Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 11395:2016 ISO/TS 17919:2013 Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm–Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm–Phát hiện clostridia sinh độc tố thần kinh botulinum typ A,B,E và F

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11395:2016

ISO/TS 17919:2013

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN CLOSTRIDIA SINH ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F

Microbiology of the food chain - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Detection of botulinum type A, B, E and F neurotoxin-producing clostridia

Lời nói đầu

TCVN 11395:2016 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 17919:2013;

TCVN 11395:2016 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN CLOSTRIDIA SINH ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F

Microbiology of the food chain - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Detection of botulinum type A, B, E and F neurotoxin-producing clostridia

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sinh học phân tử phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện clostridia mang các gen độc tố thần kinh botulinum A, B, E và F. Phương pháp này phát hiện được các typ gen và không phát hiện các độc tố, do đó khi cho kết quả dương tính thì không có nghĩa là độc tố này có mặt trong mẫu được kiểm tra. Tiêu chuẩn này áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường.

Các phép thử PCR để phát hiện các trình tự gen mã hóa các typ độc tố cụ thể được nêu trong Phụ lục B và Phụ lục E.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6404 (ISO 7218) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật

TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân

TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và kiểm tra hiệu năng của môi trường nuôi cấy

TCVN 7682 (ISO 20838) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính

TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung

ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính].

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa nêu trong TCVN 11134 (ISO 22174).

4  Ký hiệu và chữ viết tắt

4.1  Ký hiệu

c là nồng độ cơ chất;

r là nồng độ khối lượng;

j là phần thể tích;

w là phần khối lượng.

4.2  Chữ viết tắt

BoNT là độc tố thần kinh botulinum.

5  Nguyên tắc

5.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này bao gồm các bước sau đây:

a) tăng sinh vi khuẩn (xem 5.2);

b) tách chiết axit nucleic (xem 5.3);

c) khuếch đại (xem 5.4);

d) phát hiện các sản phẩm PCR (xem 5.5);

e) khẳng định (xem 5.6).

CHÚ THÍCH: Real-time PCR kết hợp các bước từ c) đến e).

5.2  Tăng sinh vi khuẩn

Số lượng BoTN của clostridia (bào tử hoặc tế bào sinh dưỡng) cần phát hiện được tăng lên bằng cách kích thích nẩy mầm và cho phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng không chọn lọc (canh thang dịch chiết nấm men trypton-peptose-glucose) trong các điều kiện kỵ khí.

5.3  Tách chiết axit nucleic

Tế bào sinh dưỡng được tách ra khỏi môi trường dinh dưỡng, được dung giải và các axit nucleic được tách chiết để sử dụng trong phản ứng PCR.

5.4  Khuếch đại bằng PCR

Axit nucleic đã chiết được chuyển vào hỗn hợp PCR và khuếch đại trong máy chu trình nhiệt.

5.5  Phát hiện các sản phẩm PCR

Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di gel hoặc phương pháp thay thế thích hợp.

5.6  Khẳng định

Việc nhận biết các sản phẩm PCR cần được khẳng định bằng phương pháp thích hợp, ví dụ: phân tích trình tự, lai hoặc phân tích giới hạn.

6  Thuốc thử

6.1  Yêu cầu chung

Đối với tất cả các bước từ b) đến e) trong 5.1, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và thích hợp cho ứng dụng sinh học phân tử như quy định trong ISO 20837 và TCVN 7682 (ISO 20838).

Áp dụng các yêu cầu về thuốc thử quy định trong Điều 5 của TCVN 7682 (ISO 20838).

6.2  Môi trường nuôi cấy

6.2.1  Yêu cầu chung

Thực hiện theo TCVN 8128 (ISO 11133) về việc chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy.

6.2.2  Dịch pha loãng

Thực hiện theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và phần có liên quan trong TCVN 6507 (ISO 6887) đối với sản phẩm cần phân tích.

6.2.3  Môi trường nuôi cấy tăng sinh không chọn lọc, canh thang dịch chiết nấm men trypton- pepton-glucose (canh thang TPGY) (xem Tài liệu tham khảo [7]).

6.2.3.1  Yêu cầu chung

Có thể sử dụng môi trường nuôi cấy tăng sinh không chọn lọc đã được công nhận nếu cho hiệu năng tương đương.

6.2.3.2  Thành phần và độ pH

Trypton                                                 50 g

Pepton                                                 5 g

Chất chiết nấm men                               20 g

D-Glucose                                            4 g

Natri thioglycolat, HSCH₂COONa            1 g

Nước                                                    đến 1000 ml

pH 7,0 ± 0,2

6.2.3.3  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước bằng cách đun sôi. Sau khi khử trùng, chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở 25 °C. Phân phối môi trường này vào các bình hoặc lọ có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min ở 121 °C. Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 °C ± 3 °C. Không sử dụng môi trường sau khi chuẩn bị 4 tuần.

6.2.4  Canh thang đệm TPGY chỉ để dùng cho thực phẩm axit và axit hóa

6.2.4.1  Dung dịch gốc (đệm phosphat)

6.2.4.1.1  Dung dịch 1

Natri dihydro phosphat ngậm một phân tử nước [NaH₂PO₄.H₂O]              138 g

Nước                                                                                                    đến 1000 ml

6.2.4.1.2  Dung dịch 2

Dinatri hydro phosphat [Na₂HPO₄]                                                          142 g

Nước                                                                                                    đến 1000 ml

6.2.4.1.3  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi. Cho dung dịch 2 vào 250 ml dung dịch 1 cho đến khi pH đạt 7,2. Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 °C ± 3 °C.

6.2.4.2  Chuẩn bị môi trường hoàn chỉnh

Hòa tan các thành phần cơ bản (6.2.3.2) trong 500 ml nước bằng cách đun sôi. Thêm 100 ml dung dịch đệm phosphat (6.2.4.1). Nồng độ phosphat cuối cùng trong môi trường hoàn chỉnh là 0,1 mol/l. Thêm nước đến 1000 ml. Phân phối môi trường hoàn chỉnh này vào các bình hoặc lọ có dung tích thích hợp. Phân phối môi trường này vào các bình hoặc lọ có dung tích thích hợp. Khử trùng 15 min ở 121 °C. Bảo quản trong tủ lạnh ở 5 °C ± 3 °C. Không sử dụng môi trường sau khi chuẩn bị 4 tuần.

