các giếng và các nắp quang học hoặc các miếng phủ quang học, nếu phù hợp.

A.3.11.12  Phần mềm: Sequence DeteCtion System¹⁾ phiên bản 1.7 (Applied Biosystems Part No 4311876¹⁾) hoặc các phiên bản tương đương.

A.3.12  Vật liệu và thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, chỉ sử dụng thuốc thử phù hợp với các đặc điểm kỹ thuật của TCVN 7608 (ISO 24276) và chỉ sử dụng nước cất vô trùng hoặc nước khử khoáng vô trùng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

A.3.12.1  Hỗn hợp gốc real-time PCR

A.3.12.2  Oligonucleotit (mồi và đoạn dò).

A.3.13  Thu thập mẫu, vận chuyển, bảo quản và lưu mẫu

Các dung dịch ADN cần được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C trong thời gian tối đa một tuần hoặc ở âm 20 °C khi cần bảo quản lâu hơn (A.3.11.2). Để chuẩn bị cho real-time PCR định lượng, thuốc thử PCR phải được rã đông ở nhiệt độ 1 °C đến 4 °C trong đá lạnh.

A.3.14  Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu thử phải đại diện cho mẫu phòng thử nghiệm, ví dụ: bằng cách nghiền hoặc đồng nhất các mẫu. Các phép đo và các bước tiến hành cần được xem xét mô tả chi tiết trong TCVN 7606 (ISO 21571).

A.3.15  Hiệu chuẩn thiết bị

Thiết bị, ví dụ: máy chu trình nhiệt và pipet phải được hiệu chuẩn theo TCVN ISO/IEC 17025.^[61]

A.3.16  Các bước phân tích

A.3.16.1  Yêu cầu chung

A.3.16.1.1  Chuẩn bị ADN để dựng đường chuẩn

ADN được chiết tách, định lượng và gửi đến tất cả các phòng thử nghiệm tham gia như được nêu trong A.3.3.3.

Mỗi mẫu ADN cà chua có nồng độ 50 ng/μl được pha loãng đến 10 ng/μl, 1 ng/μl, 0,1 ng/μl, 0,01 ng/μl, 0,002 ng/μl bởi 0,1 x TE, tương ứng.

A.3.16.1.2  Thuốc thử PCR

A.3.16.1.3  Hỗn hợp gốc real-time PCR

Xem A.3.12.

A.3.16.1.4  Mồi

Xem Bảng A.9.

A.3.16.2  Quy trình

A.3.16.2.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho PCR định lượng đích là gen LAT52 ở cà chua được phát triển với tổng thể tích hỗn hợp phản ứng 25 μl.

Rã đông, trộn nhẹ nhàng và li tâm hỗn hợp gốc real-time PCR định lượng và các mẫu ADN cần thiết để phân tích. Rã đông thuốc thử ở nhiệt độ 1°C đến 4°C trong đá lạnh.

Phân phối 20 μl hỗn hợp gốc vào mỗi ống phản ứng PCR 200 μl (A.3.11.7). Thêm 5 μl các mẫu dung dịch ADN, kiểm chứng dương cà chua, kiểm chứng âm và kiểm chứng trắng (H₂O) vào các ống tương ứng.

Trộn dung dịch trong ống PCR nhẹ nhàng và li tâm nhanh trong máy li tâm (A.3.11.1).

Đặt khay vào thiết bị.

Phân tích PCR với các điều kiện chu trình real-time PCR định lượng được mô tả trong A.3.16.2.4.

A.3.16.2.2  Kiểm chứng PCR

Kiểm chứng dương và kiểm chứng âm cần được tiến hành theo TCVN 7608 (ISO 24276).

A.3.16.2.3  Chuẩn bị các chuẩn

Dựng các đường chuẩn bằng cách vẽ các giá trị Ct đối với logarit tổng số ADN đích, bằng nanogam. Có thể được thực hiện điều này bằng cách sử dụng bảng tính [ví dụ: Microsoft Excel¹⁾], hoặc trực tiếp bằng các tùy chọn sẵn có với phần mềm phát hiện trình tự (A.3.11.11).

Khối lượng tính bằng nanogam, đo cho mẫu ADN chưa biết có được bằng phép nội suy từ đường chuẩn.

A.3.16.2.4  Chương trình thời gian-nhiệt độ (PCR)

Phép thử PCR được tối ưu để sử dụng cho hệ thống phát hiện trình tự ABI Prism^®1) 7700 và hệ thống real-time PCR Rotor Gene 3000A¹⁾ (A.3.11.10). Các thiết bị khác có thể được sử dụng. Trong các trường hợp này, các điều kiện chu trình nhiệt có thể phải điều chỉnh. Chương trình thời gian-nhiệt độ cho real-time PCR định lượng được nêu ra trong Bảng A.10.

Bảng A.10 - Chương trình thời gian-nhiệt độ real-time PCR định lượng

A.3.16.2.5  Chấp nhận hoặc từ chối các tiêu chí

A.3.16.2.5.1  Sử dụng các yêu cầu tiến hành phương pháp để đánh giá các kết quả từ nghiên cứu cộng tác được nêu trong A.3.16.2.5.2 đến A.3.16.2.5.4.

A.3.16.2.5.2  Dải động học của phương pháp gồm ít nhất năm nồng độ đích có độ pha loãng 1/10. Nồng độ đích cần được dự kiến là ngưỡng liên quan với yêu cầu luật pháp.

A.3.16.2.5.3  Hệ số biến thiên của độ tái lập phải ở mức dưới 35 % nồng độ đích và trên toàn dải động học. C_v.R< 50 % được chấp nhận khi nồng độ dưới 0,2 %.

A.3.16.2.5.4  Độ đúng cần nằm trong khoảng ± 25 % giá trị chuẩn được chấp nhận trên toàn dải động.

A.3.16.2.6  Xác định

Sử dụng đoạn dò TaqMan^®1) cho phép xác định chính xác các sản phẩm PCR.

A.3.17  Xác định mẫu

Xem A.3.6.

