Tiêu chuẩn TCVN 6506-2:2009 Xác định hoạt tính phosphataza kiềm trong sữa

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 6506-2:2009

ISO 11816-2:2003

SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PHOSPHATAZA KIỀM - PHẦN 2 - PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG ĐỐI VỚI PHOMAT

Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Part 2: Fluorometric method of cheese

Lời nói đầu

TCVN 6506-2: 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 11816-2: 2003;

TCVN 6506-2: 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn. Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 6506 (ISO 11816) bao gồm các tiêu chuẩn sau:

- TCVN 6506-1: 2007 (ISO 11816-1: 2006), Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hoạt tính phosphataza kiềm - Phần 1: Phương pháp đo huỳnh quang đối với sữa và đồ uống từ sữa;

- TCVN 6506-2: 2009 (ISO 11816-2: 2003), Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hoạt tính phosphataza kiềm - Phần 2: Phương pháp đo huỳnh quang đối với sữa phomat.

SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA - XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PHOSPHATAZA KIỀM - PHẦN 2 - PHƯƠNG PHÁP ĐO HUỲNH QUANG ĐỐI VỚI PHOMAT

Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Part 2: Fluorometric method of cheese

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hoạt tính phosphataza kiềm trong phomat bằng đo huỳnh quang.

Phương pháp này có thể áp dụng cho phomat mềm và phomat nửa cứng để phân biệt phomat được chế biến từ sữa tươi nguyên liệu với phomat được chế biến từ sữa thanh trùng, với điều kiện là nấm mốc chỉ có trên bề mặt và không có ở bên trong phomat (ví dụ: phomat có vân xanh). Phương pháp này cũng có thể dùng để kiểm tra hiệu quả thanh trùng tốt đối với phomat hoặc nguyên liệu phomat.

Đối với các miếng lớn của phomat cứng khi hỗn hợp whey sữa đông tụ được hấp đến nhiệt độ trên 50 ^oC, nhiệt độ cao hơn giữ trong thời gian tương đối dài. Đặc biệt là trong tâm các sản phẩm này, do đó làm tăng tính bất hoạt của phosphotaza. Do đó, khi sử dụng phương pháp này để phân biệt giữa phomat cứng được chế biến từ sữa tươi nguyên liệu và phomat cứng được chế biến từ sữa thanh trùng cần có kỹ thuật lấy mẫu đặc biệt đối với phomat (xem Điều 7).

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6506-1 (ISO 11816-11), Sữa và sản phẩm sữa - Xác định hoạt tính phosphataza - Phần 1: Phương pháp đo huỳnh quang đối với sữa và đồ uống từ sữa.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Hoạt tính phosphataza kiềm (alkaline phosphatase activity, ALP)

Hoạt tính phosphataza kiềm có mặt trong sản phẩm, xác định được bằng quy trình quy định  trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Hoạt tính phosphataza kiềm được biểu thị bằng mili đơn vị hoạt tính enzym trên gam.

3.2. Đơn vị hoạt tính phosphataza kiềm (unit of alkaline phosphatase activity)

Lượng enzym phosphataza kiềm xúc tác để biến đổi 1 mmol cơ chất/min trên gam sản phẩm.

4. Nguyên tắc

Khi có mặt hoạt tính phosphataza kiềm, thì cơ chất este monophosphoric không phát huỳnh quang (Fluorophos^®) bị thủy phân ở 38 ^oC ± 2 ^oC trong 3 min tạo thành sản phẩm phát quang cao (Fluoroyellow^®). Lượng Fluoroyellow đo được bằng máy đo huỳnh quang đã hiệu chuẩn và tính được hoạt tính của phosphataza kiềm.

CHÚ THÍCH: Mặc dù quy trình đo kéo dài 3 min, nhưng 1 min đầu là thời gian hiệu chỉnh để đảm bảo cho mẫu đạt tới nhiệt độ 38 ^oC. Việc đo hoạt tính thực tế chỉ bắt đầu từ phút thứ hai đến hết phút thứ ba (nghĩa là trên 2 min).

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước phải là nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

5.1. Cơ chất1) Fluorophos, được kết tinh, M = 580 g/mol.

CHÚ THÍCH: Cơ chất Fluorophos là este monophospho thơm không phát huỳnh quang tan được trong nước.

