Tiêu chuẩn TCVN 14374:2025 Thuốc bảo vệ thực vật - Định lượng Trichoderma koningii bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc và khẳng định bằng PCR

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14374:2025

THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT - ĐỊNH LƯỢNG TRICHODERMA KONINGII BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)

Pesticides - Enumeration of Trichoderma koningii by the colony count method and confirmation by polymerase chain reaction (PCR)

Lời nói đầu

TCVN 14374:2025 do Học viện Nông nghiệp Việt Nam biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT - ĐỊNH LƯỢNG TRICHODERMA KONINGII BẰNG KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC VÀ KHẲNG ĐỊNH BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)

Pesticides - Enumeration of Trichoderma koningii by the colony count method and confirmation by polymerase chain reaction (PCR)

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Trichoderma koningii trong thuốc bảo vệ thực vật sinh học bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch DRBC và khẳng định bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu cố).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm.

TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014), Vi sinh vật trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nước - chuẩn bị, sản xuất, bảo quản và thử hiệu năng của môi trường nuôi cấy.

3 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1

Môi trường thạch DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar)

Môi trường dinh dưỡng, khi nuôi cấy trên môi trường này, nấm Trichoderma koningii thể hiện các đặc điểm hình thái đặc trưng so với các loài nấm khác; bao gồm đặc điểm của khuẩn lạc, sợi nấm, cành bào tử và bào tử nấm, được mô tả khi tiến hành các thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Môi trường thạch DRBC và các chất chọn lọc dành riêng cho nấm Trichoderma koningii hiện có sản phẩm thương mại sẵn có trên thị trường. Thông tin này được cung cấp nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn.

3.2

Nấm Trichoderma koningii (Trichoderma koningii fungi)

Nấm sợi thuộc chi Trichoderma, được biết đến với khả năng kiểm soát sinh học đối với nhiều loại nấm gây bệnh cho cây trồng.

Loài nấm này sống phổ biến trong đất, đặc biệt là ở vùng rễ cây, và có vai trò như một loại vi sinh vật có lợi trong nông nghiệp.

3.3

Gen endochitinase (Endochitinase gene)

Gen mã hóa enzyme endochitinase, một loại enzyme thủy phân chitin - thành phần chính của thành tế bào nấm. Enzyme này giúp phá vỡ chuỗi polysaccharide chitin bằng cách cắt liên kết bên trong chuỗi, từ đó làm suy yếu và tiêu diệt các loài nấm gây bệnh khác.

Gen endochitinase thường được sử dụng làm các marker phân tử để xác định và phân loại loài Trichoderma, vì trình tự của gen này có sự đặc trưng cho các loài trong chi Trichoderma, đặc biệt là các chủng có tiềm năng kiểm soát sinh học ^[6,9].

3.4

Định lượng Trichoderma koningii (Trichoderma koningii enumeration)

Việc xác định số lượng nấm Trichoderma koningii (3.2) (CFU/g hoặc CFU/mL) trong một khối lượng hoặc thể tích cụ thể của thuốc bảo vệ thực vật sinh học khi tiến hành thử nghiệm theo tiêu chuẩn này.

4 Nguyên tắc

Định lượng Trichoderma koningii bằng phương pháp đếm số lượng đơn vị khuẩn lạc nấm đặc trưng phát triển trên môi trường chọn lọc DRBC và được khẳng định thông qua đặc điểm hình thái và phản ứng chuỗi PCR với cặp mồi KoniF và KoniR.

5 Môi trường, hóa chất

5.1 Yêu cầu chung

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết chuyên dùng cho phân tích vi sinh vật và theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Chuẩn bị, sản xuất và thử hiệu năng môi trường nuôi cấy theo TCVN 8128:2015 (ISO 11133:2014).

Ưu tiên sử dụng các thành phần cơ bản khô, hoặc các môi trường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị môi trường, thuốc thử, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.2 Nước, nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương để pha chế hoá chất, môi trường nuôi cấy vi sinh vật [xem TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987)].

