Tiêu chuẩn TCVN 8400-53:2022 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 53: Bệnh viêm phổi hóa mủ ở gà

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-53:2022

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 53: BỆNH VIÊM PHỔI HÓA MỦ DO VI KHUẨN ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE Ở GÀ

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 53: Purulent pneumonia disease caused by Ornithobacterium rhinotracheale in chicken

Lời nói đầu

TCVN 8400-53:2022 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật- Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

- TCVN 8400-1:2019, Phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2:2010, Phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3:2010, Phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4:2010, Phần 4: Bệnh Niu cát xơn;

- TCVN 8400-5:2011, Phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6:2011, Phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

- TCVN 8400-7:2011, Phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8:2011, Phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9:2011, Phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10:2022, Phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11:2019, Phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12:2011, Phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13:2019, Phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14:2011, Phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15:2019, Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16:2011, Phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli;

- TCVN 8400-17:2011, Phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18:2014, Phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19:2014, Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20:2014, Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21:2014, Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22:2014, Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23:2014, Phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24:2014, Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TCVN 8400-25:2014, Phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26:2014, Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27:2014, Phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28:2014, Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29:2015, Phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30:2015, Phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31:2015, Phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32:2015, Phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33:2015, Phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34:2015, Phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35:2015, Phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

- TCVN 8400-36:2015, Phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo vi rút typ 2;

- TCVN 8400-37:2015, Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38:2015, Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona vi rút;

- TCVN 8400-39:2016, Phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40:2016, Phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Riemerella anatipestifer gây ra;

- TCVN 8400-41:2019, Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

- TCVN 8400-42:2019, Phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

- TCVN 8400-43:2019, Phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44:2019, Phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45:2019, Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46:2019, Phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47:2019, Phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

- TCVN 8400-48:2020, Phần 48: Bệnh tiêu chảy có màng nhày do vi rút ở bò;

- TCVN 8400-49:2020, Phần 49: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-50:2020, Phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản;

- TCVN 8400-51:2020, Phần 51: Bệnh viêm phổi, màng phổi truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-52:2022, Phần 52: Bệnh nhiệt thán ở gia súc;

- TCVN 8400-53:2022, Phần 53: Bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale ở gà;

- TCVN 8400-54:2022, Phần 54: Bệnh tỵ thư ở gia súc;

- TCVN 8400-55:2022, Phần 55: Bệnh u nhày ở thỏ.

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 53: BỆNH VIÊM PHỔI HÓA MỦ DO VI KHUẨN ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE Ở GÀ

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 53: Purulent pneumonia disease caused by Ornithobacterium rhinotracheale in chicken

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale ở gà.

Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để chẩn đoán bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây ra ở gia cầm khác.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này.

TCVN 8128 (ISO 11133) Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy

3  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

3.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1.1

Bệnh viêm phổi hóa mủ (Purulent pneumonia disease)

Bệnh đường hô hấp của gà và một số loài gia cầm do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây ra, xảy ra chủ yếu ở thể cấp tính.

3.1.2

Ọrnithobacterium rhinotracheale

Trực khuẩn Gram âm, không có khả năng di động, đa hình thái, không hình thành nha bào; trên môi trường thạch máu, vi khuẩn thường mọc sau 24 h đến 48 h nuôi cấy, khuẩn lạc không gây dung huyết, có màu trắng xám đến xám, đôi khi hơi đỏ sẫm, mặt lồi với bờ rõ ràng, có kích thước từ 1 mm đến 3 mm.

3.2  Các từ viết tắt

4  Thuốc thử, vật liệu thử và môi trường nuôi cấy

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ các trường hợp có quy định khác.

Thực hiện thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy theo quy định trong TCVN 8128 (ISO 11133).

4.1  Bộ thuốc nhuộm Gram (xem Phụ lục A.1)

4.2  Môi trường BHI (xem Phụ lục B.1)

4.3  Môi trường thạch máu (xem Phụ lục B.2)

4.4  Môi trường thạch sô-cô-la (xem Phụ lục B.3)

4.5  Máu, là máu cừu hoặc máu bê hoặc máu thỏ, vô trùng

4.6  Huyết thanh, là huyết thanh thai bê hoặc huyết thanh ngựa hoặc huyết thanh lợn, vô trùng

4.7  Chất chiết nấm men 25 %, vô trùng

4.8  NAD 1 %, vô trùng

4.9  Môi trường thạch MacConkey (xem Phụ lục B.4)

4.10  Các môi trường xác định các đặc tính sinh hóa (xem Phụ lục C)

4.11  Nguyên liệu cho phương pháp PCR (xem Phụ lục D)

4.12  Nguyên liệu cho phương pháp Reatime PCR (xem Phụ lục E)

4.13  Nước muối sinh lý (dung dịch natri clorua 0,9 %), vô trùng.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Tủ ấm, có bổ sung 5 % CO₂ thể tích và duy trì nhiệt độ 37 °C ± 0,5 °C.