6.3  Chiết axit nucleic

6.3.1  Cloroform, CHCl₃

6.3.2  Etanol, j(C₂H₅OH) = 96 %.

6.3.3  Muối dinatri của axit etylendiamintertra axetic (Na₂EDTA), C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.

6.3.4  Hexadecyl (trimetyl) amoni bromua [(cetyl(trimetyl) amoni bromua, CTAB], C₁₉H₄₂BrN

6.3.5  Axit clohydric, j(HCl) = 37 %

6.3.6  Isopropanol, CH₃CH(OH)CH₃

6.3.7  Proteinase-K, khoảng 20 đơn vị/mg đông khô.

6.3.8  Natri clorua, NaCl.

6.3.9  Natri hydroxit, NaOH.

6.3.10  Tris(hydroxymetyl)aminometan (tris), C₄H₁₁NO₃

6.3.11  Dung dịch đệm chiết CTAB, r(CTAB) = 20 g/l, c(NaCl) = 1,4 mol/l, c(tris) = 0,1 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,02 mol/l

Chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl hoặc NaOH.

6.3.12  Dung dịch đệm kết tủa CTAB, r(CTAB) = 5 g/l, c(NaCl) = 0,04 mol/l

6.3.13  Dung dịch natri clorua, c(NaCl) = 1,2 mol/l.

6.3.14  Dung dịch etanol, j(C₂H₅OH) = 70 %

6.3.15  Dung dịch proteinase-K, r = 20 mg/ml, được hòa tan trong nước vô trùng.

Không hấp áp lực. Bảo quản ở - 20 °C, nhưng không tái cấp đông và rã đông.

6.3.16  Dung dịch đệm Tris-EDTA (TE), c(tris) = 0,01 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l

Chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl hoặc NaOH.

6.4  Thuốc thử dùng cho PCR

6.4.1  ADN polymerase bền nhiệt, theo quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838) và TCVN 11134 (ISO 22174).

6.4.2  Deoxyribonucleosid triphosphat (dNTP) chứa dATP, dCTP, dGTP và dTTP hoặc dUTP như quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838) và TCVN 11134 (ISO 22174).

6.4.3  Dung dịch đệm PCR, theo quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838) và TCVN 11134 (ISO 22174)

Thông thường dung dịch đệm PCR được cung cấp cùng với ADN polymerase, có thể có hoặc không có MgCl₂ ở nồng độ do nhà sản xuất quy định. Nồng độ MgCl₂ cuối cùng được quy định theo phương pháp cụ thể và được nêu trong các phụ lục. Cũng có thể dùng thuốc thử có bán sẵn. Nếu không, tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.4.4  Mồi và đầu dò

Các mồi và đầu dò để phát hiện đặc hiệu các trình tự gen độc tố thần kinh được nêu trong các Phụ lục B và Phụ lục C.

7  Thiết bị, dụng cụ

7.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

7.2  Dụng cụ để chuẩn bị mẫu trước khi tăng sinh

7.2.1  Nồi cách thủy, có thể duy trì ở 50 °C ± 1 °C.

7.2.2  Máy ly tâm, để ly tâm các ống nghiệm 50 ml và 100 ml, có thể thay đổi gia tốc đến 12 000 x g

7.2.3  Bộ lọc màng, có màng nitrocellulose, cỡ lỗ 0,45 mm.

7.2.4  Ống ly tâm, dung tích 50 ml và 100 ml.

7.3  Thiết bị dùng cho tăng sinh vi khuẩn

7.3.1  Nồi cách thủy, có thể duy trì 30 °C ± 1 °C, 65 °C ± 1 °C và 100 °C ± 1 °C.

7.3.2  Bình kỵ khí hoặc tủ kỵ khí, có thể duy trì ở 30 °C ± 1 °C, phù hợp với TCVN 6404 (ISO 7218).

7.3.3  Tủ ấm, có thể duy trì ở 30 °C ± 1 °C

7.3.4  Bình hoặc chai có dung tích thích hợp.

7.4  Dụng cụ dùng để chiết axit nucleic

Sử dụng các dụng cụ thích hợp trong ISO 20837 và như sau:

7.4.1  Ống ly tâm, dung tích 1,5 ml và 2,0 ml.

7.4.2  Bộ khuấy trộn sử dụng nhiệt (thermoblock), có thể trộn với tốc độ từ 300 r/min đến 1 400 r/min.

7.4.3  Pipet chia vạch và pipep có đầu lọc, có thể tích từ 1 ml đến 1 000 ml.

7.4.4  Máy ly tâm, dùng cho các ống phản ứng có dung tích 1,5 ml và 2,0 ml, ví dụ: ống ly tâm nhỏ, có thể đạt gia tốc đến 12 000 x g.

7.4.5  Bộ trộn, ví dụ: kiểu Vortex.

7.5  Dụng cụ dùng cho PCR

Sử dụng các dụng cụ thích hợp đối với phương pháp và cụ thể như sau:

7.5.1  Pipet và pipet có đầu lọc, dung tích từ 1 ml đến 1 000 ml

7.5.2  Ống ly tâm nhỏ, dung tích 1,5 ml và 2,0 ml.

7.5.3  Ống PCR, ống phản ứng 0,2 ml hoặc 0,5 ml, đĩa nhiều giếng PCR hoặc loại thích hợp khác.

7.5.4  Máy chu trình nhiệt

7.6  Thiết bị dùng để phát hiện các sản phẩm PCR

Sử dụng thiết bị thích hợp với phương pháp và cụ thể như sau:

7.6.1  PCR gel

7.6.1.1  Hệ thống điện di gel ngang

7.6.1.2  Nguồn cung cấp điện

7.6.1.3  Máy chiếu tia UV hoặc hộp đèn UV

7.6.1.4  Hệ thống ghi dữ liệu gel

7.6.2  Máy real time PCR

7.6.2.1  Máy chu trình nhiệt real time PCR

7.6.2.2  Bộ phát hiện và phần mềm phân tích thích hợp.

8  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến việc lấy mẫu sản phẩm thì các bên có liên quan cần thống nhất về việc lấy mẫu.

