Tiêu chuẩn TCVN 9667:2025 Thịt và sản phẩm thịt - Xác định hàm lượng axit L-(+)-glutamic - Phương pháp chuẩn

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9667:2025

ISO 4134:2021

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID L-(+)-GLUTAMIC - PHƯƠNG PHÁP CHUẨN

Meat and meat products - Determination of L-(+)-glutamic acid content - Reference method

Lời nói đầu

TCVN 9667:2025 thay thế TCVN 9667:2013;

TCVN 9667:2025 hoàn toàn tương đương với ISO 4134:2021;

TCVN 9667:2025 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID L-(+)-GLUTAMIC - PHƯƠNG PHÁP CHUẨN

Meat and meat products - Determination of L-(+)-glutamic acid content - Reference method

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng máy đo quang phổ và phương pháp sử dụng máy đọc khay vi thể hấp thụ ánh sáng để xác định hàm lượng acid L-(+)-glutamic tự do trong thịt và sản phẩm thịt.

Tiêu chuẩn này áp dụng cho thịt và sản phẩm thịt, bao gồm các sản phẩm thịt gia súc và gia cầm.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 7151 (ISO 648) Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Pipet một mức.

TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức.

TCVN 8135 (ISO 1442), Thịt và sản phẩm thịt - Xác định độ ẩm (Phương pháp chuẩn).

TCVN 10505-2 (ISO 8655-2), Dụng cụ đo thể tích có cơ cấu pittông - Phần 2: Pipet pittông.

3 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Acid L-(+)-glutamic tự do [free L-(+)-glutamic acid]

Acid L-(+)-glutamic và glutamat trong thịt và sản phẩm thịt ở dạng trạng thái tự do.

4 Nguyên tắc

Acid L-(+)-glutamic tự do có trong phần mẫu thử được chiết bằng dung dịch acid perchloric. Ly tâm dịch chiết, gạn, lọc, pha loãng bằng nước đến nồng độ thích hợp rồi chỉnh pH đến 10. Nicotinamide adenin dinucleotide (NAD) bị khử bằng acid L-(+)-glutamic khi có mặt glutamat dehydrogenase, xem Công thức (1). Nicotinamide adenin dinucleotide (NADH) tạo thành được cho phản ứng với iodonitrotetrazolium chloride với sự có mặt của diaphorase, xem Công thức (2). Đo phổ của formazane tạo thành ở bước sóng 490 nm và tính hàm lượng acid L-(+)-glutamic tự do của mẫu.

5 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 12386:2018 (CAC/GL 50-2004).

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Lấy đại diện ít nhất 200 g mẫu. Bảo quản mẫu ở 4 °C hoặc cấp đông ở -18 °C nếu chưa phân tích ngay, sao cho mẫu không bị suy giảm chất lượng và thay đổi thành phần.

6 Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hoá mẫu phòng thử nghiệm bằng thiết bị thích hợp (xem 7.2.1). Chú ý sao cho nhiệt độ của mẫu không tăng quá 25 °C. Nếu sử dụng máy xay thì xay mẫu ít nhất hai lần.

Cho đầy mẫu đã chuẩn bị vào vật chứa kín khí thích hợp. Nếu mẫu chưa phân tích ngay, đậy kín vật chứa và bảo quản ở nhiệt độ 4 °C hoặc cấp đông ở - 18 °C sao cho mẫu không bị suy giảm chất lượng và thay đổi thành phần. Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, và phải trong 24 h sau khi mẫu đồng nhất.

7 Phương pháp thử bằng máy đo quang phổ

7.1 Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước ít nhất có độ tinh khiết loại 2 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Ngoại trừ dung dịch của các hợp chất vô cơ (7.1.1 và 7.1.2), bảo quản tất cả các dung dịch trong chai thủy tinh màu nâu có nắp đậy đã được làm sạch kỹ và hấp hoặc khử trùng.

