Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 12974:2020 ISO 21150:2015 Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Phát hiện E.coli

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12974:2020

ISO 21150:2015

MỸ PHẨM - VI SINH VẬT - PHÁT HIỆN E.COLI

Cosmetics - Microbiology - Detection of Escherichia coli

Lời nói đầu

TCVN 12974:2020 hoàn toàn tương đương với ISO 21150:2015.

TCVN 12974 :2020 do Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 217 Mỹ phẩm biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Kiểm tra vi sinh vật của sản phẩm mỹ phẩm được thực hiện theo phép phân tích nguy cơ vi sinh vật thích hợp để đảm bảo vấn đề an toàn và chất lượng đối với khách hàng.

Phân tích nguy cơ vi sinh vật phụ thuộc vào một số thông số sau:

- sự biến đổi tiềm ẩn của sản phẩm mỹ phẩm;

- khả năng gây bệnh của các vi sinh vật;

- vùng áp dụng sản phẩm mỹ phẩm (tóc, da, mắt, màng nhầy);

- người sử dụng (người trường thành, trẻ em dưới 3 tuổi).

Đối với các mỹ phẩm và các sản phẩm sử dụng tại chỗ, phát hiện khả năng gây bệnh về da như tụ cầu khuẩn aureus, trực khuẩn St. aeruginosa và nấm Candida albican có thể có liên quan do chúng có thể gây nhiễm trùng da và mắt. Phát hiện các loại vi sinh vật khác có thể cần thiết do những vi sinh vật này (bao gồm các chỉ số nhiễm phân như vi khuẩn E.coli) không đảm bảo về vệ sinh trong quá trình sản xuất.

MỸ PHẨM - VI SINH VẬT - PHÁT HIỆN E.COLI

Cosmetics - Microbiology - Detection of Escherichia coli

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn chung về phát hiện và nhận dạng vi sinh vật E.coli trong các sản phẩm mỹ phẩm. Các vi sinh vật được xác định trong tiêu chuẩn này có thể khác nhau theo quy định và thực tiễn của mỗi quốc gia.

Để đảm bảo an toàn và chất lượng sản phẩm cho người sử dụng, cần thực hiện phân tích nguy cơ về vi sinh vật thích hợp theo tiêu chuẩn này. Các sản phẩm có nguy cơ nhiễm vi sinh vật thấp (xem ISO 29621) bao gồm các sản phẩm có hoạt tính nước thấp, các sản phẩm nước-ancol, giá trị pH cao, v.v...

Phương pháp đề cập trong tiêu chuẩn này được dựa trên sự phát hiện E.coli trong môi trường chất lỏng không chọn lọc (canh thang tăng sinh), sau đó phân lập ở môi trường thạch chọn lọc. Các phương pháp khác có thể phù hợp, tùy thuộc vào mức độ phát hiện được yêu cầu.

CHÚ THÍCH: Để phát hiện E.coli, có thể thực hiện cấy chuyển trên môi trường nuôi cấy không chọn lọc theo các bước xác định phù hợp (ví dụ sử dụng các kit nhận dạng).

Do tính đa dạng lớn của các sản phẩm mỹ phẩm trong lĩnh vực áp dụng, phương pháp này có thể không phũ hợp với một số sán phẩm theo từng khía cạnh (ví dụ các sản phẩm cụ thể không trộn lẫn được nước). Các tiêu chuẩn khác (ISO 18415) có thể phù hợp. Các phương pháp khác (ví dụ tự động hóa) có thể được thay thế cho phép thử được nêu ở đây miễn là chứng minh được tính tương quan hoặc phù hợp.

2  Tài liệu viện dẵn

Các tài liệu viện dẫn sau đây là cần thiết để áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

ISO 21148:2005, Cosmetics - Microbiology - General instructions for microbiological examination (Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Các hướng dẫn chung đối với kiểm tra vi sinh vật)

EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics - Preservation of test organisms used for the determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal (including bacteriophages) activity [Hóa chất khử trùng và tẩy trùng - Bảo quản sinh vật thử nghiệm được sử dụng để xác định hoạt tính diệt khuẩn (bao gồm legionella), diệt khuẩn hình que, diệt bào tử, diệt nấm và diệt virut (bao gồm vật ăn vi khuẩn/thể thực phẩm]

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau.

