Tiêu chuẩn TCVN 8180-2:2009 Xác định hàm lượng natamyxin trong phomat bằng sắc ký lỏng

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8180-2:2009

ISO 9233-2:2007

PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỐI VỚI PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN

Cheese, cheese rind processed cheese - Determination of natamycin content - Part 2: High-performance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese

Lời nói đầu

TCVN 8180-2 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 9233-2:2007;

TCVN 8180-2 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8180 (ISO 9233) gồm các tiêu chuẩn sau:

- TCVN 8180-1 : 2000 (ISO 9233-1 : 2007) Phomat, cùi phomat và phomat chế biến - Xác định hàm lượng natamyxin - Phần 1: Phương pháp đo phổ hấp thụ phân tử đối với cùi phomat;

- TCVN 8180-2 : 2009 (ISO 9233-2 : 2007) Phomat, cùi phomat và phomat chế biến - Xác định hàm lượng natamyxin - Phần 2: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đối với phomat, cùi phomat và phomat chế biến.

PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NATAMYXIN - PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỐI VỚI PHOMAT, CÙI PHOMAT VÀ PHOMAT CHẾ BIẾN

Cheese, cheese rind processed cheese - Determination of natamycin content - Part 2: High-performance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng natamyxin cao hơn 0,5 mg/kg trong phomat, cùi phomat và phomat chế biến và hàm lượng natamyxin cao hơn 0,03 mg/dm² liên quan đến diện tích bề mặt.

2 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

2.1

Hàm lượng natamyxin (natamycin content)

Phần khối lượng của các chất xác định được bằng phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Hàm lượng nitơ được tính bằng miligam trên kilogam.

2.2

Hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt trong cùi phomat (surface-area-related natamycin mass in cheese rind)

Phần khối lượng của các chất liên quan đến diện tích bề mặt xác định được bằng phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt được tính bằng miligam natamyxin trên decimet vuông cùi phomat.

2.3

Cùi phomat

Lớp ngoài của phomat có bề dày 5 mm, ngoại trừ lớp bao phủ, nếu có.

3. Nguyên tắc

Phần mẫu thử đã biết được chiết bằng metanol. Dịch chiết được pha loãng bằng nước rồi được làm lạnh đến khoảng từ âm 15 ⁰C đến âm 20 ⁰C để làm kết tủa hết tất cả chất béo, rồi lọc. Hàm lượng natamyxin hoặc lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt được xác định trong dịch lọc (sau khi cô đặc, nếu cần) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có qui định khác.

4.1 Metanol (CH₃OH).

4.2 Metanol, dung dịch trong nước

Trộn 2 thể tích metanol (4.1) với 1 thể tích nước.

4.3 Dung dịch chuẩn natamyxin, nồng độ 500 mg/l

Ngay trước khi sử dụng, hòa tan trong metanol (4.1) một lượng chế phẩm natamyxin đã biết trước hàm lượng natamyxin, tương ứng với 50 mg natamyxin tinh khiết (C₃₃H₄₇NO₁₃) trong bình định mức một vạch 100 ml (5.1). Thêm nước đến vạch và trộn đều.

4.3.2 Dung dịch chuẩn làm việc natamyxin, nồng độ 5 mg/l

Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc natamyxin (4.3.1) cho vào bình định mức một vạch 50 ml (5.1). Pha loãng bằng dung dịch metanol trong nước (4.2) đến vạch và trộn.

Dùng pipet lấy 5,0 ml dung dịch đã pha loãng này cho vào bình định mức một vạch 50 ml (5.1). Pha loãng bằng dung dịch metanol trong nước (4.2) đến vạch và trộn. Nồng độ natamyxin của dung dịch chuẩn làm việc này là 5 mg/ml.

Nồng độ này phải gần bằng nồng độ của dung dịch thử đo được trong 8.3.3. Chỉnh dung dịch chuẩn làm việc này bằng cách dùng pipet và pha loãng một lượng khác, nếu cần.

4.4 Axit axetic (CH₃CO₂H), băng.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1 Bình định mức một vạch, dung tích 50 ml và 100 ml.

