Tiêu chuẩn TCVN 8140:2025 Thịt và sản phẩm thịt - Xác định hàm lượng chloramphenicol - Phương pháp chuẩn

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8140:2025

ISO 13493:2021

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHLORAMPHENICOL - PHƯƠNG PHÁP CHUẨN

Meat and meat products - Determination of chloramphenicol content - Reference method

Lời nói đầu

TCVN 8140:2025 thay thế TCVN 8140:2009;

TCVN 8140:2025 hoàn toàn tương đương với ISO 13493:2021;

TCVN 8140:2025 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHLORAMPHENICOL - PHƯƠNG PHÁP CHUẨN

Meat and meat products - Determination of chloramphenicol content - Reference method

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng (LC) để xác định hàm lượng chloramphenicol trong mô cơ thịt, bao gồm cả thịt gia súc và gia cầm.

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng - hai lần khối phổ (LC-MS/MS) để xác định hàm lượng chloramphenicol trong mô cơ, màng bao, gan của thịt và sản phẩm thịt, bao gồm cả thịt gia súc và gia cầm.

Tiêu chuẩn này quy định LC-MS/MS làm phương pháp chuẩn.

Phương pháp LC thích hợp để xác định hàm lượng chloramphenicol lớn hơn 6,5 mg/kg.

Phương pháp LC-MS/MS thích hợp để xác định hàm lượng chloramphenicol lớn hơn 0,1 μg/kg.

Phương pháp này không thích hợp để áp dụng cho các mẫu đã bị suy giảm chất lượng.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Hàm lượng chloramphenicol (chloramphenicol content)

Phần khối lượng của dư lượng chloramphenicol trong thịt và sản phẩm thịt

CHÚ THÍCH 1: Hàm lượng chloramphenicol được biểu thị bằng microgam trên kilogam.

CHÚ THÍCH 2: Hàm lượng chloramphenicol được xác định theo quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

4 Nguyên tắc

4.1 Phương pháp sắc ký lỏng

Phần mẫu thử được chiết bằng nước. Lọc và chiết pha rắn để tách các thành phần ưa béo ra khỏi dung dịch nước. Chloramphenicol được rửa giải khỏi cột bằng dichloromethan. Pha hữu cơ được làm bay hơi và tinh sạch bằng chiết lỏng-lỏng với nước và toluen. Chloramphenicol được đo bằng sắc ký pha đảo sử dụng detector cực tím (UV).

4.2 Phương pháp sắc ký lỏng - hai lần khối phổ

Phần mẫu thử được chiết bằng ethyl acetat, loại chất béo bằng n-hexan và làm sạch bằng cột chiết pha rắn cân bằng ưa nước-ưa béo (HLB). Chloramphenicol được xác định và khẳng định bằng LC-MS/MS ở chế độ theo dõi đa phản ứng (MRM), hoạt động ở chế độ ion âm.

5 Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 7925 (ISO 17604).

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Lấy mẫu đại diện ít nhất 200 g. Bảo quản mẫu sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và thay đổi thành phần.

6 Chuẩn bị mẫu thử

Để mẫu đạt đến nhiệt độ phòng. Loại bỏ mỡ thừa và những phần không ăn được.

Đồng hóa mẫu phòng thử nghiệm bằng thiết bị thích hợp (7.2.3). Chú ý không để nhiệt độ của mẫu thử cao quá 25 °C. Nếu sử dụng máy xay thịt thì xay mẫu ít nhất hai lần.

Đổ đầy mẫu đã chuẩn bị vào vật chứa có nắp đậy kín khí thích hợp. Đậy nắp vật chứa và bảo quản sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và không bị thay đổi thành phần. Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, và chỉ sử dụng trong vòng 24 h sau khi đồng hoá.

7 Phương pháp sắc ký lỏng

7.1 Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

7.1.1 Nước, ít nhất phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696). Nước không chứa các hợp chất hữu cơ.

7.1.2 Nitơ, thích hợp để làm bay hơi dung môi.

7.1.3 Dichloromethan.

7.1.4 Toluen.

7.1.5 Dung dịch đệm acetat, c(CH ₃ CO ₂ Na) = 0,01 mol/lit, pH = 4,3.

Hòa tan 0,82 g natri acetat khan trong khoảng 970 ml nước. Chỉnh pH đến 4,3 bằng acid acetic (CH ₃ CO ₂ H) loãng 50 % khối lượng, sử dụng máy đo pH (7.2.1). Chuyển dung dịch vào bình định mức một vạch 1 000 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều.