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện của sản phẩm và không bị hư hỏng hoặc bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

9  Cách tiến hành

9.1  Chuẩn bị mẫu trước khi tăng sinh

9.1.1  Yêu cầu chung

Xem Hình A.1.

Nên phân tích ít nhất 25 g, đặc biệt là đối với các mẫu mật ong, tuy nhiên, nếu nguồn mẫu bị hạn chế thì có thể sử dụng cỡ mẫu nhỏ hơn.

9.1.2  Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị và đồng hóa mẫu theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và các phần có liên quan trong TCVN 6507 (ISO 6887) ^[9]-[13] đối với mẫu cần phân tích.

9.1.3  Chuẩn bị mẫu mật ong

Đặt lọ đựng mật ong vào nồi cách thủy (7.2.1) ở 50 °C ± 1 °C trong 30 min để cho mật ong tan chảy. Đảo chiều lọ vài lần để trộn mẫu.

Cân 25 g ± 2 g mật ong cho vào ống ly tâm vô trùng dung tích 100 ml (7.2.4) và thêm ít nhất 50 ml nước cất hoặc nước đã khử ion có chứa 1 % phần thể tích polysorbate 80 đã được làm nóng trước đến 50 °C ± 1 °C. Trộn cho đến khi dung dịch đồng nhất. Ly tâm hỗn hợp ở 12 000 x g (7.2.2) trong 30 min. Cẩn thận lấy phần nổi phía trên và lọc qua màng lọc 0,45 mm (7.2.3). Trong trường hợp bộ lọc bị tắc, cho phần hỗn hợp còn lại qua bộ lọc mới. Sử dụng tất cả phần giữ lại trên các màng lọc cho các bước tiếp theo. Bảo quản tạm thời ở 5 °C ± 3 °C.

9.2  Tăng sinh vi khuẩn

9.2.1  Nuôi cấy

9.2.1.1  Yêu cầu chung

Đuổi oxy hòa tan ra khỏi môi trường tăng sinh (6.2) bằng cách đun sôi 10 min đến 15 min trong nồi cách thủy (7.3.1).

Nếu mẫu có tính axit hoặc đã axit hóa, thì chuẩn bị canh thang tăng sinh theo 6.2.4.

9.2.1.2  Nuôi cấy phần mẫu thử

9.2.1.2.1  Phục hồi các tế bào sinh dưỡng và các bào tử

Chỉnh nhiệt độ của môi trường tăng sinh đến 30 °C ± 1 ^oC trong nồi cách thủy (7.3.1). Chuyển phần thử nghiệm vào môi trường tăng sinh đã loại khí để thu được dung dịch pha loãng cuối cùng 10^-1.

9.2.1.2.2  Phục hồi các bào tử

Chỉnh nhiệt độ của môi trường tăng sinh đến 65 °C ± 1 °C trong nồi cách thủy (7.3.1). Chuyển phần thử nghiệm vào môi trường tăng sinh đã làm nóng trước để thu được dung dịch pha loãng cuối cùng 10^-1 ở 65 °C ± 1 °C. Sau khi nuôi cấy, duy trì bình hoặc chai ở 65 ^oC ± 1 °C trên 10 min, sau đó làm nguội nhanh đến 30 °C ± 1 °C trong nồi cách thủy (7.3.1).

9.2.1.3  Nuôi cấy các phần mẫu thử mật ong

Chỉnh nhiệt độ của canh thang tăng sinh đến 65 °C ± 1 °C (7.3.1). Chuyển phần giữ lại trên bộ lọc (9.1.3) vào một bình hoặc chai (7.3.4) và màng lọc hoặc bộ lọc (9.1.3) vào bình hoặc chai (7.3.4) thứ hai, mỗi bình hoặc chai, chứa ít nhất 10 ml canh thang tăng sinh đã làm nóng, trong mọi trường hợp cần đảm bảo đủ để làm ngập màng lọc. Ủ cả bình hoặc chai ở 65 ^oC ± 1 ^oC trong 10 min trong nồi cách thủy (7.3.1).

CHÚ THÍCH: Mẫu mật ong chỉ dùng để phân tích bào tử.

9.2.2  Ủ ấm

Ủ trong các điều kiện kỵ khí (7.3.2) ở 30 °C ± 1 °C. Sau khi ủ 24 h ± 2 h, lấy ra 1 ml phần đã tăng sinh để phân tích PCR và phần còn lại vẫn giữ ở các điều kiện kỵ khí.

Nếu kết quả phân tích PCR đầu tiên là âm tính, thì tiếp tục ủ 48 h ± 2 h trong cùng điều kiện, sau đó chuyển 1 ml môi trường tăng sinh này vào bình hoặc chai (7.3.4) có chứa 9 ml canh thang tăng sinh mới (6.2.3). Ủ kỵ khí (7.3.2) ở 30 °C ± 1 °C trong 18 h ± 2 h và thực hiện phản ứng PCR lần thứ hai.

9.2.3  Kiểm soát quá trình

Thực hiện kiểm soát quá trình âm tính và dương tính theo TCVN 11134 (ISO 22174).

Ví dụ về phương pháp chuẩn bị các bào tử được nêu trong Phụ lục D.

9.3  Chuẩn bị axit nucleic

9.3.1  Yêu cầu chung

Sử dụng quy trình chiết axit nucleic thích hợp đối với vi khuẩn Gram dương.

Ví dụ về quy trình được nêu trong 9.3.2 đến 9.3.4. Quy trình này bao gồm bước dung giải - dung giải nhiệt trong sự có mặt của CTAB - tiếp theo là một số bước chiết để loại bỏ các chất ức chế như các polysaccharid và protein.

Khi phần nền mẫu thử đã được chuẩn bị, áp dụng nguyên tắc chiết ADN và tinh sạch nêu trong 9.3.2 đến 9.3.4.

Mức độ tương thích giữa khối lượng và thể tích dung dịch đệm phụ thuộc vào cỡ mẫu thử được chọn.

9.3.2  Chiết mẫu

Chuyền 1 000 ml môi trường tăng sinh (9.2.2) vào ống ly tâm nhỏ (7.4.1). Ly tâm (7.4.4) trong 5 min ở khoảng 12 000 x g. Loại bỏ phần nổi phía trên ống (dung dịch lỏng).