5.2. Dung dịch đệm cơ chất, dung dịch đệm dietanolamin (DEA), (c = 2,4 mol/l) có pH 10,0.

5.3. Cơ chất làm việc

Cho lượng dung dịch đệm cơ chất (5.2) vào cơ chất Fluorophos (5.1) để thu được nồng độ cơ chất Fluorophos c = 1,044 mmol/l. Đảo chiều vật chứa để trộn kỹ.

Sử dụng chai màu hổ phách để bảo vệ khỏi ánh sáng.

Nếu dùng hệ thông thử nghiệm Fluorophos, thì chuyển lượng chứa trong chai đựng dung dịch đệm cơ chất (5.2) sang một chai cơ chất Fluorophos (5.1) và đảo chiều chai để trộn kỹ.

5.4. Dung dịch hiệu chuẩn làm việc, Fluoroyellow trong dung dịch đệm DEA.

5.4.1. Dung dịch hiệu chuẩn A, chứa 0 mmol/l Fluoroyellow.

5.4.2. Dung dịch hiệu chuẩn B, chứa 17,24 x 10^-3mmol/l Fluoroyellow.

5.4.3. Dung dịch hiệu chuẩn C, chứa 34,48 x 10^-3mmol/l Fluoroyellow.

5.5. Sữa, được làm nóng trước đến 95 ^oC trong 1 min, sau đó được làm nguội đến nhiệt độ phòng.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Máy đo huỳnh quang có lọc¹⁾, có giá giữ cuvet kiểm soát được sự ổn định nhiệt độ ở 38^oC ± 1^oC, cho ánh sáng kích thích ở bước sóng 440 nm và ánh sáng phát xạ ở 560 nm.

6.2. Cuvet thủy tinh, không phát huỳnh quang, có đường kính 12 mm và dài 75 mm.

6.3. Pipet

6.3.1. Bộ phận phân phối cố định, để phân phối 2,0 ml.

6.3.2. Pipet dạng xyranh, dung tích 0,075 ml.

6.3.3. Pipet, dung tích 1 ml và 2 ml (để hiệu chuẩn).

6.4. Tủ ấm, thích hợp để giữ cuvet và có khả năng duy trì nhiệt độ ở 38 ^oC ± 1 ^oC.

6.5. Parafilm2) hoặc màng mỏng khác thích hợp, thuộc loại thử nghiệm.

6.6. Bình định mức một vạch, dung tích 10 ml và 25 ml.

6.7. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ 63 ^oC ± 2^oC.

6.8. Ống nghiệm hoặc Ultra Turrax^®3)

7. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Tuy nhiên, TCVN 6400 (ISO 707) không thích hợp đễ lấy mẫu phomat cứng miếng to được chế biến từ sữa tươi nguyên liệu vì hoạt tính ALP phân bố khác nhau trong các loại phomat này. Hoạt tính có thể cao trong các lớp ngoài của phomat, ở khoảng 0 đến 4 cm dưới lớp cùi của mặt xung quanh, nhưng rất thấp thậm chí là zero trong lõi. Do đó các mẫu phomat cứng phải được lấy trong khoảng từ 2 cm đến 3 cm ngay dưới lớp cùi ở các mặt xung quanh.

8. Chuẩn bị mẫu thử

8.1. Yêu cầu chung

Loại bỏ lớp cùi hoặc lớp bề mặt của mẫu thử bằng dao sạch. Đảm bảo rằng mẫu thử không bị nhiễm hệ vi sinh vật bề mặt trong quá trình chuẩn bị. Nghiền nhỏ mẫu thử bằng máy nghiền hoặc dụng cụ thích hợp khác và trộn kỹ. Giữ mẫu đã chuẩn bị trong hộp chứa kín khí. Kiểm tra mẫu ngay trong ngày và bảo quản mẫu trong tủ đá.

8.2. Phomat được chế biến từ sữa thanh trùng

8.2.1. Cân từ 0,3 g đến 0,5 g mẫu thử đã chuẩn bị (8.1), chính xác đến 1 mg cho vào cốc thủy tinh có mỏ 25 ml. Thêm 1 ml đến 2 ml sữa đã chuẩn bị (5.5) và trộn mạnh bằng chày thủy tinh đến khi thu được hồ nhão. Phomat cứng phải để ngấm nước hoặc được xử lý sơ bộ bằng phương pháp thay thế trong 8.2.2.