3.1

Sản phẩm (product)

Phần sản phẩm mỹ phẩm xác định được nhận trong phòng thử nghiệm để thử nghiệm.

3.2

Mẫu thử (sample)

Phần sản phẩm (ít nhất 1 g hoặc 1 mL) được sử dụng trong thử nghiệm để chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu.

3.3

Dung dịch huyền phù ban đầu (initial suspension)

Dung dịch huyền phù (hoặc dung dịch) của mẫu trong dung tích xác định của canh thang tăng sinh phù hợp.

3.4

Pha loãng mẫu (sample dilution)

Pha loãng dung dịch huyền phù ban đầu.

3.5

Vi sinh vật xác định (specified microorganism)

Nấm men hoặc vi khuẩn hiếu khí không mong muốn trong sản phẩm mỹ phẩm và được công nhận là các loại gây bệnh về da có thể có hại đối với sức khỏe con người hoặc là chỉ số thể hiện mất vệ sinh trong quá trình sản xuất.

3.6

E.coli (Escherichia coli)

Vi khuẩn gram âm, hình que có khả năng di động, khuẩn lạc trơn bóng.

CHÚ THÍCH 1: Các đặc tính chính đối với việc xác định là catalase dương tính, oxidase âm tính, lên men lactoza, sinh ra indole, sự tăng trưởng trên môi trường chọn lọc có chứa muối mặt có khuẩn lạc đặc trưng.

CHÚ THÍCH 2: E.coli có thể được phân lập từ nguồn môi trường ẩm ướt (không khí, nước, đất) và là chỉ số nhiễm phân.

3.7

Canh thang tăng sinh (enrichment broth)

Môi trường chất lỏng không chọn lọc có chứa các chất trung hòa phù hợp và/hoặc các chất gây phân tán và được chứng minh là phù hợp với sản phẩm thử nghiệm

4  Nguyên tắc

Bước đầu tiên của quy trình là thực hiện tăng sinh bằng cách sử dụng môi trường canh thang không chọn lọc để tăng số lượng các vi sinh vật mà không gây ra nguy cơ ức chế bởi các thành phần chọn lọc có trong môi trường tăng trưởng chọn lọc/phân biệt

Bước thứ hai của thử nghiệm (phân lập) là thử nghiệm được thực hiện trên môi trường chọn lọc sau thử nghiệm nhận dạng.

Các yếu tố có khả năng gây ức chế sự tăng trưởng vi khuẩn trong mẫu thử phải được trung hòa để cho phép phát hiện sự có mặt của các vi sinh vật ^[1]. Trong tất cả các trường hợp và bất kỳ phương pháp nào, trung hòa các đặc tính kháng khuẩn của sản phẩm phải được kiểm tra và chứng minh (xem Điều 11).

5  Dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

5.1  Yêu cầu chung

Các hướng dẫn chung được nêu trong ISO 21148. Khi nước được đề cập trong tiêu chuẩn này, sử dụng nước cất hoặc nước tinh khiết như được quy định trong ISO 21148.

Canh thang tăng sinh được sử dụng để phân tán mẫu và tăng số lượng vi khuẩn ban đầu. Canh thang có thể chứa chất trung hòa nếu mẫu thử dùng để thử nghiệm có các đặc tính kháng khuẩn. Tính hiệu quả của trung hòa hóa phải được chứng minh (xem Điều 11). Thông tin liên quan đến các chất trung hòa phù hợp được nêu tại Phụ lục B.

Canh thang tăng sinh (5.3.3.1) hoặc bất kỳ loại nào được nêu trong Phụ lục A là hoàn toàn phù hợp để kiểm tra sự có mặt của E.coli với các điều kiện được cung cấp trong tiêu chuẩn này miễn là chúng đã được chứng minh là phù hợp với Điều 11.

Các dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy khác có thể được sử dụng nếu được chứng minh là phù hợp để sử dụng.

5.2  Dung dịch pha loãng dùng cho dung dịch huyền phù vi khuẩn (dung dịch natri clorua tryptone)

5.2.1  Quy định chung

Dung dịch pha loãng được sử dụng để chuẩn bị dung dịch huyền phù vi khuẩn được sử dụng đối với quy trình thử nghiệm tính phù hợp (xem Điều 11).