5.3 Môi trường thạch DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar)

5.3.1 Thành phần

Peptone (C13H24O4)	5,0 g
Glucose (C6H1206)	10,0 g
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	1,0 g
Magnesium sulphate (MgSO4)	0,5 g
Rose Bengal (C20H4CI4I4O5)	0,025 g
Chloramphenicol (C11H12CI2N2O5)	0,1 g
Dichloran	0,002 g
Thạch	20,0 g
Nước cất	1 000 mL

5.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong 1 000 mL nước cất, đun nóng, nếu cần. Phân phối môi trường với lượng thích hợp vào các bình thủy tinh (6.2.1). Không vặn chặt nắp bình thủy tinh. Khử trùng ở 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.2).

Sau khi khử trùng, phân phối lượng khoảng từ 18 mL đến 20 mL môi trường thạch DRBC vào các đĩa Perth (6.2.8) đã được chuẩn bị và để cho đông đặc. Các thao tác được tiến hành trong tủ cấy (6.1.1).

Khi môi trường đã đông đặc, làm khô bề mặt thạch trước khi sử dụng (đảm bảo không có các giọt nước trên bề mặt môi trường) bằng cách lật úp các đĩa thạch và để trong tủ ấm (6.1.4) ở nhiệt độ từ 25 °C đến 37 °C trong 25 min đến 30 min. Nếu chưa dùng ngay, bảo quản các đĩa thạch ở 4 °C ± 1 °C ở nơi tối (đĩa môi trường bảo quản chỉ được sử dụng khi xác định không bị tạp nhiễm với nấm và vi khuẩn).

5.4 Dung dịch pha loãng (dung dịch muối peptone)

5.4.1 Thành phần

Peptone từ casein 1,0 g

Sodium chloride (NaCl) 8,5 g

Nước cất 1 000 mL

5.4.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong 1 000 mL nước, đun nóng, nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, dùng máy đo pH (6.1.8), nếu cần. Chia dung dịch pha loãng với lượng 90,0 mL vào các bình thủy tinh (6.2.1) và 9,0 mL vào mỗi ống nghiệm (6.2.2). Không vặn chặt nắp và khử trùng ở 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.2).

Sai số cho phép đo của thể tích cuối cùng sau khi khử trùng không được vượt quá ± 0,2 %.

5.5 Dung dịch Tween 80 (C₆₄H₁₂₄O₂₆)

Dung dịch Tween 80 được khử trùng 15 min, trong nồi hấp áp lực (6.1.2) ở 121 °C.

5.6 Thuốc nhuộm LPCB (Lactophenol cotton blue)

5.6.1 Thành phần

Cotton blue 0,05 g

Phenol tinh thể (C₆H₆O) 20,0 g

Glycerin (C₃H₈O₃) 40,0 mL

Axít lactic (C₃H₆O₃) 20,0 mL

Nước cất 20,0 mL

5.6.2 Chuẩn bị

Cho nước cất vào bình thủy tinh (6.2.1), thêm cotton blue, khuấy đều và để yên trong 8 h đến 10 h. Lọc qua phễu lọc để loại bỏ cặn không hòa tan, thu được hỗn hợp (a).

Cho axit lactic vào cốc thủy tinh (6.2.1), thêm phenol tinh thể và khuấy đều. Bổ sung glycerin, khuấy đều, thu được hỗn hợp (b).

Trộn đều hỗn hợp (a) và hỗn hợp (b), thu được thuốc nhuộm LPCB.

Bảo quản thuốc nhuộm trong lọ sẫm màu, đậy kín, ở nhiệt độ phòng. Thời hạn sử dụng 1 tháng.

CHÚ THÍCH: Sử dụng găng tay khi chuẩn bị thuốc nhuộm LPCB. Các thao tác chuẩn bị với phenol, các chất bay hơn cần tiến hành trong tủ hút. Ưu tiên sử dụng sản phẩm dung dịch thuốc nhuộm LPCB thương mại sin có.

5.7 Hoá chất tách chiết ADN và PCR

Ưu tiên sử dụng các bộ kít thương mại (nếu có) hoặc các quy trình tách chiết ADN/PCR phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thử nghiệm và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Tham khảo quy trình tách chiết ADN và phương pháp điện di trong Phụ lục A.