5.2  Kính hiển vi, có vật kính với độ phóng đại 10 X, 40 X, 100 X.

5.3  Nồi hấp, duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C.

5.4  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g, 8 000 g, 12 000 g.

5.5  Máy PCR

5.6  Máy Realtime PCR

5.7  Bộ điện di, gồm bộ nguồn điện di, bể điện di, khay điện di.

5.8  Máy đọc gel

5.9  Pank, kéo, vô trùng.

5.10  Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,45 pm.

5.11  Pipet và đầu tip các loại, 100 µl, 200 µl, 1000 µl

5.12  Ống nghiệm, có thể tích từ 10 ml đến 15 ml, sạch và vô trùng.

5.13  Đĩa petri (hộp lồng), có đường kính từ 90 mm đến 100 mm, sạch và vô trùng.

5.14  Que cấy, vô trùng.

5.15  Bông cồn, bằng cottông đã được tẩm cồn 70 %

5.16  Tăm bông, vô trùng

5.17  Phiến kính, sạch.

5.18  Ống ly tâm (hoặc ống eppendorf), có dung tích 0,2 ml, 1,5 ml, vô trùng.

5.19  Cối chày sứ nghiền mẫu, vô trùng.

5.20  Buồng cấy an toàn sinh học cấp II

5.21  Dụng cụ đựng mẫu, lọ, túi nylon, vô trùng.

5.22  Tủ lạnh, duy trì nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C.

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh có thể gặp trên gà và một số loại gia cầm ở mọi lứa tuổi. Gà thịt thường mắc ở khoảng từ 3 đến 6 tuần tuổi; gà hậu bị, gà đẻ và gà giống thường mắc từ tuần tuổi thứ 6 và trong suốt quá trình đẻ trứng. Bệnh viêm phổi hóa mủ còn được thấy ở gà tây, vịt, ngan, ngỗng, chim bồ câu, chim cút, đà điểu, quạ, mòng biển;

- Bệnh xảy ra quanh năm, nhưng xuất hiện nhiều vào mùa đông, mùa xuân và thời điểm giao mùa;

- Bệnh lây trực tiếp từ con ốm sang con khỏe qua đường hô hấp hoặc gián tiếp qua thức ăn nước uống, dụng cụ chăn nuôi, vận chuyển...

- Tỷ lệ ốm của con vật bị nhiễm ORT gây bệnh viêm phổi hóa mủ cao, từ 50 % đến 100 %;

- Tỷ lệ chết của con vật bị mắc bệnh viêm phổi hóa mủ không cao, khoảng 5 % đến 20 %.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

Bệnh xảy ra không ồ ạt, mà ở từng ô chuồng. Gà chủ yếu mắc ở thể cấp tính, ủ bệnh từ 1 ngày đến 3 ngày thì xuất hiện triệu chứng:

- Lúc đầu gà thở khò khè, đôi lúc hắt hơi, vẩy mỏ;

- Có trường hợp gà chết nhanh, xác gà vẫn béo và chết trong trạng thái nằm ngửa;

- Sau 1 ngày đến 2 ngày tiếp theo, gà ủ rũ, khó thở tăng lên, há mỏ rướn cổ thở, ngáp gió, ho, lắc đầu, vảy mỏ, khẹc..

- Gà giảm ăn, chảy nước mắt mũi, sưng mặt;

- Với gà đẻ, sản lượng trứng giảm, trứng bị đẻ non nhiều và trứng vỏ mỏng;

Bệnh có thể xảy ra ở thể mãn tính: gà còi cọc, chậm lớn.

6.3  Bệnh tích

Bệnh tích chủ yếu ở đường hô hấp của gà như: Khí quản, màng phổi, phổi và các túi khí.

- Niêm mạc khí quản có thể xung huyết nhẹ. Từ minh quản xuống 2 phế quản và phổi, trong lòng ống bị viêm, có mủ hoặc bã đậu;

- Phổi bị viêm một bên hoặc cả hai bên, được bao bởi chất tiết keo dính giống như mủ. Trong phải có các cục mủ màu vàng hoặc có bã đậu hình ống.

- Túi khí bị viêm, dày lên, có chất tiết nhày màu trắng đục hoặc vàng đục, có lẫn bọt.

Một số bệnh tích khác của bệnh còn được ghi nhận như: Ở da vùng đầu bị phù, viêm não, viêm tủy xương, viêm khớp, màng bao tim và cơ tim bị viêm, gan sưng, lách sưng.