5.2.2  Thành phần

- tryptone, casein pancreatic 1,0 g

- natri clorua 8,5 g

- nước 1000 mL

5.2.3  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách trộn trong khi gia nhiệt. Rót vào các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min.

Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương với 7,0 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

5.3  Môi trường nuôi cấy

5.3.1  Quy định chung

Môi trường nuôi cấy có thể được chuẩn bị sử dụng các mô tả cung cấp dưới đây hoặc từ môi trường nuôi cấy khô, theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất, cần tuân theo các chỉ dẫn do nhà cung cấp môi trường nuôi cấy cung cấp.

CHÚ THÍCH: Môi trường sẵn sàng để sử dụng có thể được sử dụng khi hiệu suất tăng trưởng và/hoặc thành phần của chúng có thể so sánh được với công thức được đưa ra trong tài liệu này.

5.3.2  Môi trường thạch đối với thử nghiệm tính phù hợp (xem Điều 11) [môi trường thạch phân loại đậu tương - casein (SCDA) hoặc thạch đậu tương tripsin (TSA)]

5.3.2.1  Thành phần

- casein pancreatic 15,0 g

- bột đậu tương thủy phân bởi papaic 5,0 g

- natri clorua 5,0 g

- thạch 15,0 g

- nước 1000 mL

5.3.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường đã khử nước hoàn toàn trong nước bằng cách trộn trong khi gia nhiệt. Rót môi trường vào các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min

Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương với 7,3 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

5.3.3  Canh thang tăng sinh

5.3.3.1  Canh thang eugon LT 100

5.3.3.1.1  Quy định chung

Môi trường này chứa các thành phần trung hòa các chất ức chế có trong mẫu: lecithin và polysorbate 80 và chất phân tán: octoxynol 9.

5.3.3.1.2  Thành phần

5.3.3.1.3  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần, polysorbate 80, octoxynoi 9 và lecithin trứng lần lượt trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần khác bằng cách trộn trong khi gia nhiệt.

Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương với 7,0 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

5.3.3.2  Các canh thang tăng sinh khác

Các môi trường tăng sinh khác có thể được sử dụng nếu phù hợp (xem Phụ lục A)

5.3.4  Môi trường thạch chọn lọc để phân lập E.coli

5.3.4.1  Môi trường thạch MacConkey

5.3.4.1.1  Thành phần

5.3.4.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan tất cả các thành phần cứng trong nước và đun sôi trong một phút để đạt được dung dịch hiệu quả.

Rót vào các bình chứa phù hợp và khử trùng tại 121 °C trong 15 min.

Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương với 7,1 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

5.3.5  Môi trường thạch chọn lọc để xác định E.coli

5.3.5.1  Môi trường thạch xanh methylene - levine eosin

5.3.5.1.1  Thành phần

5.3.5.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan gelatin pancreatic, kali hydro photphat và thạch trong nước, cùng với làm ấm và để nguội. Ngay trước khi sử dụng, hóa lỏng dung dịch thạch dạng keo, cho thêm các thành phần khác, như các dung dịch theo lượng sau và trộn; đối với mỗi 100 mL dung dịch thạch hóa lỏng

- 5 mL dung dịch lactose 20 %

- 2 mL dung dịch eosin Y 2 %

- 2 mL dung dịch xanh methylen 0,033 %

Môi trường hoàn thiện có thể không trong.

Rót vào các bình chứa phù hợp và khử trùng tại 121 °C trong 15 min.

Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương với 7,1 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

6  Thiết bị, dụng cụ và đồ thủy tinh

Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm, dụng cụ và đồ thủy tinh theo quy định tại ISO 21148.

7  Các chủng vi sinh vật

Đối với việc kiểm tra xác nhận tính phù hợp của các điều kiện thử nghiệm, các chủng đại diện sau được sử dụng:

E.coli ATCC1) 8739 [chủng tương đương: CIP2) 53.126 hoặc NCIMP3) 8545 hoặc NBRC4) 3972 hoặc KCTC5) 2571 hoặc chủng khác tương đương].

