Tiêu chuẩn TCVN 8710-24:2022 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 24: Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-24:2022

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 24: BỆNH DO SÁN LÁ DOLLFUSTREMA SP. Ở CÁ DA TRƠN

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 24: Dollfustrema sp. disease in catfish

Lời nói đầu

TCVN 8710-24:2022 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8710-1:2011, Phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm;

- TCVN 8710-2:2019, Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển;

- TCVN 8710-3:2019, Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm;

- TCVN 8710-4:2019, Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm;

- TCVN 8710-5:2011, Phần 5: Bệnh taura ở tôm he;

- TCVN 8710-6:2019, Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép;

- TCVN 8710-7:2019, Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép;

- TCVN 8710-8:2012, Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm;

- TCVN 8710-9:2012, Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm;

- TCVN 8710-10:2015, Phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-11:2015, Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-12:2019, Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

- TCVN 8710-13:2015, Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;

- TCVN 8710-14:2015, Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

- TCVN 8710-15:2015, Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá;

- TCVN 8710-16:2016, Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

- TCVN 8710-17:2016, Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

- TCVN 8710-19:2019, Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

- TCVN 8710-20:2019, Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- TCVN 8710-21:2019, Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá;

- TCVN 8710-22:2022, Phần 22: Bệnh sán lá 16 móc ở cá;

- TCVN 8710-23:2022, Phần 23: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV ở cá hồi;

- TCVN 8710-24:2022, Phần 24: Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn;

- TCVN 8710-25:2022, Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu.

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 24: BỆNH DO SÁN LÁ DOLLFUSTREMA SP. Ở CÁ DA TRƠN

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 24: Dollfustrema sp. disease in catfish

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn.

2  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1.1

Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn

Bệnh do sán lá song chủ Dollfustrema sp. gây ra ở cá da trơn.

2.1.2

Sán lá Dollfustrema sp.

Ký sinh trùng thuộc giống Dollfustrema (Eckmann, 1934), phân họ Prosorhynchinae (Nicoll, 1914), họ Bucephalidae (Poche, 1907).

2.2  Các từ viết tắt

- ADN (Deoxyribonucleic acid): axit deoxyribonucleic;

- PBS (Phosphate buffered saline): dung dịch muối đệm phosphat;

- PCR (Polymerase Chain Reaction): phản ứng chuỗi polymerase;

- TAE (Tris-acetate-EDTA): Tris-axetat-axit etylendiamintetraaxetic;

- TBE (Tris-borate-EDTA): Tris-borat-axit etylendiamintetraaxetic;

- TE (Tris-EDTA): Tris-axit etylendiamintetraaxetic.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1  Etanol, từ 70 % đến 100 % (thể tích)

3.1.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR

3.2.1  Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược PCR

3.2.2  Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic)

3.2.3  Kít nhân gen PCR

3.2.4  Dung dịch đệm TE

3.2.5  Thang chuẩn ADN (ladder/ marker)

3.2.6  Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.7  Thạch agarose

3.2.8  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (xem A.1)

3.2.9  Chất nhuộm màu, ví dụ: sybr safe

3.2.10  Chất đệm tải mẫu (loading dye 6X)

3.3  Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp soi tươi

3.3.1  Lam kính

3.3.2  Lamen

3.3.3  Nước muối sinh lý (dung dịch natri clorua 0,9 %)

3.4  Thuốc thử và vật liệu dung cho phương pháp nhuộm Carmin

3.4.1  Dung dịch nhuộm AFA

3.4.2  Dung dịch nhuộm Semichon’s Carmin

3.4.3  Dung dịch tẩy màu (cồn axit).

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1  Tủ lạnh, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C