6.4  Chẩn đoán phân biệt

Chẩn đoán phân biệt bệnh viêm phổi hóa mủ với các bệnh khác có cùng triệu chứng:

- Bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn ORT: Gà bị ngạt thở, khó thở nhưng không thành chu kỳ. Tỷ lệ chết của bệnh thấp. Đặc trưng của bệnh là hình thành các cục bã đậu màu vàng, hình ống trong phổi và hai phế quản chính.

- Bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm (bệnh ILT): Gà khó thở, ngạt thở theo chu kỳ. Khi khó thở, gà tím mào, há mồm rướn dài cổ và vẩy mỏ khạc ra đờm, có thể lẫn máu. Sau đó trở lại bình thường. Tỷ lệ chết của bệnh cao và nhanh. Bệnh tích đặc trưng của bệnh là có các cục bã đậu ở ngã 3 thanh khí quản, dần trôi xuống khí quản.

- Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (bệnh IB): Gà khó thở, thở khò khè nhưng không rướn cổ ngáp. Tỷ lệ của bệnh chết cao. Bệnh tích đặc trưng của bệnh là khí quản có dịch nhầy, xuất huyết nặng. Xem thêm TCVN 8400-24.

- Bệnh hen và bệnh hen ghép với vi khuẩn E. coli (bệnh CRD và CCRD): Gà thở khò khè, chảy nước mũi, nước mắt có bọt khí. Tỷ lệ chết của bệnh thấp. Bệnh tích đặc trưng của bệnh là có viêm tơ huyết ở xoang bụng, xoang bao tim và túi khí.

7  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

7.1  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

7.1.1  Lấy mẫu

Bệnh phẩm là phổi, túi khí, dịch tiết đường khí quản.

Cách lấy mẫu:

- Lấy mẫu phổi: Dùng pank, kéo (5.9) để bóc tách lấy một hoặc cả hai bên phổi, cho vào từng lọ hoặc túi nylon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Lấy mẫu túi khí: Dùng pank, kéo (5.9) tách lấy màng túi khí, cho vào từng lọ hay túi nylon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

- Lấy mẫu khí quản: Dùng pank, kéo (5.9) để bóc tách cả đường khí quản, cho vào từng lọ hay túi nylon vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

Nếu lấy dịch tiết đường khí quản: Dùng pank, kéo (5.9) để mở đường khí quản, dùng tăm bông (5.16) ngoáy lấy dịch ở nhiều điểm trên đường khí quản. Tăm bông sau lấy mẫu được cho vào ống có dung dịch bảo quản hoặc nước muối sinh lý (4.13), đậy kín, ghi ký hiệu mẫu;

Mẫu bệnh phẩm nên được nuôi cấy trên môi trường càng sớm càng tốt. Trong trường hợp phải vận chuyển đến phòng thí nghiệm, mẫu bệnh phẩm phải được bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C.

Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ.

7.1.2  Bảo quản mẫu

- Mẫu bệnh phẩm được để trong dụng cụ đựng mẫu (5.21) có môi trường bảo quản, đóng kín, dán nhãn ghi rõ tên bệnh phẩm;

- Dụng cụ chứa mẫu bệnh phải giữ trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C;

- Các mẫu bệnh phải có giấy yêu cầu xét nghiệm kèm theo ghi rõ bệnh sử, triệu chứng, bệnh tích, đặc điểm dịch tễ của bệnh.

7.2  Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ORT

7.2.1  Xử lý mẫu và nuôi cấy vi khuẩn

- Mẫu bệnh phẩm là phổi: Dùng bông cồn (5.15) khử trùng bề mặt ngoài của phổi, dùng pank, kéo (5.9) cắt sâu vào tổ chức bên trong lấy một mẩu phổi nhỏ. Dùng pank (5.9) kẹp lấy mẩu phổi vừa cắt phết lên đĩa petri thạch máu (xem Phụ lục B.2), thạch sô-cô-la (xem Phụ lục B.3), thạch MacConkey (xem Phụ lục B.4) và cho mẩu phổi vào môi trường BHI (xem Phụ lục B.1). Dùng que cấy (5.14) ria chỗ đã phết bệnh phẩm trên các đĩa petri thạch máu, thạch sô-cô-la, thạch MacConkey. Đặt các ống môi trường BHI và đĩa thạch đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) tủ ấm có bổ sung CO₂, ủ ở 37 °C trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

- Mẫu bệnh phẩm là túi khí: Dùng pank (5.9) kẹp và cắt lấy một mẩu nhỏ túi khí phết lên các đĩa petri thạch máu (xem Phụ lục B.2), thạch sô-cô-la (xem Phụ lục B.3), thạch MacConkey (xem Phụ lục B.4) và cho mẩu phổi vào môi trường BHI (xem Phụ lục B.1). Dùng que cấy (5.14) ria chỗ đã phết bệnh phẩm trên các đĩa petri thạch máu, thạch sô-cô-la, thạch MacConkey. Đặt các ống môi trường BHI và đĩa thạch đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) tủ ấm có bổ sung CO₂, ủ ở 37 °C trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