7.1.1 Acid perchloric loãng, c = 1,0 mol/lit.

CẢNH BÁO - Việc tiếp xúc với các vật liệu dễ oxy hóa hoặc dễ cháy hoặc các chất làm khô hoặc các chất khử có thể dẫn đến cháy hoặc nổ. Người sử dụng acid này cần hiểu rõ các mối nguy của các chất này. Xem lưu ý về thực hành an toàn nêu trong Phụ lục A.

Cho 8,6 ml acid perchloric, (70 g/100 g, ρ ₂₀ = 1,67 g/ml) vào nước, thêm nước đến 100 ml.

7.1.2 Dung dịch kali hydroxide, c = 4 mol/lit, 2 mol/lit, 0,5 mol/lit và 0,02 mol/lit.

Hòa tan 22,4 g kali hydroxide trong nước. Thêm nước đến 100 ml, sau khi nguội thì trộn đều, c = 4 mol/lit.

Hòa tan 11,2 g kali hydroxide trong nước. Thêm nước đến 100 ml, sau khi nguội thì trộn đều, c = 2 mol/lit.

Chuyển 2,5 ml dung dịch kali hydroxide 2 mol/lit vào bình định mức 10 ml, thêm nước đến vạch và trộn đều, c = 0,5 mol/lit.

Chuyển 0,1 ml dung dịch kali hydroxide 2 mol/lit vào bình định mức 10 ml, thêm nước đến vạch và trộn đều, c = 0,02 mol/lit.

7.1.3 Dung dịch R1, dung dịch đệm triethanolamin phosphat, pH = 8,6.

Hòa tan 1,86 g triethanolamin hydrochloride trong khoảng 25 ml nước và chỉnh pH đến 8,6 bằng dung dịch kali hydroxide 2 mol/lit (7.1.2), dùng máy đo pH. Bổ sung 0,68 g octylphenol decaethylenglycol ether (ví dụ: Triton X-100). Thêm nước đến 100 ml và trộn đều (dung dịch A).

Hòa tan 0,86 g dikali hydro phosphat (K ₂ HPO ₄ ) và 7 mg kali dihydro phosphat (KH ₂ PO ₄ ) trong nước (7.1.2). Thêm nước đến 100 ml và trộn đều (dung dịch B).

Trộn 20 ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B.

Dung dịch này bền đến 2 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 °C đến 6 °C.

7.1.4 Dung dịch R2, dung dịch hỗn hợp của NAD và diaphorase (lipoamide dehydrogenase EC ¹⁾ 1.8.1.4), ρ _NAD = 11 mg/ml, diaphorase, xấp xỉ 4 IU/ml.

Cân 110 mg NAD và xấp xỉ 8 mg (khoảng 40 IU) diaphorase cho vào bình có nắp đậy. Thêm 10,0 ml nước và trộn đều.

Dung dịch này có thể bền đến bốn tuần khi được bảo quản ở nơi tối ở nhiệt độ từ 0 °C đến 6 °C.

7.1.5 Dung dịch R3, Dung dịch iodonitrotetrazolium chloride (INT), 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride, ρ = 0,6 mg/ml.

Cân 6 mg dung dịch INT vào bình nhỏ, màu nâu, có nắp đậy. Thêm 10 ml nước và trộn đều kỹ.

Dung dịch này có thể bền đến bốn tuần khi được bảo quản ở nơi tối ở nhiệt độ từ 0 °C đến 6 °C.

7.1.6 Dung dịch R123, hỗn hợp của dung dịch R1, R2 và R3

Dùng pipet lấy 6 ml dung dịch R1, 2 ml dung dịch R2, và 2 ml dung dịch R3 vào lọ thủy tinh màu nâu, có nắp đậy và trộn đều trước khi thử nghiệm.

Dung dịch đã trộn này có thể bền đến 1 h khi đựng trong lọ thủy tinh, màu nâu, có nắp đậy, ở nhiệt độ phòng.

