Tiêu chuẩn TCVN 8351:2010 Xác định các chất chuyển hóa của nhóm nitrofuran trong thủy sản

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8351:2010

THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN - XÁC ĐỊNH CÁC CHẤT CHUYỂN HOÁ CỦA NHÓM NITROFURAN -PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG-KHỐI PHỔ-KHỐI PHỔ

Fish and fishery products - Determination of nitrofurans metabolites - Liquid chromatogaphic and tandem mass spectrometric method

Lời nói đầu

TCVN 8351 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TCVN 8351:2010

THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( XÁC ĐỊNH CÁC CHẤT CHUYỂN HOÁ CỦA NHÓM NITROFURAN ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG-KHỐI PHỔ-KHỐI PHỔ

Fish and fishery products - Determination of nitrofurans metabolites - Liquid chromatogaphic and tandem mass spectrometric method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng của các chất chuyển hoá của nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng-khối phổ-khối phổ (LC/MS/MS).

Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1 mg/kg.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1 Dư lượng liên kết với mô

Các chất tồn dư do có các liên kết đồng hoá trị với các đại phân tử trong cơ thể động vật.

2.2 Ion sơ cấp (precursor ion)

Ion được tạo ra và chọn lọc sau giai đoạn MS thứ nhất, thông thường, nhưng không nhất thiết nó là một ion phân tử mang điện dương.

2.3 Ion thứ cấp (production ion)

Ion được tạo ra và chọn lọc trong giai đoạn MS thứ hai, ion này được sinh ra từ ion sơ cấp trong quá trình phân ly do va chạm.

3. Nguyên tắc

Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hoá nhóm nitrofuran trong sản phẩm thuỷ sản được thuỷ phân bằng axit clohydric loãng để thu được mạch nhánh của các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này được dẫn xuất hoá bằng 2-nitrobenzaldehyt. Định tính và định lượng các chất dẫn xuất bằng sắc ký lỏng-khối phổ-khối phổ (LC/MS/MS) bằng cách sử dụng các đồng vị đơtơri như chất chuẩn nội.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1 Metanol.

4.2 Metanol-d, 99,5 % D.

4.3 Dung dịch axit clohydric, 0,2 M

Hoà tan 20 ml axit clohydric (HCl) 32 % trong 1 000 ml nước.

4.4 Dung dịch natri hydroxit, 2 M

Hoà tan 80 g natri hydroxit (NaOH) khan vào 1 000 ml nước.

4.5 Dung dịch 2-nitrobenzaldehyt (NBA), 100 mM trong metanol

Hoà tan 1,51 g 2-nitrobenzaldehyt (C₇H₅NO₃) vào 100 ml metanol.

4.6 Dung dịch natri phosphat, 0,3 M

Hoà tan 11,4 g natri phosphat ngậm 12 phân tử nước (Na₃PO₄.12H₂O) vào 100 ml nước.

4.7 Etyl axetat (CH₃COOC₂H₅).

4.8 Dung môi hoà tan mẫu

Trộn 50 ml axetonitril, 450 ml nước và 0,5 ml axit axetic.

4.9 Pha động A

Trộn 1 ml axit axetic với 1 000 ml nước, lọc qua màng lọc 0,45 mm (5.14).

4.10 Pha động B

Trộn 900 ml axetonitril với 100 ml nước và 1 ml axit axetic, lọc qua màng lọc 0,45 mm (5.14).

4.11 Các dung dịch chuẩn gốc

4.11.1 Dung dịch chuẩn gốc, 50 mg/l trong metanol

Cân khoảng 1 mg đến 5 mg các chất chuẩn: 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ), 3-amino-5-morpholimethyl-2-oxazolidinon (AMOZ), 1-aminohydantoin (AHD) hydroclorit semicarbazit (SEM) hydroclorit, 3-amino-2- oxazolidinon-d₄ hydroclorit (AOZ-d₄), 3-amino-5-morpholimethyl-2-oxazolidinon-d₅ (AMOZ-d₅), 3-(2-nitrobenzylidennamino)-2-oxazolidinon (NPAOZ), 5-morpholimethyl-3-(2-nitrobenzylidennamino)-2-oxazolidinone (NPAMOZ), 3-(2-nitrobenzylidennamino)-2-4imi-dazolidinedione) (NPAHD), 3[(2-nitrophenyl) metylene]-hydrazinecarboxamide (NPSEM), chính xác đến 0,02 mg. Hoà tan các chất chuẩn trong metanol (4.1), lưu ý đến độ tinh khiết của chất chuẩn.

Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 năm.

4.11.2 Dung dịch chuẩn gốc AHD-d₂, 50 mg/l trong metanol-d

Cân khoảng 1 mg đến 5 mg chất chuẩn 1-amino-hydantoin hydroclorit-d₂ (AHD-d₂) , chính xác đến 0,02 mg. Hoà tan chất chuẩn trong metanol-d (4.2), lưu ý đến độ tinh khiết của chất chuẩn.

Dung dịch chuẩn gốc AHD-d₂ được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 năm.

4.12 Hỗn hợp các dung dịch chuẩn

4.12.1 Hỗn hợp MM1, 1 mg/l trong metanol, gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM

Lấy 200 ml từ mỗi dung dịch gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM (4.11.1) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với metanol (4.1).

Hỗn hợp MM1 được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 tháng.

4.12.2 Hỗn hợp IS1, 1 mg/l trong metanol-d, gồm AOZ-d₄, AMOZ-d₅, AHD-d₂

Lấy 200 ml từ mỗi dung dịch gốc AOZ-d₄, AMOZ-d₅ (4.11.1) và AHD-d₂ (4.11.2) cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch với metanol-d (4.2).

Hỗn hợp IS1 được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 tháng.

4.12.3 Hỗn hợp NP1, 1 mg/l trong metanol, gồm NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM

Lấy 460 ml dung dịch gốc NPAOZ (4.11.1), 332 ml dung dịch gốc NPAMOZ (4.11.1), 432 ml dung dịch gốc NPAHD (4.11.1) và 554 ml dung dịch gốc NPSEM (4.11.1) cho vào bình định mức 10 ml. Định mức đến vạch với metanol (4.1).

Hỗn hợp NP1 được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 tháng.

4.13 Hỗn hợp các dung dịch chuẩn pha loãng

4.13.1 Hỗn hợp chuẩn MM2, 50 mg/l trong metanol, gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM

Lấy 1,00 ml hỗn hợp chuẩn MM1 (4.12.1) cho vào bình định mức 20 ml, định mức đến vạch với metanol (4.1).

Hỗn hợp MM2 được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 tháng.

4.13.2 Hỗn hợp chuẩn nội IS2, 50 mg/l trong metanol-d, gồm AOZ-d₄, AMOZ-d₅, AHD-d₂

Lấy 1,00 ml hỗn hợp chuẩn IS1 (4.12.2) cho vào bình định mức 20 ml, định mức đến vạch với metanol-d (4.2).

Hỗn hợp chuẩn nội IS2 được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 tháng.

4.13.3 Hỗn hợp chuẩn NP2, 100 mg/l trong metanol, gồm NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM

Lấy 2,00 ml hỗn hợp chuẩn NP1 (4.12.3) cho vào bình định mức 20 ml, định mức đến vạch với metanol (4.1).

Hỗn hợp chuẩn NP2 được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 tháng.

4.14 Dung dịch chuẩn làm việc của các dẫn xuất nitrophenyl-WS1, 1 mg/l

Lấy 1,00 ml hỗn hợp chuẩn NP2 (4.13.3) cho vào bình định mức 1 000 ml, định mức đến vạch với dung môi hoà tan mẫu (4.8).

Dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản trong tối ở nhiệt độ 4 ⁰C và có thể sử dụng trong 1 tuần.

5 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg và 0,02 mg.

5.2 Giấy thử pH.

5.3 Pipet, 100 ml.

5.4 Bình định mức, dung tích 10 ml, 20 ml, 100 ml và 1 000 ml.

5.5 Ống ly tâm, dung tích 14 ml, làm bằng polypropylen hoặc thuỷ tinh, có nắp đậy.

