Tiêu chuẩn TCVN 8400-14:2011 Quy trình chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8400-14:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 14: BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU BÒ

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 14: Haemorrhagic septicemia in cattle disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò (haemorrhagic septicemia in cattle disease)

Bệnh truyền nhiễm phổ biến ở trâu, bò do vi khuẩn P. multocida gây ra, thường xảy ra ở thể nhiễm trùng máu với đặc điểm đặc trưng là trâu, bò chết nhanh, tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ chết cao.

CHÚ THÍCH: Bệnh phổ biến ở châu Á và châu Phi. Ở châu Á, bệnh chủ yếu do vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B (theo phân loại của Cater và Haddleston) gây ra.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

Xem Phụ lục A và Phụ lục B về mô tả các dung dịch thuốc thử.

- Thạch máu.

- Thạch Macconkey.

- Canh thang BHI.

- Thạch urê.

- Môi trường nước pepton

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 oC.

- Tủ sấy.

- Nồi hấp.

- Buồng cấy.

- Kính hiển vi quang học.

- Tủ lạnh.

- Que cấy.

- Đèn cồn.

- Đĩa Petri để đổ môi trường.

- Panh.

- Kéo.

- Lamen (coverlip).

- Phiến kính.

- Pipet thủy tinh các cỡ.

- Lọ thủy tinh các cỡ: 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml.

5. Cách tiến hành

5.1 Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Đặc điểm dịch tễ

Động vật cảm nhiễm: Trâu, bò mọi lứa tuổi đều có thể nhiễm bệnh, tuy nhiên động vật non mẫn cảm với bệnh hơn động vật già.

Bệnh có tính chất lây lan cục bộ địa phương, từng vùng nhất định, những vùng lầy lội, ruộng nước, khí hậu nóng ẩm.

Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng hay gặp nhất là vào đầu mùa mưa. Bệnh lây lan chủ yếu qua đường hô hấp.

Bệnh thường phát khi có stress như: Sự thay đổi về khí hậu đột ngột, do điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém hoặc do vận chuyển động vật.

5.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Bệnh thường xảy ra ở thể quá cấp tính và thể cấp tính, con vật chết nhanh từ vài h đến hai ngày từ khi xuất hiện những triệu chứng lâm sàng.

Con vật đờ đẫn, sốt từ 41 oC đến 42 oC, khó thở, có khi ho khan. Con vật chảy nước mắt, nước dãi, nước mũi nhiều.

Sưng, phù ở vùng ngực có thể lan xuống cổ và yếm.

Có triệu chứng thần kinh: hung dữ, điên cuồng ...

Có con có hiện tượng bụng chướng to.

Con vật kiệt sức, suy hô hấp và chết trong vòng vài h.

5.1.3 Bệnh tích

Phúc mạc viêm thủy thũng có nước vàng.

Xoang bao tim, xoang ngực và xoang bụng có dịch màu hồng nhạt. Phổi viêm.

Hạch lâm ba xuất huyết lấm tấm, tổ chức liên kết dưới da đặc biệt là ở hạch lâm ba vùng cổ và vùng đầu. Bắp thịt và niêm mạc xuất huyết màu hồng tím.

Trong các trường hợp bệnh quá cấp tính thường không thể hiện bệnh tích điển hình.

5.2 Lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm:

- Máu tim, dịch xoang bao tim: Dùng bơm, kim tiêm hoặc pipet lấy máu tim, dịch bao tim.

- Phổi: Dùng dao cắt nơi có biến đổi bệnh lý và tổ chức lành với lượng từ 10 g đến 200 g và đựng vào lọ miệng rộng hoặc túi nilon.

- Xương ống: Lấy dao cắt hai đầu khớp, róc sạch thịt.

CHÚ THÍCH: Các dụng cụ lấy mẫu như dao, kéo, panh kẹp phải được sát trùng bằng cồn 70 % trước và sau khi lấy mẫu. Bệnh phẩm phải lấy vô trùng ngay sau khi gia súc chết càng nhanh càng tốt.

Bệnh phẩm phải được bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 oC đến 8 oC và gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và những thông tin về dịch tễ.

5.3 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.3.1 Kiểm tra hình thái vi khuẩn từ bệnh phẩm

5.3.1.1 Cách làm tiêu bản

Bệnh phẩm tổ chức: Cắt một miếng nhỏ phủ tạng (gan, lách, phổi) phết lên phiến kính sạch, để khô.

Bệnh phẩm máu: Lấy một giọt máu nhỏ lên phiến kính sạch, sau đó dàn mỏng đều bằng phiến kính khác, để khô.