A.3.18  Diễn giải và tính kết quả

Sau khi kết thúc real-time PCR định lượng, xác định ngưỡng trong vùng có dữ liệu khuếch đại song song (giai đoạn PCR theo hàm số mũ - kiểu logarit) và không có hiệu ứng chéo giữa các lần lặp lại của cùng một mẫu. Xác định số chu kì mà tại đó ngưỡng đi qua đường cong khuếch đại đầu tiên và thiết lập đường nền trước giá trị ngưỡng 3 chu kì. Xuất tất cả các dữ liệu cho các tính toán tiếp theo.

Sau khi xác định một giá trị ngưỡng trong giai đoạn khuếch đại logarit như mô tả trên, giá trị Ct của mỗi phản ứng được tính toán bằng phần mềm thiết bị.

Dựng đường chuẩn theo các giá trị Ct ở ngưỡng và các giá trị logarit thập phân của số lượng ADN khuôn mẫu ban đầu.

Sau đó, sử dụng các đường chuẩn để tính toán hàm lượng ADN trong mẫu ADN chưa biết bằng cách nội suy từ các đường chuẩn.

A.3.19  Lưu giữ hồ sơ

Lưu trữ hồ sơ phải phù hợp với các yêu cầu của TCVN ISO/IEC 17025 ^[61].

A.3.20  Báo cáo

Báo cáo phải tuân thủ các yêu cầu của TCVN 7608 (ISO 24276) và TCVN ISO/IEC 17025 ^[61]

A.3.21  Các biện pháp an toàn

Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608 (ISO 24276).

A.3.22  Ngăn ngừa ô nhiễm và xử lý chất thải

Không có yêu cầu cụ thể. Xem TCVN 7608 (ISO 24276).

Phụ lục B

(Tham khảo)

Các phương pháp sàng lọc

B.1  Phương pháp sàng lọc để định lượng tương đối ADN promoter 35S ở đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR

B.1.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu để phát hiện một gen đậu tương đặc hiệu taxon (gen lectin, le1) và phát hiện ADN promoter 35S có nguồn gốc từ virút khảm súp lơ để định lượng tổng số ADN promoter 35S trong thành phần đậu tương chứa đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready^®).

Các hạn chế, xem B.1.8.

B.1.2  Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và các đặc tính hiệu năng

B.1.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được tối ưu cho mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM-410) 7) ^[18] gồm có bột đậu tương khô chứa hỗn hợp đậu tương GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường.

Đã kiểm tra độ tái lập của các phương pháp mô tả trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng những mẫu chưa biết (các mẫu được gắn nhãn từ SA đến SE, xem Bảng B.1) là các hỗn hợp của các mẫu chuẩn kể trên ^[19]. Ngoài ra, các thực phẩm thương mại sẵn có cũng đã được kiểm tra ^[20].

Số bản sao của mỗi trình tự đích trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết ^[21],[22].

Phương pháp được công bố trong Tài liệu tham khảo ^[23].

B.1.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Năm mẫu chưa biết chứa các nồng độ trong khoảng từ 0,7 % đến 3 % (theo khối lượng) bột đậu tương khô có nguồn gốc từ dòng GTS 40-3-2 được phân tích bởi 11 phòng thử nghiệm tham gia.

Phương pháp phát hiện đặc hiệu promoter 35S có kết quả độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 17 % đến 34 % (xem Bảng B.1). Trong các thực nghiệm ban đầu của thử nghiệm cộng tác, đã xác định CRM đậu tương 1 % không nhất quán với giá trị cho trước. Các nghiên cứu công bố rằng các mẫu chuẩn khác nhau được sản xuất sử dụng các quy trình thực hiện khác nhau tại các thời điểm khác nhau, dẫn đến sự phân hủy ADN ở các mức độ khác nhau. Các đơn vị tham gia thử nghiệm cộng tác được khuyến cáo trong suốt quy trình thử nghiệm cộng tác cần sử dụng CRM 2 % và pha loãng ADN để có được dung dịch ADN đối chứng 1 % dùng trong định lượng.

Đối với tách chiết ADN, sử dụng quy trình mô tả trong Tài liệu tham khảo [23]. Theo đó, ly giải 200 mg mẫu trong 1 ml guanidium hydrochloride//đệm proteinase K (0,5 mol/l//0,8 mg/ml) ở 56°C trong 3 h. Sau bước xử lý RNase, trộn 500 μl dịch chiết đã được làm trong với 1 ml hạt silica của Wizard^® 8) và thu hồi hạt nhựa cùng ADN bám quanh bằng cách cho đi qua cột lọc Wizard^{® 8)}. Sau khi rửa bằng isopropanol, tách rửa ADN ra khỏi nhựa silica trong 10 mmol/l đệm Tris pH 9,0 ở 70°C. Nồng độ ADN được ước tính bằng đo OD ở bước sóng 260 nm và được điều chỉnh về 20 μg/ml. Để phân tích PCR, 200 ng ADN từ mỗi mẫu đã được phân tích trong hai phản ứng độc lập.

Các mẫu được phân tích lặp lại hai lần.

Vì các mẫu gắn nhãn từ SA đến SE được trộn lẫn với các mẫu chuẩn khác nhau, nên các kết quả thu được với các mẫu này không thể được sử dụng cho việc đánh giá độ đúng của phương pháp real-time PCR được áp dụng. Tuy nhiên, các kết quả có thể được sử dụng cho đánh giá độ chính xác của phương pháp được áp dụng, theo đó các trường hợp nêu trên phản ánh tình huống xấu nhất dẫn đến một ước lượng thấp về độ chính xác của phương pháp real-time PCR áp dụng^[19].

Việc loại ra các phòng thử nghiệm dựa trên thiết bị real-time PCR được sử dụng và dựa trên tính toán thống kê của các giá trị số lạc. Phương pháp đã phát triển cho các máy chu trình nhiệt khối. Do đó, hai phòng thử nghiệm đang sử dụng một hệ thống LightCycler^®8) đã bị loại trừ trước khi tính toán các giá trị số lạc. Lý do cho sự loại trừ loại máy PCR cụ thể là việc quan sát cho thấy rằng phương pháp được áp dụng cần được điều chỉnh thích hợp và tối ưu hóa cẩn thận nếu chạy trên thiết bị real-time PCR khác với các thiết bị đã được quy định cụ thể trong phương pháp này. Ngoài ra, các phòng thử nghiệm được giữ lại được kiểm tra các giá trị số lạc theo Grubbs [24]. Tuy nhiên, không xác định được giá trị số lạc nào. Chi tiết về các thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng B.1.