5.6 Máy lắc ống nghiệm.

5.7 Lọ đựng mẫu cho sắc ký.

5.8 Máy lắc đảo đầu, Heidolf REAX2 hoặc tương đương.

5.9 Máy nghiền.

5.10 Máy ly tâm.

5.11 Tủ ấm, có thể điều chỉnh được ở khoảng nhiệt độ 37 ⁰C ± 2 ⁰C.

5.12 Hệ thống cô bằng khí nitơ.

5.13 Máy lắc Vortex.

5.14 Màng lọc PTFE, 13 mm, 0,45 mm.

5.15 Hệ thống LC/MS/MS, được trang bị như sau:

– hệ thống sắc kí lỏng, Water Alliance 2690 hoặc tương đương, gồm bơm và hệ thống tiêm mẫu;

– cột bảo vệ pha đảo C18, Symmetry Sentry Guard hoặc tương đương, kích thước 20 mm x 3,9 mm;

– cột C18, Symmetry hoặc tương đương, kích thước 150 mm x 3,0 mm, 5 mm,

– đầu dò khối phổ dạng bốn cực với giao diện ion hoá bằng phun điện tử (ESI), Triple quadrupole Micromass Quattro Ultima hoặc tương đương.

6. Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu

6.1.1 Mẫu thử nghiệm

Cân chính xác 1,0 g ± 0,05 g mẫu cần kiểm nghiệm đã được đồng nhất bằng máy nghiền (5.9) cho vào ống ly tâm 14 ml (5.5). Bổ sung 40 ml hỗn hợp chuẩn nội IS2 (4.13.2), đồng nhất và để yên trong 15 min.

6.1.2 Mẫu kiểm soát chất lượng

6.1.2.1 Mẫu kiểm soát âm tính: mẫu trắng không chứa AOZ, AMOZ, AHD và SEM

Cân chính xác 1,0 g ± 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng nhận), cho vào ống ly tâm 14 ml (5.5). Bổ sung 40 ml hỗn hợp chuẩn nội IS2 (4.13.2) và để yên trong 15 min. Sau đó, tiến hành thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo quy định tại 6.2.1.

6.1.2.2 Mẫu kiểm soát dương tính: mẫu trắng được bổ sung AOZ, AMOZ, AHD và SEM

Cân chính xác 4 phần có khối lượng 1,0 g ± 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng nhận), cho vào 4 ống ly tâm 14 ml (5.5). Bổ sung các dung dịch chuẩn theo Bảng 1 rồi để yên trong 15 min. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo quy định tại 6.2.1.

Bảng 1 - Chuẩn bị mẫu kiểm soát dương tính

6.1.2.3 Mẫu kiểm soát độ thu hồi: mẫu trắng bổ sung các chất dẫn xuất nitrophenyl của AOZ, AMOZ, AHD và SEM chuẩn.

Cân chính xác 2 phần có khối lượng 1,0 g ± 0,05 g mẫu trắng (đã được chứng nhận), cho vào 2 ống ly tâm 14 ml (5.5). Bổ sung 40ml dung dịch chuẩn nội IS2 (4.13.2) rồi để yên trong 15 min. Sau đó, tiếp tục thuỷ phân và dẫn xuất hoá theo quy định tại 6.2.1.

Sau khi làm bay hơi etyl axetat (xem 6.2.3), thêm vào một mẫu 20 ml hỗn hợp chuẩn NP2 (4.13.3) và 480 ml dung môi hoà tan mẫu (4.8). Thêm vào một mẫu khác 50 ml hỗn hợp chuẩn NP2 (4.13.3) và 450 ml dung môi hoà tan mẫu (4.8). Sau đó, tiến hành chuẩn bị mẫu phân tích (xem 6.2.4) với công đoạn lọc.

6.2 Xử lý mẫu

CHÚ THÍCH: Vì các chất dẫn xuất nitrophenyl rất nhạy với ánh sáng nên toàn bộ quy trình xử lý mẫu phải được tiến hành dưới ánh sáng yếu (ánh sáng vàng).