7.1.7 Dung dịch glutamat dehydrogenase (GLDH) (EC ¹⁾ 1.4.1.3), xấp xỉ 900 IU/ml.

Cân 10 mg (khoảng 900 IU) glutamat dehydrogenase (GLDH) dạng đông khô vào bình nhỏ có nắp đậy. Thêm 1 ml nước và trộn đều.

Khi bảo quản xa amoni sulfat, ethylen-dinitrilotetraaxetic (EDTA) và glutaminase thì dung dịch này có thể bền đến 12 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 °C đến 6 °C.

7.1.8 Dung dịch chuẩn gốc acid L-(+)-glutamic, ρ = 1 000 mg/lit.

Cân khoảng 50,0 mg acid L-(+)-glutamic (C ₅ H ₉ O ₄ N), chính xác đến 0,0001 g. Hoà tan trong khoảng 25 ml nước.

Chỉnh pH về 5 đến 6 bằng vài giọt dung dịch kali hydroxide 2 mol/lit (7.1.2). Sau đó chỉnh pH từ từ đến 7,0 bằng vài giọt dung dịch kali hydroxide 0,02 mol/lit (7.1.2). Thêm nước đến 50 ml và trộn đều.

Dung dịch này bền đến sáu tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 °C đến 6 °C.

7.1.9 Dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic, ρ = 100 mg/lit.

Dùng pipet lấy chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc acid L-(+)-glutamic (7.1.8) cho vào bình định mức 50 ml (7.2.8). Thêm nước đến vạch và trộn đều.

Dung dịch này được sử dụng ngay.

7.1.10 Dãy dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic, ρ = 5 mg/lit, 10 mg/lit, 15 mg/lit, 20 mg/lit, 30 mg/lit và 40 mg/lit.

Dùng pipet lấy chính xác 0,50 ml, 1,00 ml, 1,50 ml, 2,00 ml, 3,00 ml, và 4,00 ml dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic (7.1.9) cho vào sáu bình định mức 10 ml (7.2.8) riêng rẽ. Thêm nước đến vạch và trộn đều. Dung dịch này được sử dụng ngay.

7.2 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

7.2.1 Thiết bị đồng hóa bằng cơ hoặc bằng điện, có khả năng đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm.

Thiết bị này có máy cắt quay tốc độ cao hoặc máy nghiền được gắn với tấm đục lỗ với đường kính lỗ không quá 4,0 mm.

7.2.2 Bộ trộn phòng thử nghiệm, có bộ phận khuấy hoặc máy cơ cấu tạo dao động.

7.2.3 Máy ly tâm phòng thử nghiệm, có các ống ly tâm dung tích 50 ml hoặc 100 ml, hoạt động ở gia tốc hướng tâm khoảng 2000g hoặc tốc độ tương đương (ví dụ 3 500 r/min đến 4 000 r/min).

7.2.4 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,001 g, 0,000 1 g.

7.2.5 Tủ sấy, có khả năng duy trì nhiệt độ không đổi.

7.2.6 Máy đo pH.

7.2.7 Giấy lọc, có đường kính khoảng 15 cm, tốc độ lọc vừa hoặc nhanh.

7.2.8 Bình định mức một vạch, dung tích 10 ml, 50 ml và 100 ml, phù hợp với tiêu chuẩn loại B trong TCVN 7153 (ISO 1042).

7.2.9 Pipet một mức, dung tích 50 ml, 25 ml và 1 ml phù hợp với tiêu chuẩn loại B trong TCVN 7151 (ISO 648).

7.2.10 Pipet phân phối đơn kênh hoặc đa kênh và các đầu tip, dung tích 5 ml, 1 000 μl, 200 μl và 100 μl phù hợp với TCVN 10505-2 (ISO 8655-2).

7.2.11 Thìa nhỏ bằng chất dẻo hoặc nắp đậy, thìa để trộn đều kỹ lượng chứa trong cuvet, nắp để lắc cuvet.

7.2.12 Máy đo màu quang điện, được trang bị bộ lọc có hệ số truyền quang tối đa ở bước sóng 490 nm hoặc máy đo quang phổ.