Thêm tiếp mỗi lần 1ml sữa (5.5) và khuấy mạnh hỗn hợp sau mỗi lần thêm. Dùng sữa để chuyển hỗn hợp phomat/sữa sang bình định mức 25 ml (6.6). Pha loãng bằng sữa đến vạch và lắc kỹ. Dùng thìa để lấy hết phần chất béo đã tách ra. Trước khi lấy phần mẫu thử bất kỳ, cần đảo chiều bình vài lần để trộn kỹ hỗn hợp.

8.2.2. Cách khác, đặc biệt là đối với phomat cứng, nên sử dụng bình bằng gốm hoặc ống Ultra Turrax (6.8) để chuẩn bị hỗn hợp phomat/sữa. Nếu sử dụng bình bằng gốm, thì trộn kỹ một lượng mẫu thử đã chuẩn bị đã biết trước khối lượng (từ 0,3 g đến 0,5 g) với 10 ml sữa (5.5).

8.2.3. Các phép đo phải được tiến hành theo phương pháp xác định hoạt tính phosphataza kiềm trong sữa nguyên chất được quy định trong TCVN 6506-1 (ISO 11816-1).

8.3. Phomat từ sữa tươi nguyên liệu

Chuẩn bị mẫu thử theo 8.1 hoặc 8.2. Khi hoạt tính của hỗn hợp sữa/phomat lớn hơn 7000 mU/l thì dùng sữa (5.5) để pha loãng tiếp mẫu thử để thu được dung dịch 1:10.

9. Cách tiến hành

9.1. Hiệu chuẩn

Các đường chuẩn thường ổn định. Định kỳ 2 đến 3 tháng phải thực hiện hiệu chuẩn lại thiết bị. Kiểm tra thiết bị nếu thấy tỷ số hiệu chuẩn thay đổi trên 10%, sử dụng lô mới của các chất hiệu chuẩn. Làm ấm sơ bộ các dung dịch hiệu chuẩn A, B và C trước khi sử dụng. Dùng pipet (6.3.3), chuyển 2,0 ml dung dịch hiệu chuẩn A, dung dịch B và dung dịch C đã làm ấm sơ bộ (tương ứng với 5.4.1, 5.4.2 và 5.4.3) cho vào các cuvet đã dán nhãn (6.2), mỗi dung dịch thực hiện hai lần. Đặt các cuvet này vào tủ ấm (6.4) và làm ấm sơ bộ đến 38^oC trong 5 min. Dùng pipet dạng xyranh (6.3.2) lấy 0,075 ml sữa cho vào tất cả sáu cuvet. Đậy các cuvet bằng parafilm (6.5).

Đảo chiều nhẹ nhàng các cuvet để trộn lượng chứa bên trong và đặt vào tủ ấm (6.4).

Thực hiện hiệu chuẩn thông thường, bắt đầu với dung dịch A. Trước khi đặt cuvet vào máy đo huỳnh quang có lọc (6.1), dùng khăn mềm lau phía ngoài cuvet. Dùng dung dịch hiệu chuẩn A (5.4.1) để đặt máy đo huỳnh quang về zero. Đọc và ghi lại huỳnh quang thu được với dung dịch B (5.4.2) và dung dịch C (5.4.3) dựa vào dung dịch hiệu chuẩn A (5.4.1).

Khi kết thúc hiệu chuẩn, tiến hành phân tích các mẫu thử.

9.2. Xác định

Dùng bộ phân phối cố định thể tích (6.3.1) chuyển 2,0 ml dung dịch cơ chất làm việc (5.3) vào cuvet đã dán nhãn. Đặt cuvet vào tủ ấm (6.4) và làm ấm sơ bộ đến 38^oC trog 5 đến 10 min. Thêm 0,075 ml phần mẫu thử đã trộn đều (8.2 hoặc 8.3) vào cơ chất. Đậy cuvet bằng parafilm (6.5) và  trộn ngay lượng chứa trong cuvet bằng cách lắc đảo nhẹ cuvet.