Bảng B.1 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng để phát hiện GMO đặc hiệu promoter-35S

Ngoài ra, bốn mẫu thực phẩm thương mại có sẵn chưa biết chứa khoảng 0,3 % và 36 % (theo khối lượng) (các giá trị trung bình) của đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 đã được phân tích bởi bốn đơn vị tham gia. Phương pháp phát hiện đặc hiệu promoter-35S cho kết quả với độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 17 % đến 28 %^[20].

B. 1.2.3  Đặc hiệu phân tử

B.1.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được thiết kế dựa vào một trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank^®9) với mã số tiếp cận V00141.

Danh mục cây trồng biến đổi gen chứa promoter-35S của CaMV được cung cấp trong Tài liệu tham khảo [25].

Kết quả dương tính giả có thể xảy ra do trình tự được khuếch đại có nguồn gốc từ virút khảm súp lơ lây nhiễm cho cây súp lơ và các thành viên khác của họ Brassicaceae (Cruciferae) cũng như Resedaceae và Solanaceae ^[26],[27]. Vì vậy, các kết quả dương tính với Brassicaceae, Resedaceae và Solanaceae cần được xử lý cẩn thận. Các kết quả dương tính có thể chỉ ra sự có mặt của một sản phẩm có nguồn gốc thực vật biến đổi gen nhưng không được coi là bằng chứng về sự có mặt của các sản phẩm có nguồn gốc thực vật biến đổi gen mà không cần xác nhận bổ sung.

Để phân biệt giữa mẫu bị nhiễm virút và mẫu biến đổi gen, có thể sử dụng các phương pháp để phát hiện virút khảm súp lơ^[28].

B.1.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ ⁹⁾ bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3 ⁹⁾ [ngày 24 tháng tư năm 2002]. Kết quả của việc tìm kiếm xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

B.1.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Tính đặc hiệu thực nghiệm của phương pháp đã được đánh giá bằng phân tích CRM IRMM-410 từ bột đậu tương khô IRMM chứa từ 0 % đến 5 % đậu tương dòng GTS 40-3-2 và các mẫu chuẩn từ Hiệp hội Quốc tế Nghiên cứu Thực phẩm Leatherhead 9) gồm bột đậu tương chưa tách dầu (Lot No.2/99-01) chứa 0 %, 0,3 %, 1,25 % và 2 % đậu tương GTS 40-3-2, tương ứng.

Các nền mẫu thực phẩm thương mại đã được thử nghiệm là bột đậu tương, protein tách chiết từ đậu tương, thực phẩm tổng hợp chứa bột đậu tương và protein đậu tương.

B.1.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700 ⁹⁾ sử dụng hóa chất TaqMan^®9)

Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems)⁹⁾.

B.1.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

Vì là phương pháp định lượng, nên LOD đã không được đánh giá cụ thể. LOD dự kiến là tốt hơn hoặc bằng với giới hạn định lượng; ví dụ 50 bản sao bộ gen của đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen của đậu tương thông thường.

B.1.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ đã được đánh giá bằng cách đo các dãy pha loãng ADN đích theo Tài liệu tham khảo [20],

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, LOQ là 50 bản sao gen đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen đậu tương thông thường. Đối với giá trị 1C, xem Tài liệu tham khảo [20]. Điều này cho ước lượng LOQ tương đối là 0,06 (= 50 bản sao/82 000 bản sao x 100 %).

Các nồng độ được kiểm tra trong thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng B.1.

CHÚ THÍCH: Số lượng bản sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.

B.1.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

B.1.4  Nguyên tắc

Đoạn ADN có chiều dài 82 bp của trình tự promoter-35S CaMV được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai mồi đặc hiệu promoter-35S. Các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu promoter-35S được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^® 10) được sử dụng.

Đoạn ADN có chiều dài 81 bp của trình tự gen lectin đậu tương được khuếch đại bằng PCR trong một phản ứng real time PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu gen lectin đậu tương, và các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan^® đặc hiệu gen lectin ở đậu tương ¹⁰⁾.

Phép định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng hoặc phương pháp ΔΔCt hoặc phương pháp đường chuẩn kép (xem B.1.9).

B.1.5  Thuốc thử

B. 1.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

B.1.5.2  Nước

B.1.5.3  Đệm PCR (không bao gồm MgCl₂), 10 x

B.1.5.4  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l

B.1.5.5 Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi loại)

B.1.5.6  Các oligonucleotit

Chi tiết của các oligonucleotit được liệt kê trong Bảng B.2.

Bảng B.2 - Các oligonucleotit

Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin là 81 bp; chiều dài sản phẩm PCR gen 35S là 82 bp.

B.1.5.7  Enzym ADN Polymerase chịu nhiệt

Enzym ADN Polymerase của AmpliTaq Gold^®11)

B.1.5.8  Uracil N-glycosylase (tùy chọn)

B.1.6  Thiết bị, dụng cụ

B.1.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

B.1.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm ban đầu với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS và GeneAmp^® 5700 SDS (Applied Biosystems)¹¹⁾. Các hệ thống phát hiện real-time PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp các điều kiện phản ứng.

B.1.6.3  Các ống phản ứng

Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96-giếng ABI PRISM^®, hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems)¹¹⁾.

B.1.7  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

B.1.7.1  Yêu cầu chung

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt.

Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp được quy định cho tổng thể tích PCR 50 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng B.3.

Bảng B.3 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng

B.1.7.2  Các kiểm chứng PCR

Các mẫu chuẩn được chứng nhận GTS 40-3-2 (vật liệu chứa từ 0,1 % đến 5 % đậu tương biến đổi gen) được sản xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM-410)¹²⁾ có thể sử dụng làm kiểm chứng dương và làm vật liệu so sánh chuẩn ^[18].

Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

B.1.7.3  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ như được nêu trong Bảng B.4 đã được tối ưu cho hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700 (Applied Biosystems) 12). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase của AmpliTaq Gold^{® 12)}. Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.

Bảng B.4 mô tả các điều kiện phản ứng.

Bảng B.4 - Quy trình thực hiện: Các điều kiện phản ứng

B.1.8  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Vì các GMO khác với dòng đậu tương GTS 40-3-2 cũng chứa các trình tự ADN promoter 35S, nên phương pháp này chỉ phù hợp cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt các GMO khác. Trong tất cả các trường hợp khác, phương pháp này chỉ có thể được áp dụng cho các mục đích sàng lọc và kiểm soát.

Phương pháp này phù hợp để đo tỉ lệ giữa ADN promoter-35S với ADN đậu tương khi không có mặt GMO khác và các virút khảm súp lơ. Tỉ lệ này phản ánh lượng đậu tương GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương của thực phẩm nghiên cứu. Hàm lượng đậu tương GTS 40-3-2 1 % có thể được xác định nếu tổng số thành phần đậu tương vượt quá 5 % trong thực phẩm nghiên cứu.

CHÚ THÍCH: Nếu chế biến thực phẩm dẫn đến sự phân hủy hoặc loại bỏ ADN (ví dụ: dầu đậu tương tinh luyện, các lecithin đậu tương tinh luyện) thì phương pháp này không cho các kết quả đáng tin cậy.

B.1.9  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Sau khi xác định một giá trị ngưỡng (ví dụ: giá trị trong khoảng 0,01 đến 0,1 của thuốc nhuộm phát huỳnh quang được chuẩn hóa (Rn)), hệ thống phát hiện trình tự tính toán các giá trị Ct (chu kì ngưỡng) cho mỗi PCR (phương pháp ΔΔCt). Sự khác biệt giữa các giá trị Ct đặc hiệu lectin và các giá trị Ct đặc hiệu 35S của các mẫu (ΔC_t,sam) và của các mẫu chuẩn (ΔC_t,ref) được tính toán. Lượng tương đối của ADN 35S trong mẫu, w, theo phần trăm, có liên quan chặt với mẫu chuẩn được tính theo (B.1).

Trong đó c_ref là nồng độ của mẫu chuẩn (mẫu đối chứng).

Cách khác, một đường chuẩn được tính (log [c] đối với Ct) bằng hệ thống phát hiện trình tự dựa trên các chuẩn là các hỗn hợp GMO có nồng độ đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 xác định (ví dụ: 0,1 %; 0,5 %, 1 %, 2 % và 5 %) hoặc các chuẩn là các pha loãng thích hợp của các dung dịch kiểm tra thu được từ các hỗn hợp GMO có nồng độ GTS 40-3-2 xác định (ví dụ: 5 %) (phương pháp đường chuẩn kép). Đường chuẩn này được sử dụng để xác định nồng độ dòng GTS 40-3-2 của các mẫu chưa biết. Vì ADN mẫu có thể bị phân hủy do quá trình chế biến thực phẩm hoặc vì mẫu có thể chứa các thành phần khác với đậu tương, nồng độ GTS 40-3-2 cần tính phải được chuẩn hoá với tổng số ADN đậu tương có thể khuếch đại có trong mẫu. Tổng số ADN đậu tương có trong mẫu được xác định bằng phương pháp real-time PCR đặc hiệu gen lectin đậu tương qua việc sử dụng các hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương xác định [ví dụ 100 % (theo khối lượng), 50 % (theo khối lượng), 25 % (theo khối lượng), 10 % (theo khối lượng) và 1 % (theo khối lượng)]. Hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương ở trên được chuẩn bị bằng cách pha loãng ADN đậu tương từ dãy IRMM 410 với ADN mang thích hợp. Để chuẩn hóa, chia lượng ADN của GTS 40-3-2 đo được cho lượng ADN đo được của đậu tương.

Để tính kết quả của quy trình thay thế này, điều quan trọng là lượng tuyệt đối của ADN khuôn (ng) là như nhau cho mỗi PCR được sử dụng trong hiệu chuẩn.

Một quy trình thực hiện thay thế khác được mô tả trong C.2.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Các phương pháp đặc hiệu cấu trúc

C.1  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR (phương pháp 1)

C.1.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện một gen đậu tương đặc hiệu taxon (gen lectin, Ie1) và phát hiện ADN có nguồn gốc từ cấu trúc gen đặc hiệu có mặt trong đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2. Phương pháp này thích hợp để định lượng tổng số ADN có nguồn gốc từ đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương chứa đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready^®13)).

Các hạn chế, xem C.1.7.

C.1.2  Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng

C.1.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được tối ưu hóa cho các mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM-410 ¹³⁾) ^[18] gồm bột đậu tương khô chứa hỗn hợp GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường.

Đã kiểm tra độ tái lập của các phương pháp mô tả trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết (từ SA đến SE, xem Bảng C.1) là các hỗn hợp của các mẫu chuẩn đã đề cập ở trên ^[19]. Ngoài ra, các thực phẩm thương mại sẵn có đã được kiểm tra ^[20].

Các số bản sao của mỗi trình tự đích trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết ^[21],[22].

Phương pháp được công bố trong Tài liệu tham khảo [23].

C.1.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Năm mẫu chưa biết chứa các nồng độ trong khoảng 0,7 % và 3 % (theo khối lượng) bột đậu tương khô có nguồn gốc từ dòng GTS 40-3-2 được phân tích bởi 11 phòng thử nghiệm tham gia.

Phương pháp phát hiện đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 có kết quả độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 16 % đến 28 % (xem Bảng C.1). Trong các thí nghiệm ban đầu của thử nghiệm cộng tác, đã xác định đậu tương CRM 1 % không nhất quán với giá trị cho trước.

Các nghiên cứu công bố các mẫu chuẩn khác nhau được sản xuất sử dụng các quy trình thực hiện khác nhau tại các thời điểm khác nhau, có sự phân hủy ADN ở các mức độ khác nhau. Các đơn vị tham gia thử nghiệm cộng tác được khuyến cáo trong suốt quy trình thử nghiệm cộng tác cần sử dụng CRM 2 % và pha loãng ADN để có được một dung dịch ADN đối chứng 1% dùng trong định lượng.

