Tiêu chuẩn TCVN 13917-4:2024 Phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13917-4:2024

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

PHẦN 4: SỰ KIỆN NGÔ CHUYỂN GEN MON 87427

Detection and quatification of genetically modified plants and products derived from genetically modified plants by real-time PCR. Part 4: Maize event MON87427

Lời nói đầu

TCVN 13917-4:2024 do Viện Di truyền Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 13917:2023-2024 Phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen bằng phương pháp real-time PCR gồm có các phần sau đây:

-TCVN 13917-1:2023, Phần 1. Yêu cầu chung;

- TCVN 13917-2:2023, Phần 2; Sự kiện ngô chuyển gen MIR 604;

- TCVN 13917-3:2023, Phần 3: Sự kiện ngô chuyển gen MON 88017;

- TCVN 13917-4:2024, Phần 4: Sự kiện ngô chuyển gen MON 87427;

- TCVN 13917-5:2024, Phần 5: Sự kiện ngô chuyển gen MON 87460.

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN VÀ SẢN PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR PHẦN 4: SỰ KIỆN NGÔ CHUYỂN GEN MON 87427

Detection and quatification of genetically modified plants and products derived from genetically modified plants by real-time PCR. Part 4: Maize event MON 87427

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp real-time PCR (phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực) để phát hiện và định lượng sự kiện MON 87427 trong ngô (Zea mays L.) và sản phẩm có nguồn gốc từ ngô.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 7605 (ISO 21569) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định tính axit nucleic.

TCVN 7606 (ISO 21571) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Tách chiết axit nucleic.

TCVN 7608 (ISO 24276) Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Yêu cầu chung và định nghĩa.

TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016), Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Thuật ngữ và định nghĩa

TCVN 13917-1 Phát hiện và định lượng thực vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi gen bằng phương pháp real-time PCR - Phần 1: Yêu cầu chung.

3  Thuật ngữ và chữ viết tắt

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và chữ viết tắt sau đây:

3.1

ADN (Axit deoxyribonucleic)

Polymer của các deoxyribonucleotide dạng sợi đổi hoặc sợi đơn là chất mang thông tin di truyền, được mã hóa theo chuỗi các base (các hợp chất vòng nitơ có trong purin hoặc pyrimidin) và có trong nhiễm sắc thể và vật liệu nhiễm sắc thể của các bào quan.

[NGUỒN: 3.6 của TCVN 13917-1]

3.2

DNAse (Deoxyribonuclease)

Emzym xúc tác thủy phân axit deoxyribonucleic.

[NGUỒN: 3.36 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.3

Sự kiện (Event)

Cấu trúc trao đổi gen và vị trí duy nhất chèn vào bộ gen.

[NGUỒN: 3.9 của TCVN 13917-1]

3.4

Real-time PCR

Quy trình enzyme kết hợp khuếch đại in vitro các đoạn ADN đặc hiệu với việc phát hiện các sản phẩm PCR đặc hiệu trong quá trình khuếch đại.

[NGUỒN: 3.11 của TCVN 13917-1]

3.5

dNTP (deoxyribonucleotide triphosphat)

Thuật ngữ di truyền liên quan đến deoxyribonucleotide gồm deoxyadenosine nucleotide triphosphate (dATP), deoxycytidine nucleotide triphosphate (dCTP), deoxyguanosine nucleotide triphosphate (dGTP), deoxythymidine nucleotide triphosphate (dTTP) và deoxyuridine nucleotide triphosphate (dUTP).

[NGUỒN: 3.39 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.6

UNG (Uracil N-glycosylate)

Enzym loại uracil ra khỏi các trình tự axit nucleic có chứa deoxyuridine của ADN sợi đơn hoặc sợi đôi, để lại các vị trí apyrimidinic.