- Mẫu bệnh phẩm là dịch khí quản (xem 6.1): Dịch khí quản được lấy bằng que cấy (5.14) hoặc bằng tăm bông (5.16). Phết dịch khí quản các đĩa petri thạch máu (xem Phụ lục B.2), thạch sô-cô- la (xem Phụ lục B.3), thạch MacConkey (xem Phụ lục B.4) và cho mẩu phổi vào môi trường BHI (xem Phụ lục B.1). Dùng que cấy (5.14) ria chỗ đã phết bệnh phẩm trên các đĩa petri thạch máu, thạch sô-cô-la, thạch MacConkey. Đặt các ống môi trường BHI và đĩa thạch đã cấy mẫu vào trong tủ ấm (5.1) có bổ sung CO₂, ủ ở 37 °C trong 18 h đến 24 h để nuôi mẫu.

7.2.2  Phân lập vi khuẩn

Sau 24 h đến 48 h, kiểm tra kết quả nuôi cấy:

- Môi trường BHI: Ống môi trường ít đục, vi khuẩn ORT mọc yếu trong môi trường BHI.

- Trên thạch máu: Khuẩn lạc ORT không gây dung huyết, có màu trắng xám đến xám, đôi khi hơi đỏ sẫm, mặt lồi với bờ rõ ràng, có kích thước từ 1 mm đến 3 mm.

- Trên thạch sô-cô-la: Vi khuẩn ORT mọc tốt hơn so với nuôi cấy trên môi trường thạch máu. Khuẩn lạc ORT không gây dung huyết, có màu trắng xám đến xám, đôi khi hơi đỏ sẫm, mặt lồi với bờ rõ ràng, có kích thước từ 1 mm đến 3 mm.

- Trên thạch MacConkey: Vi khuẩn ORT không mọc.

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường BHI (4.2) hoặc thạch máu (4.3) hoặc thạch sô-cô-la (4.4) nuôi trong tủ ấm có bổ sung CO₂ (5.1) để xác định hình thái vi khuẩn, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn, xác định vi khuẩn bằng phản ứng PCR hoặc realtime PCR.

7.3  Xác định vi khuẩn ORT

7.3.1  Xác định hình thái vi khuẩn ORT

Từ canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn ORT (xem 7.2.2) tiến hành làm tiêu bản:

- Từ khuẩn lạc: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (4.13) lên phiến kính (5.17), dùng que cấy (5.14) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước muối sinh lý.

- Từ canh khuẩn (BHI đã nuôi cấy vi khuẩn): Dùng que cấy (5.14) lấy một vòng canh khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính (5.17).

Tiêu bản được để khô và cố định trên ngọn lửa đèn cồn;

Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A);

Soi tiêu bản thấy vi khuẩn ORT bắt màu đỏ hoặc đỏ hồng (màu của Gram âm), đa hình thái (hình tròn, hình trứng, hình que).

7.3.2  Xác định vi khuẩn ORT bằng phản ứng sinh hóa

Từ canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi là vi khuẩn ORT (xem 7.2.2) tiến hành xác định một số đặc tính sinh hóa đặc trưng được nêu trong Bảng 1.

Môi trường xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ORT và cách tiến hành các phản ứng được nêu trong Phụ lục C.

Bảng 1 - Một số đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn ORT

7.3.3  Xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp PCR

7.3.3.1  Xử lý mẫu

- Mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản, màng túi khí: Dùng pank kéo (5.9) cắt nhỏ và nghiền mẫu bệnh phẩm với nước muối sinh lý (4.13) theo tỷ lệ 1 : 9 (phần thể tích) bằng cối chày sứ (5.19) thành huyễn dịch. Chuyển huyễn dịch vào 2 ống ly tâm 1,5 ml (5.18) bằng pipet (5.11). Một ống dùng để tách ADN tiến hành phản ứng PCR, realtime PCR; ống còn lại dùng làm mẫu lưu, bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

- Mẫu bệnh phẩm là dịch tiết đường khí quản: Chuyển tăm bông đã lấy dịch tiết đường khí quản vào ống thu mẫu có sẵn nước muối sinh lý và lắc kỹ để đồng nhất mẫu. Chuyển dung dịch mẫu đã đồng nhất vào 2 ống ly tâm 1,5 ml (5.18) bằng pipet (5.11). Một ống dùng để tách ADN tiến hành phản ứng PCR, realtime PCR; ống còn lại dùng làm mẫu lưu, bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

- Đối với khuẩn lạc nghi ngờ (xem 7.2.2): Dùng pipet (5.11) hút 200 µl nước cất vào ống ly tâm 1,5 ml (5.18). Dùng que cấy (5.14) lấy từ 2 khuẩn lạc đến 3 khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn ORT hòa vào 200 µl nước cất vô trùng, lắc đều.