7.1.6 Acetonitril, loại dùng cho HPLC.

7.1.7 Pha động.

Cho 750 ml dung dịch đệm acetat (7.1.5) vào 250 ml acetonitril (7.1.6) và trộn kỹ.

Trước khi sử dụng, lọc pha động qua màng lọc 0,22 μm (7.2.2) và khử khí.

7.1.8 Dung dịch gốc chloramphenicol, 100 μg/ml.

Cân 10 mg chloramphenicol, chính xác đến 0,1 mg và chuyển vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng methanol đến vạch và trộn đều.

Dung dịch gốc này bền trong một tháng khi được bảo quản ở nơi tối.

7.1.9 Dung dịch chuẩn chloramphenicol

Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch gốc (7.1.8) cho vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều.

Chuẩn bị bốn dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml và 15,0 ml dung dịch này bằng nước đến 100 ml để thu được các dung dịch có hàm lượng chloramphenicol tương ứng là 0,05 μg/ml, 0,10 μg/ml, 0,25 μg/ml và 0,75 μg/ml.

Các dung dịch chuẩn này bền trong một tuần khi được bảo quản ở nơi tối.

7.2 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

7.2.1 Máy đo pH.

7.2.2 Màng lọc, có thể tích chết thấp và cỡ lỗ 0,22 μm.

7.2.3 Thiết bị đồng hoá bằng cơ hoặc bằng điện có khả năng đồng hoá mẫu phòng thử nghiệm.

Thiết bị này gồm máy cắt quay tốc độ cao, hoặc máy xay có gắn tấm đục lỗ, đường kính lỗ không quá 4,0 mm.

7.2.4 Máy trộn phòng thử nghiệm (ví dụ: bộ trộn nhu động ¹⁾ hoặc máy trộn Vortex).

7.2.5 Giấy lọc, loại định lượng, tốc độ lọc nhanh, đường kính khoảng 15 cm.

CHÚ THÍCH VÍ DỤ, Whatman 41, 1441-047-GE Whatman Grade 41, được cho là phù hợp ^{1 )} .

7.2.6 Cột chiết, dung tích 20 ml, chứa đất diatomit để chiết các thành phần ưa béo ra khỏi dung dịch nước.

CHÚ THÍCH Extrelu® do Merck Darmstadt, Đức (Số 11737) sản xuất, được cho là phù hợp ¹⁾ .

7.2.7 Nồi cách thủy hoặc bộ gia nhiệt, có khả năng duy trì ở (40 ± 1) °C, có bộ phận làm khô bằng nitơ (7.1.2) hoặc máy cô quay chân không.

7.2.8 Ống ly tâm, dung tích 25 ml.

7.2.9Máy trộn Vortex, vận hành ở tốc độ quay khoảng 700 r/min.

7.2.10Máy ly tâm, vận hành ở gia tốc hướng tâm khoảng 1 000g.

7.2.11 Micropipet, dung tích 300 μl.

7.2.12 Máy sắc ký lỏng, được trang bị:

- bơm có tốc độ dòng ổn định;

- bộ bơm mẫu;

- cột C ₈ hoặc C _{1 8} pha đảo có đường kính trong 3 mm, dài 20 cm và cỡ hạt 5 μm hoặc cột có chất lượng tương đương;

- detector UV/VIS thích hợp để đo ở bước sóng 285 nm; detector mảng diode (dùng để khẳng định), nếu có.

7.3 Cách tiến hành

7.3.1 Yêu cầu chung

Nếu cần kiểm tra về độ đáp ứng của giới hạn lặp lại (xem 7.5.2), tiến hành hai phép xác định riêng lẻ theo 7.3.1 đến 7.3.6.