[NGUỒN: 3.218 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

3.7

Mẫu chuẩn (Reference material - RM)

Vật liệu hoặc chất có một hay nhiều giá trị, về tính chất của nó được xác định đủ đồng nhất để sử dụng trong đánh giá phương pháp đo hoặc để ẩn định các giá trị của vật liệu.

[NGUỒN: 3.12 của TCVN 13917-1]

3.8

Mẫu chuẩn chứng nhận (Certified reference-material - CRM)

Mẫu chuẩn có kèm theo giấy chứng nhận, trong đó một hay nhiều giá trị về tính chất của nó được chứng nhận theo một thủ tục có hiệu lực, được xác nhận bởi giấy chứng nhận hoặc bởi các tài liệu khác do cơ quan chứng nhận cấp.

[NGUỒN: 3.13 của TCVN 13917-1]

3.9

Chu kỳ ngưỡng C_t (Threshold cycle - C_t)

Điểm của đường khuếch đại mà tại đó tín hiệu huỳnh quang tăng lên trên đường nền hoặc vượt qua ngưỡng cài đặt đã xác định trước.

[NGUỒN: 3.16 của TCVN 13917-1]

3.10

Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of detection - LOD)

Lượng tối thiểu hay nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không cần thiết phải định lượng, như đã được chứng minh bằng thử nghiệm cộng tác hay xác nhận có hiệu lực thích hợp khác.

[NGUỒN: 3.17 của TCVN 13917-1]

3.11

Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification - LOQ)

Nồng độ nhỏ nhất hay lượng chất phân tích nhỏ nhất trong mẫu thử có thể được định lượng với mức chấp nhận về độ chụm và độ chính xác.

[NGUỒN: 3.18 của TCVN 13917-1]

3.12

Độ không đảm bảo đo (u_meas) (Uncertainty of measurement - u_meas)

Thông số không âm đặc trưng cho sự phân tán của các giá trị đại lượng được quy cho đại lượng đo, trên cơ sở thông tin đã sử dụng.

[NGUỒN: 3.106 của TCVN 11933:2017 (ISO 16577:2016)]

4  Nguyên tắc

Phân tích ADN gồm hai phần:

a) Phát hiện đoạn ADN đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 kích thước 95 bp bằng real-time PCR.

b) Định lượng hàm lượng ADN sự kiện ngô chuyển gen MON 87427, sử dụng đồng thời với các mồi và đoạn dò đặc hiệu taxon để khuếch đại đoạn 79 bp của gen hmg A trong các vật liệu ngô chuẩn và mẫu thử nghiệm.

Các sản phẩm PCR tích lũy được đo ở mỗi chu trình (real-time) bằng đoạn dò oligonucleotit đặc hiệu trình tự đích được đánh dấu bằng hai thuốc nhuộm huỳnh quang FAM và TAMRA.

CHÚ THÍCH: FAM là thuốc nhuộm phát huỳnh quang và TAMRA là thuốc nhuộm dập tắt huỳnh quang.

5  Thuốc thử

5.1  Yêu cầu chung

Đối với chất lượng của thuốc thử được sử dụng, xem 6.6 trong TCVN 7608 (ISO 24276).

Thuốc thử phân tích phải là loại thuốc thử tinh khiết thích hợp dùng cho sinh học phân tử, không chứa ADN và DNAse, sử dụng thuốc thử phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.2  Nước, nước cất hai lần, nước đã khử ion hoặc nước có chất lượng tương đương.

5.3  Đệm phản ứng, có chứa chuẩn thụ động ROX, 2x

5.4  Dung dịch magie clorua (MgCI₂), c = 25 mmol/L.

5.5  Dung dịch deoxyribonucleosit triphosphat (dNTP) chứa dATP, dCTP, dGTP, dUTP, c = 2,5 mmol/ L (mỗi loại).

5.6  Các oligonucleotid

Chi tiết của các oligonucleotid được nêu trong Bảng 1^[1].

