Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-50:2020 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-50:2020

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 50: BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 50: Japanese encephalitis

Lời nói đầu

TCVN 8400-50 : 2020 do Chi cục Thú y vùng II - Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y thế giới (OIE) và các bài báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần:

- TCVN 8400-1 : 2019, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4 : 2010, phấn 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

- TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11 : 2019, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13 ; 2019, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15 : 2019, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

- TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Coronavirus;

- TCVN 8400-39 : 2016: phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40 : 2016: phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra.

- TCVN 8400-41 : 2019: phần 41: Bệnh dịch tả lợn Châu Phi.

- TCVN 8400-42 : 2019: phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

- TCVN 8400-43 : 2019: phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44 : 2019: phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45 : 2019: phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46 : 2019: phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47 : 2019: phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

- TCVN 8400-48 : 2020: phần 48: Bệnh tiêu chảy có màng nhày do vi rút ở bò;

- TCVN 8400-49 : 2020: phần 49: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-50 : 2020: phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản;

- TCVN 8400-51 : 2020: phần 51: Bệnh viêm phổi, màng phổi truyền nhiễm ở bò;

 

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 50: BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 50: Japanese encephalitis

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh viêm não Nhật Bản do vi rút Flavivirus gây ra ở động vật.

2 Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8402 : 2010. Bệnh động vật - Quy trình mổ khám.

3 Giải thích từ ngữ và từ viết tắt

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các từ ngữ và từ viết tắt sau:

3.1

Bệnh viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis):

Bệnh gây ra bởi muỗi mang vi rút viêm não Nhật Bản. Muỗi đóng vai trò là vector truyền và phát tán mầm bệnh thông qua việc hút máu của vật chủ mang mầm bệnh và truyền cho vật chủ khác.

3.2

Vi rút viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis virus):

Là vi rút thuộc chi Flavivirus, họ Flaviridae. Vi rút viêm não Nhật Bản có vỏ bọc với hệ gen ARN mạch đôi, mã hóa cho 10 protein bao gồm 3 protein cấu trúc (C, prM và E) và 7 protein không cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5). Vi rút được chia thành 5 genotype từ I - V dựa theo trình tự gen của protein prM và E. Genotype I và genotype III được lưu hành phổ biến tại các nước Châu Á.

3.3  Từ viết tắt

- ARN (Acid ribonucleic): axit ribonucleic;

- CPE (Cytopathic effect): bệnh tích tế bào;

- Ct (Threshold cycle): chu kỳ ngưỡng;

- DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium): môi trường DMEM dùng cho nuôi cấy tế bào;

- DPBS (Phosphate buffered gelatin saline): dung dịch muối đệm phốt phát-gelatin;

- ELISA (Enzyme -Linked Immunosorbent Assay): phản ứng miễn dịch liên kết enzyme;

- FCS (Fetal calf serum): huyết thanh thai bê;

- HA (Hemagglutination): ngưng kết hồng cầu;

- HI (Hemagglutination Inhibition): ức chế ngưng kết hồng cầu.

- JEV (Japanese encephalitis virus): vi rút viêm não Nhật Bản;

- PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phốt phát;

- PFU (Plaques forming units): Đơn vị hình hành đám hoại tử;

- PRNT (Plaque reduction neutralization test): phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử;

- Realtime RT-PCR (Realtime Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction): phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược thời gian thực;

- VPA (Viral plaque assay): phản ứng đám hoại tử do vi rút;

4 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1  Ethanol, từ 70 % đến 100 % (v/v).

4.2  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,4 ± 0,2

4.3  Kit tách chiết ARN

4.4  Kit nhân gen cho phản ứng RT-PCR và realtime RT-PCR

4.5  Mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò (xem C.1, Phụ lục C và D.1, phụ lục D)

4.6  Mẫu chuẩn dương, được chứng nhận là dương tính, hoặc ARN chuẩn dương tách chiết từ vi rút JEV có giá trị Ct đã biết trước

4.7  Nước tinh khiết, không có Rnase và Dnase

4.8  Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic)

4.9  Bột agarose

4.10  Dung dịch đệm TAE 1X (Tris-acetate-EDTA) hoặc TBE 1X (Tris-Borate-EDTA).

4.11  Chất nhuộm màu ADN. Ví dụ như Gel red hoặc SYBR safe[1].

4.12  Thang đo ADN chuẩn (Ladder / Marker), độ phân dải 100 bp

4.13  Đệm tải mẫu (loading dye)

4.14  Kít ELISA

4.15  Nước cất khử ion

4.16  Tế bào Vero, C3/36

4.17  Vi rút JEV chuẩn, chủng KV 1899 hoặc Nakayama

4.18  Môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

4.19 Môi trường α-MEM (Alpha Minimun Essential Medium)

4.20 Huyết thanh thai bê

4.21  Dung dịch trypan blue, 0.4 %

4.22  Dung dịch kháng sinh Peniciline/Streptomycine

4.23  DPBS, không có canxi và magie

4.24  Nước sinh lý (NaCl), 0,85 % (w/v)

4.25  Kaolin

4.26  Kháng thể kháng vi rút JEV chuẩn, có hiệu giá kháng thể đã biết

5 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C

5.2  Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C

5.3  Buồng cấy an toàn sinh học cấp II, III

5.4  Máy lắc trộn (votex), có thể hoạt động với tốc độ từ 200 rpm đến 2.500 rpm.

5.5  Máy đồng nhất mẫu hoặc cối chày sứ, sạch và vô trùng.

5.6  Panh và kéo, sạch và vô trùng.

5.7  Nồi hấp, có thể duy trì ở nhiệt độ 120 °C

5.8  Tủ ấm có chứa 5 % CO₂, duy trì được ở 28 °C, 37 °C.

5.9  Tủ ấm, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 °C

5.10  Ống nghiệm chịu nhiệt, 2 ml, 5 ml, 15 ml, 50 ml, sạch và vô trùng

5.11  Ống nghiệm, có chứa chất chống đông máu

5.12  Xy lanh và kim tiêm loại 22 G, 16 G, sạch và vô trùng

5.13  Dụng cụ bắt muỗi (vợt muỗi, bẫy ánh sáng)

5.14  Máy realtime PCR và PCR.

5.15 Máy ly tâm, có thể đạt tốc độ tối đa 15.000 rpm.

5.16  Hệ thống điện di (bể điện di, khay đổ thạch, lược và máy chụp gel)

5.17  Máy ly tâm lắng (spin down)

5.18  Ống PCR, 0,2 ml, không có ARNse và DNase

5.19  Ống eppendorf, không có ARNse và DNase

5.20  Kính hiển vi đảo ngược

5.21  Chai nuôi tế bào, có tiết diện 25 cm², 75 cm².

5.22  Đĩa nuôi tế bào 24 giếng.

5.23  Màng lọc, có kích thước lỗ là 0,2 μm và 0,45 μm

5.24  Buồng đếm hồng cầu

5.25  Bể điều nhiệt, duy trì nhiệt độ ở 37 °C, 42 °C, 56 °C

5.26  Lò vi sóng

5.27  Máy đọc ELISA, có thể đọc ở dải bước sóng từ 200 nm đến 9999 nm.

5.28  Máy lắc đĩa 96 giếng

5.29  Bình tam giác, 100 ml, 250 ml, 500 ml, sạch và vô trùng

5.30  Đĩa 96 giếng, đáy chữ U

5.31  Khay lạnh, chứa đá CO₂ hoặc đá lạnh nghiền nhỏ

6 Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Đặc điểm dịch tễ

Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền lây giữa người và động vật thông qua muỗi mang vi rút gây bệnh. Những loài muỗi có thể mang vi rút truyền bệnh bao gồm: Culex ritaeniorhynchus, Culex vishnui, Culex orientalis, Culex pipiens, Culex annulirostris và Anopheles spp. Muỗi mang mầm bệnh có thể truyền vi rút sang thế hệ sau qua trứng.

Các loài động vật như lợn, ngựa, trâu, bò, dê, cừu và một số động vật hoang dã như bồ câu, chim hoang dã, dơi có thể bị nhiễm vi rút viêm não Nhật Bản, nhưng hiếm khi biểu hiện triệu chứng lâm sàng trừ một số loài động vật như lợn, ngựa, hoặc trâu, bò.

Lợn là vật chủ quan trọng cho vi rút nhân lên, chim cũng có thể liên quan đến sự nhân lên và lan truyền vi rút thông qua muỗi hút máu.

Bệnh viêm não Nhật Bản xuất hiện và lây lan ở các nước Đông Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, các nước Đông Nam Á và Nam Á. Gần đây, bệnh đã lây sang vùng Tây Thái Bình Dương bao gồm các quần đảo phía đông Indonesia, Papua New Guinea và Miền bắc nước Úc.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

6.2.1  Bệnh viêm não Nhật Bản ở lợn.

Lợn nái mang thai có thể không biểu hiện triệu chứng lâm sàng, nhưng khi bị nhiễm vi rút gây rối loạn sinh sản như đẻ non, sảy thai, thai gỗ. Lợn con sinh ra yếu ớt, có biểu hiện triệu chứng thần kinh.