5.8 Cặp mồi oligonucleotide

Trình tự oligonucleotide của mồi KoniF và KonìR được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 - Trình tự oligonucleotide của mồi KoniF và KoniR ^[1]

Tên mồi	Trình tự oligonucleotide	Nồng độ
Trình tự cặp mồi Koni với kích thước 760 bp
KoniF	5’- AGCAAGGGGGTTGGCAAGTA -3’	10 pmol/µL
KoniR	5’- GAGAAGGGGTTCCCTGCAGA -3'	10 pmol/µL

CHÚ THÍCH: Trình tự oligonucleotide của mồi KoniF và KoniR được chứng minh là trình tự phù hợp để phân biệt Trichoderma koningii với các loài nấm khác như: Metarhizium anisopliae, Fusarium graminearum, Fusarium solani, Fusarium sp. và các loài Trichoderma bao gồm: Trichodenma viride, Trichoderma viridescen, Trichoderma harzianum, Trichoderma asperellum, Trichoderma reesei ^[1].

6 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007)] và cụ thể như sau:

6.1 Thiết bị

6.1.1 Tủ cấy vi sinh vật, đảm bảo độ vô trùng.

6.1.2 Nồi hấp áp lực, có khả năng duy trì nhiệt độ (121 ± 3) °C, tương đương áp suất tối thiểu 101.3 kPa.

6.1.3 Tủ sấy, thông gió đối lưu, có khả năng sấy ở nhiệt độ lên tới 70 °C ± 1 °C.

6.1.4 Tủ ấm, thông gió đối lưu, có khả năng duy trì nhiệt độ từ (25 đến 37) °C ± 1 °C.

6.1.5 Bể ổn nhiệt, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ lên đến (99 ± 1) °C.

6.1.6 Máy trộn vortex, có khả năng khuấy trộn mẫu đồng đều.

6.1.7 Kính hiển vi quang học, vật kính có độ phóng đại 4 X, 10X, 40 X và vật kính dầu 100X.

6.1.8 Máy đo pH, có bù nhiệt, chính xác đến ± 0,1 đơn vị ở 25 °C.

6.1.9 Máy PCR, có khả năng khuếch đại được ADN của mẫu.

6.1.10 Hệ thống máy điện di ngang ADN, có thể điều chỉnh cường độ dòng điện và thời gian.

6.1.11 Máy chụp ảnh gói điện di, có nguồn sáng tia tử ngoại (UV-light base).

6.1.12 Cân kỹ thuật, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

6.1.13 Máy quang phổ đo nồng độ ADN, có khả năng đo mẫu vi thể tích (1 µL), bước sóng bao phủ được 260 nm và 280 nm.

6.1.14 Máy lắc, tốc độ đạt 150 r/min.

6.1.15 Máy ly tâm, có khả năng điều chỉnh tốc độ quay tối đa 14 000 r/min và nhiệt độ đến (4 ± 1) °C.

6.2 Dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải tiệt trùng ở điều kiện 121 °C, 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.2) và sấy khô bằng tủ sấy (6.1.3) trước khi tiến hành thử nghiệm.

6.2.1 Bình hoặc cốc thủy tinh, có dung tích thích hợp, có nút đậy kín hoặc nắp vặn thích hợp.

6.2.2 Ống nghiệm, bằng nhựa chịu nhiệt, có nắp đậy.

6.2.4 Que cấy, đầu tròn bằng nhựa hoặc kim loại.

6.2.5 Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc kim loại có thể tiệt trùng.

6.2.6 Micropipet, có thể phân phối 0,05 mL ± 0,002 mL, 0,1 mL ± 0,02 mL, 1,0 mL ± 0,02 mL và 10 mL ± 0,2 mL.

6.2.7 Ống PCR, có thành mỏng (0,2 mL), chịu nhiệt.

6.2.8 Đĩa Petri, bằng chất dẻo hoặc thủy tinh không màu, trong suốt, đường kính 90 mm hoặc 200 mm, chiều sâu tối thiểu là 10 mm.

6.2.9 Lam kính, bằng thủy tinh chịu nhiệt, trong suốt, kích thước 25 x 75 mm, dày 1,0 mm đến 1,2 mm.

6.2.10 Lamen kính, bằng thủy tinh, trong suốt, kích thước 22 x 22 mm, dày 0,13 mm đến 0,16 mm.

6.2.11 Ống ly tâm, 1,5 mL và 2,0 mL, bằng nhựa chịu nhiệt, có vạch chia đến 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mL.