Đối với tách chiết ADN, sử dụng quy trình mô tả trong Tài liệu tham khảo [23], Theo đó, ly giải 200 mg mẫu trong 1 ml guanidium hydrochloride//đệm proteinase K (0,5 mol/l//0,8 mg/ml) ở 56 °C trong 3 h. Sau bước xử lý RNase, trộn 500 μl dịch chiết đã được làm trong với 1 ml hạt silica của Wizard^® 14) và thu hồi hạt nhựa có ADN bám quanh bằng cách cho đi qua một cột lọc Wizard ^{® 14)}. Sau khi rửa bằng isopropanol, tách rửa ADN ra khỏi nhựa silica trong 10 mmol/l đệm Tris pH 9,0 ở 70 °C. Nồng độ ADN được ước tính bằng cách đo OD ở bước sóng 260 nm và được điều chỉnh về 20 μg/ml. Để phân tích PCR, 200 ng ADN từ mỗi mẫu đã được phân tích trong hai phản ứng độc lập.

Các mẫu được phân tích lặp lại hai lần.

Vì các mẫu gắn nhãn từ SA tới SE là hỗn hợp của các mẫu chuẩn khác nhau, nên các kết quả thu được với các mẫu này không được sử dụng cho việc đánh giá độ đúng của phương pháp real-time PCR. Tuy nhiên, các kết quả có thể được sử dụng cho đánh giá độ chính xác của phương pháp được áp dụng, theo đó các trường hợp nêu trên phản ánh tình huống xấu nhất dẫn đến một ước lượng thấp thấp về độ chính xác của phương pháp real-time PCR áp dụng ^[19].

Việc loại ra các phòng thử nghiệm được dựa trên các thiết bị real-time PCR sử dụng và dựa trên tính toán thống kê của các giá trị số lạc. Phương pháp đã được phát triển cho các máy chu trình nhiệt khối. Do đó, hai phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống LightCycler^{® 14)} (Roche Diagnostics) bị loại trừ trước khi tính toán các giá trị số lạc. Lý do loại trừ một thiết bị PCR cụ thể là do quan sát thấy phương pháp cần điều chỉnh phù hợp và tối ưu hóa cẩn thận nếu chạy trên thiết bị real-time PCR khác với các thiết bị PCR được quy định trong phương pháp này. Các phòng thử nghiệm giữ lại được kiểm tra thêm về các số lạc theo Grubbs ^[24]. Các chi tiết của thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.1.

Bảng C.1 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng để phát hiện GMO đặc hiệu promoter-35S

Ngoài ra, bốn mẫu thực phẩm thương mại có sẵn chưa biết chứa khoảng 0,3 % và 36 % (theo khối lượng) (các giá trị trung bình) đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 đã được phân tích bởi bốn đơn vị tham gia. Phương pháp phát hiện đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 cho kết quả với độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng 23 % đến 36 % ^[20].

C.1.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.1.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này được thiết kế dựa vào một trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank^® 15), mã số tiếp cận AX033493.

C.1.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ¹⁵⁾ bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3¹⁵⁾ [ngày 24, tháng tư, 2002], Kết quả của việc tìm kiếm xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

C.1.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Tính đặc hiệu thực nghiệm của phương pháp đã được đánh giá bằng phân tích CRM IRMM-410, từ bột đậu tương khô IRMM chứa từ 0 % đến 5 % đậu tương dòng GTS 40-3-2 và các mẫu chuẩn từ Hiệp hội Nghiên cứu Thực phẩm Quốc tế Leatherhead ¹⁵⁾ gồm bột đậu tương chưa tách dầu (Lot No. 2/99-01) chứa 0 %, 0,3 %, 1,25 % và 2 % đậu tương dòng GTS 40-3-2, tương ứng.

Các nền mẫu thực phẩm thương mại đã được thử nghiệm là bột đậu tương, protein tách chiết từ đậu tương, thực phẩm tổng hợp chứa bột đậu tương và protein đậu tương.

C.1.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700¹⁵⁾ sử dụng hóa chất TaqMan^®15).

Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems)¹⁵⁾.

C.1.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

Vì là phương pháp định lượng nên giới hạn phát hiện không được đánh giá cụ thể. Giới hạn phát hiện được dự kiến tốt hơn hoặc bằng giới hạn định lượng; ví dụ: 50 bản sao bộ gen của đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen của đậu tương thông thường.

C.1.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn định lượng được đánh giá bằng cách đo dãy pha loãng ADN đích theo Tài liệu tham khảo [20].

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, giới hạn định lượng là 50 bản sao bộ gen đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong 82 000 bản sao bộ gen đậu tương thông thường. Đối với giá trị 1C, xem Tài liệu tham khảo [20],

LOQ tương đối được ước tính là 0,06 (= 50 bản sao/82 000 bản sao x 100 %).

Các nồng độ được kiểm tra trong thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.1

CHÚ THÍCH: Số lượng bản sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.

C.1.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

C.1.4  Nguyên tắc

Đoạn gen chuyển có chiều dài 83 bp được sử dụng cho cấu trúc dòng đậu tương GTS 40-3-2 được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai mồi đặc hiệu cho gen CTP từ Petunia hybrids (RRS-F, xem Bảng C.2) và đặc hiệu cho promoter-35S (RRS-R, xem Bảng C.2). Các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR (real-time) bằng một đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu cho vùng nối giữa gen CTP và promoter-35S (RRS-TMP, xem Bảng C.2). Đoạn dò oligonucleotit này được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Với mục đích đó, hóa chất TaqMan^® 16) được sử dụng.

Đoạn trình tự gen lectin đậu tương có chiều dài 81 bp được khuếch đại bằng PCR trong một phản ứng real-time PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu gen lectin đậu tương và các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR bằng đoạn dò TaqMan^{® 16)} đặc hiệu gen lectin đậu tương (Lectin-TMP, xem Bảng C.2).

Phép định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng hoặc phương pháp ΔΔCt hoặc phương pháp đường chuẩn kép (xem C.1.8).

C.1.5  Thuốc thử

C.1.5.1  Tổng quát

Đối với chất lượng của thuốc thử đã được sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.1.5.2  Nước.

C.1.5.3  Đệm PCR (không có MgCl₂), 10 x

C.1.5.4  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

C.1.5.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 2,5 mmol/l (mỗi loại).

C.1.5.6  Các oligonucleotit

Chi tiết của các oligonucleotit được liệt kê trong Bảng C.2.

Bảng C.2 - Các oligonucleotit

Chiều dài sản phẩm PCR của gen lectin là 81 bp; chiều dài sản phẩm PCR của gen RRS là 83 bp.

C.1.5.7  Enzym ADN Polymerase chịu nhiệt

Enzym ADN polymerase của AmpliTaq Gold^® 17).

C.1.5.8  Uracil N-glycosylase (tùy chọn).

C.1.6  Thiết bị, dụng cụ

C.1.6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm tiêu chuẩn trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

C.1.6.2  Máy chu trình nhiệt

Hồ sơ thời gian-nhiệt độ quy định được thử nghiệm đầu tiên với hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS ¹⁷⁾ và GeneAmp^® 5700 SDS (Applied Biosystems) ¹⁷⁾. Các hệ thống phát hiện realtime PCR khác có thể được sử dụng sau khi điều chỉnh phù hợp với các điều kiện phản ứng.

C.1.6.3  Các ống phản ứng

Các ống phản ứng phải phù hợp để khuếch đại PCR cho từng máy chu trình nhiệt, ví dụ: khay phản ứng quang học 96 giếng ABI PRISM^®, hoặc các nắp quang học MicroAmp^® (8 nắp ống/dải, phẳng) (Applied Biosystems) ¹⁷⁾.

C.1.6.4  Cách tiến hành: Chuẩn bị PCR

Chuẩn bị PCR cho trình tự đích gen đối chứng và cho trình tự đích GMO phải được thực hiện trong các ống riêng biệt. Multiplex PCR (sử dụng các đánh dấu huỳnh quang khác nhau cho các đoạn dò) chưa được kiểm tra hay xác nhận giá trị sử dụng.

Phương pháp quy định tổng thể tích PCR 50 μl cho mỗi hỗn hợp phản ứng với các thành phần như được liệt kê trong Bảng C.3.

Bảng C.3 - Hỗn hợp phản ứng khuếch đại ở thể tích/nồng độ cuối cho mỗi ống phản ứng

C.1.6.5  Các kiểm chứng PCR

Các mẫu chuẩn được chứng nhận GTS 40-3-2 (vật liệu có chứa 0,1 % đến 5 % đậu tương biến đổi gen) được sản xuất bởi IRMM, Geel, Bỉ (dãy IRMM 110 18)) có thể được sử dụng làm kiểm chứng dương và làm vật liệu so sánh chuẩn ^[18].

Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.1.6.6  Chương trình thời gian-nhiệt độ

Chương trình thời gian-nhiệt độ như được nêu trong Bảng C.4 đã được tối ưu hóa cho hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700 ¹⁸⁾ (Applied Biosystems). Trong nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng, chương trình được sử dụng kết hợp với ADN polymerase của AmpliTaq Gold^{® 18)}. Việc sử dụng các máy chu trình nhiệt khác có thể yêu cầu những điều chỉnh thích hợp cụ thể. Thời gian hoạt hóa/biến tính ban đầu phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.

Bảng C.4 mô tả các điều kiện phản ứng.

Bảng C.4 - Quy trình thực hiện: Các điều kiện phản ứng

C.1.7  Các hạn chế và diễn giải các kết quả

Vì các GMO khác với dòng đậu tương GTS 40-3-2 có thể chứa một phần của gen chuyển được sử dụng để tạo dòng đậu tương GTS 40-3-2, đặc biệt promoter-35S, trình tự CTP từ Petunia hybrida và vùng nối đặc hiệu giữa hai yếu tố gen này, nên phương pháp này thích hợp cho định lượng ADN GTS 40-3-2 khi không có mặt GMO khác, như đã được nêu cụ thể ở trên.

Phương pháp này thích hợp để đo tỉ lệ giữa ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 với ADN đậu tương. Tỉ lệ này phản ánh lượng đậu tương GTS 40-3-2 trong thành phần đậu tương của thực phẩm nghiên cứu.

Nếu tổng số thành phần đậu tương ít hơn 5 % trong thực phẩm nghiên cứu, hàm lượng 1 % đậu tương GTS 40-3-2 không chắc xác định được.

CHÚ THÍCH: Nếu quá trình chế biến thực phẩm dẫn đến sự phân hủy hoặc loại bỏ ADN (ví dụ: dầu đậu tương tinh luyện các lecithin đậu tương tinh luyện) thì phương pháp này không cho các kết quả đáng tin cậy.

C.1.8  Hiệu chuẩn và tính kết quả

Sau khi xác định một giá trị ngưỡng (ví dụ: giá trị trong khoảng 0,01 đến 0,1 của thuốc nhuộm phát huỳnh quang được chuẩn hóa (Rn)), hệ thống phát hiện trình tự tính toán các giá trị Ct (chu kì ngưỡng) cho mỗi PCR (phương pháp ΔΔCt). Sự khác biệt giữa các giá trị Ct đặc hiệu lectin và các giá trị Ct đặc hiệu RRS của các mẫu (ΔC_t,sam) vả của các mẫu chuẩn (ΔC_t,ref) được tính toán. Lượng tương đối của ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 trong mẫu, w, theo phần trăm, có liên quan chặt với mẫu chuẩn được tính toán theo phương trình (C.1):