5.2 Máy thái hoặc dụng cụ tương tự, có thể cắt các phần phomat dày 5 mm và rộng khoảng 30 mm (xem ví dụ ở Hình A.1).

5.3 Máy cắt, có thể cắt mỏng các lát phomat dày 1 mm (xem ví dụ ở Hình A.2).

5.4 Máy nghiền hoặc máy trộn.

5.5 Dao sắc, có thể cắt được các lát phomat thành các miếng nhỏ.

5.6 Máy khuấy từ hoặc máy lắc.

5.7 Bính nón, dung tích 100 ml và 200 ml, bằng thủy tinh màu và được đậy bằng nút thủy tinh mài.

5.8 Xyranh, dung tích 10 ml, loại dùng một lần.

5.9 Màng lọc micro, cỡ lỗ 0,20 mm đến 0,45 mm, bền với các dung dịch cồn.

5.10 Giấy lọc gấp nếp, tốc độ nhanh, đường kính 150 mm (ví dụ: S và S số 595 1/2) 1)

5.11 Phễu chiết, đường kính khoảng 70 mm.

5.12 Tủ đông lạnh, có thể làm đông lạnh ở khoảng từ âm 15 ⁰C đến âm 20 ⁰C.

5.13 Cột chiết, để cô đặc dịch lọc, nếu cần [ví dụ: Sep-pac C18 1) hoặc Waters số 519101)]

5.14 Máy sắc ký lỏng, có detector UV có thể đo ở bước sóng 303 nm, được trang bị máy ghi và/hoặc máy tích phân.

5.15 Cột phân tích, dài 150 mm, đường kính trong 4,6 mm, loại C8, có cỡ hạt 5 mm [ví dụ: Lichrosorb RP8)1

5.16 Cột bảo vệ, dài 100 mm, đường kính trong 2,1 mm, loại C8, có cỡ hạt 30 mm đến 40 mm [ví dụ: Perisorb RP8)¹]

5.17 Bình đựng mẫu, có dung tích thích hợp.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Phương pháp lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Mẫu phòng thử nghiệm phải là phomat nguyên hoặc phần phomat đại diện cho cả khối phomat.

7. Chuẩn bị mẫu thử

7.1 Cùi phomat

Cắt mẫu thử thành các phần hoặc các phần nhỏ sao cho chiều rộng của cùi phomat không lớn hơn 30 mm, nếu cần. Dùng máy thái (5.2) loại ra toàn bộ cùi từ tất cả các phần thu được bằng cách cắt miếng có bề dày tối đa 5 mm.

Từ phần cùi thu được, cắt bằng dao sắc (5.5), cắt các lát hình chữ nhật có diện tích từ 2 dm² đến 4 dm². Xác định diện tích bề mặt, tính theo decimet vuông và khối lượng của nó tính theo kilogam.

Dùng máy nghiền (5.4) cẩn thận nghiền toàn bộ cùi, cả các miếng đã cân và đã đo rồi trộn kỹ. Chuyển ngay phần mẫu thử đã chuẩn bị này sang bình đựng mẫu (5.17).

Sau khi chuẩn bị xong mẫu thử, rửa sạch tất cả các dụng cụ đã tiếp xúc với mẫu bằng nước nóng rồi sau đó bằng metanol (4.1). Làm khô các dụng cụ đã rửa, ví dụ: dùng luồng không khí nén.

7.2 Lõi phomat và phomat chế biến

Sau khi đã loại bỏ cùi (7.1), dùng máy cắt (5.3) loại bỏ một lớp tối đa 1 mm từ phần đã cắt bỏ củi của mẫu phomat.

Cắt tất cả các lát phomat thành các miếng nhỏ khoảng 50 mm² và trộn kỹ. Chuyển ngay phần mẫu thử đã chuẩn bị này sang bình đựng mẫu (5.17).

Sau khi chuẩn bị xong mẫu thử, rửa sạch tất cả các dụng cụ đã tiếp xúc với mẫu bằng nước nóng rồi sau đó bằng metanol (4.1). Làm khô các dụng cụ đã rửa, ví dụ: dùng luồng không khí nén.