6.2.2  Bệnh viêm não Nhật Bản ở ngựa.

Ngựa khi bị bệnh có biểu hiện sốt, bỏ ăn, thể trạng yếu, rối loạn vận động và thị giác, sợ ánh sáng, liệt cục bộ hoặc toàn thân, sau đó rơi vào trạng thái hôn mê và chết.

6.2.3  Bệnh viêm não Nhật Bản ở các loài động vật khác.

Các loài động vật khác như dê, cừu và một số động vật khác như: chim hoang dã, bồ câu, dơi có thể mẫn cảm với vi rút, nhưng ở dạng mang trùng và không biểu hiện triệu chứng lâm sàng.

6.2.4  Bệnh viêm não Nhật Bản ở trâu, bò

Trâu, bò khi bị bệnh có biểu hiện sốt, bỏ ăn, sùi bọt mép, nghiến răng, đi vòng tròn, rối loạn vận động và nằm một chỗ.

6.3  Bệnh tích đại thể

- Ở lợn: Lợn con sinh ra bị úng não thủy, phù dưới da, xoang bụng và xoang ngực tích nước, xuất hiện những điểm hoại tử ở gan và lách, màng não tủy xung huyết.

- Ở ngựa: Não bị viêm, màng não tủy xung huyết, xuất huyết đinh ghim trên mặt cắt của não.

- Ở trâu, bò: viêm phổi thùy, phổi khí thũng, dạ múi khế bị loét, viêm kẽ thận. Bệnh tích có thể trầm trọng hơn do nhiễm trùng kế phát.

CHÚ THÍCH: Tất cả các mẫu phải được dán nhãn, ghi kí mã hiệu và gửi kèm theo Phiếu gửi mẫu bệnh phẩm và các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của ca bệnh.

7.1.3  Chuẩn bị mẫu

7.1.3.1  Mẫu mô: lấy khoảng 1 g mẫu, loại bỏ các mô mỡ và các tổ chức liên kết. Mẫu được cắt thành những miếng nhỏ, nghiền bệnh phẩm bằng máy đồng nhất hoặc cối chày sứ vô trùng (5.5) với 10 ml dung dịch PBS (xem A.1, Phụ lục A) thành hỗn dịch 10 %.

7.1.3.2  Mẫu dịch não tủy: lắc kỹ ống đựng mẫu bằng máy lắc trộn (5.4).

7.1.3.3  Mẫu huyết thanh: ủ mẫu máu (7.1.1.2.1) ở nhiệt độ 37 °C/2 h - 3 h, hoặc để qua đêm trong tủ lạnh (5.2). Ly tâm (5.15) ở tốc độ 2.500 rpm/ 15 min để tách huyết thanh. Chắt lấy huyết thanh và cho vào ống nghiệm 5 ml (5.10). Huyết thanh được bảo quản trong tủ lạnh (5.2) để chờ xét nghiệm.

7.1.3.4. Mẫu máu chống đông: cho thêm môi trường α-MEM (4.19) vào máu chống đông (7.1.1.2.2) thành hỗn dịch 10 %, ly tâm với tốc độ 2.500 rpm/ 10 min. Lấy dung dịch nước trong để làm xét nghiệm.

CHÚ THÍCH:

1) Đối với mục đích nghiên cứu và giám sát sự lưu hành vi rút trên vật chủ trung gian truyền bệnh, tiến hành lấy mẫu muỗi tại chuồng nuôi, hoặc vùng có nguy cơ cao. Sử dụng các dụng cụ (5.13) để bẫy và bắt muỗi trong khoảng 48 h. Muỗi được bảo quản ở nhiệt độ 2 °C - 8 °C về phòng thí nghiệm trong vòng 24 h để xác định loài muỗi.

2) Những loài muỗi có thể mang vi rút (xem 6.1) được thu gom vào trong ống nghiệm (5.10). Mỗi ống từ 50 con - 100 con. Mẫu được đồng nhất với 500 μl α-MEM (4.19) bằng máy lắc trộn, ly tâm với tốc độ 2.500 rpm/10 min. Lấy dung dịch nước trong để làm xét nghiệm.

7.2  Phát hiện vi rút JEV

7.2.1  Phát hiện vi rút JEV bằng phương pháp realtime RT-PCR

7.2.1.1  Tách chiết ARN

- Hỗn dịch (7.1.3.1), mẫu dịch não tủy (7.1.3.2) hoặc hỗn dịch tế bào nuôi cấy vi rút (xem 7.2.3) được dùng để tách chiết ARN. Quy trình chiết tách theo hướng dẫn của kít sử dụng (tham khảo Phụ lục B). Mẫu ARN thu được dùng cho phản ứng realtime RT-PCR.

7.2.1.2  Chuẩn bị mồi và mẫu dò

Trình tự cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho vi rút viêm não Nhật Bản (xem Bảng C.1, Phụ lục C). Cách chuẩn bị mồi và mẫu dò như sau:

7 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

7.1.1  Lấy mẫu

7.1.1.1  Động vật chết

7.1.1.1.1  Mẫu mô

- Đối với động vật mới chết nghi mắc bệnh: Thực hiện mổ khám động vật theo TCVN 8402 : 2010

- Lấy các mẫu mô bao gồm: mô não của động vật nghi mắc bệnh, gan, lách, nhau thai của thai bị sảy. Dùng panh, kéo (5.6) lấy mỗi mô từ 10 g đến 20 g mẫu, cho vào các ống nghiệm 50 ml (5.10) riêng biệt, đóng nắp, ghi thông tin và ký mã hiệu mẫu.

7.1.1.1.2  Mẫu dịch não tủy

- Bẻ và giữ đầu động vật vuông góc với chiều dài của cổ, dùng kéo cắt sạch lông ở vùng não chẩm (vùng giữa đốt atlas và xương sọ), sát trùng bằng bông cồn 70°. Dùng xy lanh 10 ml với kim tiêm 16 G (5.12), đâm kim tại vùng não chẩm theo hướng song song với chiều dài của đầu. Hút lấy từ 1 ml đến 2 ml dịch não tủy cho vào ống nghiệm vô trùng (5.10)

7.1.1.2  Động vật sống

7.1.1.2.1  Mẫu huyết thanh: sát trùng bằng bông cồn 70°, dùng xy lanh với kim tiêm 22G (5.12) lấy khoảng 05 ml máu từ tĩnh mạch của động vật, rút pit tông tạo khoảng trống, ghi ký hiệu mẫu trên thành ống xy lanh rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng chiếu trực tiếp.

7.1.1.2.2  Mẫu máu chống đông:

Sát trùng bằng bông cồn 70°, dung xy lanh 10 ml (5.12) lấy khoảng 5 ml máu và cho vào ống nghiệm có chất chống đông EDTA (5.11).

7.1.1.2.3  Mẫu dịch não tủy

- Cách tiến hành như điều 7.1.1.1.2. Tuy nhiên, trước khi lấy mẫu, cần cố định động vật và tránh làm tổn thương não và tủy sống của động vật.

7.1.2  Bảo quản mẫu

Mẫu phải được bao gói, bảo quản trong thùng bảo ôn ở nhiệt độ 5 °C ± 3 °C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 h sau khi lấy mẫu.

- Chuẩn bị mồi, mẫu dò gốc: mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh (5.15) ở tốc độ 8000 rpm trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE (4.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm mồi gốc và mẫu dò gốc.

- Chuẩn bị mồi, mẫu dò làm việc:

+ Mồi làm việc được dùng ở nồng độ 20 μM: lấy 20 μl mồi gốc pha với 80 μl nước tinh khiết (4.7).

+ Mẫu dò được dùng ở nồng độ 6 μM: lấy 6 μl mẫu dò gốc pha với 94 μl  nước tinh khiết (4.7).

7.2.1.3 Thực hiện phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã chuẩn bị (7.2.1.2) và pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) theo hướng dẫn của bộ kit (tham khảo Bảng C.2, Phụ lục C)

- Hỗn hợp nhân gen: cho 20 μl vào mỗi ống PCR 0,2 ml (5.18);

- Mẫu đối chứng dương chuẩn (4.6): cho 5 μl mẫu ARN vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu đối chứng âm: cho 5 μl nước tinh khiết (4.7) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu xét nghiệm: cho 5 μl ARN vừa tách chiết (7.2.1.1) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Trộn đều và ly tâm lắng (5.17), đặt ống PCR vào máy realtime PCR (5.14);

- Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt được cài đặt (xem Bảng C.3, Phụ lục C).

CHÚ THÍCH:

1) Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

2) Để tiết kiệm chi phí xét nghiệm, sử dụng cặp mồi, mẫu dò phát hiện gen NS2A (tất cả các genotype) của vi rút JEV trước, nếu âm tính thì kết luận âm tính. Trường hợp dương tính, tiến hành xác định genotype bằng các cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu tương ứng.

7.2.1.4  Đánh giá kết quả

Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct ≤ 30 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính;

2) Mẫu không có giá trị Ct là âm tính;

3) Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại, hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác để khẳng định. Nếu vẫn còn nghi ngờ, cần lấy mẫu lại để xét nghiệm kết hợp với điều tra dịch tễ học để đưa ra kết luận cuối cùng.

