Tiêu chuẩn TCVN 8710-5:2011 Chẩn đoán bệnh taura trên tôm he

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-5:2011

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 5: BỆNH TAURA Ở TÔM HE

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 5: Taura syndrome in Penaeus vannamei

Lời nói đầu

TCVN 8710-5:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TCVN 8710-5:2011

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 5: BỆNH TAURA Ở TÔM HE

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 5: Taura syndrome in Penaeus vannamei

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh taura trên tôm he chân trắng.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫnghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8376:2010, Tôm và sản phẩm tôm - Phát hiện virut gây hội chứng taura (TSV) bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp-phiên mã ngược (RT-PCR).

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa nêu trong TCVN 8376:2010.

4. Phương pháp chẩn đoán

4.1 Chẩn đoán lâm sàng

4.1.1 Dịch tễ học

Virut gây hội chứng taura (TSV) cảm nhiễm chủ yếu trên các loài tôm thuộc họ Tôm he (Penaeidae):Penaeus vannamei, P. stylirostris, P. monodon, Penaeus chinensis, Penaeus japonicus... Trong số đó tôm Penaeus vannamei là loài nhạy cảm nhất với bệnh taura.

Bệnh gây chết từ 40 % đến 90 % tuỳ theo kích cỡ tôm bệnh.

Phương thức lan truyền bệnh: Bệnh cũng có thể lây lan theo những cá thể nhiễm bệnh mãn tính lantruyền sang con cháu trong quá trình sinh sản hoặc thông qua những sinh vật mang mầm bệnh vàovùng nuôi như: chim Gallus domesticus, ký chủ trung gian dưới nước như Trichocorixa reticulate. và qua nguồn nước có chứa vi rút và qua thức ăn nhiễm bệnh TSV làm thức ăn cho tôm nuôi.

4.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn cảm nhiễm: Chủ yếu giai đoạn giống Poslarvae từ 14 ngày đến 40 ngày tuổi, kích thước khoảng 0,1 g đến 5 g. Tôm lớn hơn vẫn có thể nhiễm bệnh này.

Thời kì ủ bệnh: Giai đoạn này diễn ra trong thời gian ngắn khoảng 2 ngày đến 5 ngày cho đến khi bùng phát bệnh, tôm không thể hiện dấu hiệu bệnh lí ra bên ngoài..

Giai đoạn cấp tính: Kéo dài khoảng 1 ngày đến 10 ngày. Tôm bị bệnh sẽ chuyển màu đỏ nhợt nhạt của biểu mô vỏ, đặc biệt vùng đuôi, chân bơi. Ngoài ra còn có thể có dấu hiệu khác như mềm vỏ, ruột rỗng và thường chết khi lột xác. Tỉ lệ chết tích lũy từ 80 % đến 95 %. Đặc điểm trên các lát cắt mô bệnh học của tầng biểu bì mang, dạ dày, ruột trước, ruột sau, mô liên kết thể hiện các vùng bị hoại tử.

Giai đoạn mãn tính: Những con tôm nhiễm TSV sống sót bắt mồi trở lại bình thường nhưng sẽ mang vi rút suốt đời. Các sắc tố đen trên vỏ ki tin, sau vài lần lột xác sẽ biến mất. Và trở thành vật mang mầm bệnh, nếu là tôm bố mẹ sẽ lan truyền cho thế hệ sau theo trục dọc, hoặc theo trục ngang nếu trở thành mồi ăn thịt cho các cá thể khác.

4.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

4.2.1 Phương pháp RT PCR, theo TCVN 8376:2010.

4.2.2 Phương pháp mô bệnh học

4.2.2.1 Lấy mẫu

Thu lấy mẫu tôm từ postlavare 5 (hậu ấu trùng 5 ngày tuổi) đến tôm trưởng thành. Mẫu tôm phải còn sống hoặc đang trong tình trạng hấp hối.

Thu những mẫu tôm có biểu hiện bệnh có dấu hiệu không bình thường, có nhiều điểm bị thương tổn màu nâu, đen trên vỏ kitin, có hiện tượng mềm vỏ và đổi màu đỏ của các phần phụ. Không dùng tômchết hoặc tôm bảo quản đá để cắt mô.

4.2.2.2 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

- Cồn 70 %, 80 %, 95 % và cồn tuyệt đối;

- Parafin;

- Xylen;

- Keo dán, ví dụ Bom Canada;

4.2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh.

- Kính giải phẫu

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen

- Lọ nhỏ cố định mẫu.

- Bình rót parafin;

- Bộ phận làm lạnh mẫu;

- Máy cắt mẫu microtome;

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ;

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu;

- Kính hiển vi quang học;

- Cassete;

- Khung đúc mẫu.

4.2.2.4 Cách tiến hành

4.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu

Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10.

Đối với tôm ấu trùng hoặc tôm postlavare (hậu ấu trùng) có thể cố định cả con trong dung dịch từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con trên bể. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn lấy mang, dạ dày và biểu mô dưới vỏ cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

4.2.2.4.2 Khử mẫu cố định

Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

4.2.2.4.3 Làm trong mẫu

Ngâm sang xylen 1 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm sang xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm tẩm parafin 2 lần, mỗi lần 56 ºC đến 58 ºC trong 1 h.

Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắtđược tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

4.2.2.4.4 Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

4.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượttrong cồn tuyệt đối, cồn 90 % và cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòinước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ cồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, vídụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

4.2.2.4.6 Đọc kết quả

Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao.