Bảng 1 - Các oligonucleotid

Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu gen hmg là 79 bp; kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 là 95 bp. Có thể sử dụng thuốc nhuộm reporter và/hoặc thuốc nhuộm quencher tương tự nếu cho các kết quả tương đương hoặc tốt hơn.

5.7  Enzym ADN polymerase chịu nhiệt

5.8  Uracil N-glycosylase (UNG), tùy chọn, để giảm thiểu nhiễm chéo PCR.

6  Thiết bị, dụng cụ

6.1  Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phù hợp cho các thử nghiệm sinh học phân tử trong suốt quy trình, trừ khi có quy định khác.

6.2  Máy ly tâm

Sử dụng các loại máy ly tâm có tốc độ quay tối đa từ 6.800 rpm đến 18.000 rpm, lực ly tâm tối đa từ RCF 2680 xg đến 27.070 xg.

6.3  Máy chu trình nhiệt real-time

Thiết bị khuếch đại ADN in vitro và thực hiện các chu trình nhiệt độ-thời gian cần thiết cho PCR. Ngoài ra, thiết bị phải có khả năng kích thích các phân tử huỳnh quang ở các bước sóng quy định và phát hiện đù ánh sáng huỳnh quang phát xạ của chất đánh dấu huỳnh quang được dùng để thực hiện các phân tích định dạng TaqMan.

6.4  Ống phản ứng, phù hợp với mỗi máy chu trình nhiệt real-time.

6.5  Pipetman, có các dung tích phù hợp

7  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Đối với hạt ngô và sản phẩm từ ngô, nên lấy mẫu theo TCVN 9027 (ISO 24333) Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc - Lấy mẫu. Đối với các sản phẩm khác, lấy mẫu theo tiêu chuẩn cụ thể có liên quan. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thoả thuận với nhau về vấn đề này.

8  Chuẩn bị mẫu thử

- Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện, mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

- Chuẩn bị phần mẫu thử theo 5.1 của TCVN 7606 (ISO 21571)

- Tách chiết/tinh sạch theo 5.2 của TCVN 7606 (ISO 21571). Nên tiến hành tách chiết/tinh sạch ADN theo các phương pháp nêu trong phụ lục A của TCVN 7606 (ISO 21571).

- Định lượng ADN đã tách chiết/tinh sạch theo 5.3 của TCVN 7606 (ISO 21571). Nên tiến hành định lượng ADN đã tách chiết/tinh sạch theo các phương pháp nêu trong phụ lục B của TCVN 7606 (ISO 21571).

ADN đã tách chiết/tinh sạch được đánh giá độ tinh sạch theo Điều 6.3 của TCVN 13917-1.

9  Cách tiến hành

9.1  Thiết lập real-time PCR ^[2]

Chuẩn bị hỗn hợp real-time PCR cho trình tự đích đặc hiệu taxon hmg và trình tự đích đặc hiệu MON 87427 phải được thực hiện trong các ống riêng biệt.

Phương pháp này sử dụng tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là 25 μL cho mỗi phản ứng real-ltime PCR, với các thành phần thuốc thử như trong Bảng 2a, 2b. Thuốc thử phải được rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng. Mỗi loại thuốc thử phải được trộn cần thận và ly tâm (trong thời gian 20 - 30 giây ở tốc độ từ 6000 rpm trở lên) trước khi lấy bằng pipet. Hỗn hợp thuốc thử PCR được chuẩn bị có chứa tất cả các thành phần trừ ADN mẫu thử. Tổng lượng hỗn hợp thuốc thử PCR cần được chuẩn bị phụ thuộc vào số phản ứng cần thực hiện, bao gồm ít nhất một lượng dư được lấy bằng pipet để dự phòng cho phản ứng bổ sung, số lượng mẫu thử và các phép kiểm chứng lặp lại theo Điều 7.2 của TCVN 13917-1:2023. Thành phần hỗn hợp phản ứng real-time được nêu trong Bảng 2a và 2b.