7.2.2 Phát hiện vi rút JEV bằng phương pháp RT-PCR

7.2.2.1  Tách chiết ARN

Thực hiện theo điều 7.2.1.1

7.2.2.2  Thực hiện phản ứng RT-PCR

Phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút JEV trên cơ sở phát hiện gen E (phát hiện tất cả các genotype) và xác định các genotype I (G I) và genotype III (G III), các bước được thực hiện như sau:

Chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM với nước tinh khiết (4.7): thực hiện theo điều 7.2.1.2.

Trình tự mồi phát hiện các gen đặc hiệu của vi rút JEV (xem Bảng D.1, Phụ lục D). Pha hỗn hợp phản ứng RT-PCR theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng (xem Bảng D.2, phục lục D).

- Hỗn hợp nhân gen: cho 20 μl vào mỗi ống PCR 0,2 ml (5.18);

- Mẫu đối chứng dương chuẩn (4.6): cho 5 μl mẫu ARN vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu đối chứng âm: cho 5 μl nước tinh khiết (4.7) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu xét nghiệm: cho 5 μl ARN vừa tách chiết (7.2.1.1) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Trộn đều và ly tâm lắng (5.17), đặt ống PCR vào máy PCR (5.14);

- Chạy phản ứng RT-PCR theo chu trình nhiệt cài đặt (xem Bảng D.3, Phụ lục D). Sản phẩm thu được sau phản ứng RT-PCR đem điện di (5.16) để đọc kết quả.

CHÚ THÍCH:

1) Mẫu đối chứng dương và đối chứng âm phải được tiến hành cùng với mẫu xét nghiệm.

2) Nhiệt độ và thời gian của phản ứng PCR có thể thay đổi tùy theo kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

7.2.2.3 Điện di

7.2.2.3.1 Chuẩn bị thạch (gel) điện di

Pha 1,5 g bột agarose (4.9) với 100 ml dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X (xem 4.10) vào chai thủy tinh 250 ml, rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 °C), cho chất nhuộm màu ADN (4.11) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó đổ thạch vào khay đã cắm lược (5.16), để thạch đông lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra khỏi bản thạch.

7.2.2.3.2  Tiến hành điện di

- Chuyển bản thạch vào bể điện di, đổ dung dịch TAE 1X hoặc TBE 1X (cùng loại với dung dịch sử dụng để pha agarose) vào bể điện di cho đến khi ngập bản thạch.

- Cho 2 μl thang đo ADN chuẩn (4.12) vào giếng đầu tiên. Cho 10 μl sản phẩm PCR của mẫu, đối chứng âm và đối chứng dương vào các giếng còn lại.

- Điện di ở hiệu điện thế từ 90 V đến 100 V trong 30 min - 40 min.

- Sau khi điện di xong, đặt gel đã điện di vào máy đọc gel (5.16) để phân tích kết quả.

CHÚ THÍCH: đối với hỗn hợp phản ứng RT-PCR mà chưa có thành phần đệm tải mẫu, cần bổ sung dung dịch đệm tại mẫu vào sản phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất trước khi tiến hành điện di.

7.2.2.4  Đánh giá kết quả

- Mẫu dương tính: hiển thị vạch sản phẩm có kích thước giống với đối chứng dương (xem Bảng D1, Phụ lục D).

- Mẫu âm tính: không có vạch sản phẩm, hoặc có hiển thị vạch sản phẩm nhưng có kích thước khác với đối chứng dương.

- Mẫu nghi ngờ: hiển thị vạch sản phẩm không rõ, hoặc xuất hiện nhiều hơn 01 vạch sản phẩm so với đối chứng dương. Những mẫu nghi ngờ cần phải xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp khác để khẳng định.

Điều kiện của phản ứng:

Phản ứng RT-PCR chỉ có giá trị khi đáp ứng các yêu cầu sau:

- Đối chứng dương: dương tính với sản phẩm điện di có kích thước đã biết (xem Bảng D1, Phụ lục D).

- Đối chứng âm: âm tính và không có sản phẩm điện di.

7.2.3 Phát hiện vi rút JEV bằng phương pháp phân lập vi rút trên môi trường tế bào

7.2.3.1  Cách tiến hành

Vi rút viêm não Nhật Bản có thể được nuôi cấy trên các môi trường tế bào khác nhau như: tế bào Vero, C6/36, BHK-21. Quy trình thực hiện phân lập vi rút trên môi trường tế bào cơ bản là giống nhau.

Bước 1: chuẩn bị tế bào Vero (4.15) trong chai nuôi tế bào có tiết diện 25 cm² (5.21)

- Giải đông tế bào Vero trong bể điều nhiệt ở 37 °C (5.25).

- Chuyển hỗn hợp tế bào vào ống nghiệm 15 ml (5.10) chứa sẵn 10 ml môi trường DMEM đã bổ sung 10 % FCS (xem A.4, Phụ lục A)

- Trộn đều bằng pipet và ly tâm ở tốc độ 1.000 rpm trong 5 min ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên.

- Bổ sung 5 ml môi trường DMEM đã có 10 % FCS, trộn đều bằng pipet.

- Hút chuyển tế bào Vero vào chai nuôi tế bào 25 cm² và nuôi trong tủ ấm (5.8).

Quan sát sự phát triển của tế bào hàng ngày dưới kính hiển vi đảo ngược (5.20). Sau từ 3 ngày đến 4 ngày thay môi trường một lần. Khi tế bào bao phủ ≥ 80 % thì dùng cho phân lập vi rút.

CHÚ THÍCH:

1) Tế bào Vero hồi phục rất chậm sau giải đông, có thể phải cấy chuyển từ 2 đến 3 lần để tế bào đạt được sự phát triển bình thường.

2) Khi phân lập vi rút trên tế bào C3/36, phải ủ ở nhiệt độ 28 °C trong tủ ấm có 5 % CO₂

3) Trong quá trình chuẩn bị tế bào, phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối, tránh sự tạp nhiễm từ môi trường vào tế bào.

Bước 2: gây nhiễm hỗn dịch bệnh phẩm trên môi trường tế bào

- Loại bỏ môi trường DMEM. Rửa bề mặt tế bào bằng dung dịch PBS để loại bỏ FCS.

- Hút 200 μl hỗn dịch mẫu đã được chuẩn bị (7.1.3.1, 7.1.3.2, 7.1.3.4) vào chai tế bào 1 lớp 25 cm² đã được chuẩn bị tại bước 1.

- Ủ 37 °C ở tủ ấm (5.8) trong 1 h, cứ 15 min lắc nhẹ 1 lần.

- Bổ sung 5 ml môi trường DMEM có 1 % kháng sinh. Ủ 37 °C trong tủ ấm (5.8).

- Kiểm tra bệnh tích tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi đảo ngược (5.20).

- Từ ngày thứ 4 trở đi, cứ 2 ngày lại thay môi trường DMEM có bổ sung 1 % kháng sinh.

7.2.3.2  Đánh giá kết quả:

- Khi quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược (5.19) thấy xuất hiện khoảng 75 % bệnh tích tế bào: tế bào bị tách khỏi chai nuôi cấy, tế bào có dạng tròn to, hoặc bị co lại, chụm lại tạo thành những cụm.

- Tiến hành thu hoạch hết hỗn dịch trong chai nuôi tế bào vào ống nghiệm 50 ml (5.10), giữ trong tủ lạnh âm sâu 80 °C (5.1). Ghi thông tin về mẫu trên thành ống bao gồm: dòng tế bào, ngày thu, lịch sử cấy chuyển, tên thử nghiệm viên.

- Xác định vi rút bằng phương pháp realtime RT-PCR (7.2.1) hoặc phương pháp RT-PCR (7.2.2).

+ Nếu kết quả dương tính thì kết luận mẫu có vi rút JEV trong mẫu.

+ Nếu kết quả âm tính, tiến hành phân lập lần 2.

CHÚ THÍCH: Đối với những mẫu không quan sát thấy bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy, dùng trypsine để phân tách tế bào, tạo dung dịch cho lần cấy tiếp theo. Mẫu được coi là âm tính khi không có bệnh tích tế bào trong 4 lần cấy chuyển liên tục.

7.3 Chẩn đoán bằng phương pháp huyết thanh học

7.3.1  Phát hiện kháng thể JEV bằng phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT)

7.3.1.1  Cách tiến hành

Thực hiện theo Phụ lục G.

7.3.1.2  Đánh giá kết quả

Theo điều G.3.13, Phụ lục G.

7.3.2  Phát hiện kháng thể kháng vi rút JEV bằng phản ứng HA/HI

7.3.2.1  Cách tiến hành

Thực hiện theo điều I.2, Phụ lục I.

7.3.2.2  Đánh giá kết quả

Thực hiện theo điều I.3, Phụ lục I.

7.3.3 Phát hiện kháng thể kháng vi rút JEV bằng phương pháp ELISA

7.3.3.1  Nguyên lý phản ứng

Dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym rồi cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó cho cơ chất (chất nền) vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym đã gắn tạo nên màu. Sử dụng kít ELISA thương mại để phát hiện kháng thể kháng vi rút viêm não Nhật Bản IgG hoặc IgM ở lợn hoặc ngựa do nhiễm tự nhiên và phân biệt với kháng thể do tiêm phòng vắc xin.

