Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 11135:2015 Vi sinh vật trong thực phẩm-Phát hiện độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11135:2015

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F

Microbiology of food - Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F

Lời nói đầu

TCVN 11135:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2002.08 Detection of Botulinal Neurotoxins A, B, E, and F. Amplified ELISA System;

TCVN 11135:2015 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F

Microbiology of food - Detection of botulinal neurotoxins A, B, E and F

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phát hiện các độc tố thần kinh typ A, B, E và F do vi khuẩn Clostridium botulinum sinh ra (botulinal neurotoxin) khi nuôi cấy trong môi trường chất chiết nấm men glucose pepton trypton (TPGY) và môi trường canh thang thịt (CMM) nguyên chất.

Kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 9049:2012, Thực phẩm - Xác định Clostridium botulinum và độc tố của chúng bằng phương pháp vi sinh

3.  Nguyên tắc

Phương pháp này được dùng để phát hiện các độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E và F trong các môi trường nuôi cấy TPGY và CMM nguyên chất, sử dụng kỹ thuật ELISA (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn kết enzym). Các độc tố bị bắt giữ bởi các kháng thể immunoglobin G (IgG) được phủ trên các đĩa vi giếng (microtiter plate) và được phát hiện bằng cách sử dụng các IgG đã biotinyl hóa và các chất cộng hợp phosphatase kiềm streptavidin. Enzym gắn kết được quan sát bằng cách sử dụng cơ chất được khuếch đại.

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.2. Dung dịch đệm cacbonat-bicacbonat, 0,05 M, pH 9,6 ± 0,1

Hòa tan lượng chứa trong một viên nang bicacbonat (ví dụ: Cat.No.C-3041; Sigma, St. Louis, MO) trong 100 ml nước.

4.2. Dung dịch đệm casein, 1,0 %

Cho một túi bột muối đệm phosphat (PBS) (ví dụ: Sigma; Cat.No. P3813) vào 800 ml nước, 10 g casein không chứa vitamin (ví dụ: Research Organics, Cleveland, OH 44125-1083, www.resorg.com; Cat. No.1087C) và 3 ml dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 M (tương đương 4,0 g NaOH/100 ml nước).

Làm nóng đến khoảng 80 °C trong khi vẫn khuấy. Chỉnh đến pH 7,9 ± 0,1 bằng dung dịch natri hydroxit 1 M; sau đó pha loãng đến 1 lít. Khử trùng ở 121 °C trong 20 min. pH cuối cùng phải là 7,6 ± 0,1.

4.3. Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 1 M.

4.4. Kháng độc tố typ A, B, E hoặc F, ví dụ: Southeast Regional Laboratory, Atlanta, GA 30309-3998.

4.5. Kháng độc tố typ A, B, E hoặc F đã biotin hóa, ví dụ: Atlanta, GA 30309-3998.

4.6. Dung dịch đệm rửa Tween (TBS-T) - nước muối đệm Tris, Tris-axit clohydric (HCI) 0,05 M, natri clorua (NaCI) 0,138 M, kali clorua (KCI) 0,0027 M

Cho lượng chứa trong một gói TBS, ví dụ: Sigma; Cat.No. T6664 hoặc loại tương tự vào 900 ml nước, chỉnh pH đến 7,5 ± 0,1 bằng axit clohydric 2 M, cho 0,05 ml Tween-20 (ví dụ: Curtin Matheson Inc., PO Box 1546, Houston, TX 77251-1546) hoặc tương đương và pha loãng đến 1 lít. Nồng độ cuối cùng của Tween là 0,005 %.

4.7. Chất cộng hợp (conjugate) phosphatase kiềm-ExtraVidin, ví dụ: Cat. No. E2636. Bảo quản dung dịch ở 4 °C.

4.8. Hệ cơ chất ELISA khuếch đại, gồm cơ chất và chất khuếch đại (ví dụ: Invitrogen Corp., PO Box 6482, Carlsbad, CA 92008, www.invitrogen.com; Cat. No. 19589-019).

4.9. Axit sulfuric (H₂SO₄), 0,3 M

Pha loãng axit sulfuric đậm đặc (96 % đến 98 %), bằng cách cho 1 ml axit này vào 59 ml nước.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1. Khay vi giếng hoặc đĩa 96 giếng.

5.2. Màng chất dẻo để bọc đĩa vi giếng.

5.3. Pipet đa kênh, 8 hoặc 12 vị trí, dung tích từ 50 μl đến 200 μl.

5.4. Pipet dùng cho đĩa vi giếng, có thể phân phối được từ 0,2 μl đến 100 μl.

5.5. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 35 °C ± 2 °C.