Việc nuôi cấy cần tuân theo các quy trình được cung cấp bởi do nhà cung cấp chủng chuẩn cung cấp. Chủng vi sinh vật có thể được lưu giữ trong phòng thử nghiệm theo EN 12353,^[12]

8  Xử lý các sản phẩm mỹ phẩm và mẫu phòng thử nghiệm

Nếu cần thiết, lưu giữ các sản phẩm được thử nghiệm tại nhiệt đô phòng.

Không ủ, làm lạnh hoặc cấp đông sản phẩm và mẫu trước hoặc sau khi phân tích.

Lấy mẫu các sản phẩm mỹ phẩm sẽ được phân tích cần được thực hiện theo ISO 21148. Phân tích mẫu theo ISO 21148 và theo quy trình ở Điều 9.

9  Cách tiến hành

9.1  Khuyến nghị chung

Sử dụng thiết bị, vật liệu khử trùng và kỹ thuật vô trùng để chuẩn bị mẫu, dung dịch huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng. Trong trường hợp chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu trong chất hòa tan phù hợp, thời gian trôi qua giữa giai đoạn kết thúc chuẩn bị và thời gian chất nuôi cấy tiếp xúc với canh thang tăng sinh phải nhiều hơn 45 min trừ khi được đề cập cụ thể trong điều khoản hoặc tài liệu đã thiết lập.

9.2  Chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu trong canh thang làm giàu

9.2.1  Quy định chung

Làm giàu được chuẩn bị từ mẫu (3.2) của ít nhất 1 g hoặc 1 ml mẫu thử sản phẩm được trộn kỹ theo điều kiện thử nghiệm mà được phân tán trong ít nhất 9 mL canh thang tăng sinh.

Ghi lại chính xác khối lượng hoặc dung tích của mẫu, S.

Phương pháp phải được kiểm tra để đảm bảo rằng thành phần (chất trung hòa đã được thêm vào) và dung tích canh thang thực hiện thỏa đáng (xem 11.3).

CHÚ THÍCH: Trong một số trường hợp và khi có thể, lọc sản phẩm mỹ phẩm qua màng sau khi ngâm trong canh thang tăng sinh tạo điều kiện cho sự trung hòa các đặc tính kháng khuẩn của sản phẩm (xem 11.3).

9.2.2  Các sản phẩm có thể trộn với nước

Cho mẫu, S, của sản phẩm vào bình chứa phù hợp có chứa dung tích canh thang phù hợp.

9.2.3  Các sản phẩm không trộn được với nước

Cho mẫu, S, của sản phẩm vào bình chừa phù hợp có chứa lượng phù hợp chất hòa tan (ví dụ Polysorbate 80).

Phân tán mẫu trong chất hòa tan và bổ sung dung tích canh thang phù hợp.

9.2.4  Các sản phẩm có thể lọc dược

Sử dụng bộ lọc với màng có kích cỡ lỗ danh định không lớn hơn 0,45 μm.

Chuyển mẫu, S, lên trên màng trong thiết bị lọc (xem ISO 21148). Lọc ngay và rửa màng sử dụng lượng nước và/hoặc chất pha loãng xác định.

Chuyển và ngâm màng vào trong ống hoặc bình có kích cỡ phù hợp có chứa lượng canh thang phù hợp.

9.3  Ủ canh thang tăng sinh cấy truyền

Ủ dung dịch huyền phù ban đầu đã được chuẩn bị trong canh thang (xem 9.2) tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong ít nhất 20 h (tối đa 72 h).

9.4  Phát hiện và nhận dạng E.coli

9.4.1  Phân lập

Sử dụng que cấy vòng đã tiệt trùng, ria một phần canh thang tăng sinh đã ủ (9.3) trên bề mặt của môi trường thạch MacConkey (5.3.4.1) để phân lập khuẩn lạc.

Lật ngược đĩa Petri và sau đó ủ tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong ít nhất 24 h (tối đa 48 h).

Kiểm tra các đặc tính của khuẩn lạc (xem Bảng 1).

Bảng 1 - Hình thái đặc tính của E.coli trên môi trường thạch MacConkey

9.4.2  Nhận dạng E.coli

9.4.2.1  Quy định chung

Thực hiện các thử nghiệm sau đối với các khuẩn lạc nghi ngờ được phân lập trên môi trường thạch MacConkey. Sự xuất hiện của E.coli có thể được xác nhận bởi các thử nghiệm nuôi cấy và sinh hóa phù hợp khác.