7.3.3.2  Tiến hành phản ứng

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit ELISA (tham khảo K.2, Phụ lục K).

7.3.3.3  Đánh giá kết quả

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit ELISA (tham khảo K.4, Phụ lục K).

8 Kết luận

Động vật được coi là mắc bệnh viêm não Nhật Bản khi có các đặc điểm về dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với vi rút viêm não Nhật Bản bằng một trong những phương pháp sử dụng trong tiêu chuẩn này.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử và môi trường

A.1  Dung dịch đệm phốt phát (PBS).

A.1.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)	8,5 g
Dipotassium phosphate (K2HPO4)	2,0 g
Monotassium phosphat (KH2PO4)	1,0 g
Nước cất	1.000 ml

A.1.2  Cách chuẩn bị

Hòa tan các thành phần (xem A.1.1) trong 500 ml nước cất khử ion (4.15), lắc đều cho tan hết, sau đó bổ sung nước cất vừa đủ 1.000 ml. Điều chỉnh pH trong khoảng 7.2 ± 0.2 bằng dung dịch HCl 1N hoặc NaOH 1N. Hấp 121 °C trong thời gian 15 min, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

CHÚ THÍCH: có thể sử dụng PBS có bán sẵn và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch kháng sinh đậm đặc.

A.2.1  Thành phần

Penicillin	106 IU
Streptomycin	1 g
Kanamycin	1 g
Nước cất	10 ml

A.2.2  Cách chuẩn bị

Lắc đều cho tan, lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 0,45 μm (5.23). Sử dụng tốt nhất trong 1 tuần, bảo quản ở âm 20 °C.

A.3  Dung dịch DPBS dùng cho duy trì và cấy chuyển tế bào

- Hòa tan 9,55 g bột DPBS trong 1.000 ml nước cất 2 lần, hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần, bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

A.4  Môi trường nuôi tế bào (Sử dụng trong quá trình cấy chuyển và nuôi tế bào)

A.4.1  Thành phần

Môi trường DMEM	440 ml
Huyết thanh thai bê (xem 4.20)	50 ml
Kháng sinh (Penicillin/Streptomycin: 10000 UI/ml)	5 ml
Kháng nấm (Fungizone 250 μg/ml)	5 ml

A.4.2  Cách chuẩn bị

Bổ sung thành phần kháng sinh và kháng nấm vào môi trường DMEM, sau đó thêm huyết thanh thai bê 10 % theo đúng tỷ lệ. Bảo quản ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C. Sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

A.5  Chuẩn bị trypsin-EDTA 1X

A.5.1  Thành phần

Trypsin-EDTA 10X	100 ml
PBS (xem A.1, Phụ lục A)	900 ml

A.5.2  Cách chuẩn bị

Lắc đều trypsin trong PBS, sau đó lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45 μm (5.23), chia nhỏ lượng ra ống và bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Sử dụng tốt nhất trong 6 tháng.

A.6  Dung dịch Alserver

A.6.1  Thành phần

Citrate Natri (Na3C6H5O7.H2O)	8 g
A xít citric (H3C6H5O7.H2O)	0,55 g
Đường dextrose (C6H12O6)	20,5 g
Muối tinh khiết (NaCl)	4,2 g
Nước cất vừa đủ	1.000 ml

A.6.2  Cách chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong 1.000 ml nước cất vừa đủ. Hấp 110 °C trong thời gian 10 min, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C. Sử dụng tốt nhất trong 3 tháng.

A.7  Dung dịch dextrose-gelatine-veronal (DGV)

A.7.1  Thành phần

Barbital	0,58 g
Sodium barbital	0,38 g
CaCl2.2H2O	0,026 g
MgSO4.7H2O	0,12 g
NaCl	8,50 g
Đường dextrose (C6H12O6)	10,0 g
Nước cất vừa đủ	1.000 ml

A.7.2 Cách chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong 1.000 ml nước cất vừa đủ. Hấp 110 °C trong thời gian 10 min, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

A.8  Dung dịch NaCl 1.5 M

Cân 87,7 g NaCl và hòa tan trong 1000 ml nước cất vừa đủ. Bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

A.9  A xít boric (H₃BO₃) 0.5 M

Cân 30,92 g a xít boric và hòa tan trong 700 ml nước cất nóng ở nhiệt độ 70 °C. Để nguội và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

A.10 NaOH 1 N

Cân 40 g NaOH và hòa tan trong 1.000 ml nước cất vừa đủ. Bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

A.11  Muối borate (BS), pH 9.0

A.11.1  Thành phần

NaCl 1.5M	80 ml
A xít boric 0.5M	100 ml
NaOH 1N	24 ml
Nước cất vừa đủ	1.000 ml

A.11.2  Cách chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

A.12  dung dịch albumin bò 4 %

A.12.1  Thành phần

Albumin bò (V)	4 g
Muối borate, pH 9.0	96 ml

A.12.2 Cách chuẩn bị

Điều chỉnh pH = 9,0 bằng dung dịch NaOH 1N và dung dịch muối borate để có thể tích cuối cùng là 100 ml

A.13  Dung dịch pha loãng kháng nguyên (BABS)

Albumin bò, 4%	10 ml
Muối borate, pH 9.0	90 ml

A.14  Dung dịch Na₂HPO₄ 0.5 M

Cân 70,99 g Na₂HPO₄ và hòa tan trong 1000 ml nước cất.

A.15  Dung dịch NaH₂PO₄ 1 M

Cân 138,01 g NaH₂PO₄.H₂O và hòa tan trong 1.000 ml nước cất

A.16  Dung dịch pha loãng điều chỉnh vi rút (VAD)

VAD (pH)	NaCl 1,5 M, ml	Na2HPO4 0,5 M, ml	NaH2PO4 1 M, ml
6.0	100	32	184
6.2	100	62	160
6.4	100	112	144
6.6	100	160	120
6.8	100	192	104
7.0	100	240	80

Thêm nước cất vừa đủ 1000 ml.

CHÚ THÍCH:

1) Giá trị pH cuối cùng của dung dịch VAD là kết quả của sự kết hợp dung dịch BABS, pH 9 và dung dịch điều chỉnh (VAD) theo tỷ lệ 1:1, giá trị pH thích hợp cho phản ứng trong khoảng pH 6,0 đến 7,0.

2) Đối với một chủng vi rút mới, cần thiết phải đánh giá hiệu giá ngưng kết của vi rút và tối ưu hóa phản ứng HA trong dải pH (6,0 - 7,0) ở các điều kiện nhiệt độ phòng và nhiệt độ 37 °C.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Chiết tách ARN bằng bộ kít Qiagen RNeasy minikit[2]

B.1  Chuẩn bị

Dung dịch RLT: lấy 49,5 ml dung dịch RLT vào ống ly tâm 50 ml vô trùng (5.10), thêm 0,5 ml dung dịch β-mercaptoetanol (β-ME) thành dung dịch RLT có 1 % β-ME (sau khi bổ sung β-ME, dung dịch RLT này có thể giữ được 1 tháng ở nhiệt độ phòng).

B.2  Cách tiến hành

- Nhỏ 200 μl hỗn dịch đã chuẩn bị (7.1.3.1, 7.1.3.2) hoặc hỗn dịch tế bào nuôi cấy vi rút (7.2.3) vào ống eppendorf (5.19) cùng với 600 μl RLT (xem B.1), lắc đều trên máy lắc trộn (5.4 ) rồi ly tâm (5.17).

- Thêm 500 μl etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn, ly tâm lắng (5.17).

- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc (spin column) đặt trong ống thu (collection tube), ly tâm trong 15 s với tốc độ 10.000 rpm ở nhiệt độ phòng. Bỏ ống thu cùng dịch đã qua ly tâm, thay ống thu mới vào cột lọc.

- Bổ sung 700 μl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột lọc, ly tâm trong 15 s ở tốc độ 10.000 rpm. Bỏ ống thu cùng dịch đã qua ly tâm, thay ống thu mới vào cột lọc.

- Nhỏ 500 μl dung dịch rửa RPE buffer vào cột lọc và ly tâm trong 15 s ở tốc độ 10.000 rpm, thay ống thu mới. Rửa lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 10.000 rpm trong 2 min, loại bỏ ống thu.

- Đặt cột lọc vào ống eppendorf (5.19), cho 50 μl nước (4.7) vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 min - 3 min. Ly tâm cột lọc trong 1 min ở tốc độ 10.000 rpm, bỏ cột lọc. ARN thu được sau ly tâm được dùng để tiến hành phản ứng RT-PCR hoặc realtime RT-PCR.

- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong vòng 24 h trước khi làm phản ứng, nếu sau 24 h nên bảo quản mẫu ở âm 20 °C hoặc nhiệt độ thấp hơn.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Trình tự các cặp mồi, mẫu dò, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR phát hiện vi rút viêm não Nhật Bản

Bảng C.1 - Trình tự các cặp mồi, mẫu dò cho phản ứng realtime RT-PCR

Gen đích	Kí hiệu mồi	Trình tự (5'-3’)	Nguồn tham khảo
NS2A (tất cả genotypes)	NS2A-F	AGC-TGG-GCC-TTC-TGG-T	[4]
	NS2A -R	CCC-AAG-CAT-CAG-CAC-AAG
	NS2A -P	FAM-CTTCGCAAGAGGTGGACGGCCA-TAMRA
Genotype I	JE-E1-2140F	GGGGACAAGCAGATTAACCA	[5]
	JE-E1-2325R	GAAGGCACCACCAAACACTT
	JE-E1-2200P	FAM-TCAACAACTTTGAAAGGGGC-TAMRA
Genotype I	JE-E3-1978	CCTTGCAAAATTCCGATTGT	[7]
	JEE3-2222R	TGAGCTCCCTTCAAAGTCGT
	JE- E3-2038P	FAM-CTGGTGACAGTGAACCCCTT-TAMRA
CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi và mẫu dò được tiêu chuẩn khuyến cáo sử dụng. Các phòng thí nghiệm có thể sử dụng các cặp mồi, mẫu dò khác được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) hoặc Phòng Thí nghiệm tham chiếu của OIE về bệnh viêm não Nhật Bản khuyến cáo sử dụng.

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

STT	Thành phần nguyên liệu	Nồng độ sử dụng	Thể tích (μl) cho 1 phản ứng
1	Nước không có ARNse và DNase		6.0
2	Mồi xuôi	20 μM	0,5
3	Mồi ngược	20 μM	0,5
4	Đoạn dò	6 μM	0.5
5	2X Buffer		12,5
6	Mẫu chiết tách (ARN)		5
Tổng thể tích cho 1 phản ứng:			25

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime RT-PCR

Gen đích	Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
NS2A (phát hiện các genotype)	50 °C	15 min	1
	95 °C	2 min	1
	95 °C	15 s	40
	62 °C (*)	30 s
Genotype I	50 °C	15 min	1
	95 °C	2 min	1
	95 °C	15 s	40
	60 °C (*)	30 s
Genotype III	50 °C	15 min	1
	95 °C	2 min	1
	95 °C	15 s	40
	58 °C (*)	30 s
CHÚ THÍCH: 1) Nhiệt độ và thời gian chỉ phù hợp với qScriptXLT 1-Step RT-qPCR ToughMix, của hãng Quantabio[3]. Việc thực hiện cài đặt nhiệt độ và thời gian nên tuân thủ theo hướng dẫn của từng bộ kít được sử dụng. 2) (*): Ghi nhận tín hiệu huỳnh quang.

 

Phụ lục D

(Quy định)

Trình tự các cặp mồi, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút viêm não Nhật Bản

Bảng D.1 - Trình tự các cặp mồi, mẫu dò cho phản RT-PCR

Gen đích	Kí hiệu mồi	Trình tự (5'-3')	Kích thước sản phẩm (bp)
Gen E (phát hiện tất cả các genotype) [9]	JE Com-F	GCGTCTCAAGCAGCAAAGTT	565
	JE Com-R	GTCATGTCGGTTTAAACTCGCGAC
Genotype I [2]	JEG1F	CAGTCGCGAGTTTAAACGCA	708
	JEG1R	CATTCAGTTCGTCCCGCACA
Genotype III [2]	JEG3F	GGATGCTTGGCAGTAACAAC	395
	JEG3R	AAGTCCACATCCGTTGCC
CHÚ THÍCH: Trình tự cặp mồi trong Bảng D.1 được tiêu chuẩn khuyến cáo sử dụng. Các phòng thí nghiệm có thể sử dụng các cặp mồi khác được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) hoặc Phòng Thí nghiệm tham chiếu của OIE về bệnh viêm não Nhật Bản khuyến cáo sử dụng.

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng RT-PCR

STT	Thành phần nguyên liệu	Nồng độ sử dụng	Thể tích (μl) cho 1 phản ứng
1	Nước không có RNase và DNase		5,0
2	Mồi xuôi	20 μM	0,5
3	Mồi ngược	20 μM	0,5
4	qScript XLT One-Step RT (25X)		1,0
5	One-Step Tough Mix (2X)		12,5
6	GelTrack Loading Dyes (50X)		0,5
7	Mẫu chiết tách (ARN)		5
Tổng thể tích cho 1 phản ứng:			25

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR

Gen đích	Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
Gen E (phát hiện tất cả các genotype)	48 °C	20 min	01
	94 °C	3 min	01
	94 °C	15 s	35
	55 °C	40 s
	72 °C	1 min
Phát hiện genotye (G1 và G3)	48 °C	20 min	01
	94 °C	3 min	01
	94 °C	15 s	35
	52 °C	40 s
	72 °C	1 min
CHÚ THÍCH: Thành phần phản ứng RT-PCR, nhiệt độ và thời gian cài đặt cho phản ứng chỉ phù hợp với qScript XLT One-Step RT-PCR Kít, của hãng Quantabio[4]. Khi sử dụng kít khác, nên tuân thủ theo hướng dẫn của từng bộ kít được sử dụng.

 

Phụ lục E

(Quy định)

Cấy chuyển và nuôi cấy tế bào

E.1  Nguyên vật liệu

- Chai nuôi tế bào 25 cm² đã phát triển thành 1 lớp tế bào Vero bao phủ khoảng 90 % bề mặt chai

- Môi trường nuôi tế bào (xem A.4, Phụ lục A)

- Trypsin có 0,05 % EDTA

- DPBS 1X (xem A.3, Phụ lục A)

CHÚ THÍCH: tất cả các môi trường phải được cân bằng ở 37 °C và tất cả vật tư dùng cho tế bào đều phải được hấp vô trùng trước khi sử dụng.

E.2  Cách tiến hành

- Hút bỏ môi trường trong chai tế bào 25 cm² đang nuôi tế bào Vero 1 lớp đã phủ 90 % bề mặt chai.

- Rửa bề mặt thảm tế bào bằng 5 ml DPBS 1X (4.23), tráng qua và hút bỏ DPBS.

- Thêm 5 ml trypsin 1X-EDTA vào chai tế bào 25 cm² láng đều lên bề mặt tế bào sao cho bề mặt tế bào được phủ trypsin. Ủ trong thời gian từ 5 min đến 10 min trong tủ ấm ở 37 °C (5.8).

- Khi tế bào đã tách hết, bổ sung 5 ml DMEM có 10 % FCS (A.4, Phụ lục A) vào chai để vô hoạt trypsin, trộn đều, chuyển toàn bộ hỗn dịch tế bào sang ống nghiệm 15 ml.

- Ly tâm hỗn dịch tế bào ở tốc độ 1.000 rpm trong 5 min. Loại bỏ phần dung dịch ở trên, giữ cặn tế bào.

- Hoàn nguyên cặn với 5 ml DMEM có bổ sung 10 % FCS, sau đó đếm tế bào và chuyển vào chai nuôi cấy 25 cm² với lượng phù hợp. Nuôi chai tế bào trong tủ ấm 37 °C có 5 % CO₂ (5.8)

Theo dõi sự phát triển hàng ngày của tế bào trên kính hiển vi đảo ngược (5.20). Sau 3 ngày lại thay môi trường nuôi cấy mới. Đến khi tế bào phát triển thành một lớp bao phủ 90 % chai nuôi cấy thì lại tiến thành cấy chuyển lặp lại như quy trình trên đây.

 

Phụ lục F

(Quy định)

Phương pháp xác định số lượng tế bào sử dụng Haemocytometer

F.1 Các bước thực hiện.

- Làm sạch buồng đếm và nắp kính.

- Nhẹ nhàng khuấy chai nuôi tế bào để trộn đều đồng nhất.

- Hút 200 μm dung dịch tế bào vào ống eppendorf mới, bổ sung 200 μm trypan blue 0.4 % (4.21), trộn đều.

- Hút 100 μm dung dịch tế bào và trypan blue vào buồng đếm (nhỏ dung dịch vào cạnh buồng đếm dung dịch sẽ theo mao dẫn đi vào đầy các ngăn).

- Đếm các tế bào còn sống (là các tế bào không bị nhuộm màu trypan blue) tại 4 hình vuông ở 4 góc.

F.2 Tính toán kết quả:

Ct = T x Tb x 1/4 x 10⁴

Trong đó:

Ct: Số lượng tế bào ban đầu có trong 1 ml

T: Tổng số tế bào tại 4 góc vuông

Tb: Hệ số pha loãng giữa dung dịch tế bào với trypan blue

1/4: Hệ số góc vuông

10⁴: Hệ số chuyển đổi

Ví dụ: Đếm tổng số tế bào tại 4 góc vuông có 480 tế bào, Ct = 480 × 2 × 1/4 × 10⁴ = 240 × 10⁴ = 2.4 × 10⁶ tb/ml.

 

Phụ lục G

(Quy định)

Phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT)

G.1  Nguyên liệu

G.1.1  Tế bào Vero (ATCC No. CCL-81)

G.1.2  Môi trường nuôi cấy tế bào (theo A.4, Phụ lục A)

G.1.3  Huyết thanh chuẩn dương, có hiệu giá đã biết

G.1.4  Môi trường thạch agarose 4 %

Hòa tan 1 g thạch agarose (4.9) trong 50 ml nước cất trong bình thủy tinh (5.29), lắc đều và đặt trong lò vi sóng (5.26) trong khoảng 30 s - 45 s để cho thạch tan chảy hoàn toàn (tránh đun sôi trong lò vi sóng). Giữ môi trường ở nhiệt độ 42 °C trong bể điều nhiệt trước khi dùng.

