Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13917-1:2023 Phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen - Phần 1: Yêu cầu chung

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13917-1:2023

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR - PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

Detection and quantification of genetically modified plants and products derived from genetically modified plants by real-time PCR method - Part 1: General requirements

Lời nói đầu

TCVN 13917-1:2023 do Viện Di truyền Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 13917: 2023, Phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen bằng phương pháp realtime PCR gồm có các phần sau:

- TCVN 13917-1:2023, Phần 1: Yêu cầu chung;

- TCVN 13917-2:2023, Phần 2: Sự kiện ngô chuyển gen MIR 604;

- TCVN 13917-3:2023, Phần 3: Sự kiện ngô chuyển gen MON 88017.

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR - PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

Detection and quantification of genetically modified plants and products derived from genetically modified plants by real-time PCR method - Part 1: General requirements

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu chung để phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen bằng phương pháp real-time PCR (phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực).

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 7606:2007, (ISO 21571:2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Tách chiết axit nucleic

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1

Lô hàng (Lot)

Lượng xác định vật liệu mà từ đó mẫu được lấy ra để kiểm tra sự có mặt của sinh vật biến đổi gen.

[NGUỒN: 2.1 của TCVN 9027:2011 (ISO 24333:2009)]

3.2

Mẫu ban đầu (Increment)

Lượng vật liệu được lấy tại một thời điểm từ các điểm lấy mẫu riêng lẻ trong khắp lô hàng hoặc ruộng sản xuất.

[NGUỒN: 2.3 của TCVN 9027:2011 (ISO 24333:2009)]

3.3

Mẫu chung (Aggregate sample)

Tập hợp các mẫu ban đầu (3.2) được lấy trong khắp lô hàng hoặc ruộng sản xuất, được gộp lại và trộn đều.

[NGUỒN: 2.4 của TCVN 9027:2011 (ISO 24333:2009)]

3.4

Mẫu phòng thử nghiệm (Laboratory sample)

Mẫu được chuẩn bị bằng cách trộn đều và chia mẫu chung để gửi đến phòng thử nghiệm và dùng để kiểm tra hoặc thử nghiệm.

[NGUỒN: 2.5 của TCVN 9027:2011 (ISO 24333:2009)]

3.5

Trộn đều (Homogenization)

Trộn kỹ bằng tay hoặc bằng phương tiện cơ học sao cho các đặc tính vật lý được phân bố đều trong mẫu chung hoặc mẫu phòng thử nghiệm.

[NGUỒN: 2.6 của TCVN 9027:2011 (ISO 24333:2009)]

3.6

ADN (Axit deoxyribonucleic)

Polymer của các deoxyribonucleotide dạng sợi đôi hoặc sợi đơn là chất mang thông tin di truyền, được mã hóa theo chuỗi các base (các hợp chất vòng nitơ có trong purin hoặc pyrimidin) và có trong nhiễm sắc thể và vật liệu nhiễm sắc thể của các bào quan.

[NGUỒN: 3.38 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.7

Phát hiện sản phẩm PCR (Detection of PCR product)

Hành động ghi nhận hoặc phát hiện sự tồn tại của sản phẩm PCR bằng cách quan sát dải huỳnh quang với các đầu dò huỳnh quang trong các ứng dụng real-time PCR.

[NGUỒN: 3.42 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.8

Phương pháp định lượng (Quantitative method)

Phương pháp phân tích theo đó số lượng hoặc nồng độ của chất phân tích có thể xác định được và biểu thị bằng con số với các đơn vị đo thích hợp.

[NGUỒN: 3.161 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.9

Sự kiện (Event)

Cấu trúc trao đổi gen và vị trí duy nhất chèn vào bộ gen.

[NGUỒN: 3.56 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.10

Sinh vật biến đổi gen (Genetically engineered organism - GMO)

Sinh vật trong đó vật liệu di truyền đã được thay đổi thông qua công nghệ sinh học hiện đại theo cách không xảy ra tự nhiên bởi việc nhân và/hoặc tái tổ hợp.

[NGUỒN: 3.73 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.11

Real-time PCR

Quy trình enzyme kết hợp khuếch đại in vitro các đoạn ADN đặc hiệu với việc phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu trong quá trình khuếch đại.

