Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12657:2019 Thực phẩm - Định lượng nhanh nấm men và nấm mốc sử dụng đĩa đếm Petrifilm™3M™

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN-12657:2019

THỰC PHẨM - ĐỊNH LƯỢNG NHANH NẤM MEN VÀ NẤM MỐC SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM™ 3M™

Foods - Enumeration of yeast and mold using 3M™ Petrifilm™ rapid count plate

Lời nói đầu

TCVN 12657:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2014.05 Enumeration of yeast and mold in food, 3M™ Petrifilm™ Rapid yeast and mold Count Plate;

TCVN 12657:2019 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỰC PHẨM - ĐỊNH LƯỢNG NHANH NẤM MEN VÀ NẤM MỐC SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM™ 3M™

Foods - Enumeration of yeast and mold using 3M™ Petrifilm™ rapid count plate

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa đếm Petrifilm™ 3M™ để định lượng nhanh nấm men và nấm mốc trong sản phẩm thực phẩm có hoạt độ nước cao và sản phẩm có hoạt độ nước thấp.

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận giá trị sử dụng và các kết quả đánh giá được nêu trong Phụ lục A.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật.

3  Nguyên tắc

Phương pháp này sử dụng các đĩa đếm Petrifilm 3M định lượng nhanh nấm men và nấm mốc [Rapid Yeast and Mold (RYM)] chứa môi trường dinh dưỡng được bổ sung các chất kháng sinh, chất tạo đông tan được trong nước lạnh và hệ chất chỉ thị nấm men và nấm mốc. Các đĩa đếm Petrifilm 3M RYM được dùng để định lượng nấm men và nấm mốc trong hầu hết các nền mẫu thực phẩm sau 48 h.

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương trừ khi có quy định khác.

4.1  Dịch pha loãng, pepton 0,1 % vô trùng.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1  Đĩa Petrifilm 3M RYM

LƯU Ý: Bảo quản các túi đựng đĩa RYM trong tủ lạnh hoặc tủ lạnh đông. Ngay trước khi sử dụng, để các túi chưa mở đạt đến nhiệt độ phòng (20 °C đến 25 °C) và độ ẩm tương đối nhỏ hơn 60 %. Sau khi dùng, nếu còn các đĩa chưa sử dụng thì gập và làm kín mép túi. Không để các túi đã mở trong tủ lạnh. Bảo quản các túi đã làm kín nơi khô ráo, ở nhiệt độ phòng (20 °C đến 25 °C) và độ ẩm tương đối nhỏ hơn 60 % không quá 4 tuần. Nếu nhiệt độ phòng thử nghiệm cao hơn 25 °C và/hoặc độ ẩm cao hơn 60 % thì nên bảo quản các túi đã làm kín này trong tủ lạnh đông.

Nếu bảo quản các túi đã làm kín trong tủ lạnh đông thì cần phải để trong vật chứa kín.

Các dĩa RYM sau khi đã nuôi cấy có thể được bảo quản đến 7 ngày ở nhiệt độ - 10 °C đến - 20 °C.

Cần tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.2  Pipet, đã được hiệu chuẩn, dung tích 1,0 ml, chia vạch đến 0,1 ml, có đầu tip vô trùng. Có thể dùng pipet tự động.

5.3  Thiết bị trộn nhu động, có túi trộn.

5.4  Dụng cụ dàn mẫu cầm tay bằng chất dẻo, được cung cấp cùng với đĩa đếm (5.1).

5.5  Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ ở 25 °C ± 1 °C và 28 °C ± 1 °C.