5.6. Máy rửa đĩa vi giếng, có cài đặt chương trình.

5.7. Máy lắc đĩa vi giếng.

5.8. Máy đọc đĩa vi giếng, có các bộ lọc cỡ lỗ 490 nm và 630 nm.

5.9. Pipet dùng một lần, dung tích 1 ml, 5 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng là 0,01 ml, 0,1 ml và 0,1 ml.

5.10. Bể chứa pipet đa kênh.

6. Cách tiến hành

6.1. Yêu cầu về an toàn

Độc tố botulinum là chất cực độc đối với con người. Chỉ cần một lượng nhỏ qua đường tiêu hóa, hô hấp, hấp thụ qua mắt, hoặc tiếp xúc trực tiếp qua vết xước ở da cũng có thể gây nhiễm độc sâu và dẫn đến tử vong. Nhân viên phòng thử nghiệm cần được tiêm phòng vacxin phòng ngừa độc tố botulinum. Sau khi sử dụng, rửa sạch máy rửa đĩa vi giếng bằng nước cất, sử dụng nguyên tắc bảo dưỡng. Thu lấy chất thải vào bể chứa chất thải và khử trùng ở 121 °C trong 60 min. Không được có độc tố trong đường ống máy rửa sau khi sử dụng thiết bị.

6.2. Quy trình ELISA khuếch đại

Chuẩn bị 1 đĩa vi giếng (5.1), cho từng loại độc tố cần kiểm tra. Đánh dấu đĩa typ A, B, E hoặc F. Sử dụng micropipet (5.4) để hút các kháng độc tố gốc. Pha loãng kháng độc tố (4.4) với dung dịch đệm bicacbonat (4.2), trong các ống nghiệm thủy tinh theo quy định của nhà cung cấp. Chuyển các kháng độc tố pha loãng vào các kênh của bể chứa pipet đa kênh (5.10). Sử dụng pipet đa kênh 8 vị trí (5.3) hút 100 μl dung dịch pha loãng thích hợp của các kháng độc tố typ A, B, E hoặc F từ các kênh của bể chứa, phân phối vào từng giếng của mỗi đĩa vi giếng. Cần có bốn đĩa (mỗi đĩa cho một typ: A, B, E và F). Các đĩa được phủ bằng màng chất dẻo (5.2) và bảo quản ở 4 °C ± 2 °C qua đêm.

Lấy đĩa ra khỏi tủ bảo quản ở 4 °C ± 2 °C và rửa đĩa 5 lần trong TBS-T (4.6), thời gian giữa các lần rửa cách nhau 45 s ± 5 s. Sử dụng máy rửa đĩa (5.6) hoặc thiết bị cơ học khác. Không sử dụng chai dạng bóp để rửa. Cho dung dịch đệm casein (4.2) đầy đến miệng các giếng của mỗi đĩa (khoảng 300 μl) và để trong tủ ấm (5.5) từ 60 min đến 90 min ở 35 °C ± 2 °C. Không rửa đĩa khi lấy ra. Các đĩa vẫn phủ màng chất dẻo trong thời gian rã đông dịch cấy thử nghiệm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tháo tấm phủ, loại bỏ dung dịch đệm casein và cho mẫu thử đã rã đông và mẫu kiểm chứng vào từng cặp giếng (100 μl cho mỗi giếng). Khi thêm thuốc thử phải thực hiện từ bên trái đĩa sang bên phải của đĩa. Ủ các đĩa chứa các chất cấy độc tố và mẫu kiểm chứng trong 2 h ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C.

Ủ lặp lại các độc tố kiểm chứng đặc hiệu typ A, B, E và F đã biết trên các đĩa tương ứng. Ủ 100 μl dung dịch đệm casein trong các cặp giếng thay cho các chất cấy thử nghiệm hoặc kiểm chứng để kiểm chứng mẫu trắng. Chuẩn bị các thuốc thử kháng thể dán nhãn biotin typ A, B, E và F (4.5) như hướng dẫn kèm theo khoảng 15 min đến 30 min trước khi sử dụng và trong khi ủ các mẫu thử nghiệm. Pha loãng các kháng độc tố đã biotin hóa trong dung dịch đệm casein theo hướng dẫn đi kèm. Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch TBS-T như trên. Cho các kháng độc tố đã pha loãng typ A, B, E hoặc F đã biotin hóa (100 μl cho mỗi giếng) vào các đĩa thích hợp tương ứng đã dán nhãn và ủ ấm khoảng 60 min ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C.