4.1.2  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ - 20 °C đến - 80 °C

4.1.3  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg

4.1.4  Pipet đơn kênh các loại

4.1.5  Ống đong, dung tích 100 mL; 500 mL; 1000 mL

4.1.6  Máy ly tâm

4.1.7  Lò vi sóng

4.1.8  Dụng cụ chứa mẫu, kín, có nắp đậy, không rò rỉ, vô trùng.

4.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR

4.2.1  Máy nhân gen PCR

4.2.2  Máy tách chiết Taco

4.2.3  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

4.2.4  Máy lắc trộn Vortex

4.2.5  Máy ly tâm Spindown

4.2.6  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.2.7  Máy đọc sản phẩm PCR

4.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp soi tươi

4.3.1  Kính hiển vi

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

- Vòng đời của sán lá Dollfustrema sp. ở hệ sinh thái nước ngọt Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu, chưa xác định được ký chủ trung gian và điều kiện sinh thái liên quan đến sự phát triển diễn biến của bệnh.

- Cá da trơn bị bệnh do Dollfustrema sp. thường ở giai đoạn 2 tháng đến 3 tháng đầu của chu kỳ nuôi thương phẩm. Bệnh gây chết với tỷ lệ cao lên đến 70 %.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

- Cá nhiễm sán lá Dollfustrema sp. thường gầy yếu, da tái nhợt hoặc sậm màu, một số trường hợp cá bị vàng da do sán ký sinh.

- Cá nhiễm bệnh có biểu hiện kém ăn, bơi lờ đờ gần các góc lồng hoặc ao.

- Quan sát dấu hiệu bên ngoài thấy hiện tượng xuất huyết các gốc vây và hậu môn.

5.3  Dấu hiệu bệnh tích

- Giải phẫu cá cho thấy gan và thận có dấu hiệu bị hoại tử, xuất huyết và xuất hiện nhiều các u hạt (granuloma) bao xung quanh sán tạo thành bọc giống như bào nang có màu trắng gọi là "đốm trắng" trên gan và thận nổi rõ, kích thước 2,0 mm đến 2,5 mm.

- Trường hợp cá nhiễm nặng sán lá Dollfustrema sp. trong đường tiêu hóa gây hoại tử ruột, có chất dịch màu vàng trong bụng.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Phương pháp soi tươi

6.1.1  Lấy mẫu

Cá có kích thước < 4 cm: Lấy nguyên con từ 10 con đến 15 con

Cá có kích thước từ 4 cm đến 6 cm: Lấy nguyên con từ 5 con đến 10 con

Cá có kích thước > 6 cm và cá bố mẹ: Lấy nguyên con từ 3 con đến 5 con hoặc lấy gan, thận của từ 3 con đến 5 con

Mẫu bệnh phẩm phải được lấy vô trùng và để riêng biệt trong dụng cụ chứa mẫu (4.1.8).

6.1.2  Bảo quản mẫu

- Mẫu cá được vận chuyển đến phòng thí nghiệm phải còn sống, hoặc mẫu cá được bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C và vận chuyển đến phòng thí nghiệm không quá 24 h.

- Trong phòng thí nghiệm mẫu sán được thu và bảo quản trong dung dịch etanol 70 % (3.1.1) theo tỉ lệ mẫu : cồn bằng 1 : 10.

6.1.3  Cách tiến hành soi tươi

Tiến hành lấy mẫu gan và ruột để tiến hành soi tươi:

- Mẫu gan, thận: Lấy bào nang màu trắng hay còn gọi là đốm trắng trên gan, thận đặt lên lam kính và phá vỡ vỏ bào nang, nhỏ thêm nước muối sinh lý (0,9 %) và đặt lamen lên trên. Quan sát trực tiếp trên kính hiển vi (4.3.1) tại các độ phóng đại 4X, 10X và 40X để tìm ấu trùng sán.

6.1.4  Đọc kết quả

Nghi ngờ ấu trùng sán lá Dollfustrema sp. khi quan sát thấy ấu trùng có dạng ô van dài, cơ thể được bao phủ bởi các gai kitin nhỏ; chiều dài cơ thể 0,47 mm đến 0,54 mm, rộng nhất ở vùng giữa 0,12 mm đến 0,14 mm. Miệng nhỏ, dạng phễu, có 5 vòng gai nhỏ ở gần đỉnh đầu; kích thước miệng 0,044 mm đến 0,050 mm x 0,032 mm đến 0,035 mm. Miệng mở ở nửa sau cơ thể, ngang tinh hoàn trước.