Lau khô thành ngoài của cuvet bằng giấy mềm rồi đặt cuvet vào máy đo huỳnh quang có lọc (6.1). Để yên 1 min cho cuvet cân bằng nhiệt độ. Rồi đọc huỳnh quang, bắt đầu ở phút thứ hai và kết thúc phút thứ ba. Giá trị chênh lệch giữa hai số đọc huỳnh quang chia cho 2 để thu được giá trị trung bình huỳnh quang phát ra trên một phút.

Ghi lại giá trị trung bình tăng dần của huỳnh quang trên phút đối với từng hỗn hợp phomat/sữa và sử dụng giá trị này để tính hoạt tính phosphataza kiềm bằng mili đơn vị trên lít mẫu thử. Sử dụng hoạt tính phosphataza kiềm của phần mẫu thử để tính hoạt tính của mẫu.

Các kết quả có thể được tính tự động bằng máy tính cài đặt sẵn chương trình tích phân của máy đo huỳnh quang hoặc có thể tính được theo Điều 10.

9.3. Các phép kiểm chứng

9.3.1. Phép kiểm chứng âm tính

Gồm một phép kiểm chứng âm tính với từng mẻ mẫu thử bằng cách dùng mẫu sữa đã chuẩn bị (5.5). Số đọc của thiết bị phải nhỏ hơn 10 mU/l, cho thấy rằng không phát hiện được hoạt tính huỳnh quang.

9.3.2. Phép thử kiểm chứng dương tính

Gồm một phép kiểm chứng dương tính có mức hoạt tính phosphataza gần hoặc bằng với mức quyết định của từng mẻ mẫu thử. Ví dụ: thêm 0,1 ml sữa mới trộn kỹ vào 100 ml mẫu đã chuẩn bị (5.5).

9.3.3. Phép thử chất gây nhiễu

Tiến hành phép thử này trên mẫu cần kiểm tra bằng cách thêm 0,075 ml phần mẫu thử (8.2 hoặc 8.3) vào cuvet chứa 2,0 ml dung dịch hiệu chuẩn A (5.4.1). Đặt cuvet chứa hỗn hợp này vào thiết bị đo huỳnh quang có lọc và giữ ở 38^oC trong 5 min. Sau đó ghi lại cường độ tăng huỳnh quang trong 2 min tiếp theo. Trong khoảng 2 min này phải không có hoạt tính phosphataza kiềm.

9.3.4. Phép thử kiểm chứng phosphataza kiềm của vi sinh vật

Nếu trong các sản phẩm phomat được chế biến từ sữa thanh trùng, mà phép xác định (9.2) cho kết quả dương tính, thì tiến hành như sau: Lấy một phần mẫu thử khác (8.2 hoặc 8.3), làm nóng 30 min trên nồi cách thủy (6.7) ở 63^oC, rồi làm nguội nhanh. Xác định hoạt tính phosphataza còn sót lại theo 9.2. Hoạt tính còn sót lại là do có mặt phosphataza kiềm của vi khuẩn.

10. Tính và biểu thị kết quả

10.1. Tỷ lệ hiệu chuẩn

Ghi lại giá trị huỳnh quang của dung dịch hiệu chuẩn B (5.4.2) và dung dịch hiệu chuẩn C (5.4.3) dựa vào dung dịch hiệu chuẩn A (5.4.1) chỉnh mức huỳnh quang của máy đo huỳnh quang có lọc (6.1) về zero. Tính tỷ số hiệu chuẩn của đường chuẩn đã thiết lập, r_cal, bằng công thức (1):

               (1)

Trong đó

F_C là giá trị huỳnh quang thu được bằng cách đo dung dịch hiệu chuẩn C (5.4.3) dựa vào dung dịch hiệu chuẩn A (5.4.1) đã đặt mức huỳnh quang về zero (xem 9.1);

F_B là giá trị huỳnh quang thu được bằng cách đo dung dịch hiệu chuẩn B (5.4.2) dựa vào dung dịch hiệu chuẩn A (5.4.1) đã đặt mức huỳnh quang về zero (xem 9.1);