- Đối với canh khuẩn (xem 7.2.2): Dùng pipet (5.11) hút 200 µl canh khuẩn nghi ngờ là vi khuẩn ORT vào ống ly tâm 1,5 ml (5.18).

7.3.3.2  Tách chiết ADN

Mẫu bệnh phẩm được tách chiết ADN bằng kít thương mại. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002) [1]⁾.

Mẫu bệnh phẩm là khuẩn lạc hoặc canh khuẩn nghi ngờ là vi khuẩn ORT có thể được tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt (xem Phụ lục D.2).

7.3.3.3  Cách tiến hành

Xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 - Cặp mồi xác định vi khuẩn ORT ^[1]

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng PCR, chu trình nhiệt của phản ứng PCR được quy định tại Phụ lục D.

7.3.3.4  Đọc kết quả

Xem Phụ lục D.6.

Phản ứng PCR được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính có vạch đúng kích cỡ sản phẩm (sản phẩm 784 bp); mẫu đối chứng âm không có vạch sản phẩm;

Mẫu kiểm tra dương tính với vi khuẩn ORT khi kết quả PCR có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (kích cỡ sản phẩm 784 bp).

7.3.4  Xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp realtime PCR

7.3.4.1  Xử lý mẫu

Xem 7.3.3.1

7.3.4.2  Tách ADN

Xem 7.3.3.2.

7.3.4.3  Cách tiến hành

Xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp realtime PCR với cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Cặp mồi và mẫu dò xác định vi khuẩn ORT ^[2]

Chuẩn bị mẫu, các bước tiến hành phản ứng realtime PCR, chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR được quy định tại Phụ lục E.

7.3.4.4  Đọc kết quả

Xem Phụ lục E.5.

Điều kiện phản ứng được công nhận; Mẫu đối chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 giá trị Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct;

Mẫu kiểm tra dương tính với vi khuẩn ORT khi giá trị Ct ≤ 35;

8  Kết luận

Gà được kết luận mắc bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn ORT khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và một trong số các kết quả sau đây:

- Phân lập và xác định được vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa (xem 7.3.2);

- Kết quả PCR dương tính với vi khuẩn ORT (xem 7.3.3);

- Kết quả realtime PCR dương tính với vi khuẩn ORT (xem 7.3.4).

Phụ lục A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

A.1  Thuốc thử

A.1.1  Dung dịch tím tinh thể

Hoà tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2  Dung dịch fuchsin đậm đặc

Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích).

A.1.3  Dung dịch lugol

Nghiền kali iodua và iốt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4  Cồn axeton

A.2  Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc để khô.

A.3  Soi tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (5.2).

Phụ lục B

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ORT

B.1  Môi trường BHI

B.1.1  Nguyên liệu

Thành phần:

Môi trường BHI (*)         3,7 g

Nước cất vừa đủ           100 ml

Chỉnh pH = 7,4 ±0,2 ở 25 °C

VÍ DỤ: Môi trường BHI của hãng Merck (Cat. No. 110493)[2]⁾

B.1.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường BHI theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Lắc đều và phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống khoảng 5 ml môi trường BHI (B.1.1).

Hấp tiệt trùng các ống nghiệm chứa môi trường BHI ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Đặt ít nhất một ống môi trường BHI vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, môi trường BHI trong, không đục và không có váng là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các ống nghiệm chứa môi trường BHI trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.2  Môi trường thạch máu

B.2.1  Nguyên liệu

Thành phần:

Môi trường thạch máu: sử dụng môi trường thương mại.

VÍ DỤ: Mối trường thạch máu cơ bản (Blood agar base) của hãng Merck (Cat. No. 110886)[3]⁾.

B.2.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản theo hướng dẫn của nhà sản xuất, phân phối vào các bình. Đưa các bình chứa thạch máu vào nồi hấp (5.3) hấp tiệt trùng ở 121 °C trong 20 min.

Để môi trường thạch máu cơ bản nguội đến khoảng 40 °C thì bổ sung từ 5 % đến 7 % thể tích máu.

Lắc trộn đều máu với môi trường thạch máu cơ bản và phân phối vào các đĩa petri (5.13) khoảng 20 ml/đĩa.

Đặt ít nhất một đĩa môi trường thạch máu vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, trên bề mặt môi trường thạch máu không có khuẩn lạc mọc là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các đĩa thạch máu trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.3  Môi trường thạch sô-cô-la

B.3.1  Nguyên liệu

Thành phần môi trường thạch sô-cô-la:

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

B.3.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thạch máu cơ bản theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Môi trường thạch máu cơ bản sau khi đã vô trùng xong, để nhiệt độ môi trường giảm xuống khoảng 70 °C thì bổ sung máu vào. Duy trì nhiệt độ của môi trường này bằng bể ủ nhiệt ở 70 °C trong 20 min và có lắc đều.