Thêm 500 ml dung dịch đệm chiết CTAB (6.3.11) đã làm ấm trước (65 °C) vào các hạt cặn và trộn nhẹ cho đến khi dung giải hết. Ủ 30 min ở 65 °C, trong khi vẫn khuấy trộn (7.4.2). Thêm 20 ml dung dịch proteinase-K (6.3.7), trộn nhẹ ống và ủ 30 min ở 65 °C, trong khi vẫn khuấy trộn (7.4.2). Cho ly tâm 10 min ở khoáng 12 000 x g. Chuyển phần nổi phía trên sang một ống mới, thêm 0,7 đến 1 lần thể tích cloroform (6.3.1) và trộn kỹ.

Ly tâm 15 min ở khoảng 12 000 x g. Chuyển phần nổi phía trên (dung dịch lỏng) vào một ống mới.

9.3.3  Kết tủa CTAB

Thêm 2 lần thể tích dung dịch đệm kết tủa CTAB (6.3.12). Ủ 60 min ở nhiệt độ phòng mà không khuấy trộn. Ly tâm 15 min ở 12 000 x g. Loại bỏ phần nổi phía trên. Hòa tan ADN đã kết tủa bằng cách thêm 350 pl dung dịch NaCl (6.3.13). Thêm 350 ml cloroform (6.3.1) và trộn kỹ. Cho ly tâm 10 min ở 12 000 x g. Chuyển pha nước vào một ống mới.

CHÚ THÍCH: Việc làm kết tủa CTAB là không cần thiết đối với tất cả các nền mẫu, chỉ dùng cho các nền mẫu giàu protein và polysaccharid. Cách khác, việc tinh sạch pha rắn các ADN (ví dụ: sử dụng các cột xoáy) có thể cho kết quả tương đương.

9.3.4  Kết tủa ADN

Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol (6.3.6), trộn kỹ bằng cách đảo ngược ống và giữ ống ở nhiệt độ phòng trong 20 min. Ly tâm 15 min ở 12 000 x g. Loại bỏ phần nổi phía trên. Thêm 500 ml dung dịch etanol (6.3.14) vào ống và đảo chiều ống vài lần. Bước này rất cần để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn CTAB. Ly tâm 10 min ở 12 000 x g. Loại bỏ phần nổi phía trên. Làm khô các hạt ADN và hòa tan lại bằng 100 ml dung dịch đệm thích hợp, ví dụ dung dịch đệm TE (6.3.16), thu được dung dịch gốc ADN và được bảo quản ở - 20 °C cho đến khi sử dụng.

9.4  Khuếch đại PCR

Có thể sử dụng các quy trình khác nhau để khuếch đại các sản phẩm PCR. Phát hiện sản phẩm PCR có thể dựa vào gel hoặc bằng các tín hiệu huỳnh quang.

Tất cả các yêu cầu cho việc khuếch đại PCR được quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838).

Ví dụ về các phương pháp PCR gel-based được nêu trong Phụ lục B và các phương pháp real-time PCR được nêu trong Phụ lục C.

9.4.1  Kiểm soát PCR

Thực hiện kiểm soát PCR theo TCVN 11134 (ISO 22174).

9.4.2  Phát hiện sản phẩm PCR

Có thể sử dụng các quy trình khác nhau để phát hiện các sản phẩm PCR. Ví dụ về các phương pháp PCR gel-based được nêu trong Phụ lục B và các phương pháp real-time PCR được nêu trong Phụ lục C.

9.5  Khẳng định kết quả PCR dương tính

Thực hiện quy trình quy định trong TCVN 7682 (ISO 20838).

9.5.1  Giải thích các kết quả

Các kết quả thu được, bao gồm cả các kiểm soát quy định trong TCVN 11134 (ISO 22174), cần rõ ràng và các bước kiểm soát phải cho kết quả như dự kiến, nếu không thì phải lặp lại quy trình.

Kết quả PCR là:

a) dương tính, nếu một sản phẩm PCR đặc hiệu được phát hiện và khẳng định và tất cả các kết quả kiểm chứng như dự kiến;

b) âm tính trong các giới hạn phát hiện, nếu không phát hiện sản phẩm PCR cụ thể và và tất cả các kết quả kiểm soát như dự kiến.

Kết quả PCR dương tính có nghĩa là chỉ ra sự có mặt của độc tố thần kinh botulinum. Để khẳng định sự có mặt của độc tố thần kinh phải áp dụng các phương pháp thích hợp.

Phụ lục A

(Quy định)

Sơ đồ quy trình

Hình A.1

Phụ lục B

(Tham khảo)

Phân tích PCR đa mồi để phát hiện các gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F sử dụng điện di gel agarose

B.1  Phương pháp 1

B.1.1  Giới thiệu

Điều này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện các gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum các typ A, B, E và F và sử dụng điện di gel agarose.

Đối với các hạn chế xem B.1.7.6.

B.1.2  Các đặc tính hiệu năng

B.1.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận cho ADN được chiết tách từ các chủng đối chứng C. botulinum typ A, B, E và F và từ các mẫu bị nhiễm tự nhiên.

Phương pháp này có trong tài liệu tham khảo [1] [2] [5].

B.1.2.2  Đánh giá lý thuyết của phương pháp

Đánh giá lý thuyết đã được thực hiện bằng cách nghiên cứu trình tự tương đồng với các cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ, trong đó EMBL là Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử châu Âu và DDBJ là cơ sở dữ liệu ADN của Nhật Bản (Tài liệu tham khảo [16], 2009-09-20). Kết quả nghiên cứu đã khẳng định việc nhận biết hoàn toàn chỉ với các trình tự đích dự kiến.

B.1.2.3  Tính chọn lọc

B.1.2.3.1  Phép thử chọn lọc dương

Độ chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 86 chủng C. botulinum typ A, 70 chủng C .botulinum typ B, 15 chủng C. botulinum/butyricum typ E và 6 chủng C. botulinum typ F, xem Bảng B.1.

Bảng B.1 - Chọn lọc dương của PCR đa mồi sử dụng các chủng đích

B.1.2.3.2  Phép thử chọn lọc âm

Tính chọn lọc âm của phương pháp đã được thử nghiệm với 34 sinh vật không phải đích, xem Bảng B.2. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích.