Rửa các đĩa 5 lần bằng dung dịch TBS-T như trên. Bổ sung 100 μl dung dịch chất cộng hợp phosphatase kiềm-ExtraVidin (4.7), (pha loãng 1 μl/10 ml dung dịch đệm casein) vào từng giếng và ủ trong 60 min ± 5 min ở 35 °C ± 2 °C. Rửa đĩa 5 lần bằng TBS-T với lần cuối ngâm trong dung dịch đệm rửa (4.6) khoảng 10 min ± 2 min. Loại bỏ hết dung dịch đệm rửa bằng cách úp đĩa và vỗ nhẹ trên khăn giấy. Hoàn nguyên cơ chất GIBCO và các dung dịch khuếch đại bằng cách cho dung dịch chất pha loãng thích hợp vào chai đựng cơ chất đông khô và chất khuếch đại (4.8). Sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất sản phẩm này. Thêm 50 μl dung dịch cơ chất GIBCO và ủ khoảng 11 min đến 13 min ở 25 °C ± 2 °C trên máy lắc đĩa (5.7) (khoảng 100 r/min), sau đó thêm 50 μl dung dịch khuếch đại GIBCO và ủ 2 min đến 10 min mà không lắc.

6.3. Đọc đĩa

Cho dung dịch chất khuếch đại vào đĩa gần với máy đọc đĩa (4.8). Đọc độ hấp thụ ở 490 nm và 630 nm (bộ lọc chuẩn) khi các phép kiểm chứng dương tính đạt độ hấp thụ từ 0,8 đến 1,2 và các phép kiểm chứng âm tính được chấp nhận. Lấy độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm trừ đi độ hấp thụ ở bước sóng 630 nm. Dừng phân tích (cho hiện màu) bằng cách thêm 50 μl dung dịch axit sulfuric 0,3 M (4.9), có thể đọc độ hấp thụ sau đó (trong khoảng 2 h). Thuốc thử dừng phản ứng được cho vào ở thời gian bất kỳ (từ 2 min đến 12 min) sau khi thêm chất khuếch đại vào lúc các phép kiểm chứng dương tính cho độ hấp thụ khoảng 1,0 và các phép kiểm chứng âm tính là chấp nhận được (không quá 0,2 trên mức nền).

6.4. Giải thích kết quả

Phép thử dương tính là khi có giá trị độ hấp thụ > 0,2 trên giá trị độ hấp thụ quan sát được trong các giếng kiểm chứng âm tính. Có thể có phản ứng chéo giữa các mẫu độc tố. Nếu các đĩa không được rửa sạch hoàn toàn, thì có thể quan sát thấy hấp thụ nền cao hơn trong tất cả các giếng.

6.5. Khẳng định kết quả

Các kết quả ELISA dương tính là giả định về độc tố C. botulinum và phải được khẳng định bằng phương pháp chuẩn quy định trong TCVN 9049:2012.

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) các kết quả thu được;

d) ngày kết thúc thử nghiệm;

e) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này cùng với mọi tình huống bất thường khác có thể ảnh hưởng đến kết quả.

 

PHỤ LỤC A

(Tham Khảo)

KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM LIÊN PHÒNG

Bảng A.1 - Kết quả thử nghiệm liên phòng về việc phát hiện các độc tố botulinum (≥ 1 MLD/ml) trong TPGY^a bằng các phương pháp ELISA khuếch đại và phương pháp chuẩn