10.2. Phương pháp tính

10.2.1. Hỗn hợp phomat/sữa

Tính hoạt tính phosphataza kiềm, A_p1, của hỗn hợp phomat/sữa (8.2 hoặc 8.3), tính bằng mili đơn vị hoạt tính enzym trên lit, theo công thức (2) sau đây:

                  (2)

Trong đó

F_av là giá trị huỳnh quang trung bình do phần mẫu thử (9.2) phát ra trong 1 min, được đo dựa vào dung dịch hiệu chuẩn A (xem 9.1) tại thời điểm bắt đầu phút thứ hai và ở cuối phút thứ ba;

c_B là nồng độ Fluoroyellow trong dung dịch hiệu chuẩn B (5.4.2), tính bằng micromol trên 2 ml dung dịch hiệu chuẩn;

f₁ là hệ số chuyển đổi từ đơn vị trên mililit sang mili đơn vị trên lit, trong trường hợp của các mẫu thanh trùng (8.2) thì f₁ = 1 x 10⁶

V là thể tích phần mẫu thử, tính bằng mililit (ml).

10.2.2. Phomat

10.2.2.1. Tính hoạt tính phosphataza kiềm của mẫu thử, A_p, tính bằng mili đơn vị hoạt tính enzym trên gam, theo công thức (3) sau đây:

                  (3)

Trong đó

A_p1 là hoạt tính phosphataza kiềm của hỗn hợp phomat/sữa (8.2 hoặc 8.3) tính bằng mili đơn vị hoạt tính enzym trên lit (mU/l).

f₂  là hệ số pha loãng, tương ứng với dung dịch pha loãng thứ hai của hỗn hợp phomat/sữa ban đầu để thu được giá trị phát hiện hoạt tính không quá 7000 mU/l trong phần mẫu thử [ví dụ: phomat từ sữa tươi nguyên liệu (8.3)], nếu có.

m là khối lượng phần mẫu thử (8.2 hoặc 8.3), tính bằng gam trên 25 ml (g/25ml).

10.2.2.2. Nếu dùng bình gốm hoặc ống Ultra Turrax đối với phomat cứng (8.2.2) thì tính hoạt tính phosphataza kiềm của mẫu thử, A_p, theo công thức (4) sau đây:

                  (4)

Trong đó m’ là khối lượng phần mẫu thử (8.2.2), tính bằng gam trên 10 ml (g/10ml).

10.3. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến đơn vị số nguyên gần nhất của mili đơn vị.

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) về độ chụm của phương pháp sẽ được công bố trong Tạp chí của IDF.

Các giá trị về giới hạn lặp lại và giới hạn tái lập được biểu thị ở mức xác suất 95% và có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

CHÚ THÍCH: IDF 135 đưa ra hướng dẫn cụ thể về các phép thử liên phòng của phương pháp phân tích về các sản phẩm sữa. Hướng dẫn này được dựa vào TCVN 6910-1 (ISO 5725-1).

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử độc lập riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử, tiến hành trên cùng một nguyên liệu thử, trong cùng một phòng thử nghiệm, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp lớn hơn các giá trị r nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Giới hạn lặp lại

Hệ số biến thiên của giới hạn lặp lại là:

- Hoạt tính ALP ≤ 100 mU/g: 50%

- Hoạt tính ALP > 100 mU/g: 10%

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi áp dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên cùng mẫu thử, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các kỹ thuật viên khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5% các trường hợp lớn hơn các giá trị R nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 – Giới hạn tái lập

Hệ số biến thiên của giới hạn lặp lại là:

- Hoạt tính ALP ≤ 100 mU/g: 100%

- Hoạt tính ALP > 100 mU/g: 20%

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các thao tác chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] IDF 135. Milk and milk products – Precision characteristics of analytical methods ~ Outline of collaborative study procedure.

[5] IDF Special Issue 9602. Heat treatment and alternative methods. 1996. pp 337-388.

[6] PELLEORIN0 L.BAIII u G. RCSMINI P F_ERKANTI P..B_ARONI; F and ADueo F Effects of heal lond gradienl occuring In moulding on characterization and ripening of Grame Padano cheese Imi 77 1997. pp. 217-228

[7] International Unuin oJ Biochemistry Nomenclature J Am Med. Assoc. 73. 1988. p 260