Khi phân tích dung dịch thử (hoặc dãy các dung dịch thử), phân tích kèm mẫu trắng thêm chuẩn với hàm lượng chloramphenicol 10 μg/kg và mẫu trắng.

7.3.2 Phần mẫu thử

Cân 10 g (m) mẫu thử đã chuẩn bị (xem Điều 6) chính xác đến 0,1 g cho vào bình nón 100 ml.

7.3.3 Chuẩn bị dịch chiết

7.3.3.1 Lấy 40,0 ml nước và trộn kỹ trong 3 min bằng máy trộn phòng thử nghiệm (7.2.4).

7.3.3.2 Thể tích (V ₁ ) của pha nước thu được là 40,0 ml cộng với thể tích nước trong phần mẫu thử (thường khoảng 7,5 ml nước trong 10 g mẫu).

7.3.3.3 Lọc mẫu qua giấy lọc (7.2.5).

7.3.4 Chiết pha rắn

7.3.4.1 Chuyển 20,0 ml (V ₂ ) dịch lọc vào cột chiết (7.2.6).

7.3.4.2 Sau (15 ± 0,2) min, rửa giải chloramphenicol bằng 70 ml dichloromethan (7.1.3). Cho bay hơi pha hữu cơ dưới dòng nitơ (7.1.2) nhẹ trong nồi cách thủy (7.2.7) đến thể tích khoảng 1 ml.

7.3.4.3 Dùng khoảng 10 ml dichloromethan (7.1.3) chuyển phần còn lại vào ống ly tâm (7.2.8). Làm bay hơi cẩn thận cho đến khi khô hoàn toàn.

7.3.5 Chiết lỏng-lỏng

7.3.5.1 Cho 400 μl (V ₃ ) nước và 2,0 ml toluen (7.1.4) vào phần cặn và trộn nhẹ trong 1 min bằng máy trộn Vortex (7.2.9) với tốc độ quay khoảng 700 r/min.

7.3.5.2 Ly tâm trong 5 min ở gia tốc hướng tâm 1 000g bằng máy ly tâm (7.2.10). Dùng pipet loại bỏ pha hữu cơ càng triệt để càng tốt.

7.3.5.3 Thêm 1,5 ml toluen và trộn nhẹ trong 1 min ở tốc độ quay khoảng 700 r/min trong máy trộn Vortex (7.2.9). Ly tâm 5 min ở gia tốc hướng tâm 1 000g trong máy ly tâm (7.2.10).

7.3.5.4 Dùng pipet loại bỏ pha hữu cơ càng triệt để càng tốt. Dùng micropipet (7.2.11) chuyển 300 μl pha nước vào vật chứa thích hợp.

7.3.6 Phân tích sắc ký

7.3.6.1 Điều kiện sắc ký

CHÚ THÍCH Thể tích bơm và tốc độ dòng thể tích phụ thuộc vào kích thước cột.

7.3.6.2 Chạy sắc ký

Chờ cho đến khi hệ thống sắc ký lỏng (7.2.1.2) ổn định. Bơm mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và bốn dung dịch chuẩn chloramphenicol (7.1.9).

Kiểm tra các tín hiệu chloramphenicol trong sắc ký đồ của mẫu cùng thời gian lưu của các hàm lượng chloramphenicol trong các dung dịch này.

7.3.6.3 Tiến hành đo

Đo chiều cao pic hoặc diện tích chloramphenicol trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.

Các kết quả thu được đối với các dung dịch chuẩn chloramphenicol phải tuyến tính với các hàm lượng chloramphenicol của các dung dịch này.

CHÚ THÍCH: Đối với hàm lượng chloramphenicol lớn hơn 10 μg/kg thì sử dụng detector mảng diode (DAD).

7.4 Tính kết quả

Tính hàm lượng chloramphenicol của mẫu thử theo Công thức (1):

Trong đó

Báo cáo kết quả được làm tròn chính xác đến 0,1 μg/kg.

Kết quả về độ thu hồi không được hiệu chính. Độ thu hồi phải được nêu trong báo cáo thử nghiệm (xem Điều 9).

7.5 Độ chụm

7.5.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo ISO 5725:1986 [1].