Bảng 2a - Thành phần hỗn hợp phản ứng real-time cho trình tự đích đặc hiệu taxon hmg

Bảng 2b - Thành phần hỗn hợp phản ứng real-time cho trình tự đích đặc hiệu MON 87427

Chuẩn bị các ống phản ứng như sau:

a) trộn hỗn hợp thuốc thử PCR, ly tâm trong thời gian 30 giây đến 1 phút ở tốc độ thấp nhất là 6000 rpm và dùng pipet lấy 20 pL cho vào mỗi ống phản ứng;

b) thêm 5 pL từng ADN mẫu thử hoặc mẫu chuẩn hoặc kiểm chứng ADN đích dương tính hoặc kiểm chứng ADN đích âm tính hoặc nước vào các ống phản ứng tương ứng;

c) trộn và ly tâm trong thời gian 30 giây đến 1 phút ở 6000 rpm;

d) chuyển các ống phản ứng đã chuẩn bị vào máy chu trình nhiệt. Bật chương trình thời gian và nhiệt độ như trong Bảng 3.

9.2  Các mẫu kiểm chứng PCR

Có thể sử dụng các mẫu chuẩn đã được chứng nhận (CRM) MON 87427 (CRM chứa từ 0 % đến 100 % sự kiện ngô chuyển gen MON 87427) hoặc các mẫu chuẩn (RM) tương đương làm mẫu đối chứng dương, vật liệu chuẩn so sánh và vật liệu xây dựng các điểm của đường chuẩn trong phân tích định lượng.

Các kiểm chứng thích hợp bất kỳ khác cần bao gồm được quy định trong TCVN 7608 (ISO 24276).

9.3  Cài đặt chương trình nhiệt độ và thời gian

Cài đặt chương trình nhiệt độ và thời gian như trong Bảng 3. Việc sử dụng các điều kiện phản ứng và máy chu trình nhiệt real-time khác có thể yêu cầu sự điều chỉnh phù hợp cụ thể và cần được kiểm tra xác nhận. Nhiệt độ và thời gian yêu cầu để hoạt hóa enzym phụ thuộc vào từng loại polymerase được sử dụng.

Bảng 3 - Chương trình nhiệt độ và thời gian

9.4  Dựng đường chuẩn

Sử dụng ADN mẫu chuẩn (RM) hoặc mẫu chuẩn chứng nhận (CRM) có nồng độ phần trăm sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 đã biết để dựng đường chuẩn^[4]. Đường chuẩn phải nằm trong phạm vi dài động, bao gồm các giá trị tương ứng với mục đích sử dụng dự kiến, thể hiện dưới dạng phần trăm sự kiện ngô chuyển gen MON 87427^[3]. Pha loãng ADN chuẩn (CRM/RM) về nồng độ xấp xỉ 40 ng/μL và sử dụng 200 ng ADN là điểm chuẫn số một. Đường chuẩn được xây dựng bằng cách pha loãng theo tỷ lệ nhất định (ví dụ 1:2; 1:4; 1:5; 1:10), để tạo thành 4 đến 5 điểm chuẩn tương ứng. Mỗi điểm chuẩn lặp lại ít nhất 2 lần đối với cả gen đặc hiệu taxon hmg và gen đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON 87427. Các mẫu thử nghiệm được thực hiện đồng thời với đường chuẩn trong cùng một lượt chạy phản ứng real-time^[4].

Đối với mỗi điểm chuẩn, sự khác biệt đối với mỗi giá trị gen đích sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 và gen đích taxon hmg được tính toán (đỏ là ΔCt). Dựng đường chuẩn bằng cách vẽ đồ thị các giá trị ΔCt của các điểm chuẩn theo logarit số phần trăm gen đích sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 và gen đích taxon hmg. Độ đốc (a) và giao điểm (b) của đường chuẩn (y = ax + b) sau đó được sử dụng để tính hàm lượng phần trăm (%) sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 trung bình của các mẫu chưa biết. Giá trị này có thể được tính bằng Excel hoặc trên tùy chọn sẵn có của phần mềm hệ thống real-time PCR chuyên biệt.