6.2  Phương pháp nhuộm Carmin

6.2.1  Lấy mẫu (theo 6.1.1)

6.2.2  Bảo quản mẫu (theo 6.1.2)

6.2.3  Chuẩn bị mẫu

Lấy bào nang màu trắng hay còn gọi là đốm trắng trên gan, thận đặt lên lam kính và phá vỡ vỏ bào nang, tách riêng sán để tiến hành nhuộm.

Phải dùng các dụng cụ vô trùng khác nhau khi lấy mô ở các mẫu khác nhau để tránh lây nhiễm.

6.2.4  Cách tiến hành

Tiến hành xử lý mẫu, nhuộm soi tiêu bản theo hướng dẫn (xem Phụ lục D)

6.2.5  Đọc kết quả

Soi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao, sau khi nhuộm, có thể quan sát rõ hình thái bên ngoài (xem 6.1.4) và cấu tạo cơ quan bên trong của sán như sau:

Hầu tròn, đường kính 0,035 mm. Ruột lớn, hướng lên trên. Buồng trứng nằm giữa hai tinh hoàn hoặc ngang tinh hoàn trước. Kích thước buồng trứng 0,024 mm x 0,020 mm; tinh hoàn 0,026 mm đến 0,035 mm x 0,026 mm đến 0,029 mm. Túi sinh dục ở mút cuối cơ thể; phần sau đạt đến ngang tinh hoàn sau, kích thước 0,102 mm đến 0,138 mm x 0,035 mm đến 0,050 mm. Tuyến noãn hoàng gồm các bao noãn nhỏ xếp thành một hàng hình vòng cung ở khoảng giữa ruột.

6.3  Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

6.3.1  Lấy mẫu (theo 6.1.1)

Tiến hành xử lý mẫu để thu ấu trùng sán và sán trưởng thành (theo 6.1.3).

6.3.2  Bảo quản mẫu (theo 6.1.2)

6.3.3  Cách tiến hành

6.3.3.1  Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.2) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít tách chiết ADN của Qiagen: DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)1) (xem Phụ lục B1).

Hoặc sử dụng kit tách chiết TACO RNA/DNA extraction Kit (GeneReach Cat. No. atc-d/ma, 320 tests)¹⁾ (xem Phụ lục B2).

6.3.3.2  Chuẩn bị mồi

Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu BD1 và BD2 (3.2.1) để phát hiện sán lá Dollfustrema sp.

Trình tự cặp mồi (xem Phụ lục C, Bảng C.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm Spindown (4.2.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 μM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.6) (10 μl mồi gốc và 40 μl nước tinh khiết không có nuclease).

6.3.3.3  Tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR sử dụng cặp mồi BD1 và BD2, sử dụng kít nhân gen PCR (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.3.3.4  Điện di

6.3.3.4.1  Chuẩn bị bản thạch

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.7) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.8) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ của thạch giảm xuống khoảng 40°C đến 50 °C thì bổ sung 10 μl chất nhuộm màu (3.2.9) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược, bản thạch không dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản thạch vào bể điện di (4.2.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất).

6.3.3.4.2  Chạy điện di

Hút 2 μl chất đệm tải mẫu (loading dye 6X) (3.2.10) vào 8 μl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch. Thực hiện điện di trong bộ điện di, chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.5) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 μl thang chuẩn ADN (3.2.5) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.3.3.5  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc sản phẩm PCR (4.2.7).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

- Đối chứng âm có kết quả âm tính, không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Đối chứng dương có kết quả dương tính được thể hiện bằng vạch sáng rõ có kích thước 1158 bp.