G.1.5  Dung dịch đỏ trung tính 0,1 % (w/v): Hòa tan bột đỏ trung tính trong nước cất thành dung dịch 0,1 % (w/v), hấp vô trùng và bảo quản trong lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ 4°C.

G.1.6  Chuẩn bị môi trường phủ thứ nhất.

G.1.6.1  Thành phần

α-MEM chứa kháng sinh	14 ml
Huyết thanh thai bê (FCS)	1 ml
Môi trường thạch agarose 4 %	5 ml

G.1.6.2  Cách chuẩn bị

Làm ấm dung dịch α-MEM (4.19) chứa kháng sinh trong bể điều nhiệt 37 °C, thêm các thành phần trên theo đúng tỷ lệ và đảm bảo vô trùng. Giữ môi trường ở nhiệt độ 42 °C trong bể điều nhiệt trước khi dùng.

G.1.7  Chuẩn bị môi trường phủ thứ hai.

G.1.7.1  Thành phần

α-MEM chứa kháng sinh	12,8 ml
Huyết thanh thai bê (FCS)	1 ml
Môi trường thạch agarose 4 %	5 ml
Dung dịch đỏ trung tính 0,1 %	1,2 ml

G.1.7.2 Cách chuẩn bị

Thực hiện tương tự như điều G.1.6.2

G.2  Xác định nồng độ vi rút JEV bằng phản ứng đám hoại tử (VPA)

G.2.1  Nguyên lý của phản ứng

Phản ứng đám hoại tử xác định số đơn vị hình thành đám hoại tử (PFU) trong mẫu vi rút. Đám hoại tử được hình thành khi tế bào bị nhiễm vi rút trong tế bào đơn lớp được cố định trong môi trường thạch bán lỏng, tế bào bị nhiễm vi rút sẽ bị dung giải và lây nhiễm sang tế bào liền kề và chu kỳ nhiễm - dung giải lặp lại đối với tế bào liền kề. Một vùng tế bào bị nhiễm vi rút sẽ hình thành đám hoại tử có thể quan sát được bằng mắt thường khi nhuộm màu.

G.2.2  Cách tiến hành

G.2.2.1  Chuẩn bị dung dịch tế bào trong đĩa 24 giếng:

- Nuôi cấy và kiểm tra tế bào Vero trong chai nuôi 75 cm² (5.21) và xác định tế bào đang phát triển với hơn 95 % sống sót (theo Phụ lục E).

- Xác định nồng độ tế bào (theo Phụ lục F). Thêm khoảng 1,0 × 10⁴ đến 5 × 10⁴ tế bào/giếng từ chai 75 cm² sang đĩa 24 giếng (5.22). Ủ trong tủ ấm (5.8) từ 2 ngày đến 3 ngày. Khi tế bào đạt độ bao phủ ≥ 90 % thì dùng cho phản ứng VPA.

G.2.2.2  Pha loãng vi rút JEV theo hệ số 10 bằng môi trường α-MEM như sau:

+ Hút 1,8 ml môi trường α-MEM (4.19) vào tất cả các giếng,

+ Thêm 0,2 ml vi rút JEV (4.17) vào giếng 1 và trộn đều, sau đó hút 0.2 ml từ giếng 1 sang giếng 2, và pha loãng tiếp tục đến giếng thứ 7 và bỏ đi ở giếng cuối cùng.

G.2.2.3  Hút loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào trong đĩa 24 giếng, thêm 0,1 ml vi rút JEV đã pha loãng ở mỗi nồng độ thích hợp (3 nồng độ pha loãng cuối cùng). Giếng thứ 8 là giếng đối chứng âm, thêm 0,2 ml môi trường không có vi rút JEV.

G.2.2.4 Ủ đĩa 24 giếng trong tủ ấm CO₂ ở nhiệt độ 37 °C/ 1 h.

G.2.2.5  Loại bỏ toàn bộ môi trường nuôi cấy (tránh chạm vào lớp tế bào).

G.2.2.6  Lắc nhẹ môi trường (G.1.6) và cho 0,5 ml môi trường phủ thứ nhất vào tất cả các giếng. Để đĩa 24 giếng trong buồng cấy an toàn sinh học cấp II (5.3) khoảng 1 h để thạch đông lại. Đặt đĩa úp ngược trong tủ ấm (5.8) trong 48 h.

G.2.2.7 Thêm 0,5 ml môi trường phủ thứ 2 (G.1.7) vào các giếng và để thạch đông lại trong tủ ấm (5.8) trong 1 h. Đặt đĩa úp ngược trong tủ ấm (5.8) trong 48 h.

G.2.2.8  Tính toán đám hoại tử bằng mắt thường và xác định hiệu giá vi rút theo công thức sau:

Số đám hoại tử (PFU/ml) = số PFU đếm được × D × V

Trong đó:

D: Độ pha loãng

V: Thể tích vi rút đã pha loãng được thêm vào giếng.

Ví dụ: Nếu cấy 0,1 ml vi rút JEV ở nồng độ pha loãng 10^-6 trong 01 giếng và tại nồng độ đó đếm được 44 đám hoại tử. Vậy hiệu giá vi rút = 44 × 10⁶ = 4,4 × 10⁷ PFU/ 0.1 ml = 4,4 × 10⁸ PFU/ml

CHÚ THÍCH:

- Nếu số đám hoại tử quá nhiều, không thể đếm được, cần tiếp tục pha loãng để có thể xác định chính xác hiệu giá vi rút ban đầu.

- Mỗi nồng độ pha loãng nên làm lặp lại 02 lần, lấy giá trị trung bình của số đám hoại tử đếm được của 02 lần lặp lại để xác định hiệu giá vi rút ban đầu.

G.3  Phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT)

G.3.1  Chuẩn bị tế bào vero trên đĩa 24 giếng với độ bao phủ ≥ 90 % (xem G.2.1).

G.3.2  Huyết thanh (7.1.3.3) được vô hoạt ở nhiệt độ 56 °C trong 30 phút trong bể điều nhiệt (5.25)

G.3.3  Pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ 1:10 trong dung dịch α-MEM: cho giếng đầu tiên 450 μl dung dịch α-MEM, các giếng còn lại mỗi giếng 250 μl dung dịch α-MEM (theo sơ đồ tại Bảng G.1).

Bảng G.1 - Sơ đồ pha loãng mẫu huyết thanh và ủ hỗn hợp huyết thanh-vi rút

Thành phần/Bước thực hiện	Hiệu giá pha loãng						Đối chứng
	1/10	1/20	1/40	1/80	1/160	1/320	NC	PC	DC
Dung dịch α-MEM, μl	450	250	250	250	250	250			250
Huyết thanh vô hoạt, μl	50						250	250
Pha loãng huyết thanh	Pha loãng huyết thanh như điều G.3.4
Vi rút JEV (200 PFU/0.1 ml), μl	250	250	250	250	250	250	250	250	250
Ủ hỗn hợp huyết thanh-vi rút	Ủ 37 °C trong 1 h - 2 h
CHÚ THÍCH: NC: Đối chứng âm tính; PC: Đối chứng dương tính; DC: Đối chứng của dung dịch pha loãng

G.3.4 Lấy 50 μl huyết thanh đã vô hoạt (G.3.2) cho vào giếng đầu tiên và trộn đều, sau đó hút chuyển 250 μl từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2, trộn đều và hút 250 μl từ giếng 2 sang giếng thứ 3, trộn đều và thực hiện tương tự cho tới giếng cuối cùng và hút bỏ đi 250 μl.

G.3.5  Chuẩn bị vi rút JEV

Giải đông vi rút gốc (4.17) trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 37 °C.

Pha loãng vi rút gốc đã được xác định hiệu giá ban đầu (G.2) tới hiệu giá 200 PFU/0.1 ml và 20 PFU/0.1 ml.

G.3.6  Thêm 250 μl vi rút đã pha loãng (G.3.5) ở nồng độ 200 PFU/0,1 ml vào các nồng độ huyết thanh đã pha loãng. Trộn đều bằng cách lắc nhẹ và đậy lắp đĩa phản ứng.

G.3.7  Ủ đĩa hỗn hợp huyết thanh-vi rút trong bể điều nhiệt (5.25) ở 37 °C trong 1 h - 2 h hoặc có thể ủ qua đêm trong tủ lạnh (5.2).

G.3.8  Ghi kí hiệu mẫu và hiệu giá huyết thanh pha loãng trên đĩa tế bào Vero 24 giếng. Dùng pipet hút bỏ toàn bộ dung dịch nuôi cấy.

G.3.9  Chuyển 0,1 ml hỗn hợp huyết thanh-vi rút (G.3.7) ở các nồng độ huyết thanh đã pha loãng vào trong đĩa tế bào 24 giếng (G.3.1).

G.3.10  Ủ đĩa tế bào đã nuôi cấy trong tủ ấm CO₂ (5.8) trong 1 h.