5.6  Tủ lạnh, có thể duy trì được nhiệt độ ở 2 °C đến 8 °C để bảo quản đĩa Petrifilm 3M RYM.

5.7  Tủ lạnh đông, có thể duy trì được nhiệt độ ở -10 °C đến -20 °C.

5.8  Thiết bị đếm khuẩn lạc, loại chuẩn hoặc loại có thể quan sát với độ khuếch đại tương đương.

5.9  Cân, có thể cân chính xác đến 0,1 g.

6  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

7  Chuẩn bị mẫu thử

7.1  Chuẩn bị phần mẫu thử, theo phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO 6887).

7.2  Chuẩn bị huyền phù mẫu thử với độ pha loãng 1:10

7.2.1  Đối với sản phẩm sữa

Chuẩn bị dung dịch pha loãng 10^-1 của phần mẫu thử, trong điều kiện vô trùng, bằng cách dùng pipet (5.2) lấy 11 ml hoặc dùng cân (5.9) cân 11 g phần mẫu thử (7.1) cho vào 99 ml dịch pha loãng (4.1). Lắc trộn 25 lần để đồng nhất mẫu thử và dịch pha loãng.

7.2.2  Đối với các sản phẩm thực phẩm khác

Cân khoảng 25 g phần mẫu thử (7.1), chính xác đến 0,1 g, cho vào thiết bị trộn nhu động vô trùng (5.3) và thêm 225 ml dung dịch pha loãng (4.1) và lắc trộn ở tốc độ cao để đồng nhất mẫu.

Chuẩn bị các độ pha loãng thập phân, sử dụng dung dịch pha loãng (4.1).

8  Cách tiến hành

Đặt dĩa Petrifilm 3M RYM (5.1) lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm film lên và nhỏ 1 ml huyền phù mẫu thử (7.2) vào chính giữa đĩa. Đậy cẩn thận tấm film xuống chất cấy. Dàn đều huyền phù bằng cách ấn nhẹ dụng cụ dàn mẫu (5.4) trên toàn bộ vùng phát triển của đĩa Petrifilm 3M RYM trước khi tạo gel. Không trượt dụng cụ dàn mẫu qua tấm film.

Nhấc dụng cụ dàn mẫu ra và để yên đĩa ít nhất 1 min cho gel đông đặc lại.

Ủ các đĩa Petrifilm 3M RYM ở 25 °C hoặc 28 °C mặt cấy mẫu hướng lên trên với các chồng không quá 40 đĩa.

Đếm số lượng nấm men và nấm mốc trong các đĩa sau khi ủ 48 h. Nếu các khuẩn lạc không rõ thì ủ thêm 12 h.

Dùng thiết bị đếm khuẩn lạc chuẩn (5.8) có đèn nền hoặc kính lúp có đèn để đếm các đĩa RYM.

Đếm các khuẩn lạc nấm men nhỏ, lồi, viền mép rõ, có màu hồng/nâu vàng, xanh da trời/xanh lá cây.

Đếm các khuẩn lạc nấm mốc phẳng, tâm màu sẫm và mép lan, có màu xanh da trời/xanh lá cây. Màu sắc, hình thái của khuẩn lạc nấm men và nấm mốc có thể thay đổi khi kéo dài thời gian ủ, được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 - Hình thái khuẩn lạc nấm men và nấm mốc trên đĩa 3M RYM

Nấm men	Nấm mốc
nhỏ	lớn
viền mép khuẩn lạc rõ	viền mép lan
màu hồng/nâu vàng đến xanh da trời/xanh lá cây	màu xanh da trời/xanh lá cây thay đổi theo thời gian ủ kéo dài
khuẩn lạc lồi	khuẩn lạc phẳng
màu sắc đồng đều	tâm phẳng sẫm màu với viền mép lan

Vùng phát triển là 30 cm². Các đĩa chứa nhiều hơn 150 khuẩn lạc có thể được định lượng hoặc được coi là quá nhiều không đếm được. Việc ước tính có thể được thực hiện bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều diện tích đại diện và xác định số trung bình trên diện tích đó.

Các mẫu thực phẩm trong một số ít trường hợp có các yếu tố gây nhiễu khi sử dụng đĩa đếm Pertrifilm 3M RYM

- toàn bộ nền đĩa có màu xanh (thường gặp ở những sản phẩm dùng vi sinh vật trong quá trình sản xuất). Trường hợp này không thể coi là nhiều quá không đếm được.