Để môi trường nguội xuống khoảng 40 °C bổ sung huyết thanh, chất chiết nấm men và NAD. Lắc trộn đều các thành phần và phân phối vào các đĩa petri (5.13) khoảng 20 ml/đĩa.

Đặt ít nhất một đĩa môi trường thạch sô-cô-la vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, trên bề mặt môi trường thạch sô-cô-la không có khuẩn lạc mọc là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các đĩa thạch sô-cô-la trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

B.4  Môi trường thạch MacConkey

B.4.1  Nguyên liệu

Thành phần:

Chỉnh pH = 7,4 ± 0,2 ở 25 °C

B.4.2  Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường thạch MacConkey theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Vô trùng môi trường thạch MacConkey ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Lắc đều, để môi trường nguội xuống khoảng 40 °C, chia ra đĩa petri (5.13) khoảng 20 ml/đĩa.

Đặt ít nhất một đĩa môi trường thạch MacConkey vào trong tủ ấm (5.1) ủ ở 37 °C với điều kiện hiếu khí để kiểm tra vô trùng. Sau từ 18 h đến 24 h, trên bề mặt môi trường thạch MacConkey không có khuẩn lạc mọc là đảm bảo vô trùng sẽ được bảo quản và sử dụng.

Bảo quản các đĩa thạch MacConkey trong tủ lạnh (5.22) ở nhiệt độ 4 °C.

Phụ lục C

(Quy định)

Xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ORT

C.1  Phản ứng oxidase

Tiến hành phản ứng trên giấy có tẩm sẵn dung dịch thuốc thử Tetrammethyl-P. phenylen diamin hydrochlorid 1 % hoặc nhỏ 1 giọt dung dịch thuốc thử Tetrammethyl-P. phenylen diamin hydrochlorid 1 % lên giấy lọc.

Dùng que cấy (5.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 7.2.2) phết lên mặt giấy đã thấm thuốc thử.

Đọc kết quả sau 30 s:

- Dương tính: Tại chỗ phết khuẩn lạc có xuất hiện màu tím;

- Âm tính: Không xuất hiện màu tím.

C.2  Phản ứng catalase

Nhỏ một giọt dung dịch H₂O₂ 3 % lên phiến kính (5.17).

Dùng que cấy (5.14) lấy khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 7.2.2) cho vào giọt dung dịch H₂O₂.

Đọc kết quả sau 5 s:

- Phản ứng dương tính: Có hiện tượng sủi bọt;

- Phản ứng âm tính: Không có hiện tượng sùi bọt

C.3  Khả năng di động

C.3.1  Thành phần môi trường

C.3.2  Chuẩn bị

Hòa gelatin vảo nước để 30 min, bổ sung các thành phần khác, đun cho tan hoàn toàn.

Chia ra các ống nghiệm (5.12), khoảng 6 ml cho mỗi ống nghiệm.

Vô trùng môi trường ở 115 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

C.3.3  Cách tiến hành

Dùng que cấy (5.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 7.2.2) cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường (C.3.1). Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h.

C.3.4  Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính (có khả năng di động): Môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu;

- Phản ứng âm tinh: Môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu.

C.4  Khả năng phân giải urê

Sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen). Pha chế môi trường và bổ sung urê theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Dùng que cấy (5.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 7.2.2) cấy vào môi trường thạch urê. Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển sang màu hồng;

- Phản ứng âm tính: Môi trường không chuyển màu.

C.5  Khả năng phân giải arginin

C.5.1  Thành phần môi trường arginin

Thành phần:

Chỉnh pH đến 6,0

Dung dịch chỉ thị màu Bromocresol purple

C.5.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên và chỉnh pH môi trường trong khoảng 6,0 ± 0,2.

Chia môi trường ra ống nghiệm (5.12), chia khoảng 4 ml môi trường/ống.

Vô trùng môi trường ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

Kiểm tra vô trùng môi trường. Bảo quản môi trường ở điều kiện khoảng từ 4 °C đến 8 °C.

C.5.3  Cách tiến hành

Dùng que cấy (5.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 7.2.2) cấy vào môi trường canh thang arginin. Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h.

C.5.4  Đọc kết quả

- Dương tính: Môi trường chuyển màu tím;

- Âm tính: Môi trường có màu vàng (không chuyển màu).

Nếu sử dụng môi trường thương mại thì pha chế và đọc kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.6  Khả năng phân giải lysin

Sử dụng môi trường có lysin như canh thang lysin decarboxylase hoặc thạch sắt - lysin. Cách pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Nếu sử dụng môi trường canh thang lysin decarboxylase.