Bảng B.2 - Tính chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích

B.1.2.4  Độ nhạy

B.1.2.4.1  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo (2])

Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các mẫu nhiễm nhân tạo với các mức nuôi cấy khác nhau (0,1 cfu đến 10 cfu và từ 10 cfu đến 100 cfu trước khi tăng sinh) trong 10 g các nền mẫu thực phẩm khác nhau (cá đóng hộp, xúc xích đóng hộp và mật ong) được nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy (Tài liệu tham khảo [1]). Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm bẩn nhân tạo là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %). Giới hạn phát hiện của phương pháp được quy định là 1 cfu đến 10 cfu hoặc số bào tử trên 10 g trước khi tăng sinh.

B.1.2.4.2  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu nhiễm tự nhiên (Tài liệu tham khảo [2])

Giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo 382 mẫu nhiễm tự nhiên (ví dụ như mật ong, thực vật và các loại thịt đóng hộp), sử dụng cách thử sinh học trên chuột làm phương pháp đối chứng. Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm tự nhiên là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %.

CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với các phần mẫu thử là 10 g.

B.1.2.5  Kiểm soát phân tích

Tất cả các phép thử đã được thực hiện sử dụng quá trình kiểm chứng dương tính và âm tính đối với PCR, kiểm chứng khuếch đại nội bộ (IAC) được mô tả trong B.1.6.

B.1.2.6  Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử

Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện trên MyCycler^®1) và Mastercycler^®2) Gradient sử dụng 2xMultiplex qPCR MasterMix^®3) (Tài liệu tham khảo [1]) và hỗn hợp mồi theo Bảng B.7 (Tài liệu tham khảo [2], [5]).

B.1.3  Nguyên tắc

Các đoạn ADN đặc hiệu của BoNT/typ gen A, B, E và F, được khuếch đại bằng PCR đa mồi kết hợp với IAC tương đồng sử dụng tám mồi. Việc phát hiện các sản phẩm PCR được thực hiện bằng điện di gel agarose.

B.1.4  Thuốc thử

B.1.4.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.1.4.2  Thuốc thử dùng cho PCR

B.1.4.2.1  Nước không chứa nuclease.

B.1.4.2.2  Dung dịch đệm PCR, 10x4)

Thông thường dung dịch đệm PCR được cung cấp cùng với ADN polymerase, có thể có hoặc không có MgCl₂ ở nồng độ do nhà sản xuất quy định. Nồng độ MgCl₂ cuối cùng được quy định theo phương pháp cụ thể và được nêu trong Bảng B.7. Cũng có thể dùng thuốc thử có bán sẵn. Nếu không thì tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.1.4.2.3  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

B.1.4.2.4  ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml.

B.1.4.2.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l.

B.1.4.2.6  Oligonucleotid.

Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.3.

Bảng B.3 - Trình tự của các oligonucleotid

B.1.4.3  Hóa chất điện di gel

B.1.4.3.1  Yêu cầu chung

Điện di gel agarose có thể được thực hiện với dung dịch đệm TAE hoặc dung dịch đệm TBE. Các dung dịch được mô tả trong phương pháp này thường không cần phải hấp áp lực.

B.1.4.3.2  Agarose, thích hợp dùng cho điện di ADN và cho việc tách kích thước dự định của các phân tử ADN.

B.1.4.3.3  Axit boric, H₃BO₃, chỉ dùng cho hệ thống đệm TBE.

B.1.4.3.4  Bromophenol xanh, C₁₉H₉Br₄O₅SNa và/hoặc xylen xyanol FF, C₂₅H₂₇N₂O₆S₂Na.

B.1.4.3.5  Chuẩn khối lượng phân tử ADN, ví dụ: chế phẩm thương mại có chứa các đoạn ADN từ khối lượng phân tử rất cao đến khối lượng phân tử rất thấp.

B.1.4.3.6  Axit axetic băng, CH₃COOH, chỉ dùng cho hệ thống đệm TAE.

B.1.4.3.7  Muối dinatri của axit etylendiaminetetraaxetic (Na₂EDTA), C₁₀H₁₄O₈Na₂.

B.1.4.3.8  Ethidium bromide (EthBr), C₂₁H₂₀N₃Br.

B.1.4.3.9  Glycerol, C₃H₈O₃.

B.1.4.3.10  Natri axetat, C₂H₃O₂Na, chỉ dùng cho hệ thống đệm TAE.

B.1.4.3.11  Axit clohydric, j(HCl) = 37 %.

B.1.4.3.12  Natri hydroxit, NaOH.

B.1.4.3.13  Tris (hydroxymethyl) aminometan (tris), C₄H₁₁NO₃.

B.1.4.3.14  Dung dịch đệm Tris-axetat-EDTA (TAE) (1x), c(tris) = 0,050 mol/l, c(C₂H₃O₂Na) = 20 mmol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Chỉnh đến pH 8,0 bằng axit axetic băng hoặc NaOH. Nên chuẩn bị dung dịch đệm TAE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa 50 lần). Loại bỏ dung dịch nếu nhìn thấy có kết tủa.

Có thể tiến hành pha loãng các dung dịch đệm điện di đậm đặc, ngay trước khi sử dụng, với nước không tiệt trùng, nước cất một lần hoặc nước đã khử ion.

B.1.4.3.15  Dung dịch đệm Tris-borat-EDTA (TBE) (0,5x), c(tris) = 0,055 mol/l, c(axit boric) = 0,055 mol/l, c(Na₂EDTA) = 0,001 mol/l.

Chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl hoặc NaOH. Nên chuẩn bị dung dịch đệm TBE theo dung dịch gốc đậm đặc (đậm đặc tối đa 10 lần). Loại bỏ dung dịch nếu nhìn thấy có kết tủa. Có thể pha loãng các dung dịch đệm điện di đậm đặc ngay trước khi sử dụng với nước không tiệt trùng, nước cất một lần hoặc nước đã khử ion.

B.1.4.3.16  Dung dịch đệm nạp mẫu (5x), j(glycerol) = 50 %, r(bromophenol xanh) = 2,5 g/l và/hoặc r(xylen xyanol) = 2,5 g/l, được hòa tan trong dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B.1.4.3.15).