6.2.1 Thuỷ phân và dẫn xuất hoá

Thêm 5 ml axit clohydric 0,2 M (4.3) và 50 ml dung dịch 2-NBA trong metanol (4.5) vào các ống nghiệm chứa mẫu (xem 6.1.1; 6.1.2.1; 6.1.2.2; 6.1.2.3). Đậy nắp ống và lắc bằng tay để phân tán mẫu. Đặt lên máy lắc ống nghiệm (5.6) rồi đặt cả hệ thống vào trong tủ ấm (5.11). Ủ mẫu qua đêm ở nhiệt độ 37 ⁰C ± 2 ⁰C.

6.2.2 Trung hoà

Sau khi làm nguội, thêm 500 ml dung dịch Na₃PO₄ 0,3 M (4.6) vào mẫu. Lắc mẫu bằng tay. Điều chỉnh pH về 7,0 ± 0,5 bằng dung dịch NaOH 2 M (4.4), kiểm tra pH bằng giấy thử pH (5.2). Lắc bằng tay và để yên trong 5 min. Kiểm tra lại pH và điều chỉnh thêm nếu cần thiết.

6.2.3 Chiết

Thêm 4 ml etyl axetat (4.7) vào mẫu đã điều chỉnh pH. Chiết mẫu bằng cách đặt trên máy lắc đảo đầu (5.8) trong 20 min. Ly tâm mẫu trong 10 min ở tốc độ 2 000 r/min. Chuyển lớp hữu cơ ở phía trên sang một ống ly tâm 14 ml (5.5) sạch. Lặp lại bước chiết bằng cách thêm 4ml etyl axetat (4.7) vào phần mẫu còn lại, đóng nắp ống ly tâm rồi đặt trên máy lắc đảo đầu (5.8) trong 20 min. Ly tâm mẫu trong 10 min ở tốc độ 3 500 r/min. Lấy lớp hữu cơ và kết hợp với phần hữu cơ đã lấy ở lần đầu rồi làm bay hơi cho đến khô ở nhiệt độ 45 ⁰C với hệ thống cô bằng khí nitơ (5.12) với tốc độ dòng khí chậm.

Tổng thể tích phần hữu cơ phải lớn hơn 6 ml, nếu không phải chiết thêm một lần nữa.

6.2.4 Chuẩn bị mẫu phân tích

Hoà tan cặn khô bằng 500 ml dung môi hoà tan mẫu (4.8), lắc trên máy lắc Vortex (5.13) trong 20 s. Lọc dịch đục qua màng lọc 13 mm, 0,45 mm (5.14) và thu dịch lọc vào lọ đựng mẫu (5.7).

6.2.5 Phân tích trên LC/MS/MS

6.2.5.1 Điều kiện máy LC

– tốc độ:                                   0,4 ml/min;

– thể tích mẫu tiêm:                   50 ml;

– nhiệt độ cột:                           40 ⁰C;

– toàn bộ thời gian phân tích:    22 min;

– pha động:                              chế độ gradient theo Bảng 2.

Bảng 2 - Điều kiện gradient dung môi của máy LC

6.2.5.2 Điều kiện của đầu dò MS

– tỉ số chia:                                           xấp xỉ 1 : 2

– kiểu ion hoá:                                      ESI, dương

– điện thế mao quản:                             2,7 kv

– điện thế khối nón:                               30 v

– nhiệt độ nguồn:                                  120 ⁰C

– nhiệt độ khử dung môi:                       300 ⁰C

– tốc độ dòng khí khử dung môi:                       500 l/h

– tốc độ khí qua khối nón:                     200 l/h

– khí gây phân ly bằng va chạm:            argon, p = 3,2x10^-3 bar.

6.2.5.3 Điều kiện phân ly MS/MS

NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD và NPSEM bị phân ly thành các ion thứ cấp liên quan đến cấu trúc. Các chất đồng vị đánh dấu được sử dụng làm chất chuẩn nội cũng có cách phân ly tương tự (Bảng 3).

Bảng 3 - Các điều kiện phân ly MS/MS

6.2.6 Kiểm tra hiệu năng của hệ thống LC/MS/MS

Tiêm dung dịch chuẩn làm việc 1 mg/l (4.14). Xác định tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) đối với bước chuyển có cường độ thấp nhất. Tỷ lệ S/N phải lớn hơn 6. Lặp lại bước tiêm để kiểm tra sự lặp lại của thời gian lưu, diện tích pic và tỉ lệ các ion.

