Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12609:2019 Dầu, mỡ động thực vật - Xác định hàm lượng chất phenol

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12609:2019

DẦU, MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT PHENOL CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal and vegetable fats and oils - Determination of phenolic antioxidants content by high performance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 12609:2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 983.15 Phenolic antioxidants in oils, fats, butter oil. Liquid chromatographic method;

TCVN 12609:2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

DẦU, MỠ ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT PHENOL CHỐNG OXY HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal and vegetable fats and oils - Determination of phenolic antioxidants content by high performance liquid chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV để xác định hàm lượng chất phenol chống oxy hóa trong sản phẩm dầu, mỡ động vật và thực vật.

Giới hạn định lượng của phương pháp đối với propyl gallate [PG], 2,4,5-trihydroxybutyrophenone [THBP], tert-butylhydroquinone [TBHQ], axit nordihydroguaiaretic [NDGA], 2- và 3-terf-butyl-4-hydroxyanisole [BHA], 2,6-di-tert-butyl-4-hydroxymethylphenol [lonox-100], 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene [BHT] là từ 20 µg/g đến 200 µg/g trong dầu, mỡ, từ 10 µg/g đến 100 µg/g trong dầu bơ và đối với octyl gallate [OG], dodecyl gallate [DG] là từ 10 µg/g đến 100 µg/g trong dầu bơ.

2  Nguyên tắc

Các chất chống oxy hóa được chiết bằng axetonitril. Dịch chiết được cô đặc và hòa lại bằng 2-propanol. Các chất chống oxy hóa được tách bởi hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV tại bước sóng 280 nm.

3  Thuốc thử

Tất cả thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích, dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc có chất lượng tương đương. Nước sử dụng là nước đã loại ion, được lọc qua màng lọc 0,45 µm (4.11) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Axetonitril (CH₃CN).

3.2  Metanol (CH₃OH).

3.3  n-Hexan (CH₃(CH₂)₄CH₃).

3.4  2-Propanol ((CH₃)₂CHOH).

3.5  Axitaxetic (CH₃COOH).

3.6  Dung môi pha loãng, hỗn hợp của 2-propanol (3.4) và axetonitril (3.1) (1:1 phần thể tích).

3.7  Dung môi chiết

3.7.1  Hexan bão hòa axetonitril

Bão hòa 300 ml hexan (3.3) trong phễu chiết bằng cách thêm axetonitril (3.1) cho đến khi 2 lớp phân biệt rõ sau khi lắc 2 min. Loại bỏ lớp axetonitril phía dưới.

3.7.2  Axetonitril bão hòa hexan

Bão hòa 300 ml axetonitril (3.1) trong phễu chiết bằng cách thêm hexan (3.3) cho đến khi 2 lớp phân biệt rõ sau khi lắc 2 min. Loại bỏ lớp hexan phía trên.

3.8  Pha động

Kênh A: Axit axetic 5 % trong nước. Lấy 50 ml axit axetic (3.5) vào bình định mức 1 lít, pha loãng đến vạch bằng nước, trộn kỹ, lọc qua bộ lọc dung môi cỡ lỗ 0,45 µm, loại khí.

Kênh B: Axetonitril (3.1) - metanol (3.2) (1:1 thể tích) trộn kỹ, loại khí.

3.9  Chất chuẩn BHA (hỗn hợp 2- và 3-BHA), BHT, TBHQ, lonox-100, THBP và PG; NDGA, OG, và DG, độ tinh khiết ≥ 97 % (khối lượng)

3.10  Dung dịch chuẩn

CHÚ THÍCH: TBHQ rất dễ bị oxy hóa, đặc biệt dưới ánh sáng. Bảo quản lạnh tất cả dung dịch chất chống oxy hóa và tránh ánh sáng trực tiếp. Kiểm tra tín hiệu của TBHQ thông qua PG hoặc THBP và chuẩn bị mới nếu tín hiệu giảm trên 5 %.

3.10.1  Dung dịch chuẩn gốc, 1 mg/ml

Cân khoảng 50 mg mỗi chất chống oxy hóa (3.9), chính xác đến 0,1 mg, và chuyển vào các bình định mức 50 ml (4.7) riêng biệt. Hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi pha loãng (3.6), trộn kỹ.

3.10.2  Dung dịch chuẩn làm việc, 0,01 mg/ml (10 µg/ml)

Dùng pipet hút chính xác 1 ml mỗi loại dung dịch chuẩn gốc (3.10.1) chuyển vào bình định mức 100 ml (4.7), pha loãng đến vạch bằng dung môi pha loãng (3.6), trộn kỹ.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm bộ loại khí dung môi, bơm gradient 2 kênh, bộ bơm mẫu có thể bơm 10 µl, detector UV tại bước sóng 280 nm. Điều kiện hoạt động: đầu dò có độ nhạy 0,05 AUFS, tốc độ dòng 2,0 ml/min và bộ phân tích dữ liệu.