9.4.2.2  Vết gram

Thực hiện thử nghiệm được xác định trong ISO 21148. Kiểm tra que gram âm (bacilli).

9.4.2.3  Nuôi cấy trên môi trường thạch xanh methylene - levine eosin (môi trường thạch EMB)

Cấy truyền trên bề mặt của môi trường thạch xanh methylene - levine eosin với các khuẩn lạc phân lập nghi ngờ phát triển trên môi trường thạch MacConkey sao cho các khuẩn lạc phân lập phát triển. Lật ngược đĩa Patri và sau đó ủ tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong ít nhất 24 h (tối đa 48 h).

Kiểm tra các đặc tính của khuẩn lạc như được xác định trong Bảng 2.

Bảng 2 - Hình thái đặc tính của E.coli trên môi trường thạch xanh methylene - levine eosin

10  Biểu thị kết quả (phát hiện E.coli)

Nếu việc nhận dạng các khuẩn lạc khẳng định sự có mặt của các chủng này, biểu thị kết quả là:

- “Có E.coli trong mẫu S”

Nếu không quan sát thấy có sự tăng trưởng sau khi làm giàu quan sát hoặc nhận diện các khuẩn lạc không khẳng định sự có mặt của các chủng này, biểu thị kết quả là:

- “Không có E.coli trong mẫu S”

11  Trung hòa hóa các đặc tính kháng khuẩn của sản phẩm

11.1  Quy định chung

Các thử nghiệm khác nhau trong 11.2 đến 11.3 cho thấy rằng vi sinh vật có thể phát triển theo các điều kiện phân tích.

11.2  Chuẩn bị chất để cấy

Trước khi thử nghiệm, cấy bề mặt thạch loại đậu tương-casein (SCDA) hoặc thạch đậu tương triptic (TSA) (5.3.2) hoặc môi trường phù hợp khác (không chọn lọc, không trung hòa) với E.coli. ủ đĩa tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong 18 h đến 24 h.

Để thu hoạch chủng cấy sử dụng que cấy vòng đã tiệt trùng, vệt bề mặt nuôi cấy và cho vào lại trong dung dịch pha loãng (5.2) để nhận được dung dịch huyền phù hiệu chuẩn khoảng 1 x 10⁸ CFU trên mL (ví dụ sử dụng thiết bị đo quang phổ, ISO 21148:2005, Phụ lục C).

Sử dụng dung dịch huyền phù đã được hiệu chuẩn này và dung dịch pha loãng của nó trong 2 h

11.3  Tính phù hợp của phương pháp phát hiện

11.3.1  Cách tiến hành

11.3.1.1  Trong các ống có 9 mL dung dịch pha loãng (5.2), chuẩn bị dung dịch pha loãng của dung dịch huyền phù đã được hiệu chuẩn (11.2) để nhận được lần đếm cuối cùng trong khoảng 100 CFU/mL và 500 CFU/mL. Để đếm nồng độ cuối cùng của các vi sinh vật có thể phát triển trong dung dịch huyền phù đã được hiệu chuẩn pha loãng, cho 1 mL dung dịch huyền phù vào trong đĩa Petri và rót 15 mL đến 20 mL môi trường thạch nóng chảy (5.3.2) được giữ trong bồn cách thủy tại nhiệt độ không lớn hơn 48 °C. Để đông đặc và sau đó ủ tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong 20 h đến 24 h.

11.3.1.2  Chuẩn bị hai dung dịch huyền phù ban đầu giống nhau (9.2) theo các điều kiện đã chọn đối với thử nghiệm (ít nhất 1 g hoặc 1 mL sản phẩm theo thử nghiệm, thể tích xác định của canh thang làm giàu) trong ống hoặc bình. Khi sử dụng phương pháp lọc màng (9.2.4), lọc hai lần mỗi lần ít nhất 1 mL sản phẩm thử nghiệm và cho mỗi màng vào trong ống hoặc bình có chứa canh thang tăng sinh theo các điều kiện được chọn cho thử nghiệm.