7.2.13 Cuvet, có chiều dài đường quang 10 mm.

7.3 Cách tiến hành

7.3.1 Yêu cầu chung

Nếu cần kiểm tra yêu cầu về độ lặp lại thì tiến hành hai phép xác định riêng rẽ.

7.3.2 Phần mẫu thử

Cân khoảng 25 g mẫu thử (xem Điều 6) hoặc khối lượng thích hợp khác (m ₁ ), chính xác đến 0,001 g.

7.3.3 Chuẩn bị dịch chiết

7.3.3.1 Cho 50 ml acid perchloric loãng (7.1.1) vào mẫu thử và đồng hóa hỗn hợp bằng máy trộn phòng thử nghiệm (7.2.2).

7.3.3.2 Chuyển phần mẫu thử đã đồng nhất sang ống ly tâm (7.2.3). Ly tâm 10 min ở 10 °C, gia tốc hướng tâm khoảng 2 000g hoặc tương đương (ví dụ: 3 500 r/min đến 4 000 r/min). Cẩn thận gạn bỏ chất béo và thu phần dịch đã lọc qua giấy lọc gấp nếp (7.27) vào bình nón 100 ml. Loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu tiên.

7.3.3.3 Dùng pipet (7.2.9) lấy 25 ml dung dịch (chỉ sử dụng dung dịch hơi đục) cho vào ống y tâm (7.2.3). Chỉnh pH đến dải giá trị từ 7 đến 8 bằng dung dịch kali hydroxide (7.1.2) 4 mol/lit, sau đó chỉnh pH từ từ đến 10,0 bằng dung dịch kali hydroxide (7.1.2) 2 mol/lit và 0,5 mol/lit, phát hiện bằng máy đo pH (7.2.6). Ly tâm trong 3 min ở gia tốc hướng tâm khoảng 2 000g hoặc tốc độ tương đương (ví dụ: 3 500 r/min đến 4 000 r/min).

CHÚ THÍCH Nếu pH hơi cao hơn 10,0 thì có thể chỉnh về giá trị pH yêu cầu (7.1.1) bằng acid perchloric.

7.3.3.4 Chuyển tất cả huyền phù vào bình định mức 50 ml (7.2.8). Thêm nước đến vạch và trộn đều.

7.3.3.5 Làm nguội dung dịch 10 min trong đá lạnh và lọc qua giấy lọc (7.2.7). Loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu tiên.

7.3.3.6 Dùng pipet lấy 5 ml hoặc thể tích thích hợp (V ₁ ) khác của dịch lọc cho vào bình định mức 50 ml (7.2.8). Thêm nước đến vạch và trộn đều. Dung dịch thu được được dùng để xác định hàm lượng acid L-(+)-glutamic tự do trong phần mẫu thử.

Thể tích V ₁ phải được chọn sao cho hàm lượng acid L-(+)-glutamic của dung dịch từ 8 mg/lit đến 40 mg/lit.

7.3.4 Xác định

7.3.4.1 Chuẩn bị thiết bị phát hiện

Cài đặt máy đo quang phổ (7.2.12) và làm nóng sơ bộ theo yêu cầu kỹ thuật của thiết bị cho đến khi đạt được các điều kiện cân bằng. Cài đặt bước sóng detector đến 490 nm. Chỉnh đường nền của thiết bị về zero bằng nước tinh khiết.

7.3.4.2 Xác định độ hấp thụ acid L-(+)-glutamic trong dung dịch thử

7.3.4.2.1 Duy trì nhiệt độ của dung dịch R123 (7.1.6), nước và dung dịch thử acid L-(+)-glutamic (7.3.3.6) khoảng từ 20 °C đến 25 °C.

Dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch R123 (7.1.6) cho vào cuvet (7.2.13) và bổ sung 2,0 ml nước. Dung dịch thu được là dung dịch mẫu trắng.

Dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch R123 (7.1.6), 1,8 ml nước và 200 μl dung dịch thử acid L-(+)-glutamic (7.3.3.6) cho vào cuvet khác. Dung dịch thu được là dung dịch thử.

Trộn đều các dung dịch này bằng thìa hoặc lắc (7.2.11), đặt vào máy đo quang phổ và đọc độ hấp thụ A ₁ của dung dịch thử và A _{b 1} của dung dịch mẫu trắng ở bước sóng 490 nm so với nước.

7.3.4.2.2 Dùng pipet lấy 50 μl dung dịch GLDH (7.1.7) cho vào từng cuvet. Trộn đều lượng chứa trong cuvet (7.2.11).

Đọc độ hấp thụ A ₁ ' của dung dịch thử và A' _{b 1} của dung dịch mẫu trắng ở bước sóng 490 nm so với nước trong 10 min đến 15 min và ghi lại độ hấp thụ sau mỗi 2 min cho đến khi thu được độ hấp thụ ổn định. Kết quả thử là giá trị độ hấp thụ không đổi.

Tránh để dung dịch phản ứng phơi nhiễm với ánh sáng. Nhiệt độ của dung dịch phải được duy trì từ 20 °C đến 25 °C.

7.3.4.3 Xác định độ hấp thụ của dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic

Lặp lại các thao tác được mô tả trong 7.3.4.2.1 nhưng thay dung dịch thử acid L-(+)-glutamic (7.3.3.6) bằng dãy dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic (7.1.10). Đọc độ hấp thụ A _s1 của dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic và A _b2 của dung dịch mẫu trắng. Sau đó, lặp lại các thao tác được mô tả trong 7.3.4.2.2. Đọc độ hấp thụ A _{s 1} ' của dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic và A _b2 ' của dung dịch mẫu trắng.

CHÚ THÍCH Nếu 7.3.4.2 và 7.3.4.3 được tiến hành đồng thời thì bỏ qua phép xác định dung dịch mẫu trắng trong 7.3.4.3. Lấy trực tiếp giá trị A _{b 1} đối với A _b2 và A _{b 1} ' đối với A _{b 2} '.

7.3.4.4 Xác định độ ẩm của mẫu thử

Xác định độ ẩm của mẫu thử theo TCVN 8135 (ISO 1442).

7.4 Tính và biểu thị kết quả

7.4.1 Chênh lệch độ hấp thụ của dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic

Tính chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic bằng Công thức (3):

Trong đó:

7.4.2 Chênh lệch độ hấp thụ của dung dịch thử acid L-(+)-glutamic

Tính chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch thử acid L-(+)-glutamic bằng Công thức (4):

Trong đó:

7.4.3 Công thức hồi quy tuyến tính của đường chuẩn acid L-(+)-glutamic

Dựng đường chuẩn acid L-(+)-glutamic với nồng độ của dãy dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic (7.1.10) tương ứng trục toạ độ x và ΔA _s1 (7.4.1) tương ứng trục toạ độ y. Công thức hồi quy tuyến tính của đường chuẩn acid L-(+)-glutamic được nêu trong Công thức (5):

Trong đó

7.4.4 Nồng độ acid L-(+)-glutamic của dung dịch thử

Tính nồng độ acid L-(+)-glutamic trong dung dịch thử (7.3.3.6) bằng Công thức (6):

Trong đó

7.4.5 Hàm lượng acid L-(+)-glutamic của mẫu thử

Tính hàm lượng acid L-(+)-glutamic của mẫu thử bằng Công thức (7):

Trong đó:

Làm tròn kết quả chính xác đến 0,01 g/100 g.

7.5 Độ chụm

7.5.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bằng phép thử liên phòng thử nghiệm được thực hiện phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 15725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Các kết quả của các phép thử này đã được công bố (xem Tài liệu tham khảo [4]). Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các nền mẫu khác với các dải nồng độ và các nền mẫu đã nêu.