G.3.11  Phủ môi trường phủ thứ nhất: thực hiện như điều G.2.6.

G.3.12  Phủ môi trường phủ thứ hai: thực hiện theo điều G.2.7.

G.3.13  Đánh giá kết quả:

- Tính số đám hoại tử (PFU) trong giếng đối chứng âm (không có huyết thanh hoặc huyết thanh âm tính) và xác định PFU ở ngưỡng giảm 50 % (PFU₅₀) và ở ngưỡng 90 % (PFU₉₀).

PFU₅₀ = 0,5 × PFU/giếng

PFU₉₀ = 0,1 × PFU/giếng

Xác định hiệu giá huyết thanh:

PRNT₅₀ là độ pha loãng cao nhất gần với 50 % giảm đám hoại tử trung bình của đối chứng âm (PFU₅₀).

PRNT₉₀ là độ pha loãng cao nhất gần với 90 % giảm đám hoại tử trung bình của đối chứng âm (PFU₉₀).

Mẫu xét nghiệm có hiệu giá PRNT₉₀ ≥ 1/20 được coi là dương tính.

- Điều kiện của phản ứng:

+ Đối chứng tế bào không bị tạp nhiễm

+ Đối chứng âm: không có sự giảm hoặc giảm không đáng kể số đám hoại tử và trong ngưỡng đã xác định

+ Đối chứng dương: phải cho kết quả dương tính tương ứng với hiệu giá đã xác định.

 

Phụ lục H

(Quy định)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)

H.1 Thuốc thử và vật liệu thử

H.1.1  Vi rút viêm não Nhật Bản (JEV), chủng KV 1899 hoặc Nakayama

H.1.2  Ngỗng trắng trưởng thành, sạch bệnh

H.2  Chuẩn bị vi rút kháng nguyên

Vi rút kháng nguyên dùng cho phản ứng HA/HI có thể mua thương mại từ nhà sản xuất, hoặc từ phòng thí nghiệm tham chiếu về bệnh viêm não Nhật Bản. Ngoài ra, phòng thí nghiệm có thể chuẩn bị kháng nguyên chuẩn theo phương pháp sau:

- Nuôi cấy vi rút JEV (H.1.1) trong chai 75 cm² chứa môi trường tế bào C6/36. Quy trình thực hiện tương tự như điều 7.2.3.1. Thu toàn bộ dung dịch tế bào sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ 28 °C trong vòng 1 tuần vào ống 50 ml.

- Ly tâm 2.500 rpm/15 min. Lấy dung dịch nước trong để thực hiện phản ứng HA, phần còn lại chia nhỏ ra ống nghiệm 5 ml (5.10), bảo quản ở nhiệt độ -80 °C.

H.3  Chuẩn bị hồng cầu ngỗng

H.3.1  Dùng xy lanh 10 ml lấy 5 ml máu ngỗng (H.1.2) từ tĩnh mạch cánh, chống đông bằng 5 ml dung dịch Alsever (A.6, Phụ lục A) theo tỷ lệ 1:1.

H.3.2  Chuyển hồng cầu chống đông sang ống nghiệm 15 ml. Ly tâm 2.000 rpm/10 min, loại bỏ phần nước trong.

H.3.3  Bổ sung thêm 3 lần thể tích dung dịch DGV (xem A.7, Phụ lục A).

H.3.4  Ly tâm 1500 rpm/15 min, loại bỏ phần nước trong. Rửa lặp lại 2 đến 3 lần bằng dung dịch DGV và loại bỏ nước trong.

H.3.5  Bọc dung dịch hồng cầu thu được trong một lớp giấy bạc.

H.3.6  Thêm 13,3 ml dung dịch DGV (A.7, Phụ lục A) vào 1 ml hồng cầu đặc (H.3.5) tạo thành dung dịch hồng cầu tiêu chuẩn. Bảo quản hồng cầu tiêu chuẩn trong tủ mát (5.2) và sử dụng trong vòng 1 tuần.

H.3.7  Trước khi thực hiện phản ứng HA/HI, tiếp tục pha loãng 01 đơn vị thể tích hồng cầu tiêu chuẩn với 23 đơn vị thể tích dung dịch pha loãng VAD (A.16, Phụ lục A).

H.4 Pha loãng kháng nguyên

H.4.1 Cho 50 μl dung dịch BABS (A.13, Phụ lục A) vào các giếng từ giếng 1 đến giếng 12 (theo sơ đồ tại Bảng H.1). Cho 50 μl vi rút kháng nguyên (H.1.1) vào giếng 1. Trộn đều kháng nguyên với dung dịch BABS ở giếng 1, hút 50 μl từ giếng 1 chuyển sang giếng 2 và trộn đều, hút 50 μl chuyển sang giếng 3 và trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 và hút bỏ 50 μl ở giếng 11. Giếng 12 chỉ có dung dịch BABS để làm đối chứng hồng cầu.

H.4.2 Cho 50 μl hồng cầu ngỗng đã pha loãng (H.3.7) vào mỗi giếng, lắc nhẹ bằng tay hoặc bằng máy lắc đĩa (5.28) trong 1 min. Ủ đĩa phản ứng trong tủ ấm 37 °C và đọc kết quả sau 30 min.

Bảng H.1 - Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu ngỗng (HA)

Các bước	Nguyên liệu	Thứ tự các giếng
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Pha loãng KN	BABS, μl	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
	KN kiểm tra, μl	50	Trộn đều, chuyển 50 μl lần lượt từ giếng 1 đến giếng 11 rồi hút bỏ 50 μl										0
Cho HC	HC ngỗng, μl	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
	Độ pha loãng KN
CHÚ THÍCH: KN: kháng nguyên; HC: hồng cầu.

H.5  Đánh giá kết quả

- Phản ứng HA dương tính: khi có ngưng kết hồng cầu tạo thành lớp màng mỏng bám xung quanh thành và đáy đĩa. Những mẫu dương tính với phản ứng HA là những mẫu có chứa vi rút gây ngưng kết hồng cầu.

- Phản ứng HA âm tính: khi không có ngưng kết hồng cầu, hồng cầu lắng xuống đáy đĩa.

Xác định hiệu giá ngưng kết hồng cầu (HA):

Hiệu giá HA của một mẫu được xác định tại nồng độ pha loãng cao nhất có ngưng kết hồng cầu. Ví dụ mẫu có phản ứng HA dương tính ở độ pha loãng 1/1024 thì hiệu giá HA của mẫu được xác định là 1/1024 hoặc 10 log₂.

H.6  Xác định hiệu giá kháng nguyên 8 đơn vị HA/50 μl

- Xác định hiệu giá ngưng kết và pha loãng kháng nguyên thành 8 đơn vị HA.

Ví dụ: mẫu kháng nguyên chuẩn có phản ứng HA dương tính ở hiệu giá là 1/256 (8 log₂). Pha loãng kháng nguyên ban đầu để được 8 đơn vị HA: 1/256 : 8 = 1/32. Lấy 1 ml kháng nguyên pha loãng trong 31 ml dung dịch BABS, được 8 đơn vị HA.

 

Phụ lục I

(Quy định)

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI)

I.1  Xử lý mẫu huyết thanh

Trước khi tiến hành phản ứng HI, mẫu huyết thanh (7.1.3.3) phải được xử lý để loại bỏ các chất gây ức chế và chất gây ngưng kết không đặc hiệu. Cách tiến hành như sau:

I.1.1  Ủ huyết thanh trong bể điều nhiệt (5.25) ở nhiệt độ 56 °C trong 30 min.

I.1.2  Pha kaolin (4.25) trong dung dịch BS, pH 9.0 (A.11, Phụ lục A) thành dung dịch 14 %.

I.1.3  Cho 900 μl dung dịch kaolin 14 % vào 100 μl huyết thanh đã vô hoạt (I.1.1). Ủ 30 min ở nhiệt độ phòng, cứ 5 min lắc nhẹ 01 lần.

I.1.4  Ly tâm 8.000 rpm trong 5 min, lấy nước trong (huyết thanh ở độ pha loãng 1/10) chuyển sang ống mới.

I.1.5  Cho hồng cầu ngỗng đặc (H.3.5) vào huyết thanh (1.1.4) theo tỷ lệ 1/50. Ví dụ; cho 20 μl hồng cầu ngỗng đặc vào 980 μl huyết thanh. Để ở nhiệt độ phòng trong 1 h, cứ 5 min lắc nhẹ 01 lần.

I.1.6  Ly tâm 8.000 rpm/5 min. Lấy nước trong để thực hiện phản ứng HI.

I.2  Tiến hành phản ứng HI

- Cho 25 μl dung dịch BABS (xem A.13, Phụ lục A) vào các giếng (từ giếng 2 đến giếng 12). Cho 50 μl huyết thanh đã được xử lý (1.1) vào giếng 1.

- Chuyển 25 μl huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều huyết thanh với dung dịch BABS ở giếng 2, chuyển 25 μl sang giếng 3 và trộn đều, chuyển 25 μl sang giếng 4, tiếp tục đến giếng 11, hút bỏ 25 μl ở giếng 11.