6.2.12 Đầu hút vô trùng các loại, có khả năng chịu nhiệt.

7 Lấy mẫu

Tiêu chuẩn này không quy định việc lấy mẫu, nên lấy mẫu theo TCVN 12017:2017.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

8 Cách tiến hành

8.1 Pha loãng mẫu thử

Dùng cân kỹ thuật (6.1.12) cân 10 g mẫu, chính xác đến 0,01 g, hoặc dùng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2.12) hút 10 mL mẫu cho vào bình thủy tinh (6.2.1) chứa 90 mL dung dịch pha loãng (5.4). Bổ sung 0,1 mL dung dịch Tween 80 (5.5). Trộn đều mẫu trên máy lắc (6.1.14) cho đến khi đồng nhất. Dung dịch phía trên sau khi phần tử nặng lắng xuống được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu có độ pha loãng 10^-1.

Dùng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2.12) hút 1 mL dịch huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm (6.2.2) chứa 9 mL dung dịch pha loãng (5.4). Tránh đầu tip chạm vào dung dịch pha loãng. Trộn kỹ trên máy trộn vortex (6.1.6) khoảng 10 s, dung dịch thu được có nồng độ 10‘2. Lặp lại qui trình để thu được dung dịch có các nồng độ pha loãng thập phân tiếp theo. Chuẩn bị các nồng độ pha loãng, tiếp theo từ 10^-3 đến 10^-7.

CHÚ THÍCH: Hoạt hóa mẫu, theo hướng dẫn của nhà sản xuất để đảm bảo kết quả chính xác, nếu có.

8.2 Cấy và ủ mẫu

Sử dụng micropipet (6.2.6) với đầu hút vô trùng (6.2.12) hút 0,1 mL dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào mỗi đĩa Petri (6.2.8) chứa môi trường thạch DRBC (5.3). Mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa.

Dùng que dàn mẫu (6.2.5) dàn đều dịch cấy trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt. Sử dụng một que dàn mẫu vô trùng cho một đĩa. Đậy nắp đĩa và để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 min cho dịch cấy hấp thụ vào bề mặt thạch.

Nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở 25 °C trong 48 h đến 72 h. Sau thời gian trên, nếu các khuẩn lạc nấm hình thành nhưng không thể hiện đặc trưng nhận dạng thì ủ đĩa thêm 24 h đến 48 h.

8.3 Đếm và nhận diện khuẩn lạc

Trên môi trường DRBC, khuẩn lạc nấm Trichoderma koningii có hình tròn, đồng tâm, kết cấu dạng bông, phát triển nhanh, ở giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, khuẩn lạc được hình thành dưới dạng điểm nhỏ, cỏ màu trắng nhạt. Sau đó chuyển dần sang màu trắng và khuẩn lạc đạt kích thước 3 mm đến 4 mm, khuẩn lạc có hình tròn sau 72 h nuôi cấy (xem B.1 và B.2 của Phụ lục B).

Đếm các khuẩn lạc có các đặc điểm giống mô tả của Trichoderma koningii ở hai độ pha loãng liên tiếp, trên các đĩa Petri có chứa không nhiều hơn 150 khuẩn lạc.

Khuẩn lạc Trichoderma koningii được khẳng định thông qua phép thử khẳng định.

CHÚ THÍCH 1: Quá trình nuôi ủ có thể kéo dài đến 96 h để kiểm tra lại số khuẩn lạc có thay đổi trên đĩa nuôi cấy hay không.

CHÚ THÍCH 2: Trên môi trường DRBC, có thể xuất hiện các khuẩn lạc của loài nấm khác. Các khuẩn lạc này có thể nhận diện và loại trừ bằng cách quan sát màu sắc sợi nấm, đặc điểm hình thái sợi nấm, cuống sinh bào tử và bào tử trên kính hiển vi.

CHÚ THÍCH 3: Có thể sử dụng đĩa Petri đường kính 200 mm thay cho đĩa có đường kính 90 mm để thuận tiện trong quá trình đếm.