Dùng que cấy (5.14) lấy canh khuẩn hoặc khuẩn lạc của vi khuẩn nghi ngờ (xem 7.2.2) cấy vào môi trường canh thang lysin decarboxylase. Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển sang màu tím đậm hoặc màu đỏ tía;

- Phản ứng âm tính: Môi trường chuyển sang màu vàng.

C.7  Khả năng lên men đường

C.7.1  Thành phần

- Môi trường nước pepton (pha theo hướng dẫn của nhà sàn xuất).

- Dung dịch chỉ thị màu bromocrezol: cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % (thể tích) và lắc cho tan hết.

- Các đường: glucose, lactose, fructose, galactose, maltose, sucrose, arabinose, sorbitol.

C.7.2  Chuẩn bị môi trường pepton - đường

- Chuẩn bị môi trường pepton có chất chỉ thị:

Cho 1 ml chỉ thị màu bromocrezol vào 100 ml môi trường nước pepton.

Đun sôi, lắc kỹ môi trường.

Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2

Chia môi trường ra các ống nghiệm (5.12), chia 4 ml môi trường/ống.

Vô trùng môi trường pepton đã có chất chỉ thị ở 121 °C trong 20 min bằng nồi hấp (5.3).

- Chuẩn bị dung dịch đường 10 % (thể tích):

Các đường glucose, lactose, fructose, galactose, maltose, sucrose, arabinose, sorbitol được pha trong nước thành từng dung dịch đường 10 %.

Vô trùng các dung dịch đường bằng nồi hấp (5.3) ở 110 °C trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc (5.10) có kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

- Chuẩn bị dung dịch pepton - đường:

Mỗi 1 ống môi trường pepton đã có chất chỉ thị được bổ sung 1 loại đường đã được vô trùng.

Bổ sung 0,4 ml dung dịch đường/1 ống pepton đã có chất chỉ thị. Ghi tên từng loại đường lên thân ống.

C.7.3  Cách tiến hành

Dùng que cấy (5.14) lấy khuẩn lạc hoặc dùng pipet (5.11) để lấy canh khuẩn của vi khuẩn ORT nghi ngờ (xem 7.2.2) cấy vào từng ống môi trường pepton - đường (xem C.7.2).

Sử dụng một bộ môi trường pepton - đường không có vi khuẩn để làm đối chứng.

Nuôi trong tủ ấm (5.1), đọc kết quả sau 24 h.

C.7.4  Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu vàng;

- Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu (giống môi trường làm đối chứng).

Phụ lục D

(Quy định)

Xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp PCR

D.1  Nguyên liệu cho phương pháp PCR

D.1.1  Taq PCR Master Mix Kit;

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen Taq PCR Mastermix kit Qiagen (Cat. No. 201443); Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2 X) (Cat. No. K1071) [6]⁾.

D.1.2  Cặp mồi (primers): mồi xuôi (OR16S-F1) và mồi ngược (OR16S-R1) (Bảng 2);

D.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

D.1.4  Dung dịch đệm điện di: có thể dùng dung dịch đệm TAE hoặc TBE;

D.1.5  Chất nhuộm màu ADN;

VÍ DỤ: Chất nhuộm màu SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen; hoặc chất nhuộm màu Gel Red của hãng Biotium ⁶⁾.

CẢNH BÁO: Không sử dụng chất nhuộm màu ethidi bromua vì có thể gây ung thư.

D.1.6  Đệm tải mẫu (Loading dye);

D.1.7  ADN chuẩn (Ladder, marker), thang 100 bp;

D.1.8  Dung dịch đệm TE.

D.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: Là bệnh phẩm nghi mắc bệnh ORT (xem 7.1.1) hoặc là canh khuẩn, khuẩn lạc vi khuẩn ORT nghi ngờ (xem 7.2.2).

Mẫu đối chứng dương: Là chủng vi khuẩn đã được xác định là ORT hoặc sử dụng các chủng ORT chuẩn.

Tách chiết ADN

- Tách chiết ADN của vi khuẩn ORT bằng kít thương mại: Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002) [7]⁾.

- Tách chiết ADN của vi khuẩn ORT bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 2 khuẩn lạc đến 3 khuẩn lạc, hòa vào 200 µl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (5.4) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

D.3  Chuẩn bị mồi

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (5.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (D.1.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM/µl làm mồi gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM/µl: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (D.1.3).

VÍ DỤ: lấy 20 µl mồi gốc có nồng độ 100 µl và thêm 80 µl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 µM/µl.

D.4  Cách tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem D.3). Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml (5.18).

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Dùng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Taq PCR Mastermix (2X) (Cat. No. K1071) ⁷⁾, thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng D.1.

Bảng D.1 - Thành phần của phản ứng PCR xác định vi khuẩn ORT

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN của vi khuẩn ORT vào ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease vảo ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: Cho 5 µl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy PCR (5.5) với chu trình nhiệt như nêu trong Bảng D.2.