[NGUỒN: 3.162 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.12

Mẫu chuẩn (Reference material - RM)

Vật liệu hoặc chất có một hay nhiều giá trị, về tính chất của nó được xác định đủ đồng nhất và tốt để đánh giá một phương pháp đo hoặc để ấn định các giá trị của vật liệu.

[NGUỒN: 3.5.1 của TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2007)]

3.13

Mẫu chuẩn chứng nhận (Certified reference material - CRM)

Mẫu chuẩn có kèm theo giấy chứng nhận, trong đó một hay nhiều giá trị về tính chất của nó được chứng nhận theo một thủ tục có hiệu lực, được xác nhận bởi giấy chứng nhận hoặc bởi các tài liệu khác do cơ quan chứng nhận cấp.

[NGUỒN: 3.5.2 của TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2007)]

3.14

Taxon

Nhóm hoặc thể loại cụ thể bất kỳ mà trong đó các sinh vật liên quan được phân loại.

[NGUỒN: 3.204 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.15

Taxon đích (Target taxon)

Taxon mà sinh vật biến đổi gen thuộc loại đó.

[NGUỒN: 3.1.1 của TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2007)]

3.16

Chu kỳ ngưỡng C_t (Threshold cycle - C_t)

Điểm của đường khuếch đại mà tại đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên trên đường nền hoặc vượt qua ngưỡng cài đặt đã xác định trước.

[NGUỒN: 3.212 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.17

Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of detection - LOD)

Lượng tối thiểu hay nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không cần thiết phải định lượng, như đã được chứng minh bằng thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp khác.

[NGUỒN: 3.1.6 của TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2007)]

3.18

Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification - LOQ)

Nồng độ nhỏ nhất hay lượng chất phân tích nhỏ nhất trong mẫu thử có thể được định lượng với mức chấp nhận về độ chụm và độ chính xác.

[NGUỒN: 3.1.7 của TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2007)]

4  Yêu cầu đối với phòng thử nghiệm

Bụi và sự phân tán dòng khí có thể nhiễm bẩn ngẫu nhiên vào ADN. Vì thế, tổ chức khu vực làm việc của phòng thử nghiệm phải được:

- phân khu một cách có hệ thống các bước phương pháp có liên quan trong việc tạo ra kết quả;

- thực hiện nguyên tắc “dòng chảy xuôi chiều” để xử lý mẫu.

Nguyên tắc này đảm bảo cho ADN cần phân tích và ADN đã khuếch đại bằng PCR được tách rời tự nhiên.

Phòng thử nghiệm nên thiết kế các khu vực làm việc chuyên dụng/riêng biệt với các thiết bị, dụng cụ kèm theo như sau:

a) khu vực nghiền và đồng hóa mẫu;

b) khu vực chiết axit nucleic từ nguyên liệu thử nghiệm;

c) khu vực riêng để cài đặt phản ứng Real-time PCR;

d) khu vực riêng cho quá trình xử lý tiếp theo, bao gồm phân tích và xác định đặc tính của trình tự ADN đã được khuếch đại, nếu có.

Sự tách biệt vật lý thông qua sử dụng các phòng khác nhau là cách hiệu quả và thích hợp nhất để đảm bảo phân tách các khu vực làm việc. Việc sử dụng phương pháp ngăn phòng để tạo các khu vực làm việc chuyên dụng/riêng biệt cũng cho hiệu quả tương đương. Cài đặt hệ thống dòng khí và điều hướng sao cho ngăn bụi/amplicon xâm nhập từ các khu vực làm việc có nguy cơ ô nhiễm cao hơn đến các khu vực làm việc có nguy cơ ô nhiễm thấp hơn.

5  Yêu cầu lấy mẫu

5.1  Yêu cầu đối với thiết bị, dụng cụ

5.1.1  Có nhiều loại thiết bị, dụng cụ lấy mẫu khác nhau. Thiết bị, dụng cụ được chọn phải phù hợp với các loại thực vật và sản phẩm thực phẩm sẽ lấy mẫu và số lượng cũng như vật chứa liên quan. Cần đặc biệt cẩn thận để đảm bảo các thiết bị lấy mẫu là sạch để tránh nhiễm bẩn vật liệu đang được lấy phân tích.