B.1.4.3.17  Dung dịch ethidium bromide, c(EthBr) = 0,5 mg/l

Nên bảo quản các dung dịch ethidium bromide ở dạng đậm đặc (ví dụ: 10 mg/ml) ở 5 °C ở nơi tối (EthBr nhạy với ánh sáng). Đồng thời nên tránh cân EthBr. Dung dịch gốc cần được chuẩn bị bằng cách hòa tan trong một lượng nước thích hợp, đựng trong bình đã chứa bột EthBr, hoặc sử dụng các viên EthBr đã biết trước khối lượng. Việc hòa tan EthBr cần thực hiện tránh sánh sáng, có khuấy trộn ở nhiệt độ phòng. Việc hòa tan này thường mất khoảng 1 h.

CẢNH BÁO - Ethidium bromide là một chất gây đột biến, cần thực hiện theo quy trình xử lý an toàn.

B.1.5  Thiết bị, dụng cụ

B.1.5.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thích hợp với phương pháp và cụ thể như sau:

B.1.5.2  Thiết bị dùng cho PCR

B.1.5.2.1  Pipet và pipet có dầu lọc, có dung tích từ 1 mI đến 1 000 ml.

B.1.5.2.2  Ống ly tâm nhỏ, có dung tích 1,5 ml và 2,0 ml.

B.1.5.2.3  Ống PCR, ống phản ứng 0,2 ml hoặc 0,5 ml, đĩa PCR vi giếng hoặc dụng cụ phù hợp khác.

B.1.5.2.4  Máy chu trình nhiệt.

B.1.5.2.5  Thiết bị sử dụng để phát hiện các sản phẩm PCR.

B.1.5.2.6  Lò vi sóng hoặc nồi cách thủy đun sôi.

B.1.5.2.7  Hệ thống điện di gel ngang.

B.1.5.2.8  Nguồn cung cấp điện.

B.1.5.2.9  Máy chiếu tia UV hoặc hộp đèn UV.

B.1.5.2.10  Hệ thống ghi dữ liệu gel

B.1.6  Kiểm soát khuếch đại nội bộ (Tài liệu tham khảo [2])

B.1.6.1  Nguyên tắc

Một đoạn ADN plasmid pUC 19 được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu. Các mồi có các đuôi -5' giống với các mồi được sử dụng để phát hiện các gen BoNT/F, trong khi các mồi có đuôi 3' được bổ sung cho pUC 19 xác định trước trình tự ADN có chiều dài và trình tự xác định. Đoạn ADN được sử dụng làm khuôn mẫu cho IAC cạnh tranh.

B.1.6.2  Thuốc thử

B.1.6.2.1  Yêu cầu chung

Về chất lượng thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.1.6.2.2  Nước, không chứa nuclease.

B.1.6.2.3  Dung dịch magie clorua, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

B.1.6.2.4  ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml.

B.1.6.2.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l.

B.1.6.2.6  Dung dịch kali clorua, c(KCI) = 0,5 mol/l.

B.1.6.2.7  Tris (hydroxymetyl) aminometan hydroclorua, c(C₄H₁₁NO₃HCl) = 0,1 mol/l.

Chỉnh pH đến 8,3 bằng HCl hoặc NaOH.

B.1.6.2.8  Plasmid pUC 19 (nhập số L09137).

B.1.6.2.9  Oligonucleotid

Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.4

Bảng B.4 - Trình tự của các oligonucleotid

B.1.6.3  Cài đặt PCR để xây dựng IAC

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 ml cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.5. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.5 đã chứng minh là phù hợp.

Bảng B.5 - Bổ sung thuốc thử

B.1.6.4  Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.6 đã được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng các chu trình nhiệt MyCycler^® hoặc Mastercycler^® Gradient²⁾ và Taq ADN polymerase5). Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể điều chỉnh khi cần. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng B.6 - Chu trình nhiệt

B.1.6.5  Sử dụng IAC

Sử dụng phương pháp thích hợp để tinh sạch sản phẩm PCR. Thường 1 500 bản sao/giếng IAC là thích hợp đối với các phương pháp PCR gel-based. IAC được quy định như một IAC cạnh tranh và được xây dựng để cạnh tranh với các mồi khuếch đại gen độc tố thần kinh typ F.

B.1.7  Cách tiến hành

B.1.7.1  Cài đặt PCR

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 ml cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.7. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.7 đã chứng minh là phù hợp.

Bảng B.7 - Bổ sung thuốc thử

B. 1.7.2  Kiểm chứng PCR

B.1.7.2.1  Yêu cầu chung

Cần thực hiện các phép kiểm chứng trong B.1.7.2.2 đến B.1.7.2.4 của TCVN 11134 (ISO 22174).

B.1.7.2.2  Kiểm chứng PCR âm tính

Sử dụng nước không chứa ADN làm kiểm chứng âm tính.

B.1.7.2.3  Kiểm chứng PCR dương tính

Hỗn hợp ADN của clostridia sinh ra BoNT, dương tính đối với tất cả bốn trình tự đích (các gen độc tố thần kinh typ A, B, E và F), khoảng 1 000 bản sao.

B.1.7.2.4  Kiểm soát khuếch đại

Sử dụng IAC hoặc kiểm soát khuếch đại bên ngoài (EAC) phù hợp. Ví dụ của IAC được nêu trong B.1.6.

B.1.7.3  Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.8 đã được sử dụng cho các nghiên cứu đánh giá xác nhận với MyCycler^® và với Mastercycler^® Gradient, sử dụng 2x Multiplex qPCR MasterMix (Tài liệu tham khảo [1]) và MasterMix theo Bảng B.7 (Tài liệu tham khảo [2] [5]). Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể phải điều chỉnh cho phù hợp. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng6). Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng B.8 - Chương trình thời gian-nhiệt độ

B.1.7.4  Phát hiện sản phẩm PCR (điện di gel)

B.1.7.4.1  Yêu cầu chung

Có thể thực hiện điện di gel agarose với dung dịch đệm TAE hoặc dung dịch đệm TBE. Sử dụng cùng dung dịch đệm để hòa tan agarose và để nạp đầy bình điện di.