4.2  Cột phân tích HPLC

Cột LC: cột nhồi C18 silica hoặc loại tương đương, có khả năng phân tách được tất cả 9 chất chống oxy hóa được thể hiện như trong Hình A.1. Xác nhận thời gian lưu của từng chất bằng cách bơm từng dung dịch chuẩn riêng rẽ, nếu cần.

Sử dụng cột bảo vệ, nếu cần.

CHÚ THÍCH: Các cột có chiều dài 150 mm với cỡ hạt nhồi nhỏ hơn (< 3,5 µm) cũng có thể cho độ phân giải tương đương.

4.3  Dụng cụ thủy tinh

Rửa sạch tất cả dụng cụ thủy tinh lần lượt bằng cloroform, axeton, metanol và thổi khô bằng khí nitơ.

4.4  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.5  Phễu chiết các loại có nắp, dung tích 125 ml, 250 ml.

4.6  Bình cầu cổ nhám, đáy tròn, dung tích 250 ml, 500 ml.

4.7  Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 1 000 ml.

4.8  Cốc thủy tinh, dung tích 50 ml.

4.9  Máy lắc, tốt nhất là loại có thể xoay hoặc lắc đảo chiều.

4.10  Máy cô quay.

4.11  Màng lọc xyranh, làm bằng polyvinyliden florua (PVDF), đường kính 13 mm hoặc 25 mm, cỡ lỗ 0,45 µm.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng màng polypropylen (PP) ưa nước hoặc polytetrafloetylen (PTFE) nhưng không được dùng màng lọc nylon.

4.12  Ống đong chia vạch, có nắp bằng thủy tinh, dung tích 10 ml.

4.13  Lọ HPLC, phù hợp với bộ bơm mẫu của máy HPLC.

4.14  Pipet các loại, có thể phân phối chính xác 0,5 ml.

5  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6  Cách tiến hành

6.1  Chiết

Cân cốc thủy tinh 50 ml (4.8) cùng lượng mẫu thử thích hợp có chứa khoảng 5,5 g dầu lỏng hoặc dầu bơ hoặc 3,0 g mỡ lợn hoặc mỡ khác loại (hóa lỏng bằng cách sử dụng bể điều nhiệt tại 60 °C hoặc tủ sấy và lắc xoáy (4.9) hoặc lắc để đảm bảo đồng nhất), chính xác đến 0,01 g. Gạn nhiều nhất có thể phần mẫu thử vào phễu chiết 125 ml (4.5) có chứa 20 ml (22,5 ml đối với mỡ) hexan bão hòa (3.7.1). Cân lại cốc để xác định khối lượng mẫu thử. Lắc để trộn phần dung dịch thử với hexan và chiết ba lần, mỗi lần sử dụng 50 ml axetonitril bão hòa hexan (3.7.2). Nếu xuất hiện nhũ tương, giữ phễu chiết dưới vòi nước nóng 5 s đến 10 s. Gộp dịch chiết vào phễu chiết 250 ml (4.5) và cho dịch chiết chảy từ từ vào bình cầu đáy tròn 250 ml hoặc 500 ml (4.6) và loại bỏ các giọt dầu-hexan phía trên.

CHÚ THÍCH 1: Tại bước này, có thể bảo quản 150 ml dịch chiết axetonitril qua đêm trong tủ lạnh.

Cho bay hơi đến 3 ml đến 4 ml, sử dụng máy cô quay (4.10) với nhiệt độ bể ≤ 40 °C trong vòng 10 min.

CHÚ THÍCH 2: Thời gian cô quay dài có thể làm mất TBHQ. Để giảm thời gian cô quay, sử dụng nguồn chân không và hệ thống làm lạnh hiệu quả.

CHÚ THÍCH 3: Sử dụng bình cầu 500 ml để giảm mất mát trong quá trình sử dụng chân không. Cần thêm để đảm bảo lượng chiết xuất đủ sau khi bay hơi dung môi.

Sử dụng pipet chuyển hỗn hợp axetonitril - dầu vào ống đong 10 ml (4.12). Tráng bình với những lượng nhỏ axetonitril chưa bão hòa (3.1). Rửa sạch đáy bình cầu, pipet và gộp dịch rửa vào ống đong 10 ml cho đến khi thu được 5 ml. Rửa pipet từ trên xuống và tiếp tục rửa bình cầu bằng những lượng nhỏ 2-propanol và gộp vào ống đong cho đến khi được 10 ml. Trộn kỹ lượng chứa trong ống đong.

CHÚ THÍCH 4: Việc chiết xuất kéo dài có thể làm mất TBHQ.

Đối với mẫu trắng thuốc thử: lấy 25 ml hexan bão hòa axetonitril (3.7.1) và thực hiện như mẫu thử, từ giai đoạn “…chiết ba lần, mỗi lần sử dụng 50 ml dung dịch axetonitril bão hòa hexan”.