5.1.2  Thiết bị, dụng cụ lấy mẫu cần được khử trùng bằng phương pháp phù hợp và phải được bảo quản trong điều kiện vô trùng cho đến khi sử dụng.

5.1.3  Tất cả thiết bị, dụng cụ lấy mẫu được sử dụng phải đáp ứng các yêu cầu về an toàn, phải được kiểm tra, vận hành và bảo dưỡng định kỳ. Sử dụng khẩu trang, găng tay bảo hộ lao động trong quá trình lấy mẫu.

5.2  Yêu cầu đối với quá trình lấy mẫu

5.2.1  Quá trình lấy mẫu bao gồm các bước sau:

- thu thập đủ số lượng mẫu ban đầu để tạo thành mẫu chung;

- giảm mẫu chung thành mẫu phòng thử nghiệm;

- đồng hóa và giảm kích cỡ mẫu bằng phương pháp thích hợp để tạo thành mẫu phân tích;

- xác định sai số lấy mẫu, nếu cần thiết.

5.2.2  Việc lấy mẫu phải được tiến hành sao cho mẫu thử nghiệm thu được phải đại diện cho lô hàng hóa, lô ruộng sản xuất.

Phương pháp lấy mẫu, khối lượng mẫu thử nghiệm phụ thuộc vào mục đích của việc lấy mẫu, qui mô, cách thức sản xuất và từng loại thực vật và sản phẩm thực vật cụ thể.

5.2.3  Quy trình lấy mẫu phải được thực hiện sao cho vật liệu đã lấy mẫu được bảo vệ khỏi mọi nguồn nhiễm bẩn từ bên ngoài do mưa, bụi v.v...

5.2.4  Tất cả các quy trình lấy mẫu phải được thực hiện trong một thời gian đủ ngắn để tránh mọi sự thay đổi về bản chất ADN trong các mẫu.

5.2.5  Trong trường hợp có tranh chấp, mẫu phải do đại diện của các bên có liên quan cùng lấy hoặc do bên thứ ba được chỉ định.

5.2.6  Cần chú ý để đảm bảo tính nguyên vẹn của các mẫu từ thời điểm được lấy đến thời điểm sử dụng trong phòng thử nghiệm.

5.3  Mẫu phòng thử nghiệm

Mẫu chung phải được trộn đều trước khi chia mẫu để thu được mẫu phòng thử nghiệm, Chia mẫu chung để thu được số lượng mẫu phòng thử nghiệm có khối lượng quy định. Dụng cụ phải được làm sạch kỹ giữa mỗi lần chia mẫu để tránh bị nhiễm chéo.

Tham khảo Phụ lục A về cỡ mẫu phòng thử nghiệm khuyến nghị của các loại ngũ cốc, hạt có dầu và sản phẩm của chúng.

5.4  Bao gói và dán nhãn mẫu

5.4.1  Yêu cầu chung

Mẫu phòng thử nghiệm phải được đựng trong các vật chứa mẫu phù hợp với khối lượng của mẫu. Các vật chứa phải duy trì được các đặc tính ban đầu của mẫu phòng thử nghiệm, được làm kín để tránh làm thay đổi mẫu chứa bên trong, đồng thời chống giả mạo, lẫn mẫu và có thể nhận biết được.

5.4.2  Dán nhãn mẫu

Các thông tin được liệt kê từ a) đến f) được ghi bằng mực không xóa được và phải rõ ràng. Thông tin về nhãn mẫu sẽ được dán vào túi đựng mẫu và được coi như tem niêm phong mẫu của phòng thử nghiệm.

Nhãn của mẫu phòng thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) tên của sản phẩm;

b) khối lượng đại diện;

c) số nhận biết lô hàng;

d) ngày lấy mẫu;

e) vị trí và địa điểm lấy mẫu;

f) tên của người lấy mẫu.

5.4.3  Gửi mẫu

Sau khi kết thúc quá trình lấy mẫu, mẫu cần được gửi đến phòng thử nghiệm trong thời gian sớm nhất có thể.