B.1.7.4.2  Chuẩn bị gel agarose

Các sản phẩm PCR được khuếch đại nên phát hiện bằng cách sử dụng gel agarose 2,0 %. Cân một lượng thích hợp agarose (B.1.4.3.2) cho vào dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B. 1.4.3.15). Làm sôi dung dịch trong lò vi sóng hoặc trong nồi cách thủy (B.1.5.2.6) cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Bù lượng hao hụt do bay hơi bằng một lượng nước tương đương, xoay bình để trộn (tránh không tạo bọt khí), làm nguội dung dịch xuống khoảng 60 °C và giữ ở nhiệt độ này cho đến khi sử dụng. Chuẩn bị giá đỡ gel (khay đựng gel) với lượng thích hợp. Rót dung dịch agarose vào khay gel và để gel đông đặc ở nhiệt độ phòng (thường là 1 h).

B.1.7.4.3  Điện di gel agarose

Cẩn thận tháo lược mẫu ra khỏi gel. Chuyển gel (trên khay) vào bể điện di, sao cho các giếng nằm gần với catot (điện cực âm). Đổ đầy bể điện di bằng dung dịch đệm điện di (B.1.4.3.14 hoặc B.1.4.3.15). Phủ lên trên gel bằng khoảng 2 mm của cùng dung dịch đệm.

Trộn dung dịch đệm với các sản phẩm PCR (10 ml) (B.1.4.3.16) theo tỷ lệ 1 đến 5 (ví dụ: cho 2,5 ml dung dịch đệm vào 10 ml sản phẩm PCR), trộn và sử dụng micropipet để đưa hỗn hợp này vào các giếng. Nếu các mẫu chưa biết nghi ngờ quá đặc, thì cần pha loãng để nạp vào gel.

Để xác định kích thước của sản phẩm PCR, bổ sung dung dịch đệm (B.1.4.3.16) và chuẩn khối lượng phân tử ADN (B.1.4.3.5) theo tỷ lệ 1 đến 5. Chất chuẩn khối lượng phân tử ADN được nạp vào gel ít nhất là trước giếng mẫu đầu tiên và sau giếng mẫu cuối cùng.

Tiến hành điện di ở nhiệt độ phòng với điện áp và cường độ dòng điện thích hợp (thường điện áp ổn định tối đa là 5 V/cm và nên quan tâm đến khoảng cách giữa các điện cực). Trong các điều kiện quy định, ADN tích điện âm, vì vậy di chuyển từ cực âm đến cực dương. Thời gian điện di phụ thuộc vào khoảng cách dịch chuyển yêu cầu, dòng điện được cung cấp, dung dịch đệm được sử dụng, sự điện thấm và nồng độ agarose trong gel.

B.1.7.4.4  Nhuộm màu

Sau khi kết thúc điện di, ủ gel từ 15 min đến 50 min trong dung dịch ethidium bromide (B.1.4.3.17) ở nhiệt độ phòng, tốt nhất là để ở nơi tối với lắc nhẹ. Nếu cần, giảm màu nền bằng khử màu gel trong nước từ 10 min đến 30 min.

Cách khác để nhuộm màu sau điện di, có thể bổ sung EthBr vào gel trước khi rót. Trong trường hợp này, EthBr được cho vào gel để có nồng độ cuối cùng là 0,01 mg/ml gel khi gel đã được làm nguội đến 60 °C. Để giảm thiểu các vấn đề di chuyển của EthBr trong gel, có thể bổ sung một số EthBr vào bể đệm điện di. Sau khi điện di gel, thường không cần có bước khử màu.

CHÚ THÍCH: Việc nhuộm có thể được thực hiện bằng cách sử dụng chất nhuộm màu xen giữa ADN khác.

B.1.7.4.5  Ghi hình gel

Chuyển gel lên bề mặt chiếu sáng, bật đèn UV và ghi lại huỳnh quang ADN bằng cách chụp ảnh hoặc ghi video.

Các trình tự đích được coi là phát hiện được nếu kích thước của sản phẩm PCR tương ứng với chiều dài dự kiến của các trình tự ADN đích. Xem Bảng B.9. Để giải thích các kết quả, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

Bảng B.9 - Kích thước sản phẩm khuếch đại

B.1.7.5  Khẳng định kết quả PCR dương tính

Kết quả PCR dương tính phải được khẳng định, ví dụ: bằng trình tự của các sản phẩm PCR. Có thể sử dụng các phương pháp thích hợp khác để khẳng định.

B.1.7.6  Hạn chế của phương pháp

Phương pháp này đã được thử nghiệm để phát hiện các typ và phân typ hiện có của các độc tố thần kinh của clostridia typ A, B, E và F. Tại thời điểm công bố, chưa có xác nhận liệu các mồi được liệt kê trong Bảng B.3 có thể phát hiện các phân typ mới của BoNT/A, B, E và F hay không.

B.2  Phương pháp 2

B.2.1  Giới thiệu

Điều này mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu và phát hiện các gen mã hóa các typ độc tố thần kinh botulinum A, B, E và F, sử dụng điện di gel agarose.

Về những hạn chế xem B.2.7.6.

B.2.2  Đặc tính hiệu năng

B.2.2.1  Yêu cầu chung

Phương pháp này đã được điều chỉnh đối với ADN được chiết từ typ A, B, E, và F của C. botulinum từ các chủng đối chứng và từ mẫu bị nhiễm tự nhiên.

Các phần của phương pháp này đã được công bố trong Tài liệu tham khảo [5].

B.2.2.2  Đánh giá lý thuyết của phương pháp

Đánh giá lý thuyết đã được thực hiện bằng cách nghiên cứu trình tự tương đồng với các cơ sở dữ liệu GenBank/EMBL/DDBJ (Tài liệu tham khảo [16], 2009/09/20). Kết quả nghiên cứu đã khẳng định việc nhận biết hoàn toàn với các trình tự đích dự kiến.

B.2.2.3  Tính chọn lọc

B.2.2.3.1  Phép thử chọn lọc dương

Phép thử chọn lọc dương của phương pháp đã được thử nghiệm với 19 chủng C. botulinum typ A, 19 chủng C .botulinum typ B, 17 chủng C. botulinum typ E và 9 chủng C. botulinum typ F, xem Bảng B.10.

Bảng B.10 - Phép thử chọn lọc dương của PCR đa mồi sử dụng các chủng đích

B.2.2.3.2  Phép thử chọn lọc âm

Phép thử chọn lọc âm của phương pháp đã được thử nghiệm với 34 sinh vật không phải đích, xem Bảng B.11. Không quan sát được phản ứng chéo với các vi khuẩn không phải đích.