Với điều kiện phản ứng trên

Mẫu xét nghiệm âm tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng 1158 bp (không có sản phẩm khuếch đại);

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

Mẫu xét nghiệm dương tính khi:

- Tại giếng của mẫu thử xuất hiện sản phẩm khuếch đại có vạch sáng kích thước 1158 bp.

- Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

- Có kết quả giải trình tự gen.

7  Kết luận

Cá da trơn được xác định nhiễm sán lá Dollfustrema sp. khi có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh do sán lá Dollfustrema sp. và:

- Định loại hình thái học sán lá song chủ dưới độ phóng đại của kính hiển vi như đã mô tả, hoặc:

- Định loại hình thái học sán lá song chủ bằng phương pháp nhuộm Carmin, hoặc:

- Có kết quả dương tính bằng phương pháp PCR và kết quả giải trình tự gen.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1  Thành phần

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.2.1  Thành phần

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH về trung tính bằng dung dịch natri hydroxit 1 N hoặc dung dịch axit clohydric 1 N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B.1  Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506):

- Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống eppendort, thêm 180 μl dung dịch ATL, thêm 20 μl protease K vào, lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex (4.2.4);

- Ủ ở 56 °C qua đêm cho đến khi hoàn toàn đồng nhất (thỉnh thoảng lắc bằng máy lắc trộn Vortex trong quá trình ủ). Lắc trộn đều.

- Thêm 200 μl dung dịch AL (Lysis buffer). Lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex;

- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min;

- Thêm 200 μl etanol (từ 96 % đến 100 %) vào ống eppendort. Lắc đều bằng máy lắc trộn Vortex;

- Hút huyễn dịch trong ống eppendort, chuyển sang cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột lọc;

- Thêm 500 μl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.2.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột lọc;

- Thêm 500 μl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml;

- Nhỏ 200 μl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm bằng máy ly tâm với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu được sang ống eppendort 1,5 ml khác;

- Bào quản mẫu ADN ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C trong vài tuần và ở - 20 °C trong thời gian dài.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện sán lá Dollfustrema sp. trên cá da trơn.

B.2  Tách chiết ADN bằng bộ kit tách chiết TACO RNA/DNA

B.2.1  Thuốc thử và vật liệu thử

Bộ kít tách chiết TACO RNA/DNA (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests)

Etanol 100 % (cồn tuyệt đối).

B.2.2  Chuẩn bị

- Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml cồn tuyệt đối

- Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml cồn tuyệt đối

- Tiến hành theo sơ đồ

B.2.3  Chuẩn bị mẫu thử

- Cho 250 μL/mẫu dung dịch đệm vào các ống eppendort.

- Cho 100 μL/mẫu vào ống eppendort chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy lắc trộn Vortex (4.2.4) trong 15 s.

- Ly tâm 12000 g trong 1 min.

- Cho 350 μL (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.

B.2.4  Đưa mẫu vào máy tách chiết TACO

- Đặt đĩa vào máy TACO

- Đặt lược vào máy TACO.

- Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách trong khoảng 50 min.

- Thu 100 μL ADN từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendort mới.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện sán lá Dollfustrema sp. trên cá da trơn.

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp PCR phát hiện sán lá Dollfustrema sp.

C.1  Trình tự cặp mồi

Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi ^[5]

C.2  Thực hiện phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR bao gồm:

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi BD1 và BD2 (3.2.1) đã được chuẩn bị và kít nhân gen PCR (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) Cat K10713).

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng C.2).

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng PCR

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng chuẩn.

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có nuclease.

- Mẫu thử: Cho 5 μl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng.

- Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen PCR (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp nhuộm Carmin

D.1  Thành phần thuốc thử

D.1.1  Thuốc nhuộm Semichon’s Carmin

- Axit axetic 100 %: 50 ml

- Nước cất: 50 ml

- Chất nhuộm Carmin đỏ

D.1.2  Thuốc nhuộm AFA

- Formaldehyd 37 %: 10 ml

- Etanol 95 %: 5 ml

- Axit axetic 100 %: 2 ml

- Nước cất: 40 ml

D.1.3  Dung dịch tẩy màu

- Axit clohydric: 1 ml

- Etanol 70 %: 100 ml

D.2  Chuẩn bị

Chuẩn bị 1 lọ thủy tinh, cho axit axetic 100 % và nước cất, thêm Carmin đỏ đến khi dung dịch bão hòa, sau đó đặt lọ dung dịch vào chậu nước ấm 90 °C trong vòng 15 min. Cuối cùng gạn phần nổi phía trên bằng giấy lọc và thu phần dung dịch ở dưới.

D.3  Cách tiến hành

Ngâm mẫu sán trong etanol 70 % (3.1.1);

Đặt mẫu sán giữa 2 lam kính, ép nhẹ và ngâm trong bể chứa dung dịch nhuộm AFA (3.4.1) qua đêm;

- Chuyển vào ngâm trong etanol 70 % trong 30 min;

- Chuyển vào đĩa petri chứa dung dịch nhuộm Semichon’s Carmin (3.4.2) trong 60 min;

- Rửa bằng cồn 70 % trong 30 min và làm nhạt màu bằng cách nhúng vào cồn axit (3.4.3) trong 5 min mỗi lần, lặp lại cho đến khi mẫu xuất hiện màu hồng;

- Rút nước bằng cách ngâm etanol trong vòng 30 min cho mỗi nồng độ: 80 %, 90 % và 100 %;.

- Làm trong bằng xylen trong 1 min và gắn keo dán D.P.X mountant trên lam kính với lamen;

- Dán nhãn với thông tin như ngày, tên loài, nơi lấy mẫu và người lấy mẫu.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Animal Parasitology, Biology 625 laboratory manual (.pdf version) Fall semester 2005 Tuesdays 02:30-5:20; Ackert Rm 226 (Copyright© 2004-2005 Steve J Upton PhD, Kansas State University);

[2] Bui Ngoc Thanh, Nguyen Thi Nguyen, Nguyen Thi Ha, Dao Xuan Truong, Nguyen Van Ha, Truong Thi My Hanh a causative agent of liver - kidney white spot dissease of channel catfish (ictalurus punctatus) cultured in the north of Vietnam;

[3] Gui T. Wang, Wei J. Yao, P. Nie (2001). Seasonal occurrence of Dollfustrema vaneyi (Digenea: Bucephalidae) metacercariae in the bullhead catfish Pseudobagrus fulvidraco in a reservoir in China; Dis Aquat Org, Vol. 44: 127-131.

[4] Dali Chen & Guitang Wang & Weijian Yao & Pin Nie (2007). Utility of ITS1-5.8S-ITS2 sequences for species discrimination and phylogenetic inference of two closely related bucephalid digeneans (Digenea: Bucephalidae): Dollfustrema vaneyi and Dollfustrema hefeiensis

[5] Matthew J. Nolan, Stephen S. Curran, Terrence L. Miller, Scott C. Cutmore, Cinzia Cantacessi, Thomas H. Crib (2015). Dollfustrema dura n. sp. and Heterobucephalopsis perarduum n. sp. (Digenea: Bucephalidae) from the giant moray eel, Gymnothorax javanicus (Bleeker) (Anguilliformes: Muraenidae), and proposal of the Heterobucephalopsinae n. subfa; Parasitology International

[6] Kim Luton, Donna Walker and David Blair (1992). Comparisons of ribosomal internal transcribed spacers from two congeneric species of flukes (Platyhelminthes: Trematoda: Digenea). Molecular and Biochemical Parasitology, 56 (1992) 323-328.

[7] Overstreet RM, Curran SS (2002). Superfamily Bucephaloidea Poche. In: Gibson Dl, Jones A, Bray RA, editors. Keys to the trematoda V1. CABI Publishing and The natural History Museum, p. 67-11.