7.5.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm thu được trong các điều kiện lặp lại nên nhỏ hơn hoặc bằng giá trị 0,55 % của hàm lượng acid L-(+)-glutamic trong khoảng từ 0,159 2 g/100 g đến 0,305 0 g/100 g, với xác suất 95 % các trường hợp.

7.5.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm thu được trong các điều kiện tái lập nên nhỏ hơn hoặc bằng giá trị 0,82 % của hàm lượng acid L-(+)-glutamic trong khoảng từ 0,159 2 g/100 g đến 0,305 0 g/100 g, với xác suất 95 % các trường hợp.

7.6 Giới hạn phát hiện

Khi W _m (độ ẩm của mẫu thử trong 7.3.4.4) là 70 và V ₁ /50 (hệ số pha loãng của dịch lọc trong 7.3.3.6) là 1/15 thì giới hạn phát hiện hàm lượng acid L-(+)-glutamic là 0,02 g/100 g.

8 Phương pháp sử dụng máy đọc khay vi thể hấp thụ ánh sáng

8.1 Thuốc thử

Sử dụng thuốc thử giống như trong 7.1.

8.2 Thiết bị, dụng cụ

Ngoài các thiết bị nêu trong 7.2.1 đến 7.2.9, sử dụng các thiết bị, dụng cụ sau đây:

8.2.1 Pipet phân phối đơn kênh hoặc đa kênh và các đầu tip, dung tích 1 000 μl, 200 μl, 100 μl và 20 μl phù hợp với TCVN 10505-2 (ISO 8655-2).

8.2.2 Máy đọc khay vi thể hấp thụ ánh sáng, bước sóng 490 nm

8.2.3 Khay vi thể, 96 giếng (khuyến cáo), phẳng và trong suốt

8.2.4 Lọ nhỏ thủy tinh màu nâu, có nắp, dung tích không nhỏ hơn 1,5 ml.

8.3 Cách tiến hành

8.3.1 Yêu cầu chung

Nếu yêu cầu kiểm tra độ lặp lại thì tiến hành hai phép xác định đơn lẻ.

8.3.2 Chiết acid L-(+)-glutamic trong phần mẫu thử

Phương pháp chiết giống như trong 7.3.2 và 7.3.3.

8.3.3 Xác định

8.3.3.1 Chuẩn bị thiết bị phát hiện

Cài đặt máy đọc khay vi thể hấp thụ ánh sáng (8.2.2), làm nóng sơ bộ thiết bị theo yêu cầu kỹ thuật của thiết bị cho đến khi các điều kiện được cân bằng. Cài đặt các thông số phát hiện; bước sóng phát hiện 490 nm, chế độ đọc vi thể theo hàng và theo giếng, khoảng thời gian đọc xấp xỉ 0,5 s một giếng.

8.3.3.2 Xác định độ hấp thụ

8.3.3.2.1 Duy trì nhiệt độ của dung dịch R123 (7.1.6), nước, dãy dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic (7.1.10), dung dịch thử acid L-(+)-glutamic (8.3.2) từ 20 °C đến 25 °C.

Dùng pipet lấy 300 μl dung dịch R123 (7.1.6) và 600 μl nước cho vào lọ nhỏ thủy tinh màu nâu có nắp (8.2.4). Trộn đều dung dịch bằng cách lật ngược hoặc lắc chậm lọ. Dung dịch thu được là dung dịch mẫu trắng.

Dùng pipet lấy 300 μl dung dịch R123 (7.1.6) 540 μl nước và 60 μl dung dịch thử acid L-(+)-glutamic (8.3.2) cho vào lọ nhỏ thủy tinh màu nâu có nắp (8.2.4). Trộn đều dung dịch bằng cách lật ngược hoặc lắc chậm lọ. Dung dịch thu được là dung dịch thử.