- có số lượng đáng kể các chấm nhỏ màu xanh (thường gặp ở những sản phẩm có gia vị hoặc cấu trúc hạt).

- báo cáo kết quả là đơn vị khuẩn lạc tạo thành/gam (CFU/g).

Nếu cần, nhấc tấm film lên và lấy khuẩn lạc ra khỏi gel để tiến hành phân lập và nhận diện tiếp.

9  Tính và biểu thị kết quả

Số đếm trung bình (của các ô) nhân với 30 để thu được số đếm ước tính trên một đĩa. Nếu cần có số đếm chính xác hơn thì cần thử nghiệm tiếp trên các độ pha loãng cao hơn.

Để tính số lượng nấm men, nấm mốc nhân tổng số lượng khuẩn lạc có trong một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu tại một độ pha loãng thực hiện đếm các đĩa kép) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm tổng vi khuẩn.

Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 150 thì xác định số đếm ước tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình trên một ô vuông và nhân số đếm này với 30 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 30 cm²). Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính.

Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả được báo cáo là “quá nhiều không đếm được”.

10  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng;

- kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

- ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm;

- ngày tháng thử nghiệm;

- các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

- mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm nguyên liệu thịt bò xay đông lạnh được nêu trong Bảng A.1.

Bảng A.1 - Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm nguyên liệu thịt bò xay thô đông lạnh sử dụng dĩa đếm RYM so với phương pháp trong TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008)

Mẫu	Phương pháp Petrifilm 3M RYM					Phương pháp FDA-BAM/ TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) a				Giá trị Pd	Chênh lệch trung bình	Chênh lệch trung bình nghịch đảoe
	Lô hàng	Nb	Trung bìnhc	sr	sR	N	Trung bình	sr	sR
25 °C, 48 h	Kiểm soát	11(0)	<1,00	-	-	11(0)	<1,00	-	-	-	-	-
	Thấp	11(0)	2,12	0,41	0,41	11(0)	2,07	0,36	0,38	0,5323	0,05	14,34
	Vừa phải	11(1)	3,52	0,10	0,10	11(0)	3,47	0,09	0,11	0,1637	0,05	360,10
	Cao	11(0)	4,65	0,13	0,14	11(0)	4,59	0,10	0,14	0,2266	0,06	5763,84
25 °C, 60 h	Kiểm soát	11(0)	<1,00	-	-	11(0)	<1,00	-	-	-	-	-
	Thấp	11(0)	2,14	0,36	0,37	11(1)	2,07	036	0,38	0,3773	0,07	20,55
	Vừa phải	11(0)	3,52	0,10	0,10	11(0)	3,47	0,09	0,11	0,1573	0,05	360,10
	Cao	11(0)	4,65	0,14	0,15	11(0)	4,59	0 10	0,14	0,1750	006	5763,84
28 °C, 48 h	Kiểm soát	11(0)	<1,00			11(0)	<1,00
	Thấp	11(0)	2,17	0,29f	0,30	11(1)	2,07	0,36	0,38	0,1391	0,10	3042
	Vừa phải	11(0)	3,53	0,10	0,10	11(0)	3,47	0,09	0,11	0,0824	0,06	437,23
	Cao	11(0)	4,67	0,08f	0,11	11(0)	4,59	0,10	0,14	0,0966	0,08	7869,00
28 °C, 60 h	Kiểm soát	11(0)	<1,00			11(0)	<1,00
	Thấp	11(0)	2,16	0,29f	0,29	11(1)	2,07	0,36	0,38	0,1843	0,09	27,05
	Vừa phải	11(0)	3,53	0,09	0,10	11(0)	3,47	0,09	0,11	0,1095	0,06	437,23
	Cao	11(2)	4,67	0,08f	0,11	11(0)	4,59	0,10	0,14	0,1068	008	7869,00
a Mẫu đã được phân tích theo sự thống nhất các phương pháp FDA-BAM chương 18 và TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) sử dụng pepton 0,1 % làm mẫu pha loãng. b N = số phòng thử nghiệm có kết quả báo cáo đầy đủ. Ngoại lệ trong dấu ngoặc đơn. c Giá trị Log10 nấm men và nấm mốc, tính bằng CFU/g. d Chênh lệch đáng kể (p < 0,05). e Độ lệch trung bình, tính bằng CFU/g f Kết quả chỉ ra rằng phương pháp dự kiến được lặp lại nhiều hơn so với phương pháp chuẩn, sr là độ lệch chuẩn lặp lại; sR là độ lệch chuẩn tái lập.