8.4 Nhận diện Trichoderma koningii bằng phép thử khẳng định

Từ mỗi đĩa Petri đã chọn (8.3), lấy năm khuẩn lạc Trichoderma koningii giả định để thực hiện phép thử khẳng định. Nếu trên đĩa Petri có ít hơn năm khuẩn lạc, thì lấy tất cả các khuẩn lạc có mặt.

8.4.1 Đánh giá đặc điểm hình thái sợi nấm, thể bình và bào tử

Nấm Trichoderma koningii được cấy vào vị trí chính giữa trên đĩa Petri chứa môi trường thạch DRBC (5.3), găm lamen kính (6.2.10) đã hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 min, xung quanh điểm cấy nấm một góc 45 °C. Nuôi trong tủ ấm (6.1.4) ở 25 °C trong 72 h. Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm LPCB (5.6) lên lam kính (6.2.9). Đặt lamen mà trên đó có sợi nấm mọc lan úp xuống lam kính, tránh có bọt khí.

Soi tiêu bản trên kính hiển vi quang học (6.1.7), đánh giá đặc điểm sợi nấm, thể bình và bào tử nấm. Các chủng được nghi ngờ là Trichoderma koningii khi cho kết quả dương tính về đặc điểm sợi nấm, thể bình và bào tử (xem B.1 và B.3 của Phụ lục B).

8.4.2 Xác định Trichoderma koningii bằng phương pháp PCR

Thực hiện phản ứng khuếch đại đoạn gen endochitinase trong ống PCR (6.2.7) (xem Bảng 2 và Bảng 3) với các cặp oligonucleotide (xem Bảng 1) đối với các chủng cho kết quả dương tính với phép thử khẳng định thông qua đặc điểm hình thái sợi nấm, bào tử, thể bình (8.4.1). Nếu mẫu phản ứng cho sản phẩm đặc hiệu đúng kích thước của gen endochitinase (760 bp) thì khẳng định mẫu là Trichoderma koningii và ngược lại (xem B.4 của Phụ lục B).

Bảng 2 - Thành phần phản ứng PCR

Thành phần	Thể tích (µL)
Nước không chứa nuclease	7
Mồi xuôi KoniF (10 pmol/µL)	1
Mồi ngược KoniR (10 pmol/µL)	1
Hỗn hợp phản ứng PCR (PCR master mix 2X)	10
ADN	1
Tổng thể tích	20

Bảng 3 - Chu trình PCR áp dụng cài đặt cho máy PCR

Bước - số chu kỳ	Nhiệt độ	Thời gian
Bước 1 -1 chu kỳ	95 °C	5 min
Bước 2 - 29 chu kỳ	94 °C	1 min
	58 °C	30 s
	72 °C	1 min
Bước 3 - 1 chu kỳ	72 °C	10 min
Bước 4 - 1 chu kỳ	12 °C	Giữ ∞

9 Tính và biểu thị kết quả

- Số lượng khuẩn lạc nấm Trichoderma koningii, a, trên mỗi đĩa Petri được tính theo Công thức (1): a = AXC (1)

Trong đó:

b là số lượng khuẩn lạc Trichoderma koningii giả định cho thấy có đặc điểm như phép thử khẳng định của tiêu chuẩn;

A là số lượng khuẩn lạc Trichoderma koningii giả định được lấy để thực hiện phép thử khẳng định;

C là tổng số khuẩn lạc Trichoderma koningii giả định đếm được trên đĩa Petri.

Kết quả được làm tròn đến số nguyên gần nhất.

- Số lượng nấm Trichoderma koningii, N, trong một đơn vị kiểm tra, được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gam (CFU/g) hoặc trên mililit (CFU/mL), đã được nhận dạng hoặc khẳng định có trong mẫu thử được tính theo Công thức (2):

Trong đó:

∑a là tổng số khuẩn lạc Trichoderma koningii đếm được trên tất cả các đĩa Petri được giữ lại ở hai độ pha loãng liên tiếp, a tính được từ công thức (1);

V là thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa Petri, tính bằng mililit (mL);

n₁ là số đĩa Petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

n₂ là số đĩa Petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất được giữ lại.

Biểu thị kết quả dưới dạng a x 10^x, trong đó 1,0 ≤ a < 10 và hệ số a có hai chữ số có nghĩa; x là số mũ của 10.