Mẫu cần được bảo quản và vận chuyển trong các điều kiện thích hợp để duy trì tính nguyên vẹn của mẫu.

5.4.4  Báo cáo lấy mẫu

Báo cáo lấy mẫu bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) ngày lấy mẫu;

b) tên và chữ ký của những người được ủy quyền lấy mẫu;

c) nguồn gốc mẫu (ví dụ, xilô phẳng, xilô đứng, xe tải);

d) quy trình lấy mẫu đã sử dụng (dụng cụ, sản phẩm ở dạng tĩnh/dòng chảy v.v...);

e) nơi lấy mẫu, ví dụ tên và địa chỉ địa điểm lấy mẫu;

f) các điều kiện vận chuyển và bảo quản.

6  Phương pháp tách chiết/tinh sạch ADN

6.1  Yêu cầu chung

Yêu cầu của việc tách chiết/tinh sạch ADN là cung cấp ADN có chất lượng và số lượng phù hợp cho các phân tích tiếp theo. Chất lượng ADN phụ thuộc vào độ dài, tính toàn vẹn cấu trúc và độ tinh khiết về mặt lý hóa của ADN sau khi tách chiết/tinh sạch.

6.2  Chuẩn bị mẫu để tách chiết ADN

Cần thử nghiệm mẫu đại diện. Đảm bảo rằng các mẫu thử được sử dụng để tách chiết ADN đại diện cho mẫu phòng thử nghiệm, ví dụ bằng cách đồng hóa mẫu hoặc các phần mẫu thử thích hợp. Lấy ít nhất hai phần mẫu từ mẫu phòng thử nghiệm đã đồng nhất làm các phần mẫu thử để tách chiết ADN và phân tích tiếp theo.

6.3  Tách chiết/tinh sạch ADN bằng phương pháp dựa trên CTAB

Phương pháp tách chiết ADN từ phần mẫu thử cần tuân thủ các hướng dẫn và biện pháp chung được mô tả theo TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005) Phụ lục A.3. Phương pháp này có thể dùng để tách chiết ADN từ thực vật và các loại chất nền có nguồn gốc từ thực vật, đặc biệt do có khả năng loại bỏ các hợp chất polisacarit và polyphenol vốn có khả năng ảnh hưởng đến chất lượng ADN. Phương pháp này cũng có thể dùng cho các loại chất nền khác. Ngoài ra có thể sử dụng các bộ kít thương mại để tách chiết và tinh sạch ADN^[1].

Các mẫu kiểm chứng, bao gồm kiểm chứng mẫu trắng về quy trình tách chiết, kiểm chứng tách chiết dương tính khi có mẻ thuốc thử chiết mới được dùng, cần được kèm theo trong quá trình tách chiết mẫu phân tích.

CHÚ THÍCH: Phương pháp tách chiết sẽ cung cấp đủ lượng ADN cho phân tích dự định (ít nhất là đủ để đáp ứng LOD/LOQ thực tế mong muốn). Nếu có thể, sản lượng phải tương đương với kết quả thu được trong nghiên cứu kiểm chứng. Nếu một phương pháp tách chiết ADN không cho kết quả thích hợp cho phân tích dự định trên một chất nền cụ thể, thì LOD thực tế sẽ bị ảnh hưởng.

6.4  Đánh giá độ tinh sạch của ADN đã tách chiết được

Chất lượng, số lượng và tính nguyên vẹn của mẫu axit nucleic có ảnh hưởng đến tính năng của phương pháp phân tích, do đó ảnh hưởng đến kết quả thu được. Có thể đánh giá độ tinh sạch của ADN đã tách chiết được thông qua sự có mặt hay vắng mặt của chất ức chế PCR bằng cách kiểm tra các độ pha loãng khác nhau được chuẩn bị từ dung dịch ADN sao cho dung dịch ADN càng được pha loãng thì nồng độ chất ức chế càng ít. Tiêu chí chấp nhận: chênh lệch (ΔC_t) trung bình giữa giá trị chu kỳ ngưỡng C_t đo được và giá trị C_t ngoại suy của mẫu pha loãng đầu tiên của thử nghiệm ức chế phải nhỏ hơn 0,5 [(giá trị C_t đo được trừ giá trị C_t ngoại suy)] và độ dốc của đường cong ức chế phải nằm trong dải từ - 3,6 đến - 3,1, tương ứng với hiệu suất khuếch đại từ 90 % đến 110 %.