Bảng A.2 - Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm nguyên liệu cá hồi sử dụng đĩa đếm RYM so với phương pháp trong TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008)

Mẫu	Phương pháp Petrlfilm 3M RYM					Phương pháp FDA-BAM/ TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) a				Giá trị Pd	Chênh lệch trung bình	Chênh lệch trung bình nghịch đảoe
	Lô hàng	Nb	Trung bìnhc	sr	sR	N	Trung bìnhc	sr	sR
25 °C, 48 h	Kiểm soát	12(0)	<1,00			12(0)	<1,00
	Thấp	14(0)	1,45	0,17f	0,26	14(0)	1,55	0,19	0,34	0,4165	0,10	-7,30
	Vừa phải	14(1)	2,12	0,26	0,39	14(0)	2,21	0,20	0,24	0,3322	0,09	-30,36
	Cao	14(2)	3,00	0,18	0,49	14(1)	3,08	0,12	0,31	0,2833	0,08	-202,26
25 °C, 60 h	Kiểm soát	12(0)	<1,00			12(0)	<1,00
	Thấp	14(0)	1,53	0,23	0,28	14(0)	1,55	0,19	0,34	0,8391	0,02	-1,60
	Vừa phải	14(0)	2,20	0,21	0,27	14(0)	2,21	0,20	0,24	0,7789	0,01	-3,69
	Cao	14(2)	3,04	0,18	0,41	14(1)	3,08	0,12	0,31	0,5418	0,04	-105,79
28 °C, 48 h	Kiểm soát	12(0)	<1,00			12(0)	<1,00
	Thấp	14(0)	1,58	0,16f	0,21	14(0)	1,55	0,19	0,34	0,7381	0,03	2,54
	Vừa phải	14(0)	2,17	0,17f	0,29	14(0)	2,21	0,20	024	0,6139	0,04	-11,73
	Cao	14(2)	3,01	0,17	0,45	14(1)	3,08	0,12	0,31	0,3904	0,07	-178,97
28 °C, 60 h	Kiểm soát	12(0)	<1,00			12(0)	<1,00
	Thấp	14(0)	1,60	0,17f	0,20	14(0)	1,55	0,19	0,34	0,5474	0,05	4,33
	Vừa phải	14(0)	2,21	0,17f	0,23	14(0)	2,21	0,20	0,24	0,9483	0,00	0,00
	Cao	14(2)	3,03	0,18	0,42	14(1)	3,08	0,12	0,31	0,4687	0,05	-130,75
a Mẫu đã được phân tích theo sự thống nhất các phương pháp FDA-BAM chương 18 và TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008) sử dụng pepton 0,1 % làm mẫu pha loãng. b N = số phòng thử nghiệm có kết quả báo cáo đầy đủ. Ngoại lệ trong dấu ngoặc đơn. c Giá trị Log10 nấm men và nấm mốc, tính bằng CFU/g. d Chênh lệch đáng kể (p < 0,05). e Kết quả hiện tại, tính bằng CFU/g f Kết quả chỉ ra rằng phương pháp dự kiến được lặp lại nhiều hơn so với phương pháp chuẩn, sr là độ lệch chuẩn lặp lại; sR là độ lệch chuẩn tái lập.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 8275-1:2010 (ISO 21527-1:2008), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc - Phần 1: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc trong các sản phẩm có hoạt độ nước lớn hơn 0,95

[2] U.S. Food and Drug Administration (FDA), Bacteriological Analytical Manual (BAM), Chapter 18 Yeasts, Molds and Mycotoxins