Khi tôm bị bệnh TSV, trên các lát cắt mô bệnh học của tầng biểu bì mang, dạ dày, mô liên kết thể hiện các vùng bị hoại tử. Trong tế bào bị cảm nhiễm, nhân kết đặc hay phân tán, trong tế bào chất xuất hiện các thể vùi hình cầu kích thước từ 1 µm đến 20 µm, bắt màu trung gian giữa màu tím của haematoxylin và màu hồng của eosin. Ngoài ra một dấu hiệu khác của bệnh taura ở thời kì cấp tính là các ống tuyến an ten bị phá hủy, xuất hiện nhiều các tế bào bạch cầu có nhân, sự vắng mặt của các tế bào máu trong phần mô bị hoại tử, xuất hiện sắc tố đen trên vỏ ki tin, là sản phẩm cuối cùng của hoạt động miễn dịch của tôm khi bị bệnh.

5. Kết luận

Tôm được xác định nhiễm bệnh taura khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính thu được từ một trong hai phương pháp sau:

- Phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính;

- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút taura.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch Davidson

Cồn 95 %:                                                       330 ml

Formalin (formaldehyd 37 %):                        220 ml

Axit axetic đậm đặc:                                       115 ml

Nước:                                                             335 ml

A.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể:                             1 g

Natri iodat:                                                       0,2 g

Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g

Axit xitric:                                                        1 g

Cloral hydrat:                                                  50 g

Nước:                                                             1000 ml

Hoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit xitric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3 Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y:                                                           1 g

Cồn 70 %:                                                       1 lít

Axit axetic băng:                                             5 ml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn 70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axitaxetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bonami, J.R., Hasson, K.W., Mari, J., Poulos, B.T., Lightner, D.V., , Taura syndrome of marine penaeid shrimp: characterization of the viral agent.. J. Gen. Virol, 1997. 78(313-319).

[2] Brock, J.A., Gose, R., Lightner, D.V., Hasson, K., , An overview of TS an important disease of farmed Penaeus vannamei. In: Browdy, C.L., Hopkins, J.S. (Eds.), Proceedings of The Special Session on Shrimp Farming. Aquaculture 1995: p. 84-94.

[3] Bùi Quang Tề. 2008. Bệnh học thủy sản.

[4] Chang, Y.S., Peng, S.E., Yu, H.T., Liu, F.C., Wang, C.H., Lo, C.F., Kou, G.H. 2004. Genetic and phenotypic variations of isolates of shrimp Taura syndrome virus found in Penaeus monodon and Metapenaeusensis in Taiwan. J. Gen. Virol, 2004. 85: p. 2963 - 2968.

[5] Hasson, K.W., Lightner, D.V., Poulos, B.T., Redman, R.M., White, B.L., Brock, J.A., Bonami, J.R. 1995. Taura syndrome in Penaeus vannamei: demonstration of a viral etiology. Dis. Aquat. Org. 23: p. 115-126

[6] Lightner, D. V,. R.M.R., K. W. Hasson, C. R. Pantoja. 1995. Taura syndrome in Penaeus vannamei (Crustacea: Decapoda): gross signs, histopathology and ultrastructure. Dis. Aquat. Org. 21: p. 53 - 59.

[7] Lightner DV. 1996. A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. World Aquaculture Soc., Baton Roug. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., 
Desselberger U. & Ball L.A. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Eighth
Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Academic Press, 2005.
1259 pp

[8] Mari, J., Poulos, B.T., Lightner, D.V., Bonami, J.R. 2002. Shrimp Taura syndrome virus: genomic characterization and similarity with members of the genus Cricket paralysisđếnlike viruses. J. Gen. Virol. 83: p. 915-926.

[9] Nielsen, L., Sang Oum,W., Cheevadhanarak, S., Flegel, T.W. 2005. Taura syndrome virus (TSV) in Thailand and its relationship to TSV in China and the Americas. Dis. Aquat. Org. 63: p. 101- 106.

[10] Nunan L.M., Poulos B.T. & Lightner D.V. 1998. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) used for the detection of Taura Syndrome Virus (TSV) in experimentally infectedshrimp. Dis. Aquat. Org., 34: p.87 - 91.

[11] Overstreet, R.M., Lightner, D.V., Hasson, K.W., McIlwain, S., Lotz, J.M. 1997. Susceptibility to Taura syndrome virus of some penaeid shrimp species native to the Gulf of Mexico and thesoutheastern United States. J. Invertebr. Pathol, 1997. 69: p. 165-176.

[12] Robles - Sikisaka, R., Hasson,K.W.,Garcia,D.K., Brovont, K.E.,Cleveland,K.D., Klimpel,K.R.,Dhar, A.K. 2002. Genetic variation and immunohistochemical differences among geographic isolates of Taura syndrome virus of penaeid shrimp. J. Gen. Virol. 83: p. 3123-3130.

[13] Srisuvan, T., Tang, K.F.J., Lightner, D.V. 2005. Experimental infection of Penaeus monodon with  Taura syndrome virus (TSV). Dis. Aquat. Org. 67: p. 1-8.

[14] Tang, K.F.J., Lightner, D.V. 2005. Phylogenetic analysis of Taura syndrome virus isolates collected between 1993 and 2004 and virulence comparison between two isolates representing different genetic variants. Virus Res. 112: p. 69-76.

[15] Tang, K.F.J., Noble, B., D.V. Lightner. 2008. Taura syndrome virus from Venezuela is a new genetic variant. Aquaculture. 284: p. 62-67.

[16] Vanpatten K.A., N.L.M.L.D.V. 2004. Seabirds as potential vectors of penaeid shrimp viruses and the development of a surrogate laboratory model utilizing domestic chickens. Aquaculture. 241: p. 31-46.

[17] Yu, C.I. & Song, Y.L. 2000. Outbreaks of Taura syndrome in pacific white shrimp Penaeus  vannamei cultured in Taiwan. Fish Pathology 35(1): p. 21-24.