5.3.1.2 Cố định tiêu bản

Tiêu bản đã để khô, nhỏ cồn metanol ngập tiêu bản, để khô.

5.3.1.3 Nhuộm tiêu bản

Nhuộm Gram theo quy định tại Phụ lục A. 
Nhuộm Giemsa theo quy định tại Phụ lục B.

5.3.1.4 Hình thái vi khuẩn

Nhuộm Gram: Vi khuẩn P. multocida bắt màu hồng (màu của vi khuẩn gram âm), lưỡng cực (hai đầu đậm hơn), có dạng cầu trực khuẩn, hình chấm tròn hoặc hình que. Vi khuẩn không có nha bào, lông nhưng có giáp mô tạo thành vòng sáng xung quanh vi khuẩn.

Nhuộm Giemsa: Vi khuẩn hình bầu dục, bắt màu tím, lưỡng cực.

5.3.2 Tiêm động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm: Chuột bạch hoặc thỏ.

Tiêm động vật thí nghiệm: Máu, tuỷ xương hoặc phủ tạng được nghiền nát, hoà với nước muối sinh lý 0,9 % theo tỷ lệ 1/10, tiêm cho chuột bạch (từ 0,1 ml đến 0,2 ml), thỏ (từ 1 ml đến 2 ml) vào dưới da, xoang phúc mạc hoặc tĩnh mạch.

P. multocida làm chết động vật thí nghiệm trong vòng 24 h đến 36 h. Máu tim và phủ tạng được lấy để phết tiêu bản kiểm tra trực tiếp trên kính hiển vi và tiến hành phân lập giám định vi khuẩn.

5.3.3 Nuôi cấy, phân lập, giám định vi khuẩn

5.3.3.1 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

Bệnh phẩm được cấy vào môi trường thạch máu, thạch Macconkey, canh thang BHI. Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường phân lập sau 24 h nuôi cấy như sau: 
Môi trường canh thang BHI

- Pasteurella mọc làm đục môi trường, lắc có vẩn nhẹ (vẩn sương mù) môi trường không có cặn ở đáy. Môi trường thạch máu

- Khuẩn lạc của P. multocida có 3 dạng: Dạng nhầy (M) kích thước to nhất, trắng hơi xám khuẩn lạc nhầy, ướt. Dạng (S) kích thước nhỏ bóng, rìa nhẵn, mặt vồng. Dạng xù xì (R) thường dẹt.

- P. multocida không gây dung huyết trên thạch máu.

- Khuẩn lạc của P. multocida có mùi tanh của nước dãi khô.

Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn P. multocida không mọc trên thạch MacConkey.

Cấy khuẩn lạc có hình thái đặc trưng vào môi trường thạch thường hoặc thạch máu hay canh thang BHI ủ ở 37 oC trong vòng 18 h đến 24 h để tiến hành kiểm tra hình thái vi khuẩn, đặc tính sinh hoá.

5.3.3.2 Giám định vi khuẩn

1.3.3.2.1 Giám định hình thái vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy

Làm tiêu bản và cố định tiêu bản: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính hoặc lấy một vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính, để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.

Nhuộm tiêu bản: Tiêu bản sau khi đã cố định, nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram (Phụ lục A).

Hình thái vi khuẩn: Vi khuẩn bắt màu đỏ không nhìn rõ lưỡng cực như tiêu bản nhuộm từ tổ chức hay máu, có dạng cầu trực khuẩn hoặc đa hình thái: hình bầu dục, hình chấm tròn hoặc hình que. Vi khuẩn đứng rải rác, không thành chuỗi.

1.3.3.2.2 Giám định các đặc tính sinh hóa

Giám định các tính chất sinh hóa theo bảng sau:

Phương pháp tiến hành: Phụ lục C.

1.3.3.2.3 Thử độc lực trên động vật thí nghiệm

Huyễn dịch tiêm: Lấy khuẩn lạc, phân lập được từ bệnh phẩm sau khi đã được giám định hình thái, tính chất mọc trên các môi trường và sinh hoá cấy vào môi trường nước thịt, nuôi cấy tĩnh (không lắc) ở 37 oC sau 24 h lấy 0,2 ml canh trùng tiêm cho hai chuột theo dõi trong 7 ngày.

Đọc kết quả:

- Nếu tất cả 2 chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực cao.

- Nếu một nửa số chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng có độc lực yếu.

- Nếu không có chuột chết: Vi khuẩn tụ huyết trùng không có độc lực.

CHÚ THÍCH: Vi khuẩn tụ huyết trùng phân lập được từ động vật thí nghiệm chết sau khi tiêm bệnh phẩm không cần kiểm tra lại độc lực trên động vật thí nghiệm.