Cách khác, một đường chuẩn được tính (log [c] đối với Ct) bằng hệ thống phát hiện trình tự dựa trên các chuẩn là các hỗn hợp GMO có nồng độ đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 xác định (ví dụ: 0,1 %; 0,5 %, 1 %, 2 % và 5 %), hoặc các chuẩn là các pha loãng thích hợp của các dung dịch kiểm tra thu được từ các hỗn hợp GMO có nồng độ GTS 40-3-2 xác định (ví dụ: 5 %) (phương pháp đường chuẩn kép). Đường chuẩn này được sử dụng để xác định nồng độ dòng GTS 40-3-2 của các mẫu chưa biết. Vì ADN mẫu có thể bị phân hủy do quá trình chế biến thực phẩm hoặc vì mẫu có thể chứa các thành phần khác với đậu tương, nồng độ GTS 40-3-2 tính toán phải được chuẩn hóa với tổng số ADN đậu tương có thể khuếch đại có mặt ở trong mẫu. Tổng số ADN đậu tương có trong mẫu được xác định bằng phương pháp real-time PCR đặc hiệu gen lectin đậu tương qua việc sử dụng các hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương xác định [ví dụ 100 % (theo khối lượng), 50 % (theo khối lượng), 25 % (theo khối lượng), 10 % (theo khối lượng) và 1 % (theo khối lượng)]. Hỗn hợp ADN chuẩn có nồng độ ADN đậu tương ở trên được chuẩn bị bằng cách pha loãng ADN đậu tương từ dãy IRMM 410 hoặc 410R 19) với ADN mang thích hợp. Để chuẩn hóa, chia lượng ADN của GTS 40-3-2 đo được cho lượng ADN đo được của đậu tương.

Để tính kết quả của quy trình thay thế này, điều quan trọng là lượng tuyệt đối của ADN khuôn (ng) là như nhau cho mỗi PCR được sử dụng trong hiệu chuẩn.

Một quy trình thay thế khác được mô tả trong C.2.

C.2  Phương pháp đặc hiệu cấu trúc để định lượng ADN đậu tương dòng GTS 40-3-2 sử dụng real-time PCR (phương pháp 2)

C.2.1  Giới thiệu

Phụ lục này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện gen đậu tương đặc hiệu taxon (lectin gen, Ie1) và vùng cấu trúc gen đặc hiệu nối giữa ADN promoter-35S từ virút khảm súp lơ với các tín hiệu hướng lục lạp của Petunia hybrida phía trước trình tự của gen tổng hợp 5 enolpyruvylshikimate-3-phosphate từ Agrobacterium (epsps) có mặt trong đậu tương biến đổi gen dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready^® 20)) để định lượng tương đối lượng đậu tương dòng GTS 40-3-2.

Các hạn chế, xem C.2.8.

C.2.2  Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp và các đặc tính hiệu năng

C.2.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp đã được tối ưu hóa cho các thiết bị real-time PCR sử dụng các mẫu chuẩn được chứng nhận (CRM IRMM-410R ²⁰⁾) ^[18] gồm bột đậu tương khô chứa các hỗn hợp của GTS 40-3-2 và đậu tương thông thường.

Đã kiểm tra độ tái lập và độ chính xác của phương pháp trong các thử nghiệm cộng tác bằng cách sử dụng các mẫu chưa biết là các mẫu chuẩn được đề cập ở trên. Ngoài ra, một loại mẫu chuẩn đã qua xử lý là bột đậu nành tách béo (TVP) đã được kiểm tra.

Số lượng bản sao của mỗi trình tự đích trong bộ gen chưa được đánh giá chi tiết.

C.2.2.2  Thử nghiệm cộng tác

Sáu mẫu chưa biết chứa khoảng 0,1 % và 5 % (theo khối lượng) các mẫu chuẩn đã được chứng nhận nêu trên (CRM IRMM-410R ²⁰⁾) và mẫu TVP chứa 2 % (theo khối lượng) đậu tương dòng GTS 40-3-2 được phân tích bởi

- 14 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống ABI PRISM^® 7700 SDS,

- 6 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống ABI GeneAmp^® 5700 SDS và

- 12 phòng thử nghiệm sử dụng hệ thống LightCycler^{® 20)} (Roche Diagnostics).

Số lượng đơn vị tham gia cũng như số lượng mẫu được tuân thủ các tiêu chí của bộ TCVN 6910 (ISO 5725).

Kết quả phát hiện đặc hiệu-cấu trúc GTS 40-3-2 cho độ lệch chuẩn tương đối tái lập trong khoảng từ 27 % đến 44 % khi sử dụng hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 SDS và ABI GeneAmp^® 5700 SDS, tương ứng, và trong khoảng từ 27 % đến 64 % khi sử dụng hệ thống LightCycler^{® 20)} (Roche Diagnostics).

Để tách chiết ADN, các quy trình thực hiện được mô tả trong A.3 của TCVN 7606 (ISO 21571) đã được sử dụng.

Đối với mỗi mẫu, thực hiện song song hai tách chiết ADN. Phân tích mỗi mẫu lặp lại ba lần.

Độ chụm, độ chính xác và giới hạn định lượng của phương pháp được xác định bằng thử nghiệm cộng tác. Dữ liệu về độ đặc hiệu, tuyến tính và giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng được xác định trước thử nghiệm cộng tác. Hàm lượng ADN của các mẫu thử nghiệm bao phủ được các giá trị này.

Một bản tóm tắt các dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng về độ đúng và độ chính xác được nêu trong Bảng C.5 và C.6.

Bảng C.5 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng cho ABI PRISM^® 7700 SDS và GeneAmp^® 5700 SDS21)

Bảng C.6 - Dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng cho hệ thống LightCycler^® 22)

Các kết quả liệt kê trong Bảng C.6 minh họa sự biến thiên quan sát được đối với hệ thống LightCycler^®22) (Roche Diagnostics). Lưu ý số phòng thử nghiệm gửi trả kết quả không đủ theo TCVN 6910 (ISO 5725).

C.2.2.3  Đặc hiệu phân tử

C.2.2.3.1  Yêu cầu chung

Phương pháp được thiết kế dựa vào một trình tự được mô tả tại cơ sở dữ liệu GenBank^{® 22)}, mã số tiếp cận AY596948.