6.2.7 Trình tự tiêm mẫu

Các mẫu được phân tích theo trình tự sau:

– dung môi trắng;

– mẫu kiểm soát âm tính (6.1.2.1);

– mẫu kiểm soát dương tính (6.1.2.2);

– mẫu kiểm soát độ thu hồi (6.1.2.3);

– dung môi trắng;

– mẫu cần kiểm nghiệm (6.2.4);

– dung môi trắng;

– mẫu kiểm soát âm tính (6.1.2.1);

– mẫu kiểm soát dương tính (6.1.2.2).

7. Biểu thị và tính kết quả

7.1 Tính tỉ số ion

Tỉ số ion, R, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính theo công thức sau:

                                         (1)

trong đó:

A₁              là diện tích của pic ion thứ cấp có cường độ thấp nhất;

A₂              là diện tích của pic ion thứ cấp có cường độ cao nhất.

7.2 Tính độ lệch tương đối của tỉ số ion

Độ lệch tương đối của tỉ số ion, DR, được tính theo công thức sau:

(2)

trong đó:

DR             là độ lệch tương đối giữa tỉ số ion của chất cần phân tích trong mẫu thử với tỉ số ion trung bình của chất đó trong mẫu kiểm soát dương tính có nồng độ 1 mg/kg và cao hơn, tính bằng phần trăm (%);

R_s              là tỉ số ion của chất cần phân tích trong mẫu thử, tính bằng phần trăm (%);

R_m             là tỉ số ion trung bình của chất cần phân tích trong mẫu kiểm soát dương tính có nồng độ 1 mg/kg và cao hơn, tính bằng phần trăm (%).

7.3 Tính thời gian lưu tương đối

Thời gian lưu tương đối theo theo công thức sau:

(3)

trong đó:

Rrt             là thời gian lưu tương đối;

Rt              là thời gian lưu của chất cần phân tích;

Rt_IS            là thời gian lưu của chất chuẩn nội (đối với NPSEM thì NPAHD-d₂ là chất chuẩn nội).

7.4 Tính độ lệch chuẩn của thời gian lưu tương đối

Độ lệch chuẩn của thời gian lưu tương đối, DRrt, được tính theo công thức sau:

(4)

trong đó:

DRrt           là độ lệch tương đối giữa thời gian lưu tương đối của chất cần phân tích trong mẫu thử so với thời gian lưu tương đối của chất đó trong mẫu kiểm soát dương tính, tính bằng phần trăm (%);

Rrt_s            là thời gian lưu tương đối của chất cần phân tích trong mẫu thử;

Rrt_m           là thời gian lưu tương đối trung bình của chất cần phân tích trong mẫu kiểm soát dương tính.

7.5 Chất cần phân tích được khẳng định là có mặt khi đáp ứng các yêu cầu sau:

– tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cho mỗi ion phải không nhỏ hơn 3:1;

– mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối, sử dụng nhiều loại kỹ thuật khối phổ theo quy định trong Bảng 4.

Bảng 4 – Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối

7.6 Tính hệ số tín hiệu cho từng chất cần phân tích

Hệ số tín hiệu cho từng chất cần phân tích, RF, được tính theo công thức sau:

         (5)

trong đó:

RF             là hệ số tín hiệu;

Sp             là tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích;

Sp_IS           là diện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội (đối với NPSEM, NPAHD-d₂ được sử dụng làm chất chuẩn nội).

7.7 Tính lượng chất cần phân tích có mặt trong mẫu thử

Lượng chất cần phân tích có mặt trong mẫu thử, X, tính theo khối lượng chất chuyển hoá chưa bị dẫn xuất hoá, biểu thị bằng microgam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:

(6)

trong đó:

RF             là hệ số tín hiệu (công thức 5);

b               là độ dựng của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi quy tuyến tính;

a               là độ dốc của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi quy tuyến tính (dựng đồ thị tín hiệu của mẫu thử soát dương tính với nồng độ chất chuẩn bổ sung và áp dụng hồi quy tuyến tính).

8 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

SỰ CHUYỂN HOÁ CỦA CÁC CHẤT THUỘC NHÓM NITROFURAN

Dược chất                                                                    Chất chuyển hoá