Trong trường hợp số đếm thấp hoặc các trường hợp đặc biệt, kết quả được biểu thị theo quy định nêu trong TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007).

10 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết đề nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Phương pháp tách chiết ADN và phương pháp điện di

A.1 Hóa chất

A.1.1 Đệm CTAB

A.1.1.1 Thành phần đệm tách chiết ADN (đệm CTAB)

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 0,5 g

Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1,0 g

Tris (hydroxymethyl) amirromethane (Tris-base) 2,5 g

Sodium chloride (NaCl) 5,0 g

Nước cất 100 mL

A.1.1.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong nước đựng trong bình thủy tinh (6.2.1) và thêm nước đến 100 mL. Khử trùng ở 121 °C trong 15 min, sử dụng nồi hấp áp lực (6.1.2) và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.1.2 Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol (25:24:1)

A.1.2.1 Thành phần

Phenol	25 mL
Chloroform	24 mL
Isoamylalcohol	1 mL

A.1.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong bình thủy tinh (6.2.1) và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.1.3 Chloroform:Isoamylalcohol (24:1)

A.1.3.1 Thành phần

Chloroform 24 mL.

Isoamylalcohol 1 mL

A.1.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong bình thủy tinh (6.2.1) và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2 Cách tiến hành

A.2.1 Phương pháp tách chiết ADN

Chuẩn bị mẫu ADN tổng số: Tản nấm được lấy vào ống ly tâm 2 mL (6.2.11) chứa 1 mL đệm chiết CTAB. Trộn đều bằng máy trộn Vortex (6.1.6) sau đó ủ mẫu ở 95 °C trong 5 min, tiếp tục ủ mẫu ở 65 °C trong 20 min. Trong quá trình ủ mẫu, cứ 1 min đến 2 min đào trộn đều một lần. Bổ sung hỗn hợp Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol (25:24:1) theo tỷ lệ 1:1 (tính theo thể tích đệm thu được trước đó so với hỗn hợp 25:24:1). Trộn đều tạo huyền phù, ly tâm dung dịch huyền phù bằng máy ly tâm (6.1.15) với tốc độ 13 700 r/min ở 4 °C trong 8 min. Hút dịch nồi phía trên, bổ sung hỗn hợp Chloroform:Isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1 (tính theo thể tích đệm thu được trước đó). Trộn đều bằng máy trộn vortex (6.1.6), ly tâm ở 13 700 r/min (6.1.15) ở 4 °C trong 10 min. Chuyền dịch nổi vào ống ly tâm mới (6.2.11). Bổ sung ethanol tuyệt đối (ethanol lạnh) với tỷ lệ 2 ethanol:1 đệm thu được trước đó. Nhẹ nhàng đảo trộn đều rồi ly tâm ở 10 000 r/min (6.1.15), 4 °C trong 7 min. Loại bỏ dịch nổi phía trên, rửa kết tủa ADN với 500 µL dung, dịch ethanol 70 %. Ly tâm 5 400 r/min (6.1.15) ở 4 °C trong 5 min, sau đó loại bỏ dịch nổi phía trên và để khô trong không khí. Hoà tan kết tủa trong 50 µL đến 100 µL đệm TE. Bảo quản ADN sau khi tách chiết ở - 20 °C.

ADN sau tách chiết được xác định hàm lượng và độ tinh sạch sử dụng phương pháp đo quang phổ bằng máy đo nồng độ ADN (6.1.13) và điện di trên gel agarose 1,0 %. Nồng độ ADN thu được giá trị tối thiểu là 20 ng trong 1 µL dịch ADN, giá trị A260/280 ≥ 1,8; A260/230 trong khoảng 2,0 đến 2,2.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các phương pháp tách chiết ADN khác hoặc sử dụng kit tách chiết có sẵn trên thị trường để thu được sản phẩm ADN tương tự.