8. Cách tiến hành

8.1 Phần mẫu thử

8.1.1 Cùi phomat

Cân khoảng 10,00g mẫu thử (7.1), chính xác đến 10 mg, cho vào bình nón 200 ml (5.7).

8.1.2 Lõi phomat và phomat chế biến

Cân khoảng 5,00g mẫu thử (7.2), chính xác đến 10 mg, cho vào bình nón 100 ml (5.7).

8.2 Chuẩn bị dung dịch thử

8.2.1 Cùi phomat

8.2.1.1 Bước ban đầu

Cho 100 ml metanol (4.1) vào phần mẫu thử trong bình nón (8.1.1). Dùng máy khuấy từ (5.6) để khuấy lượng chứa trong bình nón trong 90 min hoặc lắc 90 min trên máy lắc (5.6).

Thêm 50 ml nước. Đặt ngay bình nón vào tủ đông lạnh (5.12) khoảng 60 min.

8.2.1.2 Lọc

Lọc dịch chiết lạnh qua giấy lọc gấp nếp (5.10) trong khi đó loại bỏ 5 ml dịch lọc đầu tiên. Lọc khi huyền phù vẫn còn lạnh để tránh làm tan chất béo sẽ bị đục.

Đưa dịch lọc về nhiệt độ phòng. Dùng xyranh (5.8) lấy phần dịch lọc. Lọc qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,45 mm (5.9) rồi lọc tiếp qua màng lọc micro cỡ lỗ 0,20 mm (5.9).

Lượng dung dịch mẫu thử (dịch lọc) tối thiểu là 20 ml để đo sắc ký trực tiếp (8.3.4) và 25 ml hoặc 50 ml để đo nồng độ cao gấp 5 hoặc 10 lần (8.3.5) tương ứng.

8.2.2 Lõi phomat và phomat chế biến

8.2.2.1 Bước ban đầu

Dùng ống đong lấy 50 ml metanol (4.1) cho vào phần mẫu thử trong bình nón (8.1.2). Dùng máy khuấy từ (5.6) để khuấy lượng chứa trong bình nón trong 90 min hoặc lắc 90 min trên máy lắc (5.6).

Dùng ống đong cho thêm 25 ml nước. Đặt ngay bình nón vào tủ đông lạnh (5.12) khoảng 60 min.

8.2.2.2 Lọc

Tiến hành lọc như trong 8.2.1.2.

8.3 Xác định

8.3.1 Xác định và giới hạn phát hiện

Phòng thử nghiệm sử dụng phương pháp sẽ thiết lập giới hạn phát hiện và xác định trong các điều kiện thiết bị của mình sử dụng phương pháp tính toán đã được công nhận để xác nhận rằng hàm lượng natamyxin cần xác định thấp đến 0,5 mg/kg và 0,03 mg/dm².

8.3.2 Điều chỉnh máy đo sắc ký lỏng (5.14)

Khuyến cáo sử dụng các điều kiện sắc ký dưới đây:

Pha động                                     Metanol (4.1): nước : axit axetic (4.4) theo tỷ lệ 12:8:1 (thể tích)

Tốc độ dòng:                               1 ml/min

Cài đặt detector:                          303 nm, 0,005 đơn vị hấp thụ toàn dải đo

Bộ ghi:                                        10 mV

Số đếm lý thuyết (điển hình):         tối thiểu 1500

Khi sử dụng cột khác với ví dụ trong 5.15, thì chỉnh tỷ lệ metanol : nước. Tuy nhiên, lượng tương đối của axit axetic (4.4) đối với metanol được qui định cần giữ ở độ hấp thụ tối đa ơ 303 nm.

Trước mỗi dãy phân tích, cần phải bơm dung dịch đã biết trước hàm lượng natamyxin để xác định thời gian lưu và để kiểm tra đường chuẩn (8.3.3).

Vì natamyxin không ổn định trong dung dịch metanol, do đó nên tiến hành phép đo ngay khi có thể.