Tiêu chí chấp nhận của đường chuẩn: Giá trị trung bình của độ dốc của đường chuẩn phải nằm trong khoảng từ -3,6 đến -3,1; tương ứng với hiệu suất khuếch đại từ 90 % đến 110 %^[4].

10  Tính và biểu thị kết quả

10.1  Phát hiện sự kiện ngô chuyển gen MON 87427

Trình tự đích sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 trong mẫu thử nghiệm X, được xem là phát hiện nếu:

- các mồi đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON87427-F và MON87427-R và đoạn dò MON87427 tạo thành đường cong khuếch đại hình chữ S và có thể tính được giá trị Ct^[2];

- các phản ứng kiểm chứng PCR không bổ sung ADN (kiểm chứng thuốc thử PCR, kiểm chứng chiết mẫu trắng) không tạo ra sự khuếch đại ^[2);

- các kiểm chứng khuếch đại (kiểm chứng dương ADN đích, kiểm chứng chất ức chế PCR) tạo ra sự khuếch đại và giá trị ct dự kiến^[2].

Việc biểu thị kết quả được nêu trong Điều 7.2 của TCVN 13917-1.

10.2  Định lượng sự kiện ngô chuyển gen MON87427

Hàm lượng sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 đơn bội, w, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính bằng Công thức (1):

Trong đó:

w  là hàm lượng sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 đơn bội (%) trong mẫu thử nghiệm X;

N_MON87427  là hàm lượng trung bình gen đích đặc hiệu sự kiện ngô chuyển gen MON 87427, tính bằng phần trăm khối lượng (%);

N_taxon  là hàm lượng trung bình gen đích đặc hiệu taxon hmg, tính bằng phần trăm khối lượng (%).

Tùy theo từng loại máy chu trình nhiệt real-time, hàm lượng sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 có thể được phần mềm của máy tính toán đưa ra kết quả.

11  Yêu cầu đảm bảo chất lượng

Xem Điều 8.2.3 của TCVN 13917-1:2023.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được. Ngoài ra, tùy từng trường hợp cụ thể kết quả phải ghi:

- Kết quả mẫu âm tính: "Đối với mẫu X, không phát hiện được sự kiện ngô chuyển gen MON 87427" (10.1) (có thể kèm theo LOD của phương pháp).

- Kết quả mẫu dương tính: "Đối với mẫu X, phát hiện được sự kiện ngô chuyển gen MON 87427” (10.1).

Kết quả định lượng: "Đối với mẫu X, hàm lượng ADN có nguồn gốc từ sự kiện ngô chuyển gen MON 87427 là w ± u_meas %”, trong đó u_meas là độ không đảm bảo đo (có thể kèm theo LOQ của phương pháp). (10.2).

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] GMO Methods: EU database of reference method, Quantitative PCR method for detection of maize event MON87427 (EURL GMFF, 2015). Last update 15/7/2016.

[2] TCVN 13842-2:2023 (ISO/TS 20224-3), Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phát hiện nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng real-time PCR - Phần 3: Phương pháp phát hiện ADN của lợn

[3] Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing, (2015) JRC Technical Report. European Network of GMO Laboratories (ENGL). European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EURL-GMFF). 24 pages.

[4] HO.UG.S L, GATTO F, GOERLICH O, GROHMANN L, LIESKE K, MAZZARA M, NARENDJA F, OVESNA J, PAPAZOVA N, SCHOLTENS I, ZEL J. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. JRC technical report. Version 2. 2017. EUR29015 EN. 30 pages.

[5] TCVN 12613:2019 (ISO 21570:2005), Thực phẩm - Phương pháp phân tích để phát hiện sinh vật biến đổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen - Phương pháp dựa trên định lượng axit nucleic.

[6] TCVN 9027 (ISO 24333), Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc - Lấy mẫu.