A.2.2 Phương pháp điện di

Chạy điện di trên gel agarose 1,5 % với dòng điện có hiệu điện thế 90 V trong 40 min bằng hệ thống máy điện di ngang ADN (6.1.10). Kích thước của sản phẩm PCR được so sánh với thang chuẩn ADN 100 bp (ADN ladder). Sau chạy điện di, gel agarose được đặt dưới tia UV của máy chụp ảnh gel điện di (6.1.11). Nếu mẫu phản ứng cho sản phẩm đặc hiệu đúng kích thước của gen (endochitinase = 760 bp) thì khẳng định mẫu nấm đó là nấm Trichoderma koningii. Nếu mẫu phản ứng không có sản phẩm đặc hiệu thì khẳng định mẫu nấm đó không phải là Trichoderma koningii.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Đặc điểm hình thái và phản ứng PCR khuếch đại gen endochitinase phát hiện Trichoderma koningii

B.1 Đặc điểm phân biệt của nấm Trichoderma koningii với các loài nấm khác trên môi trường DRBC

Chủng nấm	Hình thái khuẩn lạc trên môi trường DRBC	Màu sắc khuẩn lạc	Cấu trúc bề mặt khuẩn lạc	Đặc điểm bào tử	Đặc điểm sợi nấm	Thể bình
Trichoderma koningii	Khuẩn lạc phát triển nhanh, kết cấu dạng bông, lan rộng.	Khuẩn lạc hình tròn, ban đầu có màu trắng hoặc trắng, nhạt, sáu 3 đến 4 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc phát triển với màu sắc, trắng mịn trên bề mặt	Nhung mịn, đều, không có gợn sóng ro rệt	Bào tử hình elip hoặc tròn, kích thước 3 µm đến 5 µm, màu xanh nhạt (có thể trong suốt). Đôi khi sắp xếp thành chuỗi hoặc cụm nhỏ.	Sợi nấm không màu, phân nhánh mạnh, mỏng.	Thể bình dạng phình ở gốc và nhọn dần về đầu, tạo chùm hình cầu.
Trichoderma viride	Khuẩn lạc phát triển chậm, kết cấu xốp, hơi thô, lan rộng vừa phải.	Khuẩn lạc hình tròn, cổ màu xanh lá cây đậm ở trung tâm, xung quanh viền ngoài màu xanh nhạt	Bề mặt khuẩn lạc xù xì, có gợn sóng nhẹ.	Bào tử elip, 3 µm đến 6 µm, xanh lục đậm khi trưởng thành. Thường sắp xếp thành cụm hoặc rải rác.	Sợi nấm không màu, phân nhánh đều, hơi dày hơn so với T. koningii.	Thể bình thon dài, cong nhẹ, tạo thành cấu trúc giống như chùm hoa.
Trichoderma harzianum	Phát triển mạnh, khuẩn lạc dày đăc, kết cấu xốp, lan rộng nhanh chóng.	Khuẩn lạc màu xanh ngả vàng, viền khuẩn lặc có màu xanh hơi ngả sang trắng	Bề mặt xù xì, gợn sóng	Bào tử hình cầu, 3 µm đến 4 µm, màu xanh nhạt hoặc xanh, vàng. Thường sắp xếp thành cụm dày đặc.	Sợi nấm không màu, dày, ngắn phân nhánh.	Thể bình ngắn, tạo thành cấu trúc chùm, gốc phình rộng và đầu nhọn.
Trichoderma atroviride	Phát triển vừa phải, khuẩn lạc hơi gồ ghề, dày ở trung tâm.	Khuẩn lạc màu xanh đen, viền ngoài màu nhạt hơn.	Bề mặt thô ráp, có các nếp gấp rõ rệt.	Bào tử elip, kích thước 2 µm đến 4 µm, màu xanh đậm. Thường sắp xếp rời rạc hoặc cụm nhỏ.	Sợi nấm không màu, dày, nhẵn, ít phân nhánh.	Thể bình dạng hình chai, gốc rộng, dính nhọn, sắp xếp chặt thành nhóm.
Trichoderma viridescens	Phát triển chậm, khuẩn lạc lan rộng, kết cau mỏng.	Xanh lá cây nhạt, viền ngoài có màu trắng.	Mịn hoặc hơi xù xì, không có gợn sóng ro.	Bào tử hình cầu, 2 µm đến 4 µm, xanh lá cây nhạt. Sắp xếp rời rạc, không theo cấu trúc cụ thể	Sợi nấm không màu, phân nhánh ít, mỏng và ngắn.	Thệ bình nhỏ, ngắn và phình ở gốc, tạo thành các cụm nhỏ hình cầu.
Trichoderma asperellum	Khuẩn lạc phát triển nhanh, dày, lan rộng mạnh.	Xanh nhạt hoặc xanh lá cây đậm, viền ngoài mỏng.	Nhẵn mịn, đồng nhất.	Bào tử hình cầu nhỏ, 2 µm đến 3 µm, màu xanh nhạt. Đôi khi sắp xếp thành chuỗi hoặc cụm nhỏ.	Sợi nấm không màu, mịn, phân nhánh tốt.	Thể bình thon dài, gốc nhỏ, sắp xếp dày đặc thành các cụm hình cầu nhỏ.