8.3.3 Đường chuẩn

Dùng pipet lấy 1 ml, 2 ml, 4 ml, 6 ml và 8 ml tương ứng của dung dịch chuẩn làm việc natamyxin (4.3.2) cho vào một dãy các bình định mức 50 ml (5.1). Thêm dung dịch metanol trong nước (4.2) và trộn đều.

Các dung dịch hiệu chuẩn thu được này chứa 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml và 0,8 mg/ml natamyxin tương ứng. Bơm lần lượt 20 ml từng dung dịch chuẩn này lên cột. Xác định chiều cao pic hoặc diện tích pic thu được.

Dựng chiều cao pic hoặc diện tích pic thu được đối với từng dung dịch trên trục tung và nồng độ natamyxin tính bằng miligam trên kilogam trên trục hoành. Sắc đồ HPL mẫu của dung dịch chuẩn được nêu trong Hình A.3.

8.3.4 Dung dịch thử

Bơm 20 ml dung dịch thử (8.2.1.2 hoặc 8.2.2.2). Đo chiều cao pic hoặc diện tích pic có cùng thời gian lưu giống như các dung dịch chuẩn natamyxin.

Thực hiện phép đo càng nhanh càng tốt.

Nếu chiều cao pic và diện tích pic của mẫu thử là quá thấp mà không thể nội suy trên đồ thị hoặc gần như không thể, nhưng nếu cần xác định thì tiến hành theo 8.3.5.

Các ví dụ về sắc đồ của các dung dịch thử được đưa ra trong Hình A.4.

CHÚ THÍCH Sự có mặt của gia vị, cụ thể là hạt tiêu, trong phomat có thể gây nhiễu cho phép xác định trong đó có thể tạo ra pic trong sắc đồ có cùng thời gian lưu như của natamyxin. Việc tách hai pic có thể thực hiện được bằng cách rửa giải gradient hoặc sử dụng metanol pha động thay thế (4.1) : dung dịch đệm phosphat, pH 4,5 ở 11:9 phần thể tích. Dung dịch phosphat làm dung dịch đệm có thể được chuẩn bị bằng cách hòa tan 3,026 g kali dihydrophosphat trong 1l nước.

8.3.5 Hàm lượng natamyxin thấp

8.3.5.1 Cô đặc

Cần quyết định có cần phải cô đặc khoảng 5 lần hoặc 10 lần hay không. Dựa vào quyết định về kết quả thu được trong 8.3.4 và trên giới hạn phát hiện yêu cầu.

Sau đó dùng pipet lấy 25 ml hoặc 50 ml (đối với cô đặc 5 lần hoặc 10 lần tương ứng) của phần mẫu thử (8.2.1.2) cho vào cốc có mỏ. Thêm 50 ml hoặc 100 ml nước tương ứng.

Hoạt hóa ống chiết (5.13) bằng cách dùng 3 ml đến 5 ml metanol (4.1), sau đó rửa bằng 10 ml nước.

Cho dung dịch mẫu thử đã pha loãng đi qua ống này ở tốc độ 3 ml/min đến 5 ml/min bằng xyranh (5.8). Dùng xyranh (5.8) lấy 10 ml nước để tráng ống. Rửa giải natamyxin bằng 3 ml metanol (4.1), sử dụng xyranh (5.8).

8.3.5.2 Đo sắc ký lỏng hiệu năng cao

Pha loãng dịch rửa giải (8.3.5.1) đến 5 ml bằng metanol (4.1).

Tiến hành tiếp theo 8.3.4.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1 Tính hàm lượng natamyxin

Hàm lượng natamyxin trong phần lỏng được bơm của mẫu thử có được bằng cách nội suy trên đường chuẩn (8.3.3).

Hàm lượng natamyxin trong phần mẫu thử, w, tính bằng miligam trên kilogam, theo công thức (1) sau đây:

                                    (1)

Trong đó

c_n là nòng độ natamyxin trong dung dịch thử (8.2.1.2 hoặc 8.2.2.2), tính bằng microgram trên mililít (mg/ml).

m là khối lượng phần mẫu thử (8.1.1 hoặc 8.1.2), tính bằng gam (g).

V là tổng thể tích dung dịch mẫu thử (8.2.1.1 hoặc 8.2.2.1), tính bằng mililít (ml).

CHÚ THÍCH Khi dung dịch thử nghiệm thu được từ phomat được lấy mẫu dưới cùi, w, là hàm lượng natamyxin tích lũy vào phomat.

9.2 Tính hàm lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt

Lượng natamyxin liên quan đến diện tích bề mặt, m_A,n tính bằng miligam trên decimet vuông, theo công thức (2) sau đây:

                              (2)

Trong đó

A là diện tích của phần mẫu thử đã cân (7.1) tính bằng decimet vuông (dm²).

m là khối lượng của phần mẫu thử đã cân (7.1), tính bằng kilogam (kg);

w_r là khối lượng natamyxin của phần mẫu thử (7.1), tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg);

9.3 Hiệu chỉnh kết quả

Nếu phần dịch lọc đã được cô đặc như trong 8.3.5, thì chỉnh các kết quả thu được đối với w (9.1) và m_A,n (9.3) như sau:

a) khi cô đặc khoảng 5 lần thì chia kết quả thu được cho 5 và

b) khi cô đặc khoảng 10 lần thì chia kết quả thu được cho 10.

Nếu cần phải xác định lặp lại hai lần và với điều kiện lặp lại hai lần và với điều kiện đáp ứng được các yêu cầu về độ lặp lại, thì lấy hàm lượng natamyxin cuối cùng của mẫu thử là trung bình kết quả của hai lần xác định theo điều 10, làm tròn kết quả đến một chữ số thập phân.

9.4 Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến một chữ số thập phân.

10. Độ chụm

10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm này phù hợp với ISO 5725 : 1986 [2] (đối với các kết quả, xem [4]).

10.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị nêu trong Bảng B.1.

10.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong các phòng thí nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp vượt quá các giá trị nêu trong Bảng B.1.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

e) kết quả thử nghiệm thu được và nếu thỏa mãn yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các ví dụ

Chú dẫn

1 phomat

2 dao

3 cùi

4 trục

Hình A.1 - Ví dụ về máy thái các phần mẫu thử cùi phomat có bề dày 5 mm (5.2)

Hình A.2 - Ví dụ về máy cắt để cắt các phần mẫu thử cùi phomat có bề dày 1 mm (5.3)

CHÚ DẪN

A độ hấp thụ

 bước sóng

AU đơn vị hấp thụ

Hình A.3 - Sắc HPL mẫu của dung dịch chuẩn chứa 0,5 mg/kg natamyxin

CHÚ DẪN

A độ hấp thụ

t thời gian

AU đơn vị hấp thụ

1 cùi phomat, hàm lượng natamyxin 61 mg/kg    4 phomat, hàm lượng natamyxin 0,3 mg/kg

2 cùi phomat, hàm lượng natamyxin 15 mg/kg    5 như 4, sau khi cô đặc 5 lần

3 phomat, hàm lượng natamyxin 1,7 mg/kg        6 như 4, sau khi cô đặc 10 lần

Hình A.4 - Các ví dụ về phổ của các dung dịch thử khác nhau

Phụ lục B

(Tham khảo)

Kết quả phép thử liên phòng thử nghiệm

Các kết quả thử nghiệm cộng tác thu được phù hợp với ISO 5725 : 1986, do 36 phòng thử nghiệm tham gia thực hiện năm 1984 sử dụng tám mẫu thử.

Các giá trị tính bằng miligam trên decimet vuông, được tính từ các giá trị tính theo miligam trên kilogam đối với cùi phomat dày 5 mm và tỷ trọng 1,3 g/cm³.

Bảng B.1 - Các số liệu về độ chụm

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (nay đã hủy).

[3] DERUIG. WG., VAN OOSTROM. J.J., LEENHEER. K. Spectrometry and liquid chromatographic determination of natamycin in cheese and cheese rind. J. Assoc. Off. Chem., 1987, 70. pp.944-8.

[4] DERUIG, W.G. Determination of natamycin in cheese and cheese rind: Interlaboratory collaborative study. J.Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 949-54.