11.3.1.3  Đưa vô trùng 0,1 mL dung dịch huyền phù hiệu chuẩn pha loãng vô trùng các vi sinh vật vào một ống hoặc bình (phép thử thích hợp). Trộn sau đó ủ cả ống hoặc bình (thử nghiệm tính phù hợp và kiểm soát không cấy truyền) tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong 20 h đến 24 h.

11.3.1.4  Thực hiện phân lập đối với mỗi ống hoặc bình (phép thử thích hợp và kiểm soát không cấy). Sử dụng que cấy, lấy một vết (cùng các điều kiện như trong thử nghiệm) của hỗn hợp ủ trên bề mặt môi trường thạch MacConkey (xấp xỉ 15 mL đến 20 mL) trong đĩa Petri (đường kính 85 mm đến 100 mm). Ủ đĩa tại 32,5 °C ± 2,5 °C trong 24 h đến 48 h.

11.3.2  Diễn giải kết quả thử nghiệm tính phù hợp

Kiểm tra dung dịch pha loãng của dung dịch huyền phù đã hiệu chuẩn của vi khuẩn chứa trong khoảng 100 CFU/mL và 500 CFU/mL.

Tính trung hòa hóa được kiểm tra xác nhận và phương pháp phát hiện đáp ứng yêu cầu nếu đặc tính tăng trưởng của E.coli xảy ra trên đĩa thử nghiệm tính phù hợp và không có sự tăng trưởng xảy ra trên đĩa kiểm soát.

Khi sự tăng trưởng được phát hiện trên đĩa kiểm soát (các sản phẩm nhiễm khuẩn), trung hòa hóa được kiểm tra xác nhận và phương pháp phát hiện đáp ứng yêu cầu nếu E.coli được phục hồi trên đĩa thử nghiệm tính phù hợp.

Không có sự tăng trưởng trên đĩa thử nghiệm tính phù hợp cho thấy hoạt tính kháng vi khuẩn vẫn có mặt và cần chỉnh sửa các điều kiện của phương pháp bằng cách tăng thể tích canh thang, số lượng sản phẩm vẫn giữ như cũ hoặc bằng cách hợp nhất một số lượng đủ chất khử hoạt tính trong canh thang làm giàu hoặc bằng cách kết hợp các sửa đổi phù hợp để cho phép sinh trưởng E.coli.

Nếu mặc dù hợp nhất các chất khử hoạt tính phù hợp và tăng đáng kể thể tích canh thang làm giàu vẫn không thể hồi phục nuôi cấy phát triển như mô tả ở trên, cho thấy gần như không bị nhiễm khuẩn E.coli.

12  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải quy định cụ thể các thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này, nghĩa là TCVN 12974:2020 (ISO 21150:2015);

b) Tất cả thông tin cần thiết để nhận dạng hoàn toàn sản phẩm;

c) Phương pháp sử dụng;

d) Các kết quả đạt được;

e) Tất cả chi tiết hoạt động đối với chuẩn bị dung dịch huyền phù ban đầu;

f) Mô tả phương pháp sử dụng chất trung hòa và môi trường;

g) Chứng minh tính phù hợp của phương pháp, thậm chí nếu thử nghiệm đã được thực hiện tách biệt;

h) Bất kỳ điểm nào không quy định trong tài liệu này hoặc được coi là tùy chọn cùng với các chi tiết của bất kỳ sự cố nào có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Các canh thang tăng sinh khác

A.1  Môi trường lactose lỏng có chất trung hòa và phân tán

Môi trường này có chứa các thành phần

- trung hòa các chất ức chế có trong mẫu: lecithin và polysorbate 80 và

- chất phân tán: octoxynol 9

A.1.1  Thành phần

A.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần, polysorbate 80, octoxynol 9 và lecithin trứng, lần lượt trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần khác bằng cách trộn trong khi gia nhiệt. Phân tán môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Để nguội môi trường càng nhanh càng tốt sau khi khử trùng. Độ pH phải tương đương 6,9 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

A.2  Môi trường lactose lỏng

A.2.1  Thành phần

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước. Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121°C trong 15 min. Để nguội môi trường càng nhanh càng tốt sau khi khử trùng. Độ pH phải tương đương 6,9 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