6.2  Xác định

6.2.1  Điều kiện vận hành HPLC

Các điều kiện vận hành sau đây được coi là thích hợp:

- Detector: UV tại bước sóng 280 nm

- Thể tích mẫu bơm: 10 µl;

- Tốc độ dòng: 2 ml/min;

- Nhiệt độ lò cột: nhiệt độ phòng.

Chương trình dung môi: chạy gradient tuyến tính kênh B từ 30 % đến 100 % trong 10 min. Giữ cho đến khi chất chống oxy hóa cuối cùng (DG) được rửa giải. Với dung dịch thử, tăng tốc độ dòng kênh B lên 4 ml/min ở 100 % trong 6 min hoặc cho đến khi các chất béo không phân cực được rửa giải. Với cả dung dịch thử và dung dịch chuẩn, quay trở lại 30 % kênh B trong 1 min với tốc độ 2 ml/min để đường nền và áp suất ổn định (6 min). Cần giảm tốc độ dòng và tăng thời gian rửa, thời gian cân bằng nếu áp suất tăng quá mức. Chạy gradient mẫu trắng (không bơm) để chắc chắn rằng không có pic tạp ảnh hưởng đến bất kỳ chất chống oxy hóa nào có mặt. Để loại bỏ hoặc giảm thiểu các pic ảnh hưởng trong dung môi rửa giải kênh A, thay thế đầu lọc bằng bộ lọc của cột chiết pha rắn C18 đã được rửa trước và sử dụng lọc dầu vào. Nếu yếu tố ảnh hưởng nhỏ không thể loại trừ, lấy chiều cao pic của dung dịch chuẩn hoặc dung dịch mẫu tương ứng trừ đi chiều cao pic của nhiễu dung môi.

CHÚ THÍCH: Các thông số về thể tích mẫu bơm, tốc độ dòng, nhiệt độ cột có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC được sử dụng.

6.2.2  Tiến hành phân tích

Sử dụng bộ bơm mẫu (4.1), bơm 10 µl dung dịch chiết và rửa giải bằng chương trình gradient cho dung dịch chiết (6.2.1). Cứ trước và sau 3 lần đến 4 lần bơm dung dịch thử, hoặc thường xuyên hơn nếu chiều cao pic của các dung dịch chuẩn sai khác > 5 %, bơm 10 µl dung dịch chuẩn làm việc (3.10.2) và rửa giải bằng chương trình gradient cho dung dịch chuẩn (xem 6.2.1). Đối với những pic có độ lớn nằm ngoài thang đo hoặc lớn hơn 3 lần chuẩn, pha loãng dịch chiết mẫu thử bằng dung môi pha loãng (3.6) và bơm lại. Xác định pic bằng so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn.

Bơm 10 µl dung dịch chiết mẫu trắng thuốc thử và rửa giải bằng chương trình gradient cho dung dịch mẫu thử. Mẫu trắng thuốc thử phải không có pic tạp nào ảnh hưởng đến các chất chống oxy hóa được phân tích.

Sử dụng chiều cao pic được tính toán bởi hệ thống, hoặc đo chiều cao pic đến 0,1 mm, sử dụng sắc ký đồ mẫu trắng gradient để làm đường nền cơ sở. Xác định chiều cao pic chất chống oxy hóa và trung bình chiều cao pic chất chuẩn (cho bơm lặp trước và sau khi bơm dịch thử, hiệu chỉnh bằng mẫu trắng gradient).

7  Tính kết quả

Tính hàm lượng mỗi chất chống oxy hóa, X, biểu thị bằng microgam trên gam (µg/g), theo công thức sau:

Trong đó:

R_x, R_s là chiều cao pic của dung dịch thử và dung dịch chuẩn;

w là khối lượng của phần mẫu thử trong 10 ml dịch thử trước khi pha loãng, tính bằng gam trên mililit (g/ml);

C_s là nồng độ chất chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);

D là hệ số pha loãng nếu dung dịch bơm được pha loãng.

8  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

c) phương pháp thử, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) nếu kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(tham khảo)

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bằng phương pháp sắc ký

Hình A.1 - Sắc ký đồ các dung dịch chuẩn chất chống oxy hóa (khoảng 0,1 µg mỗi chất) 1, PG; 2, THBP; 3, TBHQ; 4, NDGA; 5, BHA; 6, lonox-100; 7, OG; 8, BHT; 9, DG.

Phụ lục B

(tham khảo)

Kết quả thử nghiệm liên phòng

Bảng B.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định chất chống oxy hóa trong dầu bằng phương pháp sắc ký

Bảng B.2 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định chất chống oxy hóa trong mỡ bằng phương pháp sắc ký

Bảng B.3 - Kết quả thử nghiệm liên phòng xác định chất chống oxy hóa trong dầu bơ bằng phương pháp sắc ký