Bảng B.11 - Phép thử chọn lọc âm của PCR đa mồi sử dụng các chủng không phải đích

B.2.2.4  Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu bị nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo [5])

Các giới hạn phát hiện đã được đánh giá bằng cách đo các mẫu nhiễm nhân tạo với các mức nuôi cấy khác nhau (0,1 cfu đến 10 cfu và từ 10 cfu đến 100 cfu trước khi tăng sinh) trong 10 g các nền mẫu thực phẩm khác nhau, (cá đóng hộp, xúc xích đóng hộp và mật ong) được khảo sát, sử dụng phương pháp nuôi cấy (Tài liệu tham khảo [5]). Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả đối với phương pháp sử dụng các mẫu nhiễm nhân tạo là 0 % và tỷ lệ âm tính giả là 0 %. Giới hạn phát hiện của phương pháp được quy định là 1 cfu đến 10 cfu hoặc số bào tử trên phần mẫu thử trước khi tăng sinh.

CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm được thực hiện với các phần mẫu thử 10 g.

B.2.2.5  Phân tích kiểm chứng

Tất cả các phép thử đã được thực hiện sử dụng các phép kiểm chứng dương tính và âm tính và bổ sung đối với PCR, IAC được mô tả trong B.2.6.5.

B.2.2.6  Thiết bị, dụng cụ và thuốc thử

Việc đánh giá xác nhận đã được thực hiện trên Mastercycler^® Gradient²⁾ sử dụng 2x Multiplex qPCR MasterMix^®,3) và MasterMix theo Bảng B.16.

B.2.3  Nguyên tắc

Các đoạn ADN đặc hiệu của BoNT/typ gen A, B, E và F, được khuếch đại bằng PCR đa mồi kết hợp với IAC tương đồng, sử dụng tám mồi. Việc phát hiện các sản phẩm PCR được thực hiện bằng việc sử dụng phương pháp điện di gel agarose.

B.2.4  Thuốc thử

B.2.4.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.2.4.2  Thuốc thử dùng cho PCR

B.2.4.2.1  Nước, không chứa nuclease.

B.2.4.2.2  Dung dịch đệm PCR (không chứa MgCl₂), 10x

Thông thường dung dịch đệm PCR được cung cấp cùng với ADN polymerase, có thể có hoặc không có MgCl₂ ở nồng độ do nhà sản xuất quy định. Nồng độ MgCl₂ cuối cùng được quy định theo phương pháp cụ thể và được cho trong Bảng B.14. Cũng có thể dùng thuốc thử có bán sẵn. Nếu không thì tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.2.4.2.3  Dung dịch MgCl₂, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

B.2.4.2.4  ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml.

B.2.4.2.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l.

B.2.4.2.6  Oligonucleotid.

Trình tự của các oligonucleotid được liệt kê trong Bảng B.12.

Bảng B.12 - Trình tự của các oligonucleotide

B.2.4.3  Hóa chất điện di gel

Theo quy định trong B. 1.4.3.

B.2.5  Thiết bị, dụng cụ

Theo quy định trong B.1.5.

B.2.6  Kiểm soát khuếch đại nội bộ

B.2.6.1  Nguyên tắc

Một đoạn ADN plasmid pUC 19 được khuếch đại bằng PCR sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu. Các mồi có các đuôi 5' giống với các mồi được sử dụng để phát hiện các gen BoNT/F, trong khi các mồi có đuôi 3' được bổ sung cho pUC 19 xác định trước trình tự ADN có chiều dài và trình tự xác định. Đoạn ADN được sử dụng làm khuôn mẫu cho IAC cạnh tranh.

B.2.6.2  Thuốc thử

B.2.6.2.1  Yêu cầu chung

Về chất lượng thuốc thử được sử dụng, xem TCVN 11134 (ISO 22174).

B.2.6.2.2  Nước, không chứa nuclease.

B.2.6.2.3  Dung dịch magie clorua, c(MgCl₂) = 25 mmol/l.

B.2.6.2.4  ADN polymerase bền nhiệt, 5 lU/ml.

B.2.6.2.5  Dung dịch dNTP, c(dNTP) = 10 mmol/l.

B.2.6.2.6  Dung dịch kali clorua, c(KCl) = 0,05 mol/l.

B.2.6.2.7  Tris (hydroxymetyl) aminometan hydrochlorua, c(C₄H₁₁NO₃.HCl) = 0,01 mol/l.

Chỉnh pH đến 8,3 bằng HCl hoặc NaOH.

B.2.6.2.8  pUC 19 plasmid (nhập số L09137).

B.2.6.2.9  Oligonucleotid

Trình tự của các oligonucleotid được nêu trong Bảng B.13.

Bảng B.13 - Trình tự oligonucleotid

B.2.6.3  Cài đặt PCR để xây dựng IAC

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 ml cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.14. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.14 được chứng minh là phù hợp.

Bảng B.14 - Bổ sung thuốc thử

B.2.6.4  Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt nêu trong Bảng B.15 đã được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá xác nhận sử dụng các chu trình nhiệt MyCycler^® hoặc Mastercycler^®1) Gradient²⁾ và Taq ADN polymerase³⁾.

Việc sử dụng các chu trình nhiệt khác có thể điều chỉnh khi cần. Thời gian kích hoạt và làm biến tính ban đầu phụ thuộc vào polymerase được sử dụng. Nếu sử dụng polymerase khởi động nóng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng B.15 - Chu trình nhiệt

B.2.6.5  Sử dụng lAC

Sử dụng bộ kit thử thích hợp có bán sẵn để tinh sạch các sản phẩm PCR. Thường 1 500 bản sao/giếng IAC là thích hợp đối với các phương pháp PCR gel-based. IAC được quy định như một IAC cạnh tranh và được xây dựng để cạnh tranh với các mồi khuếch đại gen độc tố thần kinh typ F.

B.2.7  Cách tiến hành

B.2.7.1  Cài đặt PCR

Phương pháp này quy định tổng thể tích PCR là 50 ml cho mỗi phản ứng với các thuốc thử được liệt kê trong Bảng B.16. PCR cũng có thể được thực hiện với một thể tích nhỏ hơn nếu các dung dịch được điều chỉnh phù hợp. Các giá trị cuối cùng của thuốc thử nêu trong Bảng B.16 được chứng minh là phù hợp.

Bảng B.16 - Bổ sung thuốc thử