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm này đã được công bố, xem Tài liệu tham khảo [5]. Các giá trị nhận được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.

Các kết quả của một phép thử liên phòng thử nghiệm khác, tiến hành theo ISO 5725:1986, cho thấy độ thu hồi đối với thịt, sản phẩm thịt và gia cầm là lặp lại và xấp xỉ 55 %.

7.5.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ, thu được bằng cách sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử nghiệm giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm do một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % trường hợp vượt quá 2,1 μg/kg đối với hàm lượng chloramphenicol là 10 μg/kg.

7.5.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thực hiện khác nhau sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá 4,9 μg/kg đối với hàm lượng chloramphenicol là 10 μg/kg.

8 Phương pháp sắc ký lỏng - hai lần khối phổ (phương pháp chuẩn)

8.1 Thuốc thử và vật liệu

Chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng phân tích, trừ khi có quy định khác.

8.1.1 Nước, ít nhất phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696).

8.1.2 Methanol, loại dùng cho LC-MS/HPLC.

8.1.3 Acetonitril, loại dùng cho LC-MS/HPLC.

8.1.4 Ethyl acetat.

8.1.5 n-Hexan.

8.1.6 Amoni hydroxide, loại phân tích.

8.1.7 β-glucuronidase, khoảng 40 000 đơn vị hoạt độ của enzym.

8.1.8 Dung dịch I methanol và nước (tỷ lệ thể tích 2:8).

Cho 20 ml methanol (8.1.2) và 80 ml nước vào bình định mức một vạch 100 ml và trộn đều.

8.1.9 Dung dịch II methanol và nước (tỷ lệ thể tích 1:1).

Cho 50 ml methanol (8.1.2) và 50 ml nước vào bình định mức một vạch 100 ml và trộn đều.

8.1.10 Chloramphenicol, độ tinh khiết > 99 %, làm chất chuẩn.

8.1.11 Dung dịch gốc chloramphenicol, 100 μg/ml.

Cân 10,0 mg chloramphenicol (8.1.10), chính xác đến 0,1 mg và chuyển vào bình định mức một vạch 100 ml. Thêm methanol (8.1.2) đến vạch và trộn đều.

Dung dịch gốc này bền trong một tháng khi được bảo quản ở nơi tối.

8.1.12 Dung dịch làm việc chloramphenicol (CAP), 1,0 μg/ml

Dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc (8.1.11) cho vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng dung dịch II methanol và nước (8.1.9) đến vạch và trộn đều.

8.1.13 Chất nội chuẩn chloramphenicol-d ₅ , độ tinh khiết ≥ 99 %, làm chất chuẩn.

8.1.14 Dung dịch chuẩn gốc nội chuẩn chloramphenicol-d ₅ (CAP-d ₅ ), 100 μg/ml.

Cân 10,0 mg chất chuẩn CAP-d ₅ (8.1.13) chính xác đến 0,1 mg và chuyển vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng methanol (8.1.2) đến vạch và trộn đều.

Dung dịch gốc này bền trong một tháng khi được bảo quản ở nơi tối.

8.1.15 Dung dịch làm việc nội chuẩn chloramphenicol-d ₅ (CAP-d ₅ ), 1,0 μg/ml.

Dùng pipet lấy 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc CAP-d ₅ (8.1.14) vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng dung dịch II methanol, nước (8.1.9) đến vạch và trộn đều.

8.1.16 Dung dịch làm việc chuẩn để dựng đường chuẩn

Chuẩn bị năm dung dịch chuẩn bằng cách dùng pipet lấy 0,01 ml, 0,05 ml, 0,1 ml, 0,2 ml và 0,5 ml dung dịch làm việc CAP (8.1.12), 0,1 ml dung dịch làm việc chuẩn CAP-d ₅ (8.1.15) cho vào năm bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng dung dịch II methanol và nước (8.1.9) để thu được các dung dịch có hàm lượng CAP là 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 1,0 ng/ml, 2,0 ng/ml và 5, 0 ng/ml với nồng độ CAP-d ₅ là 1,0 ng/ml.