7  Phương pháp phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng real-time PCR

7.1  Nguyên tắc

Phương pháp phân tích phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng real-time PCR sử dụng ADN đích để xác định sự có mặt của các vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, phụ thuộc vào tính chất cụ thể của trình tự ADN đích, được nêu trong TCVN 7608:2007, cụ thể như sau:

a) Phương pháp real-time PCR dựa vào taxon đích: có thể dùng để đánh giá sự có mặt, chất lượng và số lượng ADN có nguồn gốc từ taxon và đôi khi được sử dụng như là một vật liệu chuẩn để định lượng tương đối vật liệu có nguồn gốc biến đổi gen.

b) Phương pháp real-time PCR dựa vào các gen sàng lọc: giúp cho việc đánh giá sự có mặt sản phẩm có chứa nguyên liệu có nguồn gốc biến đổi gen. Ví dụ, phương pháp sàng lọc là định tính PCR để phát hiện đoạn khởi động 35S-CaMV.

c) Phương pháp real-time PCR dựa vào cấu trúc đặc hiệu tìm thấy: các trình tự ADN đích trong vật liệu có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, tức là có sự tổ hợp trình tự ADN nhờ kỹ thuật di truyền. Việc phát hiện một cấu trúc gen là đủ để nhận biết sự biến nạp mà ADN được xuất phát từ đó, nhưng cấu trúc của gen giống nhau có thể được sử dụng nhiều hơn một dòng biến nạp.

d) Phương pháp real-time PCR dựa vào dòng đặc hiệu tìm thấy: các trình tự ADN đích trong vật liệu có nguồn gốc từ một dòng biến nạp, thông thường trình tự ADN nằm ở vùng tiếp giáp giữa ADN được chèn vào và hệ gen của vật chủ. Số bản sao trình tự ADN dòng đặc hiệu luôn là một trên một hệ gen đơn bội đã biến đổi gen. Phương pháp dòng đặc hiệu rất phù hợp cho việc nhận dạng một dòng cụ thể, và khi được sử dụng trong phương pháp real-time PCR đã được xác nhận hiệu lực sẽ xác định được hàm lượng ADN có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen cụ thể.

7.2  Phát hiện sản phẩm PCR bằng real-time PCR

ADN thu được ở 6.3 được tiến hành nhân lên trong máy chu trình nhiệt real-time PCR, sử dụng đoạn mồi và đoạn dò theo một trong bốn phương pháp a), b), c), d) trong 7.1 để khuếch đại trình tự ADN đích. Các sản phẩm PCR được khuyếch đại và phát hiện đồng thời bằng phương pháp real-time PCR. Cần sử dụng chương trình phân tích dữ liệu cụ thể đối với thiết bị real-time PCR tương ứng để khẳng định các sản phẩm PCR.

Các đường khuếch đại real-time PCR cần được kiểm tra trực quan về hình dạng chữ S để loại trừ các kết quả dương tính giả. Việc biểu thị các kết quả real-time PCR sẽ là một trong các trường hợp sau:

a) Mẫu được coi là dương tính khi chu kỳ ngưỡng C_t của mẫu thử nhỏ hơn chu kỳ ngưỡng C_t của mẫu chuẩn tại giá trị LOD thực tế của phòng thử nghiệm.

b) Mẫu được coi là âm tính khi kết quả được biểu thị là ’’không xác định”, “không khuếch đại” cho thấy không phát hiện được ADN có nguồn gốc từ đích, hoặc giá trị chu kỳ ngưỡng C_t của mẫu thử lớn hơn chu kỳ ngưỡng C_t của mẫu chuẩn tại giá trị LOD thực tế công bố của phòng thử nghiệm.

Kiểm chứng ADN đích dương tính phải luôn dương tính.