B.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Trichoderma koningii NBRC 105940

Hình B.1 - A: Tản nấm nuôi cấy ở 25 °C trong 10 ngày, B: Khuẩn lạc được phân lập từ các mẫu thử sau 48 h nuôi cấy ở 25 °C.

B.3 Đặc điểm hình thái bào tử nấm Trichoderma koningii NBRC 105940

Hình B.2 - Bào tử của nấm Trichoderma koningii NBRC 105940 ở độ phóng đại 400X

(Conidia: bào tử; Phialides: thể bình)

B.4 Sản phẩm PCR với cặp mồi KoniF và KoniR của gen endochitinase của nấm Trichoderma koningii NBRC 105940

Hình B.3 - Sản phẩm chạy điện di trên gel agarose 1,5% sản phẩm PCR với mồi KoniF và KoniR

(Thiết kế trên vùng gen endochitinase kích thước băng vạch 760 bp)

CHÚ THÍCH: Giếng M: thang chuẩn ADN 100 bp; giếng 1: đối chứng trắng; giếng 2: Trichoderma viride NBRC 30546; giếng 3: Trichoderma viride V1; giếng 4: Trichoderma viridescen NBRC 110191; giếng 5: Trichoderma harzianum NBRC 104616; giếng 6: Trichoderma asperellum TR1; giếng 7: Trichoderma asperellum TR2; giếng 8: Trichoderma reesei TR4; giếng 9: Trichoderma hazianum TR5; giếng 10: Trichoderma reesei TR6; giếng 11: Metarhizium anisopliae; giếng 12: Fusarium graminearum N2; giếng 13: Fusarium solani N3; giếng 14: Fusarium sp. N6; giếng 15, 16, 17, 18: Trichoderma koningii NBRC 105940; giếng 19, 20, 21, 22: Trichoderma koningii VNUA11.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Dương Văn Hoàn, Tạ Hà Trang, Nguyễn Thị Thu, Trần Thị Đào, Nguyễn Xuân Trường và Nguyễn Xuân Cảnh. Ứng dụng ADN barcode kết hợp hình thái học trong nhận dạng Trichoderma koningii và Trichoderma viride. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. T12/2024: 126-133.

[2] TCVN 7682:2007 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi Polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính.

[3] TCVN 6507-1 (ISO 6687-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân.

[4] TCVN 12017:2017, Thuốc bảo vệ thực vật - Lấy mẫu.

[5] TCVN 13613:2022, Phần bón - Phương pháp dính lượng Trichoderma spp. - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

[6] Druzhinina, I.S., Kopchinskiy, A.G., and Kubicek, C.P. (2006). The first 100 Trichoderma species characterized by molecular data. Mycoscience. 47(2): 55-64.

[7] Harman, G.E., Howell, C.R., Viterbo, A., Chet, I., and Lorito, M. (2004). Trichoderma species - opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature reviews microbiology. 2(1): 43-56.

[8] Samuels, G.J., Dodd, S.L., Lu, B.-S., Petrini, O., Schroers, H.-J-, and Druzhinina, L.S. (2006). The Trichoderma koningii aggregate species. Studies in mycology. 56(1): 67-133.

[9] Sharma, P., Saravanan, K., Ramesh, R., Kumar, P.V., Singh, D., Sharma, M., Henry, M.S., and Deep, s. (2012). Cloning and semi-quantitative expression of endochitinase (ech42) gene from Trichoderma spp. African Journal of.Biotechnology. 11(66): 12930-12938.