8.1.17 Dung dịch acetonitril và nước (tỷ lệ thể tích 1:9).

Cho 10 ml acetonitril (8.1.3) và 90 ml nước vào bình định mức một vạch 100 ml và trộn đều.

8.2 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

8.2.1 Thiết bị LC-MS/MS

Máy sắc ký lỏng kết hợp với máy đo phổ khối ion hoá phun điện tử.

8.2.2 Máy cô quay chân không.

8.2.3 Máy đồng hoá, có khả năng làm việc ở tần suất quay 14 000 r/min.

8.2.4 Bộ trộn Vortex, hoạt động ở tần suất quay khoảng 2 000 r/min.

8.2.5 Máy ly tâm, hoạt động ở gia tốc hướng tâm khoảng 2 000g.

8.2.6 Ống ly tâm, dung tích khoảng 50 ml.

8.2.7 Cột chiết pha rắn của cột Oasis HLB, 200 mg/6 ml, hoặc tương đương.

Ổn định cột bằng 5 ml methanol sau đó bằng 5 ml nước để hoạt hoá và cân bằng cột.

8.2.8 Nồi cách thủy kiểm soát nhiệt độ ổn định

8.3 Cách tiến hành

8.3.1 Yêu cầu chung

Nếu phải kiểm tra về độ đáp ứng giới hạn lặp lại thì tiến hành hai phép xác định đơn lẻ theo 8.3.1 đến 8.3.5.

Phân tích dung dịch thử (hoặc dãy dung dịch thử) cùng với phân tích mẫu thêm chuẩn với hàm lượng chloramphenicol 0,2 μg/kg và mẫu trắng.

8.3.2 Phần mẫu thử

Cân 5,0 g mẫu thử đã chuẩn bị (xem Điều 6), chính xác đến 0,1 g, cho vào ống ly tâm 50 ml (8.2.6).

8.3.3 Chuẩn bị dịch chiết

8.3.3.1 Mô cơ và màng bao

8.3.3.1.1 Thêm 0,1 ml dung dịch làm việc CAP-d ₅ (8.1.15), 0,5 ml amoni hydroxide (8.1.6) và 15 ml ethyl acetat. Đồng hoá trong 30 s ở 14 000 r/min (8.2.3).

8.3.3.1.2 Ly tâm trong 5 min ở gia tốc hướng tâm 2000g (8.2.5). Chuyển phần dịch nổi phía trên vào ống ly tâm khác.

8.3.3.1.3 Lặp lại cách tiến hành ở trên với 15 ml ethyl acetat (8.1.4). Gộp hai dung dịch chiết và cho bay hơi (8.2.2) đến gần khô trong nồi cách thủy dưới 50 °C.

8.3.3.1.4 Thêm 4 ml n-hexan (8.1.5) và 4 ml nước để hoà tan cặn. Trộn 1 min ở 2000 r/min trong máy trộn Vortex (8.2.4). Ly tâm (8.2.5) 3 min ở 2 000g và loại bỏ phần dịch nổi phía trên. Thêm 4 ml n-hexan và lặp lại cách tiến hành.

8.3.3.2 Gan

Thêm 0,2 ml β-glucuronidase (8.1.7) và 15 ml nước. Trộn 1 min ở 2 000 r/min trên máy trộn (8.2.4). Đồng hoá 30 s ở 14 000 r/min (8.2.3). Thủy phân ở 37 °C trong nồi cách thủy kiểm soát nhiệt độ ổn định trong 12 h. Thực hiện theo cùng một quy trình như trong 8.3.3.1.1 đến 8.3.3.1.4.

8.3.4 Chiết pha rắn

8.3.4.1 Chuyển dung dịch ở trên vào cột Oasis HLB (8.2.7). Rửa ống ly tâm hai lần, mỗi lần dùng 5 ml dung dịch I methanol và nước (8.1.8) và cho nước rửa đi qua cột Oasis HLB. Loại bỏ dung dịch rửa giải.

8.3.4.2 Làm bay hơi cột đến khô dưới chân không (8.2.2). Rửa giải cột bằng 6 ml methanol (8.1.2) và thu lấy dung dịch rửa giải.