6. Kết luận

Trâu, bò bị bệnh tụ huyết trùng khi có các đặc điểm sau:

- Con vật có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích của bệnh.

- Kết quả nuôi cấy, phân lập, giám định sinh hóa xác định là vi khuẩn P.multocida.  Vi khuẩn có độc lực.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

A.1 Thuốc nhuộm

A.1.1 Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C25H30N3Cl)                                                                2,0 g

Etanol 95 %                                                                                     20,0 ml

Amoni oxalat [(NH4)2C2O4.2H2O]                                                     0,8 g

Nước                                                                                               80,0 ml

Hoà tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2 Dung dịch fuchsin basic

Fuchsin basic (C20H20ClN3)                                                          1 g

Etanol 95 %                                                                                     10 ml

Phenol (C6H6O)                                                                               5 g

Nước                                                                                               100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỉ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước.

A.1.3 Dung dịch lugol

Kali iodua (KI)                                                                                  2 g

Iôt (I2) tinh thể                                                                                  1 g

Nước                                                                                               200 ml

Nghiền kali iodua và iôt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Cồn axeton

Etanol 95 %                                                                           3 phần

Axeton                                                                                    1 phần

A.2. Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn-axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc sấy khô.

A.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GIEMSA

B.1 Thuốc nhuộm

Giemsa dạng bột                                                                             1 g

Glyxerin [C3H5(OH)3]                                                                      60 ml

Metanol nguyên chất                                                                       60 ml

Làm nóng glyxerin đến khoảng 55oC đến 60oC trong nồi đun cách thủy. Thêm thuốc nhuộm Giemsa, trộn đều và ủ trong 2 h. Sau đó, để nguội và thêm metanol giữ trong khoảng 2 tuần trước khi sử dụng. Khi sử dụng, pha loãng theo tỷ lệ 1/10 (phần thể tích) trong dung dịch đệm phosphat 0,01 M (pH 7,0) và giữ trong 30 min.

CHÚ THÍCH:   Có thể sử dụng thuốc thử Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.2 Cách tiến hành

Sau khi làm xong tiêu bản máu, cố định tiêu bản bằng metanol nguyên chất trong 10 min rồi rửa bằng nước. Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, để trong 20 min đến 30 min rồi rửa nhanh với nước và sấy khô.

B.3 Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.

PHỤ LỤC C

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP GIÁM ĐỊNH SINH HÓA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

C.1 Giám định khả năng lên men đường glucoza, lactoza, sinh H2S, sinh hơi

C.1.1 Môi trường

Dùng thạch nghiêng chế từ Kligler hoặc TSI. Thạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men đường glucoza, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactoza.

C.1.2 Tiến hành

Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm, rút dần que lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi cấy ở 37oC trong điều kiện hiếu khí 24 h.

C.1.3 Đọc kết quả

a) Lên men đường lactoza:

- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng. 
- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng.

b) Lên men đường glucoza:

- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng; 
- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng.

c) Khả năng sinh H2S:

- Dương tính: Ống nghiệm có màu đen;

- Âm tính: Ống nghiệm không có màu đen.

d) Khả năng sinh hơi:

- Dương tính: Thạch trong ống nghiệm bị nứt hay đẩy lên;

- Âm tính: Thạch trong ống nghiệm không bị nứt hay đẩy lên.

C.2 Khả năng sinh indol

C.2.1 Thuốc thử Kovac’s

Paradimetyl aminobenzaldehyt 5 g

Cồn amylic (C5H11OH)  75 ml

Axit clohydric đặc          25 ml

Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh 4oC. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml HCl, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục bổ sung HCl.

Bảo quản thuốc thử trong lọ màu, ở 4oC.

C.2.2. Cách tiến hành

Cấy vi khuẩn vào môi trường nước peptone hoặc môi trường nước peptone có bổ sung tryptophan, nuôi cấy ở 37oC. Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ. Phản ứng dương tính khi có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường (sinh indol). Phản ứng âm tính khi không có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường.

C.3 Phân giải Urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen) (chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo chỉ dẫn của nhà sản xuất).

Cấy vi khuẩn vào môi trường có urê, nuôi cấy ở 37oC, sau 24 h đọc kết quả.

- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu tím.

C.4 Phản ứng oxidaza

Phản ứng được tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% tetra methyl P-phenyl diamine hydroclorua. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch chà sát lên trên mặt giấy. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đen tím sau 30 s. Phản ứng âm tính khi giấy tẩm giữ nguyên màu.

C.5 Phản ứng catalaza

Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch. Nhỏ một giọt dung dịch H2O23 % lên khuẩn lạc trên phiến kính. Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau vài giây. Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt.