Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12371-2-5:2020 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12371-2-5:2020

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2- 5: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII (SMITH) MERGAERT

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-5: Particular requirements for Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

Lời nói đầu

TCVN 12371-2-7: 2020 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

- TCVN 12371-1:2019. Phần 1: Yêu cầu chung

- TCVN 12371-2-1:2018. Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus

- TCVN 12371-2-2:2018. Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.

- TCVN 12371-2-3:2019. Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.

- TCVN 12371-2-4:2020. Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với Alfalfa mosaic virus

- TCVN 12371-2-5:2020. Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

- TCVN 12371-2-6:2020. Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Potato spindle tuber viroid

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 2- 5: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII (SMITH) MERGAERT

Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 2-5: Particular requirements for Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định các yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12371-1:2019. Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.

3  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học, theo TCVN 12371- 1:2019 (điều 3) và các thiết bị sau:

3.1  Bình tam giác

3.2  Túi ni lon: Vô trùng, kín khí

3.3  Que cấy thẳng

3.4  Giấy lọc: kích thước lỗ lọc 11 μm

3.5  Ống nghiệm: bằng thủy tinh dung tích > 10 ml, có nắp đậy

3.6  Máy ly tâm: tốc độ từ 1 000 vòng/phút đến 18 000 vòng/phút

3.7  Que cấy vô trùng

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác. Sử dụng hóa chất theo TCVN 12371-1:2019 (điều 4) và một số hóa chất sau:

4.1  NNN’N’- tetramethyl-p-phenyl diamine dihydrochloride 1 %

4.2  Agarose

4.3  Natri hidrophosphat (Na₂HPO₄)

4.4  Kali hidrophosphat (K₂HPO₄)

4.5  Nước cất

4.6  Chất chiết nấm men

4.7  Peptone

4.8  Agar

4.9  Kali dihidrophosphat (KH₂PO₄)

4.10 Glucose (C₆H₁₂O₆)

4.11  Methyl red

4.12  Ethanol (C₂H₅OH) 95 %

4.13  Tryptone

4.14  L- tryptophan

4.15  p-dimethylaminobenzaldehyde

4.16  Pentanol (C₅H₁₂O)

4.17  Axit Clohydric (HCI) 35 %

4.18  Kali nitơrat (KNO₃)

4.19  Axit Sunphanilic (NH₂C₆H₄S)

4.20  Axit Acetic băng (C₂H₃COOH)

4.21  8- amino-2-napthlenesulfonic

4.22  Aesculin

4.23  Sat citrat (C₆H₅FeO₇)

4.24  Natri citrat (Na₃C₅H₅O₇)

4.25  Amoni dihidrophosphat (NH₄)H₂PO₄

4.26  Kali Clorua (KCI)

4.27  Magie Sunfat (MgSO₄)

4.28  Bromothymol blue

4.29  Arbutin 10%

4.30  Maltose 10%

4.31  Salicin10%

4.32  Raffinose 10 %

4.33  Natri malonat (C₃H₂O₄Na₂)

4.34  Amoni sunfat ((NH₄)₂SO₄)

4.35  Natri clorua (NaCI)

4.36  Dextrose

4.37  Môi trường King’s B

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12371-1:2019.

5.2  Bảo quản mẫu

Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau khi giám định như sau:

+ Thân, lá bảo quản tươi hoặc ép khô theo điều 5.2.1.1 của TCVN 12371-1:2019

+ Hạt bảo quản theo điều 5.2.1.2 của TCVN 12371-1:2019

6  Phát hiện bệnh

Giai đoạn cây con: Cây héo rũ. Trên lá của cây bệnh có các sọc dọc màu xanh nhạt tới vàng viền vết bệnh bất định hoặc lượn song, vết bệnh có thể chạy song song theo gân lá và mở rộng ra toàn bộ phiến lá. Triệu chứng trên lá xuất hiện rất sớm từ khi mới hình thành lá. Cây bệnh bị chết ngọn gây hiện tượng chồi nách màu bạc. (hình 1)

Hình 1- Ví dụ triệu chứng bệnh vi khuẩn Pantoea stewartii trên cây ngô non

Giai đoạn cây trưởng thành: Phần thân gần mặt đất có thể bị nứt. Triệu chứng trên lá tương tự như trong giai đoạn cây con.

Khi kiểm tra lô hàng cần chú ý các nước mà vi khuẩn có phân bổ (xem phụ lục A) và các loài cây mà vi khuẩn gây hại (xem phụ lục A).

7.1  Giám định

7.2  Giám định bằng phương pháp hình thái kết hợp với phản ứng sinh hóa

7.1.1  Phân lập vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn theo điều 7.1.1.1 của TCVN 12371-1:2019:

+ Mẫu (thân, lá) được nghiền trong đệm phostphat (xem phụ lục B.1).

+ Tách chiết vi khuẩn từ hạt:

Lượng mẫu hạt sử dụng: 100 hạt.

Bước 1: Rửa sạch hạt dưới vòi nước chảy. Mẫu hạt sau đó được cho vào bình tam giác (3.1) hoặc túi ni lon (3.2) kín (sau đây gọi là vật chứa)

Bước 2: Thêm vào vật chứa dung dịch đệm phostphat (phụ lục B.1) với tỷ lệ (hạt: đệm phostphat) 1:2 theo khối lượng. Đặt vật chứa trong điều kiện từ 4 °C đến 10 °C trong 6 giờ đến 8 giờ.

Bước 3: Mẫu hạt sau đó được lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ ở điều kiện phòng.

Bước 4: Dịch thu được sau khi ngâm hạt được đặt trong máy ly tâm (3.6) ly tâm với tốc độ 1 300 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ từ 4 °C đến 10 °C trong 10 phút. Thu phần kết tủa.

Bước 5: Phần kết tủa thu được hòa tan lại trong đệm phosphat dung tích bằng 1/10 lượng đệm sử dụng trong bước 2.

+ Nuôi cấy trên môi trường King’ B (4.37) (xem phụ lục 8 của TCVN12371 -1:2019) với điều kiện nhiệt độ 25 °C đến 27 °C thời gian từ 2 ngày đến 5 ngày.

Chọn các khuẩn lạc có hình thái phù hợp với mô tả hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert: khuẩn lạc màu vàng sáng tới vàng cam, rìa nhẵn, khuẩn lạc nhô cao.

7.1.2  Nuôi cấy dòng thuần

Nuôi cấy dòng thuần theo TCVN12371 -1:2019 (điều 7.1.1.1) sử dụng môi trường King’ B (4.37) (xem phụ lục B của TCVN12371 -1:2019)

7.1.3  Phản ứng sinh hóa

Các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert bao gồm:

7.1.3.1  Phản ứng nhuộm Gram

Phản ứng nhuộm Gram theo điều 7.1.1.2 của TCVN 12371-1:2019

7.1.3.2  Khả năng di động

Dùng que cấy thẳng (3.3) lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) cấy theo chiều dọc vào ống nghiệm (3.5) chứa môi trường thử khả năng di động của vi khuẩn (xem phụ lục B.2)

Đọc kết quả:

+ Vi khuẩn có khả năng di động (dương tính): Vi khuẩn phát tán ra toàn bộ ống nghiệm làm cho môi trường bị đục (thường là mang màu vàng sáng)

+ Vi khuẩn không có khả năng di động (âm tính): Vi khuẩn chỉ phát triển theo vết cấy

7.1.3.3  Phản ứng Kovac’s oxidase

Nhỏ 2 giọt đến 3 giọt NNN’N’- tetramethyl-p-phenyl diamine dihydrochloride 1 % (4.1) lên giấy lọc (3.4). Dùng que cấy vô trùng (3.7) lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) thoa lên bề mặt của giấy lọc. Đọc kết quả sau 30 đến 60 giây.

Đọc kết quả:

- Dương tính: giấy lọc chuyển màu xanh tím

- Âm tính: giấy lọc không chuyển màu.

7.1.3.4  Sản sinh Acetoin

Bước 1: Lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) đặt vào ống nghiệm (3.5) chứa 5 ml môi trường Voges-Proskauer (xem phụ lục B.3) trong điều kiện nhiệt độ 28 °C trong từ 3 ngày đến 5 ngày.

Bước 2: Chuyển mỗi 1 ml dung dịch nuôi cấy thu được ở bước 1 vào ống nghiệm (3,5) vô trùng khác.

Bước 3: Cho vào ống nghiệm (3.5) 3 giọt đến 5 giọt thuốc thử Methyl red (xem phụ lục B.4)

Đọc kết quả:

+ Dương tính: dung dịch nuôi cấy trong ống nghiệm chuyển màu đỏ

+ Âm tính: dung dịch nuôi cấy trong ống nghiệm chuyển màu vàng

7.1.3.5  Phản ứng Indole

Bước 1: Lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) nuôi cấy trong môi trường thử indole (xem phụ lục B.5). Đặt các ống nghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 28 °C trong từ 3 ngày đến 5 ngày.

Bước 2: Chuyển 5 ml dịch từ ống nghiệm (3.5) ở bước 1 vào một ống nghiệm (3.5) mới, thêm vào 0,5 ml thuốc thử Kovacs (xem phụ lục B.6)

Đọc kết quả:

+ Dương tính: dung dịch chuyển màu đỏ

+ Âm tính: dung dịch không chuyển màu

7.1.3.6  Phản ứng phân giải Nitrate

Bước 1: Dùng que cấy thẳng (3.3) lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) nuôi cấy trong môi trường Nitrate (xem phụ lục B.7). Đặt ống nghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 28 °C trong từ 3 đến 5 ngày.

Bước 2: Thêm 0,5 ml dung dịch thuốc thử nitrate (xem phụ lục B.8) vào ống nghiệm (3.5) ở bước 1

Đọc kết quả:

+ Dương tính: dung dịch chuyển màu đỏ

Trong trường hợp dung dịch chuyển màu hồng nhạt hoặc không chuyển màu. Thêm vào 2 đến 3 hạt kẽm và lắc đều. Nếu dung dịch trong ống nghiệm xuất hiện màu đỏ phản ứng được coi là âm tính. Nếu dung dịch trong ống không chuyển màu thì phản ứng được coi là dương tính.

7.1.3.7  Phản ứng phân giải Aesculin

Lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) nuôi cấy trong môi trường phân giải Aesculin (xem phụ lục B.9). Đặt ống nghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 28 °C trong 7 ngày.

Đọc kết quả:

+ Dương tính: dung dịch chuyển màu nâu hoặc đen

+ Âm tính: dung dịch không chuyển màu

7.1.3.8  Phản ứng phân hủy và oxi hóa carbonhydrate (Maltose, Arbutin, Salicin, Raffinose)

Dùng que cấy thẳng (3.3) lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) nuôi cấy trong môi trường thủy phân (xem phụ lục B.10). Đặt ống nghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 28 °C trong 3 tuần. Đọc kết quả:

+ Dương tính: môi trường chuyển sang màu vàng.

+ Âm tính: môi trường không đổi màu

7.1.3.9  Phản ứng phân giải Malonate

Lấy một khuẩn lạc (thu được từ điều 7.1.2) nuôi cấy trong môi trường phân giải Malonate (xem phụ lục B.11). Đặt ống nghiệm (3.5) có khuẩn lạc ở nhiệt độ 35 °C trong 1 ngày đến 2 ngày.

Đọc kết quả:

+ Dương tính: môi trường chuyển sang màu xanh nước biển.

+ Âm tính: môi trường không đổi màu

7.1.3.10  Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

Bảng 1- Kết quả phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

7.2  Giám định bằng ELISA

Thực hiện theo điều 7.1.2 của TCVN 12371-1: 2019

Sử dụng các loại dịch mẫu đã nêu trong điều 7.1.2.2 của TCVN 12371-1:2019 ngoài ra có thể sử dụng dịch mẫu tách chiết từ hạt như điều 7.1.1 phần tách chiết vi khuẩn từ hạt.

7.3  Giám định bằng PCR

Thực hiện theo điều 7.1.3 của TCVN 12371-1: 2019

Sử dụng một trong những cặp mồi đặc hiệu:

- Cặp mồi 1 (AGES, AT)

PST-1: 5’ CCT CAC ACC ATC GGA TGT G -3’

PST-R: 5’ ATG AGG TTA TTA ACC TCA CCA- 3’

Với chu trinh nhiệt:

Đọc kết quả

Sản phẩm được điện di bằng gel agarose 1,5 % (4.2).

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 263 bp.

Cặp mồi 2 (Coplin & Majerczak (2002))

ES16-1: 5’GCG AAC TTG GCA GAG AT -3’

ESIG2c-R: 5' GCG CTT GCG TGT TAT GAG- 3’

Với chu trình nhiệt:

Đọc kết quả

Sản phẩm được điện di bằng gel agarose 1,5 % (4.2).

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước 920 bp.

7.4  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert khi:

- Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng PCR

hoặc

- Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng ELISA

hoặc

- Vi khuẩn có đặc điểm sinh hóa phù hợp với đặc điểm sinh hóa được mô tả tại điều 7.1.3.10

7  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

- Kết quả giám định: Tên khoa học của loài

Phiếu kết quả giám định chi tiết tham khảo phụ lục C.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: Bệnh vi khuẩn héo rũ ngô

Tên khoa học: Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

Tên khác:

Aplanobacter stewartii (Smith) McCulloch

Bacillus stewartii (Smith) Holland

Bacterium stewartii (Smith) Smith

Erwinia stewartii (Smith) Dye

Pantoea stewartii subsp. stewadii (Smith) Mergaert et al.

Phytomonas stewartii (Smith) Bergey et al.

Pseudobacterium stewartii (Smith) Krasil'nikov

Pseudomonas stewartii Smith

Xanthomonas stewartii (Smith) Dowson

Vị trí phân loại:

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

A.2  Phân bố

Trong nước: Bệnh chưa có ở Việt Nam

Trên thế giới: Châu Á: Korea; Châu Mỹ: USA, Canada, Costa Rica, Puerto Rico, Trinidad and Tobago, Argentina, Bolivia, Brazil, Guyana, Paraguay, Peru; Châu Âu: Switzeland

A.3  Ký chủ

Zea mays (ngô), Zea mays subsp. mays (ngô ngọt), Zea mays subsp. mexicana, Zea mays subsp. parviglumis

Agrostis gigantea, Coix lacryma-jobi, Dactylis glomerata, Digitaria, Dracaena sanderiana, Panicum capillare, Panicum dichotomiflorum, Poa pratensis, Set aria lutescens, Sorghum sudanense, Tripsacum dactyloides, Triticum aestivum (lúa mì)

A.4  Đặc điểm sinh học

P. stewartii tồn tại trong mô sống của cây và hạt. Khả năng truyền qua hạt của vi khuẩn liên quan chặt chẽ tới mức độ gây hại của bệnh trên cây sản xuất hạt giống và cũng liên quan tới mức độ cảm nhiễm hay kháng của cây bố mẹ.

Sự thay đổi về giải phẫu học khi bệnh phát triển trong tế bao đã được nghiên cứu trên các giống ngô nhiễm và chống chịu bệnh sử dụng ánh sáng và kính hiển vi điện tử. Khi lá của cây ở giai đoạn trổ cờ được lây nhiễm vi khuẩn này, vết bệnh trên các giống nhiễm phát triển nhanh gấp 3 đến 4 lần giống kháng. Màng ngăn giữa các tế bào bó mạch bị bao phủ bởi các vật chất tương tự như exopolysaccharide của vi khuẩn khi mật độ vi khuẩn trong mạch dẫn vẫn còn rất thấp. Bó mạch bị bít tắc hoàn toàn bằng tế bào vi khuẩn và exopolysaccharide khi mật độ vi khuẩn tăng cao. Khả năng sản sinh exopolysaccharide và độc tính có quan hệ với nhau. Khả năng thủy phân polysaccharide vỏ và độc tính của P. stewartii chịu tác động của giao tiếp sinh học thông qua phân tử tín hiệu (quorum-sensing regulatory proteins). Chất làm dính (agglutinin) vi khuẩn đã được chiết xuất từ các hạt ngô trên mặt đất cà phản ứng của chất này đã được thử nghiệm với 22 dòng vi khuẩn có độc tính khác nhau. Khả năng ngưng kết đặc hiệu (Specific agglutination) tỷ lệ nghịch với độc tính của vi khuẩn. Dòng độc của vi khuẩn đã được nghiên cứu rất kĩ về mặt sinh học phân tử. Một nhóm gen độc 24kb của vi khuẩn cần thiết để tạo ra hiện tượng đốm sũng nước và héo cây con nhưng cụm gen này không bắt buộc cho sự phát triển ban đầu của vi khuẩn.

P. stewartii là một sinh vật có hệ gen đồng nhất, Một trăm hai mươi tư mẫu phân lập từ đông bắc, trung tây và trung tâm bang Atlantic tại Mỹ có kiểu chuyển hóa giống nhau tới 93%. 2 phần 3 mẫu phân lập tạo thành 18 nhóm khác nhau có kiểu chuyển hóa giống nhau trong đó 1/3 còn lại có sự khác biệt nhất định. Sự đồng bộ về kiểu hình (phenotypic) là một dẫn chứng cho thấy tác nhân gây bệnh được tổ chức hợp lý để tồn tại trong một kí chủ nhất định (ví dụ Zea mays và C. pulicaria). Bệnh không gây hại nặng trên các kí chủ khác và vi khuẩn không được truyền hữu hiệu bởi các môi giới khác.

Phụ lục B

(Quy định)

Dung dịch và Môi trường

B.1  Đệm phosphat

Thành phần:

Na₂HPO₄ (4.3)        4,26 g

KH₂PO₄ (4.4)         2,72 g

Nước cất (4.5)       1 000 ml

Hòa tan các thành phần trên vào nước cất (4.5).

Điều chỉnh pH của môi trường về pH 7,4

B.2  Môi trường thử khả năng di động của vi khuẩn

Thành phần

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần trên vào nước cất (4.5).

Điều chỉnh pH của môi trường về pH 7,2

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.3  Môi trường Voges- Proskauer

Thành phần

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần trên vào nước cất (4.5), chỉnh pH 7,5.

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.4  Thuốc thử Methyl red

Thành phần

Methyl red (4.11)             0,1 g

Ethanol 95% (4.12)          300 ml

Hòa tan hoàn toàn các thành phần thêm nước cất (4.5) cho đủ dung tích 500 ml

B.5  Môi trường thừ idole

Thành phần

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần vào nước cất (4.5), chỉnh pH từ 7,2 đến 7,4.

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.6  Thuốc thử Kovacs

Hòa tan 5 g p-dimethylaminobenzaldehyde (4.15) trong 75 ml 1 pentanol (4.16) trong bể ổn nhiệt. Để nguội và thêm vào 25 ml HCI 35 % (4.17).

B.7  Môi trường Nitrate

Thành phần

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần vào nước cất (4.5), chỉnh pH 7,2

Chia vào mỗi ống nghiệm (3.5) 10 ml môi trường.

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.8  Thuốc thử nitrate

Dung dịch A: hòa tan 1,6 g sunphanilic acid (4.19) trong 60 ml axit acetic băng (4.20) và 140 nước cất (4.5) trong bể ổn nhiệt.

Dung dịch B: hòa tan 0,2 g 8-amino-2-napthlenesulfonic acid (4.21) trong 120 ml nước cất (4.5) trong bể ổn nhiệt. Sau đó thêm vào 30 ml axit acetic băng (4.20).

B. 9  Môi trường phân giải Aesculin

Thành phần

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần vào nước cất (4.5), chỉnh pH 7,2

Chia vào mỗi ống nghiệm (3.5) 10 ml môi trường.

Hấp khử trùng theo B.1 phụ lục B của TCVN 12371-1:2019

B.10  Môi trường thủy phân

Thành phần

Chuẩn bị:

+ Dung dịch môi trường: Hòa tan hoàn toàn các thành phần (trừ Agar (4.8) và Bromothymol blue (4.28)) vào nước cất (4.5), chỉnh pH 7 đến 7,2. Thêm Agar (4.8) và Bromothymol blue (4.28) đun tới khi hòa tan hoàn toàn. Sau đó, hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút. Môi trường thu được có màu xanh lá cây đến xanh lam.

+ Môi trường thủy phân: Nhỏ 5 ml dung dịch Arbutin 10 % (4.29), Maltose 10 % (4.30), Salicin 10% (4.31), Raffinose 10% (4.32) đã vô trùng vào dung dịch môi trường chia vào các ống nghiệm (3.5) vô trùng

B.11  Môi trường phân giải Malonate

Thành phần

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần vào nước cất (4.5), chỉnh pH 6,7

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                             Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12371-2-5:2020. Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật. Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

13. Kết quả giám định:

Tên tiếng Việt: Bệnh vi khuẩn héo rũ ngô

Tên khoa học: Pantoea stewartii (Smith) Mergaert

Tên khác:

Aplanobacter stewartii (Smith) McCulloch

Bacillus stewartii (Smith) Holland

Bacterium stewartii (Smith) Smith

Erwinia stewartii (Smith) Dye

Pantoea stewartii subsp. stewartii (Smith) Mergaert et al.

Phytomonas stewartii (Smith) Bergey et al.

Pseudobacterium stewartii (Smith) Krasil’nikov

Pseudomonas stewartii Smith

Xanthomonas stewartli (Smith) Dowson

Vị trí phân loại:

Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Bradbury J. F (1986), Guide to Plant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom.

[2] CABI (2017), Crop Protection Compedium.

[3] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist’s Pocketbook.

[4] IPPC (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.

[5] TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.

[6] Viện Bảo vệ thực vật (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.