8.3.4.3 Làm bay hơi pha hữu cơ đến khô dưới áp suất chân không (8.2.2). Dịch chiết khô được hòa trong 5 ml dung dịch acetonitril (8.1.17) bằng cách trộn Vortex (8.2.4) trong 5 min để hoà tan cặn và lọc qua xyranh để bơm lệ hệ thống LC-MS (8.2.1).

8.3.5 Phân tích bằng LC-MS/MS

8.3.5.1 Điều kiện HPLC

Bảng 1 - Gradient của pha động

8.3.5.2 Thông số MS

Chuyển khối để khẳng định và định lượng, CE và CXP, xem Bảng 2.

CHÚ THÍCH Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn chloramphenicol và dung dịch chuẩn chloramphenicol-d ₅ nêu trong Phụ lục A.

Bảng 2 - Chuyển khối để khẳng định và định lượng, CE và CXP

8.3.5.3 Phép thử mẫu trắng

Tiến hành phép thử mẫu trắng như mô tả trong phương pháp xác định nhưng không thêm mẫu thử.

8.3.5.4 Định lượng và khẳng định bằng LC-MS/MS

Bơm dung dịch chuẩn làm việc và dung dịch mẫu ở các điều kiện LC-MS/MS (xem 8.3.5.1 đến 8.3.5.2). Dựng đường chuẩn, sử dụng nội chuẩn đồng vị để định lượng, với điều kiện thời gian lưu của các pic trên sắc ký đồ của mẫu phù hợp với thời gian lưu của dung dịch chuẩn. Để khẳng định, cường độ tương đối của các chuyển khối của mẫu phải tương ứng với cường độ tương đối chuyển khối của dung dịch chuẩn. Nồng độ của dung dịch chuẩn phải tương ứng với nồng độ của dung dịch mẫu. Dung sai cho phép được nêu trong Bảng 3 và chất phân tích tương ứng có thể có trong mẫu.

Bảng 3 - Dung sai tối đa cho phép đối với cường độ ion tương đối trong quá trình khẳng định

8.4 Tính kết quả

Phần mềm định lượng của thiết bị LC-MS/MS có thể xây dựng khuôn mẫu (customized template) để kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn, tính tỷ lệ diện tích pic thu được từ các phản ứng chuyển khối, khẳng định sự có mặt hay không có mặt chất phân tích và đưa ra kết quả cuối cùng, biểu thị bằng microgam trên kilogam (μg/kg). Giá trị mẫu trắng phải được trừ vào kết quả tính được ở trên. Xem Công thức (2):

Trong đó

8.5 Độ chụm

8.5.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo ISO 5725:1986. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu.

8.5.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % trường hợp vượt quá 0,01 μg/kg đối với hàm lượng chloramphenicol là 0,1 μg/kg.

8.5.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người thực hiện khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá 0,025 μg/kg đối với hàm lượng chloramphenicol là 0,1 μg/kg.

9 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này [TCVN 8140 (ISO 13493)];

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết về mọi sự cố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

- kết quả thử nghiệm thu được hoặc hai kết quả thử nghiệm thu được, nếu kiểm tra về độ lặp lại;

- độ thu hồi;

- ngày thử nghiệm.

 

Phụ lục A

(tham khảo)

Sắc ký đồ HPLC của dung dịch chuẩn và sắc ký đồ LC-MS/MS của dung dịch chuẩn chloramphenicol

Chú giải

Y AU

1 chloramphenicol

Hình A.1 - Sắc ký đồ HPLC của dung dịch chuẩn chloramphenicol ở nồng độ 5,0 μg/ml

Hình A.2 - Sắc ký đồ LC-MS/MS của dung dịch chuẩn chloramphenicol và dung dịch chuẩn chloramphenicol-d ₅ ở nồng độ tương ứng 0,5 ng/ml và 1,0 ng/ml

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ISO 5725:1986 ²⁾ , Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa

[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[4] TCVN 7925 (ISO 17604), Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Lấy mẫu thân thịt để phân tích vi sinh vật

[5] Aerts M.L., Keukens H.J., Werdmuller G.A. Liquid Chromatographic Determination of Chloramphenicol Residues in Meat: Interlaboratory Study./AOAC. 1989,72(4), pp. 570-576