Bảng D.2 - Chu trình nhiệt xác định vi khuẩn ORT

CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo bộ kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

D.5  Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE có bổ sung chất nhuộm màu (D.1.5). Cách pha chế thạch agarose và bổ sung chất nhuộm màu, sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Cho 2 µl dung dịch đệm tải vào 10 µl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 µl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được chạy điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch) ở bộ điện di (5.7), trong thời gian từ 20 min đến 30 min, ở 100 V.

D.6  Đọc kết quả

Phản ứng PCR được công nhận khi: Mẫu đối chứng dương tính có vạch đúng kích cỡ sản phẩm (sản phẩm 784 bp); mẫu đối chứng âm không có vạch sản phẩm;

Mẫu kiểm tra dương tính khi có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương (kích cỡ sản phẩm 784 bp);

Mẫu kiểm tra âm tính khi không có vạch sản phẩm giống mẫu đối chứng dương;

Phụ lục E

(Quy định)

Xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp reatime PCR

E.1  Nguyên liệu cho phương pháp realtime PCR

E.1.1  Realtime PCR master mix [8]⁾;

E.1.2  Cặp mồi (primers) và mẫu dò (probe): xem Bảng 3;

E. 1.3  Nước tinh khiết không có nuclease;

E.1.4  Dung dịch đệm TE

E.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: là bệnh phẩm nghi mắc bệnh ORT (xem 7.2.1) hoặc là canh khuẩn, khuẩn lạc vi khuẩn ORT nghi ngờ (xem 7.2.2).

Mẫu đối chứng dương: là chủng vi khuẩn đã được xác định là ORT hoặc sử dụng các chủng ORT chuẩn.

Tách chiết ADN

Tách chiết ADN của vi khuẩn ORT bằng kít thương mại: Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002) [9]⁾.

Tách chiết ADN của vi khuẩn ORT bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 2 khuẩn lạc đến 3 khuẩn lạc, hòa vào 200 pl nước vô trùng không chứa nuclease. Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (5.4) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

E.3  Chuẩn bị mồi (primers) và mẫu dò (probe)

Mồi/mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi/mẫu dò gốc: Mồi/mẫu gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (5.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên.

Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (E.1.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM/µl làm mồi gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ờ nồng độ 20 µM/µl; mẫu dò sử dụng ở nồng độ 10 µM/µl: Pha loãng mồi gốc/mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (E.1.3).

VÍ DỤ: Pha mồi sử dụng lấy 20 µl mồi gốc có nồng độ 100 µl và thêm 80 µl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 µM/µl; Pha mẫu dò sử dụng lấy 10 µl mồi gốc có nồng độ 100 µl và thêm 90 µl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 10 µM/µl.

E.4  Cách tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem E.3). Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen QuantiTect Probe PCR kit, code: 204343 [10]^).

Bảng E.1 - Thành phần của phản ứng realtime PCR xác định vi khuẩn ORT

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN của vi khuẩn ORT vào ống phản ứng;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm tra: Cho 5 µl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng Realtime PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (5.6) với chu trình nhiệt như nêu trong Bảng E.2.

Bảng E.2 - Chu trình nhiệt xác định vi khuẩn ORT

E.5  Đọc kết quả

Đọc kết quả phản ứng bằng máy Reatime PCR dựa trên giá trị Ct (thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền).

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 giá trị Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct;

- Mẫu kiểm tra dương tính khi giá trị Ct ≤ 35;

- Mẫu kiểm tra âm tính khi không có giá trị Ct;

- Mẫu kiểm tra nghi ngờ khi có giá trị 35 < Ct ≤ 40.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 8400-24, Bệnh động vật- Quy trình chẩn đoán - Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm

[2] Hafez Mohamed Hafez, 2002. Diagnosis of Omithobacterium Rhinotracheale. International Journal of Poultry Science 1(5): p. 114 - 118.

[3] E. M. Abdelwhab, D. Lϋschow , and H. M. Hafez, 2013. Development of Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for Detection of Ornithobacterium rhinotracheale in Poultry. American Association of Avian Pathologists, p. 663 - 666.

[4] Zahra M., Ferreri. M, Alkasir. R., Yin. J., Han. B., Su. J., 2013. Isolation and Characterization of Small-Colony Variants of Ornithobacterium rhinotracheale. Journal Clinical Microbiology, p.3228 - 3236.

[5] Eunice Ventura Barbosa, Clarissa Varajao Cardoso, 2019. Ornithobacterium Rhinotracheale: An update review about an emerging poultry pathogen. Veterinary sciences, doi:10.3390/vetsci7010003.

[6] Nguyễn Thị Lan, Chu Đức Thắng, Nguyễn Bá Hiên, Phạm Hồng Ngân, Lê Văn Hùng, Nguyễn Thị Yến, 2016. Đặc điểm của vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) phân lập được từ đàn gà nuôi tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, tập 14, số 11, trang 1734-1740.