Dùng pipet lấy 300 μl dung dịch R123 (7.1.6) 540 μl nước và 60 μl dãy dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic (7.1.10) cho vào lọ nhỏ thủy tinh màu nâu có nắp (8.2.4). Trộn đều dung dịch bằng cách lật ngược hoặc lắc chậm lọ. Dung dịch thu được là dung dịch chuẩn.

8.3.3.2.2 Dùng pipet lấy 200 μl dung dịch mẫu trắng, dung dịch chuẩn và dung dịch thử (8.3.3.2.1) vào các giếng khác nhau của cùng một khay vi thể (8.2.3).

Đặt micropipet vào máy đọc khay vi thể vi thể hấp thụ ánh sáng và lắc 5 s đến 10 s. Đọc độ hấp thụ A _b3 của dung dịch mẫu trắng, A _{s 2} của dãy dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic và A ₂ của dung dịch thử axit L-(+)-glutamic ở bước sóng 490 nm.

8.3.3.2.3 Dùng pipet lấy 10 μl dung dịch GLDH (7.1.7) cho vào từng lọ nhỏ thủy tinh màu nâu trong 8.3.3.2.1. Trộn đều dung dịch bằng cách lật ngược hoặc lắc chậm lọ.

Lấy khay vi thể ra và dùng pipet lấy 200 μl dung dịch từ từng lọ nhỏ màu nâu cho vào các giếng khác nhau. Mỗi lọ nên được xác định ba lần và kết quả là trung bình cộng của ba lần xác định.

Đặt micropipet vào máy đọc khay vi thể hấp thụ ánh sáng và lắc 5 s đến 10 s. Đọc độ hấp thụ A _b3 ' của dung dịch mẫu trắng, A _s2 ' của dãy dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic và A ₂ ' của dung dịch thử acid L-(+)-glutamic ở bước sóng 490 nm sau khi chờ 10 min đến 15 min và duy trì đọc độ hấp thụ 2 min mỗi lần cho đến khi thu được độ hấp thụ không đổi. Kết quả thử là giá trị độ hấp thụ không đổi. Nếu tiến hành ba phép xác định thi kết quả là trung bình cộng của ba giá trị độ hấp thụ không đổi.

Trộn đều bằng pipet hoặc trộn đều từ từ để tránh tạo bọt. Tránh để dung dịch phơi nhiễm với ánh sáng. Nhiệt độ của dung dịch phải được duy trì ở 20 °C đến 25 °C.

8.3.3.3 Xác định độ ẩm của mẫu thử

Phương pháp xác định độ ẩm của mẫu thử giống như 7.3.4.4.

8.4 Tính và biểu thị kết quả

8.4.1 Chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic

Tính chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic bằng cách sử dụng Công thức (8):

Trong đó

8.4.2 Chênh lệch độ hấp thụ đối với dung dịch thử acid L-(+)-glutamic

Tính chênh lệch độ hấp thụ dung dịch thử acid L-(+)-glutamic bằng Công thức (9):

Trong đó

8.4.3 Công thức hồi quy tuyến tính đối với đường chuẩn acid L-(+)-glutamic

Dựng đường chuẩn acid L-(+)-glutamic với nồng độ của dãy dung dịch chuẩn acid L-(+)-glutamic (7.1.10) tương ứng trục toạ độ x và ΔA _s2 tương ứng với trục toạ độ y. Công thức hồi quy tuyến tính của đường chuẩn acid L-(+)-glutamic được nêu trong Công thức (10):

Trong đó

8.4.4 Nồng độ acid L-(+)-glutamic của dung dịch thử

Tính nồng độ acid L-(+)-glutamic trong dung dịch thử (8.3.2) bằng Công thức (11):

Trong đó

8.4.5 Hàm lượng acid L-(+)-glutamic của mẫu thử

Tính hàm lượng acid L-(+)-glutamic của mẫu thử bằng Công thức (12):

Trong đó:

Làm tròn kết quả chính xác đến 0,01 g/100 g.