- Cho 25 μl kháng nguyên 8 HA/50 μl vào các giếng từ 1 đến 11. Cho thêm 25 μl dung dịch BABS vào giếng 12 làm đối chứng hồng cầu. Lắc nhẹ trên máy lắc (5.28) sau đó ủ đĩa phản ứng ở 37 °C/ 30 min.

- Cho 50 μl hồng cầu ngỗng (H.3.7) vào mỗi giếng, lắc nhẹ trong 1 min. Để đĩa phản ứng ở ở 37 °C/ 30 min. Đọc kết quả sau 30 min (xem sơ đồ thực hiện phản ứng trong Bảng I.1).

- Kiểm soát chất lượng:

Mỗi đĩa phản ứng phải có mẫu đối chứng âm (sử dụng dung dịch pha loãng BABS), kháng thể chuẩn dương (4.26) ở hiệu giá HI đã biết, cùng tiến hành xét nghiệm với mẫu kiểm tra. Kháng nguyên 8 HA/50 μl phải được chuẩn độ lại bằng phản ứng HA để đảm bảo 8 HA/50 μl được sử dụng cho phản ứng HI là đúng (quy trình thực hiện theo Phụ lục H).

Bảng I.1 - Sơ đồ các bước tiến hành phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI)

Các bước	Nguyên liệu	Thứ tự các giếng
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Pha loãng huyết thanh	BABS, μl	0	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	50
	Huyết thanh kiểm tra, ul	50	Chuyển 25 μl từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều, chuyển tiếp tục đến giếng 11 rồi hút bỏ 25 μl										0
Cho kháng nguyên	Kháng nguyên 8 HA, μl	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	25	0
Lắc nhẹ, ủ ở 37 °C/ 30 min
Cho hồng cầu ngỗng	Hồng cầu ngỗng, μl	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
Lắc nhẹ, ủ ở 37 °C/ 30 min
Hiệu giá kháng thể

I.3  Đánh giá kết quả

- Phản ứng âm tính: có ngưng kết hồng cầu, chứng tỏ không có kháng thể kết hợp với kháng nguyên trong phản ứng.

- Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên kết hợp với kháng thể tương ứng. Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.

- Huyết thanh được coi là dương tính với kháng thể kháng vi rút JEV khi có hiệu giá HI ≥ 1/20.

CHÚ THÍCH

Phản ứng chéo có thể xảy ra giữa các vi rút thuộc Flavivirus (bao gồm vi rút JEV, West Nile virus-WNV) trong phản ứng huyết thanh học. Vì vậy, những mẫu dương tính cần phải được khẳng định lại bằng một trong những cách sau:

1) So sánh sự khác biệt về hiệu giá kháng thể giữa 02 loại kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng. Hiệu giá kháng thể kháng vi rút JEV tăng hơn 4 lần so với kháng thể kháng vi rút WNV được xác định là dương tinh với kháng thể JEV.

2) Lấy mẫu lại sau 3 tuần để khẳng định, nếu hiệu giá kháng thể tăng hơn 4 lần so với giai đoạn cấp tính thì được xác định là dương tinh do nhiễm vi rút viêm não Nhật Bản.

3) Khẳng định lại bằng phương pháp PRNT theo Phụ lục G.

 

Phụ lục K

(Tham khảo)

Phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể kháng vi rút viêm não Nhật Bản

Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể JEV có bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ: có thể sử dụng bộ kít VDPro® Japanese Encephalitis AB ELISA, Cat. No ES-JEV-01, hãng Median Diagnostics[5]

K.1 Chuẩn bị nguyên liệu

- Nguyên liệu trong bộ kít để ở nhiệt độ phòng 30 min trước khi làm phản ứng.

- Pha loãng dung dịch rửa: pha dung dịch nước rửa đặc (Washing buffer 10X) với nước cất khử ion (4.15) theo tỷ lệ 1:10. Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 μl/giếng × 3 lần rửa × 2 bước rửa × số giếng sử dụng.

- Mẫu huyết thanh (7.1.3.3) được pha loãng với dung dịch pha loãng mẫu (Dilution buffer) theo tỷ lệ 1:100 (5 μl huyết thanh + 495 μl dung dịch pha loãng).

- Thiết lập sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có đối chứng âm (Negative Control - NC), đối chứng dương (Positive Control - PC).

K.2  Cách tiến hành

K.2.1  Ủ mẫu

- Cho 100 μl mẫu đối chứng dương (Positive Control - PC) vào hai giếng A1 và A2

- Cho 100 μl mẫu đối chứng âm (Negative Control - NC) vào hai giếng B1 và B2

- Cho 100 μl huyết thanh kiểm tra đã pha loãng 1:100 (xem K.1) vào các giếng còn lại, vỗ nhẹ vào thành đĩa, tránh đọng mẫu trên thành giếng.

- Đậy nắp đĩa và đặt trong khay ẩm. Ủ trong tủ ấm (5.9) ở nhiệt độ 37 °C ± 2 °C trong 1 h.

K.2.2  Đổ bỏ dung dịch trong đĩa; Rửa đĩa bằng cách thêm 300 μl dung dịch rửa 1X vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Rửa lặp lại 3 - 5 lần, tránh làm khô đĩa giữa các lần rửa

K.2.3  Cho 100 μl dung dịch conjugate (HPRO Anti-Swine IgG Conjugate) vào các giếng. Đậy nắp đĩa và đặt trong khay ẩm. Ủ trong tủ ấm (5.9) ở nhiệt độ 37 °C ± 2 °C trong 1 h.

K.2.4 Cho 100 μl dung dịch cơ chất (TMB Subtrate) vào các giếng. Ủ đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng (25 °C ± 3 °C) trong 10 min (tránh ánh sáng).

K.2.5  Cho 50 μl dung dịch H₂SO₄ 0.5 M (Stop solution) vào các giếng để dừng phản ứng.

K.2.6  Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc (5.27) ở bước sóng 450 nm

K.3  Tính toán kết quả

- Giá trị OD của đối chứng:

Trong đó:

 là giá trị OD trung bình của đối chứng dương.

 là giá trị OD trung bình của đối chứng âm.

- Phản ứng được công nhận khi thỏa mãn đồng thời hai điều kiện sau:

 ≥ 0.50

 ≤ 0.20

- Sự có mặt của kháng thể kháng vi rút JEV được xác định bằng giá trị S/P, theo công thức sau:

K.4  Đánh giá kết quả

- Mẫu xét nghiệm có giá trị S/P ≥ 0.25 được coi là dương tính.

- Mẫu xét nghiệm có giá trị S/P < 0.25 được coi là âm tính.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] OIE (Office International des Epizooties). Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (2018). Chapter 3.1.10. Japanese Encephalitis.

[2] Chen YY, Lin JW, Fan YC, Chiou SS. Detection and differentiation of genotype I and III Japanese encephalitis virus in mosquitoes by multiplex reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Transbound Emerg Dis 2014; 61:37-43.

[3] Dong-Kun Yang, Ha-Hyun Kim, Hyun-Ye Jo, Sung-Suk Choi and In-Soo Cho. Establishment of a Multiplex RT-PCR for the Sensitive and Differential Detection of Japanese Encephalitis Virus Genotype 1 and 3. JouARNI of Bacteriology and Virology 2016. Vol. 46, No. 4 p.231 - 238.

[4] Tehmina Bharucha, Onanong Sengvilaipaseuth, Manivanh Vongsouvath, Malavanh Vongsouvath, Viengmon Davong, Phonepasith Panyanouvong, Geraldine Piorkowski, Jeremy A. Garson, Paul N. Newton, Xavier de Lamballerie, Audrey Dubot-Pérès. Development of an improved RT-qPCR Assay for detection of Japanese encephalitis virus (JEV) ARN including a systematic review and comprehensive comparison with published Methods. PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/jouARNI.pone.0194412 March 23, 2018.

[5] Loan Phuong Do, Trang Minh Bui, Futoshi Hasebe, Kouichi Morita and Nga Thi Phan. Molecular epidemiology of Japanese encephalitis in northern Vietnam, 1964-2011: genotype replacement Virology JouARNI (2015) 12:51.

[6] Dong-Kun Yang, Ha-Hyun Kim, Hyun-Ye Jo, Seung Heon Lee, Sang-Ho Jang, Sang-Oh Lee, Sung-Suk Choi, In-Soo Cho. Improvement of indirect enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Japanese encephalitis virus antibodies in swine sera. Korean J Vet Res (2017) 57(1): 31~36

[7] Nan Shao, Fan Li, Kai Nie, Shi Hong Fu, Wei Jia Zhang, Ying He, Wen Wen Lei, Qian Ying Wang, Guo Dong Liang, Yu Xicao, Huan Yu Wang. TaqMan Real-time RT-PCR Assay for Detecting and Differentiating Japanese Encephalitis Virus. Biomedical and Environmental Sciences. Volume 31, Issue 3, March 2018, Pages 208-214.

[8] Akihiko Maeda, Junko Maeda. Review of diagnostic plaque reduction neutralization tests for flavivirus infection. The Veterinary Journal 195 (2013) 33-40.

[9] OIE Reference Laboratory for Japanese Encephalitis in Animal Plant Quarantine Agency of Korea (APQA). Detection of Japanese Encephalitis, https://www.qia.go.kr/english