A.3  Môi trường đậu tương - casein - loại - lecithin - polysorbate 80 (canh thang SCDLP 80)

A.3.1  Thành phần

A.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan tất cả các thành phần hoặc môi trường hoàn toàn khử nước lần lượt trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương 7,2 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

A.4  Canh thang trung hòa D/E (canh thang trung hòa Dey/Engley)

A.4.1  Thành phần

A.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan tất cả các thành phần hoặc môi trường hoàn toàn khử nước lần lượt trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương 7,6 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

A.5  Canh thang letheen cải biến

A.5.1  Thành phần

A.5.2  Chuẩn bị

Hòa tan lần lượt polysorbate 80 và lecithin trong nước sôi cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Hòa tan các thành phần khác bằng cách trộn trong khi gia nhiệt. Trộn nhẹ để tránh tạo bọt. Rót môi trường trong các bình chứa phù hợp. Khử trùng trong nồi hấp tại 121 °C trong 15 min. Sau khi khử trùng và để nguội, độ pH phải tương đương 7,2 ± 0,2 khi đo tại nhiệt độ phòng.

Phụ lục B

(tham khảo)

Các chất trung hòa có hoạt tính khử vi khuẩn của chất bảo quản và dung dịch rửa

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] COLIPA. Guidelines on microbial quality management, published by the European cosmetic, Toiletry and Perfumery Association, 1997 (Hướng dẫn quản lý chất lượng vi khuẩn, Hiệp hội nước hoa và mỹ phẩm Châu Âu xuất bản, 1997)

[2] CTFA. Microbiology guidelines, published by the cosmetic, toiletry and fragrance association ISBN 1-882621-32-8, 2007 (Hướng dẫn về vi sinh vật, Hiệp hội nước, hoa và mỹ phẩm ISBN 1-882621-32-8 xuất bản, 2007)

[3] EP., Microbiological examination of nnn-sterile products, 4th edition, published by the European pharmacopoeia, 2002 (Kiểm tra vi sinh vật của các sản phẩm không khử trùng, xuất bản lần thứ 4 bởi Dược điển Châu Âu, 2002)

[4] FDA. Bacteriological analytical manual, 8th edition, published by the u.s. Food and Drug Administration, 1995, http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23.html (Tài liệu phân tích vi khuẩn, xuất bản lần thứ 8 bởi Cục thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ, 1995, http://www. cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23. html)

[5] JP 14, General tests - Microbial limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001 (Các thử nghiệm chung - Thử nghiệm giới hạn vi khuẩn, xuất bản bởi Dược điển Nhật Bản, 2001)

[6] USP 28, Microbial limit test (61), published by the u.s. Pharmacopoeia, 2005 [Thử nghiệm giới hạn vi khuẩn (61) xuất bản bởi Dược điển Hoa Kỳ, 2005]

[7] ATLAS R.M. Handbook of microbiological media. CRC Press, 1993 (Sách về Môi trường vi sinh vật. CRC Press, 1993)

[8] SINGER S. The use of preservative neutralizers in diluents and plating media. Cosmetics and toiletries. 1987 December, 102 p. 55 (Sử dụng các chất trung hòa bảo quản trong chất làm loãng và môi trường cấy. Mỹ phẩm và nước hoa. Tháng 12 năm 1987, 102 trang 55)

[9] ISO 21149, Cosmetics - Microbiology - Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria (Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Đếm và phát hiện vi khuẩn hiếu khí)

[10] ISO 18415, Cosmetics - Microbiology - Detection of specified and non-specified microorganisms (Mỹ phẩm - Vi sinh vật Phát hiện các vi sinh vật xác định và không xác định)

[11] EN 1040, Chemical disinfectants and antiseptics - Basic bactericidal activity - Test method and requirements (phase 1) [Chất tẩy uế và chất khử trùng hóa học - Hoạt tính vi khuẩn cơ bản - Phương pháp thử và các yêu cầu (pha 1)]

[12] ISO 29621, Cosmetics - Microbiology - Guidelines for risk assessment and identification of microbiologically low-risk products (Mỹ phẩm - Vi sinh vật - Hướng dẫn đánh giá rủi ro và nhận dạng các sản phẩm có nguy cơ thấp nhiễm vi sinh vật)