8.5 Độ chụm

8.5.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bằng phép thử liên phòng thử nghiệm được thực hiện phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Các kết quả của các phép thử này đã được công bố (xem Tài liệu tham khảo [4]). Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các nền mẫu khác với các dải nồng độ và các nền mẫu đã nêu.

8.5.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm thu được trong các điều kiện lặp lại nên nhỏ hơn hoặc bằng giá trị 0,43 % của hàm lượng acid L-(+)-glutamic trong khoảng từ 0,157 7 g/100 g đến 0,298 7 g/100 g, với xác suất 95 % các trường hợp.

8.5.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm thu được trong các điều kiện tái lập nên nhỏ hơn hoặc bằng giá trị 1,10 % của hàm lượng acid L-(+)-glutamic trong khoảng từ 0,157 7 g/100 g đến 0,298 7 g/100 g, với xác suất 95 % các trường hợp.

8.6 Giới hạn phát hiện

Khi w _m (độ ẩm của mẫu thử trong 8.3.3.3) là 70 và V ₁ /50 (hệ số pha loãng của dịch lọc trong 7.3.3.6) là 1/15 thì giới hạn phát hiện của hàm lượng acid L-(+)-glutamic là 0,02 g/100 g.

9 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mẫu thử;

- tiêu chuẩn đã sử dụng (bao gồm cả năm công bố);

- mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

- kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu hai kết quả thu được;

- mọi độ chệch do cách tiến hành;

- mọi tình huống bất thường nào quan sát được;

- ngày thử nghiệm.

 

Phụ lục A

(tham khảo)

Lưu ý về thực hành an toàn

Khi xử lý acid perchloric (HClO ₄ ) phải lưu ý về thực hành an toàn như sau:

a) Loại bỏ ngay HClO ₄ bị tràn ra và rửa kỹ bằng nhiều nước.

b) Tủ hút, ống dẫn và các thiết bị khác để loại bỏ hơi HClO ₄ phải được làm bằng vật liệu trơ hoá học và được thiết kế sao cho có thể rửa kỹ bằng nước. Các hệ thống khí thải phải được xả vào nơi an toàn và quạt phải dễ làm sạch.

c) Tránh sử dụng các hóa chất hữu cơ trong tủ hút hoặc thiết bị loại bỏ khỏi được dùng để phân hủy HClO ₄ .

d) Sử dụng kính bảo hộ, tấm chắn và các thiết bị khác cần thiết để bảo vệ cá nhân. Dùng găng tay bằng polyvinyl chloride, không sử dụng găng tay bằng cao su.

e) Trong trường hợp đốt cháy mẫu ẩm bằng HClO ₄ , đầu tiên xử lý mẫu bằng acid nitric để phá hủy dễ dàng chất hữu cơ có thể oxi hóa, trừ khi có các quy định khác. Không làm bay hơi đến khô.

f) Việc tiếp xúc HClO ₄ với các thuốc thử dạng khan mạnh như phospho pentoxit hoặc acid sulfuric đậm đặc có thể hình thành HClO ₄ khan có phản ứng mạnh với chất hữu cơ và các chất khử. Với các thuốc thử như vậy, đặc biệt thực hành cẩn thận khi tiến hành phân tích có sử dụng HClO ₄ . Các chất này cực kỳ nhạy có thể gây sốc và bỏng khi nồng độ 72 % (tính theo khối lượng).

CHÚ THÍCH: Lấy từ Tài liệu tham khảo [5].

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[2] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[3] TCVN 12386:2018 (CAC/GL 50-2004), Thực phẩm - Hướng dẫn chung về lấy mẫu

[4] ISO /TC 34/SC 6A/WG 25 report, Accuracy (trueness and precision) of the ISO/AWI 4134 testing methods

[5] AOAC Official methods of analysis. Laboratory safety, Apendix B. 1995, p.3