C.2.2.3.2  Đặc hiệu lý thuyết

Đặc hiệu lý thuyết của các mồi và đoạn dò được đánh giá thông qua tìm kiếm tại cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ²²⁾ bằng cách sử dụng các trình tự nucleotit như là các chuỗi truy vấn với chương trình BLASTN 2.2.3²²⁾ [ngày 24, tháng tư, 2002]. Kết quả của việc tìm kiếm xác nhận một sự tương đồng hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

C.2.2.3.3  Xác định thực nghiệm đặc hiệu

Các mẫu bột đậu nành khô CRM IRMM-410R ²²⁾ chứa từ 0 % đến 5 % đậu tương GTS 40-3-2 đã được xác định. Các nền mẫu thực phẩm thương mại được kiểm tra là bột đậu tương và các tách chiết protein đậu tương.

Các kiểm tra đặc hiệu trước khi thử nghiệm cộng tác cho thấy không có phản ứng chéo giữa bộ mồi/ đoạn dò trong phương pháp này với các loài/mẫu không phải đích sau: lúa (Oryza sativa), lúa mạch đen (Secale cereale), lúa mì (Triticum aestivum), lúa mạch (hordeum vulgare), kê (Panicum miliaceum), đậu lăng (Lens culinaris), đậu trắng (Phaseolus vulgaris), đậu xanh (Phaseolus aureus), một loại đậu vàng (Lupinus luteus), teosinte (Zea mays ssp.mexicana), cà chua (Lycopersicon escutentum), khoai tây (Solarium tuberosum tuberosum ssp.), lúa miến (Sorghum vulgare), ngô (Zea mays), cải dầu (Brassica napus), yến mạch (Avena sativa), lúa mì spenta (Triticum spelta), lanh (Linum usitatissimum), kiều mạch (Fagopyrum esculentum), vừng (Sesamum spp.), người (Homo sapiens sapiens), cá hồi (Sdlmo saiar), bò (Bos taunts) và Bacillus subtilis. Hơn nữa, không có phản ứng chéo được quan sát với MS8xRF3 (SeedLink) hạt cải dầu hoặc với sự kiện GM sau: Bt176, Bt11, T25, MON810, CBH351, DBT418, GA21.

Các alen và sự ổn định số bản sao của gen đối chứng đậu tương được đánh giá sử dụng ít nhất tám giống khác nhau của đậu tương.

C.2.2.4  Tối ưu hóa

Tối ưu hóa nồng độ chất phản ứng được thực hiện trên hệ thống phát hiện trình tự (SDS) ABI PRISM^® 7700 và trên thiết bị LightCycler^® sử dụng hóa chất TaqMan^® 23) ^[3]. Không cần phải tối ưu hóa thêm khi thực hiện trên thiết bị GeneAmp^®5700 vì chu trình nhiệt của thiết bị này giống với chu trình nhiệt của hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM^® 7700 ²³⁾.

Thiết kế mồi và đoạn dò đã được thực hiện bằng cách áp dụng phần mềm Primer Express^® (Applied Biosystems)²³⁾.

C.2.2.5  Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện không được đánh giá trong thử nghiệm cộng tác.

Giới hạn phát hiện cho PCR được tính toán bằng cách đo dãy pha loãng ADN đích. Theo phòng thử nghiệm phân tích, LOD đã được xác định là 5 bản sao trình tự đích (được xác định với các plasmid).

C.2.2.6  Giới hạn định lượng (LOQ)

Các giới hạn định lượng đã được đánh giá bằng cách đo các dãy pha loãng liên tiếp ADN đích.

Theo các phòng thử nghiệm phân tích, giới hạn định lượng là ít nhất 50 bản sao bộ gen đậu tương dòng GTS 40-3-2. Đối với giá trị 1 C, xem Tài liệu tham khảo ^[20].

Các nồng độ được kiểm tra trong thử nghiệm cộng tác được liệt kê trong Bảng C.5 và C.6.

CHÚ THÍCH  Số lượng bản sao không được xác định trong thử nghiệm cộng tác.

C.2.3  Điều chỉnh

Chưa có thông tin cụ thể.

C.2.4  Nguyên tắc

Đoạn ADN của trình tự đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 có chiều dài 74 bp được khuếch đại bằng PCR sử dụng một cặp mồi đặc hiệu cho GTS 40-3-2. Các sản phẩm PCR được đo qua mỗi chu trình PCR (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu cấu trúc GTS 40-3-2 được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang: FAM như một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA như một loại thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang. Vì mục đích đó, hóa chất TaqMan^®23) được sử dụng.

Đoạn ADN của gen lectin đậu tương đặc hiệu taxon (Ie1) có chiều dài 74 bp được khuếch đại bằng PCR trong một lần chạy real-time PCR riêng biệt sử dụng hai mồi đặc hiệu gen Ie1 đậu tương và các sản phẩm PCR được đo trong mỗi chu trình PCR bằng một đoạn dò TaqMan^® đặc hiệu Ie1²³⁾

Sử dụng phương pháp đường chuẩn để định lượng các ADN được tách chiết từ mẫu kiểm tra chưa biết.

CHÚ THÍCH: Trước khi phân tích PCR định lượng, các dung dịch ADN được tách chiết đã được phân tích bằng việc sử dụng một chương trình PCR định tính trên máy real-time PCR. Chương trình chạy PCR định tính (“chạy giám sát”) được tiến hành để xác định “chu kì ngưỡng” (giá trị Ct) của mỗi mẫu mã không tồn tại một kinh nghiệm thực nghiệm. Bằng cách kiểm tra hai độ pha loãng khác nhau của axit nucleic được tách chiết (ví dụ: độ pha loãng 1:10 và 1:40 của dung dịch ADN) trong chạy giám sát, sự hiện diện có thể có của chất ức chế khuếch đại có thể được xác định. Ngoài ra, một độ pha loãng thích hợp của chất chiết axit nucleic thu được từ mẫu kiểm tra phù hợp với dải hiệu chuẩn của phân tích định lượng có thể được xác định.

C.2.5  Thuốc thử

C.2.5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

C.2.5.2  Nước.

C.2.5.3  Đệm PCR (không có MgCI₂), 10x

C.2.5.4  Dung dịch MgCl₂, c(MgCI₂) = 25 mmol/l.