Việc biểu thị kết quả được ghi nhận như sau^[1]:

- các kết quả đối với tất cả các phần mẫu thử của một mẫu trong một lần phân tích phải nhất quán. Khi ít nhất một phần mẫu thử cho kết quả dương tính và ít nhất một phần mẫu thử cho kết quả âm tính thì phải lặp lại phép phân tích real-time PCR;

- nếu các kết quả PCR của lần phân tích thứ hai đối với tất cả các phần mẫu thử không giống nhau thì cần lặp lại quá trình tách chiết ADN và phân tích real-time PCR;

- nếu ít nhất hai lần lặp lại quy trình (bắt đầu từ quá trình tách chiết ADN) cho kết quả không rõ ràng là dương tính hay âm tính, thì báo cáo phải nêu rõ là mẫu âm tính ở giới hạn phát hiện (LOD).

8  Phương pháp định lượng sinh vật biến đổi gen bằng real-time PCR

8.1  Nguyên tắc

Phép phân tích định lượng bao gồm định lượng các trình tự ADN đích trong mẫu thử nghiệm. Mỗi phương pháp quy định các trình tự đích cụ thể.

Nguyên tắc định lượng thường là để xác định tỷ lệ (thể hiện là phần trăm) của hai trình tự ADN đích; ví dụ: một trình tự đại diện cho sinh vật biến đổi gen quan tâm (GM) và một trình tự đặc hiệu taxon đích (nội sinh).

Để định lượng tương đối GMO trong các mẫu chưa biết, số lượng khuôn mẫu ADN (ng) là như nhau ở cả PCR đặc hiệu taxon đích và PCR đặc hiệu GMO, nếu không nồng độ GMO tương đối không thể tính toán được.

Các chất chuẩn (các vật liệu chuẩn) được sử dụng để định lượng phải là những mẫu chuẩn chứng nhận (CRM), nếu có sẵn. Nếu không có sẵn, nên sử dụng các mẫu chuẩn thích hợp khác (xem ví dụ được nêu trong tham khảo ^[5]).

8.2  Định lượng bằng real-time PCR

8.2.1  Dựng đường chuẩn

ADN thu được ở 6.3 được tiến hành nhân lên trong máy chu trình nhiệt real-time PCR, sử dụng đoạn mồi và đoạn dò theo phương pháp dựa vào dòng đặc hiệu tìm thấy trong 7.1 d) để khuếch đại trình tự ADN đích thông qua phản ứng xúc tác bởi men ADN polymerase và các dNTP trong dung dịch đệm phản ứng. Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu, đoạn dò đặc hiệu và các hóa chất, chất chuẩn riêng cho từng loại sinh vật biến đổi gen theo sự kiện (3.9).

Sử dụng ADN chuẩn (CRM/RM) có nồng độ phần trăm sự kiện chuyển gen đã biết để dựng đường chuẩn. Đường chuẩn nên nằm trong phạm vi dải động, bao gồm các giá trị tương ứng với mục đích sử dụng dự kiến, thể hiện dưới dạng tỷ lệ phần trăm GMO ^[2]. Đường chuẩn được xây dựng bao gồm 4 đến 5 điểm, mỗi điểm chuẩn lặp lại ít nhất 2 lần đối với cả gen đặc hiệu taxon và gen đích GM. Các mẫu thử nghiệm được thực hiện đồng thời với đường chuẩn trong cùng một lượt chạy phản ứng real-timer^[3].

Đối với mỗi điểm chuẩn, sự khác biệt đối với mỗi giá trị gen đích GM và gen đích taxon được tính toán (đó là ΔCt). Đường chuẩn được tạo ra bằng cách vẽ đồ thị các giá trị ΔCt của các điểm chuẩn theo logarit số phần trăm gen đích GM và gen đích taxon. Độ đốc (a) và giao điểm (b) của đường chuẩn (y = ax + b) sau đó được sử dụng để tính hàm lượng phần trăm (%) GM trung bình của các mẫu chưa biết. Giá trị này có thể được tính toán bằng Excel hoặc trên tùy chọn sẵn có của phần mềm hệ thống real-time PCR chuyên biệt.

Tiêu chí chấp nhận của đường chuẩn: Giá trị trung bình của độ dốc của đường chuẩn phải nằm trong dải từ -3,6 đến -3,1; tương ứng với hiệu suất khuếch đại từ 90 % đến 110 %: hệ số R²: giá trị trung bình của R² ít nhất là 0,98.