Typ độc tố	A				B				E				F
Mức độc tốb)	Cao	Cao không có A	Thấp	Thấp không có A	Cao	Cao không có B	Thấp	Thấp không có B	Cao	Cao không có E	Thấp	Thấp không có E	Cao	Cao không có F	Thấp	Thấp không có F
Số phòng thử nghiệm	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	9	9
Số phép thử	60	340	60	340	120	280	120	280	60	340	60	340	110	290	98	261
Các phép thử giả định dương tính
+ ELISA	60	16	60	6	119	20	103	9	59	22	59	11	101	83	91	26
+ AOACc)	60	0	60	0	120	0	120	0	60	0	60	0	110	0	98	0
Khi bình phươngd)	14,1		4,17		15,4		3,12		17,4		6,75		57,9		3,69
Độ nhạy, %
+ ELISA	100		100		99,2		85,8		98,3		98,3		91,8		87,5
+ AOAC	100		100		100		100		100		100		100		100
Tỷ lệ âm tính giả trong tổng số các mẫu dương tính, %
+ ELISA	0		0		0,8		14,2		1,7		1,7		8,2		12,5
+ AOAC	0		0		0		0		0		0		0		0
Độ đặc hiệu, %
+ ELISA		95,3		98,5		92,9		96,8		94,5		97,3		71,4		90
+ AOAC		100		100		100		100		100		100		100		100
Tỷ lệ dương tính giả trong tổng số các mẫu âm tính, %
+ ELISA		4,7		1,5		7,1		3,2		5,5		2,7		28,6		10
+ AOAC		0		0		0		0		0		0		0		0
Sự thống nhất giữa phương pháp ELISA và AOAC, %e)	96		99		95		94		94		97		77		91
CHÚ THÍCH: a) TPGY là canh thang chất chiết nấm men glucose pepton trypton b) Kết quả cao là các mẫu chứa độc tố ở mức cao; Kết quả thấp là các mẫu chứa độc tố ở mức thấp; Không có B là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ A; Không có A là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ B; Không có E là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ E; Không có F là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ F. c) Kết quả dương tính giả định. Phương pháp AOAC đã được thực hiện chỉ trong phòng thử nghiệm nghiên cứu. d) Khi bình phương được xác định bởi McNemar là (la - bl - 1)2/(a-b), trong đó: a là các phần mẫu thử (A cao hoặc cao không có A) dương tính bằng ELISA và âm tính bằng AOAC, b là các phần mẫu thử âm tính bằng ELISA và dương tính bằng AOAC. Giá trị khi bình phương > 3,84 cho thấy có nghĩa tại ρ <> e) Tỷ lệ thống nhất phản ánh số lượng phép xác định tương đương giữa các phương pháp ELISA và AOAC.

Bảng A.2- Kết quả thử nghiệm liên phòng về việc phát hiện các độc tố botulinum (≥ 1 MLD/ml) trong CMM^a) bằng các phương pháp ELISA khuếch đại và phương pháp chuẩn

Typ độc tố	A				B				E				F
Mức độc tốb)	Cao	Cao không có A	Thấp	Thấp không có A	Cao	Cao không có B	Thấp	Thấp không có B	Cao	Cao không có E	Thấp	Thấp không có E	Cao	Cao không có F	Thấp	Thấp không có F
Số phòng thử nghiệm	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	9	9
Số phép thử	60	340	60	340	120	280	120	280	60	340	60	340	110	290	98	261
Các phép thử giả định dương tính
+ ELISA	55	8	58	0	119	22	110	17	45	1	46	11	60	33	52	24
+ AOACc)	50	0	50	0	120	0	120	0	30	0	30	0	50	0	44	0
Khi bình phươngd)	11,1		6,13		17,4		1,3		14,1		2,89		41		13,3
Độ nhạy, %
+ ELISA	100		100		99,2		91,7		75		76,7		54,5		53,1
+ AOAC	83,3		83,3		100		100		50		50		45,5		44,9
Tỷ lệ âm tính giả trong tổng số các mẫu dương tính, %
+ ELI SA	0		0		0,8		8,3		0		37		45,5		46,9
+ AOAC	16,7		16,7		0		0		50		50		54,5		55,1
Độ đặc hiệu, %
+ ELISA		97,6		100		92,1		93,9		99,7		96,7		88,6		90,8
+ AOAC		100		100		100		100		100		100		100		100
Tỷ lệ dương tính giả trong tổng số các mẫu âm tính, %
+ ELI SA		2,4		0		7,9		6,1		0,3		3,3		11,4		9,2
+ AOAC		0		0		0		0		0		0		0		0
Sự thống nhất giữa phương pháp ELISA và AOAC, %e)	97		99		94		93		96		97		79		81
CHÚ THÍCH: a) CMM là canh thang thịt b) Kết quả cao là các mẫu chứa độc tố ở mức cao; Kết quả thấp là các mẫu chứa độc tố ở mức thấp; Không có B là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ A; Không có A là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ B; Không có E là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ E; Không có F là các mẫu chất cấy không sinh độc tố typ F. c) Kết quả dương tính giả định. Phương pháp AOAC đã được thực hiện chỉ trong phòng thử nghiệm nghiên cứu. d) Khi bình phương được xác định bởi McNemar là (la - bl - 1)2/(a-b), trong đó: a là các phần mẫu thử (A cao hoặc cao không có A) dương tính bằng ELISA và âm tính bằng AOAC, b là các phần mẫu thử âm tính bằng ELISA và dương tính bằng AOAC. Giá trị khi bình phương > 3,84 cho thấy có nghĩa tại ρ <> e) Tỷ lệ thống nhất phản ánh số lượng phép xác định tương đương giữa các phương pháp ELISA và AOAC.