8.2.2  Tính kết quả

Hàm lượng GMO đơn bội, X, tính bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (1):

Trong đó:

N_GM  là hàm lượng trung bình gen đích đặc hiệu sự kiện tính bằng phần trăm khối lượng (%);

N_taxon  là hàm lượng trung bình gen đích đặc hiệu taxon adh1, tính bằng phần trăm khối lượng (%)

8.2.3  Yêu cầu đảm bảo chất lượng

Tính nhất quán giữa các phép đo nhằm đạt được các ước lượng tin cậy về số lượng trình tự đích. Nếu một ADN có nguồn gốc GMO (tính theo phần trăm) được báo cáo lại, thì cần đạt yêu cầu sau:

a) tính nhất quán của một phần mẫu thử

- thông qua loại bỏ các phép đo nhỏ hơn LOQ, và

- thông qua độ lệch cực đại quan sát được giữa các độ pha loãng của các phép đo riêng rẽ bằng giá trị dự kiến từ hệ số pha loãng tương ứng ± 33 %.

b) tính nhất quán giữa các phần mẫu thử

- nồng độ ADN có nguồn gốc GMO từ a) được ước tính tương đối cho mỗi phần mẫu thử nghiệm phải nằm trong khoảng - 50 % đến + 100 % giá trị định lượng ước tính.

Để đảm bảo tính chính xác của các phép đo, dùng mẫu chuẩn (RM) tốt nhất là mẫu chuẩn chứng nhận (CRM), để định lượng các dòng có liên quan, với một mức độ thích hợp của độ tin cậy đo lường và với nền mẫu phù hợp tương tự phải được chọn và phân tích. Trong trường hợp không có CRM, mẫu chuẩn nội bộ có thể được chuẩn bị theo quy trình đã được chứng minh sự ổn định, tính đồng nhất và có thể truy xuất nguồn gốc, bảo đảm không có độ chệch. Độ không đảm bảo đo của phép định lượng phải đáp ứng độ không đảm bảo đo của chất chuẩn.

Phụ lục A

(Tham khảo ^[6])

Cỡ mẫu phòng thử nghiệm khuyến nghị của các loại ngũ cốc, hạt có dầu và sản phẩm của chúng

Cỡ mẫu phòng thử nghiệm khuyến nghị của các loại ngũ cốc và hạt có dầu khác nhau được nêu trong Bảng A.1. Việc tính cỡ mẫu dựa trên khối lượng hạt và số lượng hạt là 10 000 mỗi mẫu.

Bảng A.1 - Cỡ mẫu phòng thử nghiệm khuyến nghị của các loại ngũ cốc và hạt có dầu

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ISO 20813:2019, Molecular biomarker analysis - Methods of analysis for the detection and identification of animal species in food and food products (nucleic acid-based methods) - General requiremnets and definitions.

[2] Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing. JRC Technical Report. European Network of GMO Laboratories (ENGL) 2015. European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EURL-GMFF). 24 pages.

[3] HOUGS L, GATTO F, GOERLICH O, GROHMANN L, LIESKE K, MAZZARA M, NARENDJA F, OVESNA J, PAPAZOVA N, SCHOLTENS I, ZEL J. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. JRC technical report. Version 2. 2017. EUR29015 EN. 30 pages.

[4] TCVN 12613:2019 (ISO21570:2005 with admendment 1:2013), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định lượng axit nucleic.

[5] THOMPSON, M., and WOOD, R. Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in Analytical Chemistry Laboratories, J.Pure App. Chem., 1995, 67 (4): 649-666.

[6] ISO 21568:2005, Foodstuffs - Method of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling.

[7] TCVN 7608:2007, (ISO 24276:2007), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa.

[8] TCVN 9027:2011 (ISO 24333:2009), Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc - Lấy mẫu.

[9] TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016), Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Thuật ngữ và định nghĩa.

[10] Thông tư 14/2011/TT-BYT ngày 01/04/2011 - Hướng dẫn chung về lấy mẫu thực phẩm phục vụ thanh tra, kiểm tra chất lượng, vệ sinh an toàn thực phẩm.