Tiêu chuẩn TCVN 8710-25:2022 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng ở hàu

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-25:2022

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 25: BỆNH DO KÝ SINH TRÙNG BONAMIA OSTREAE VÀ BONAMIA EXITIOSA Ở HÀU

Aquatic animal diseases - Diagnostic procedure - Part 25: Infection with Bonamia ostreae and Bonamia exitiosa in oysters

Lời nói đầu

TCVN 8710-25:2022 do Chi cục Thú y vùng II, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau đây:

- TCVN 8710-1:2011, Phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm;

- TCVN 8710-2:2019, Phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển;

- TCVN 8710-3:2019, Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm;

- TCVN 8710-4:2019, Phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm;

- TCVN 8710-5:2011, Phần 5: Bệnh taura ở tôm he;

- TCVN 8710-6:2019, Phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép;

- TCVN 8710-7:2019, Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép;

- TCVN 8710-8:2012, Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm;

- TCVN 8710-9:2012, Phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm;

- TCVN 8710-10:2015, Phần 10: Bệnh do Perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-11:2015, Phần 11: Bệnh do Perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

- TCVN 8710-12:2019, Phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

- TCVN 8710-13:2015, Phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;

- TCVN 8710-14:2015, Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

- TCVN 8710-15:2015, Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas hydrophila ở cá;

- TCVN 8710-16:2016, Phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

- TCVN 8710-17:2016, Phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

- TCVN 8710-19:2019, Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

- TCVN 8710-20:2019, Phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

- TCVN 8710-21:2019, Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá;

- TCVN 8710-22:2022, Phần 22: Bệnh sán lá 16 móc ở cá;

- TCVN 8710-23:2022, Phần 23: Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu do IHNV ở cá hồi;

- TCVN 8710-24:2022, Phần 24: Bệnh do sán lá Dollfustrema sp. ở cá da trơn;

- TCVN 8710-25:2022, Phần 25: Bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu.

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 25: BỆNH DO KÝ SINH TRÙNG BONAMIA OSTREAE VÀ BONAMIA EXITIOSA Ở HÀU

Aquatic animal diseases - Diagnostic procedure - Part 25: Infection with Bonamia ostreae and Bonamia exitiosa in oysters

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa ở hàu.

2  Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1.1

Bệnh do Bonamia (Bonamiasis)

Bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng Bonamia sp. gây ra ở hàu; Bonamia ký sinh trong tế bào máu của hàu, gây rối loạn chức năng tế bào và gây chết hàu.

CHÚ THÍCH: Bonamia ostreae và Bonamia exitiosa là hai loài phổ biến của giống Bonamia gây bệnh ở hàu.

2.1.2

Bonamia sp

Ký sinh trùng đơn bào nguyên sinh bắt buộc, thuộc ngành Halosporidia.

CHÚ THÍCH: Bonamia sp. là những tế bào có thành mỏng, kích thước dao động từ 2 μm đến 5 μm, phát triển nhân lên trong tế bào máu theo cơ chế trực phân. Trong giai đoạn cảm nhiễm, có thể quan sát các tế bào này trong tế bào máu hoặc tế bào biểu mô liên kết như mang, màng áo, ruột.

2.2  Các từ viết tắt

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1  Etanol, từ 70 % đến 100 % (thể tích)

3.1.2  Dung dịch muối đệm phosphat

3.1.3  Dung dịch natri hydoroxit (NaOH), 1 N

3.1.4  Dung dịch axit clohydric (HCl), 1 N

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR và Realtime PCR

3.2.1  Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược (xem C.1, Phụ lục C)

3.2.2  Đoạn dò (xem C.1, Phụ lục C)

3.2.3  Kít tách chiết ADN (xem B.1, Phụ lục B).

3.2.4  Kít nhân gen cho phản ứng PCR

3.2.5  Kít nhân gen cho phản ứng Realtime PCR

3.2.6  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE (xem A.1, Phụ lục A).

3.2.7  Chất nhuộm màu, ví dụ: Gel red hoặc SYBR safe 1)

3.2.8  Chất đệm tải mẫu

3.2.9  Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.10  Thang chuẩn ADN (Ladder), phân vạch 100 bp

3.2.11  Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.12  Thạch agarose

3.2.13  Mẫu chuẩn dương, được chứng nhận là dương tính hoặc ADN chuẩn dương tách chiết từ mẫu chuẩn dương có giá trị Ct (Chu kỳ ngưỡng đã biết trước).

3.3  Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

3.3.1  Formalin, dung dịch 10 % (thể tích)

Pha dung dịch formaldehyd 38 % với dung dịch PBS (3.1.2) hoặc nước cất theo tỷ lệ thể tích 1:9.

3.3.2  Xylen

3.3.3  Dung dịch Davidson (xem A.2, Phụ lục A)

3.3.4  Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.3, Phụ lục A)

3.3.5  Thuốc nhuộm Eosin (xem A.4, Phụ lục A)

3.3.6  Parafin, có nhiệt độ tan chảy từ 56 °C đến 60 °C

3.3.7  Keo dán lamen (Bom Canada).

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1  Nồi hấp, có thể duy trì ở nhiệt độ 121 °C.

4.1.2  Tủ sấy, có thể duy trì ở nhiệt độ 180 °C.

4.1.3  Tủ hút khí độc

4.1.4  Tủ an toàn sinh học, cấp I, II

4.1.5  Máy đồng nhất mẫu

4.1.6  Tủ mát, có thể duy trì ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C

4.1.7  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ - 20 °C đến - 80 °C

4.1.8  Bể điều nhiệt, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 °C

4.1.9  Dao mổ, panh và kéo, vô trùng

4.1.10  Ống nghiệm vô trùng, dung tích 15 ml, 45 ml

4.1.11  Ống eppendorf, dung tích 1,5 ml

4.1.12  Túi lynon, vô trùng

4.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR, Realtime PCR

4.2.1  Máy nhân gen PCR

4.2.2  Máy Realtime PCR

4.2.3  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 15 000 rpm

4.2.4  Máy lắc trộn Vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 rpm đến 2 500 rpm

4.2.5  Máy ly tâm lắng (Spindown)

4.2.6  Hệ thống điện di, gồm bộ nguồn, lược tạo giếng và bể chạy điện di

4.2.7  Máy đọc gel

4.2.8  Ống PCR 0,2 ml, không có RNase/DNase

4.2.9  Ống eppendorf, không có RNase/DNase

4.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

4.3.1  Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể

4.3.2  Máy xử lý mẫu mô tự động

4.3.3  Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C

4.3.4  Khay sắt (loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể)

4.3.5  Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ - 10 °C đến 4 °C

4.3.6  Máy cắt tiêu bản, có thể cắt tiêu bản với độ dày từ 2 μm đến 5 μm

4.3.7  Bể điều nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C

4.3.8  Phiến kính, vô trùng

4.3.9  Lamen

4.3.10  Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20 X, 40 X và 100 X

4.3.11  Máy sấy mẫu

4.3.12  Lọ thủy tinh tối màu, dung tích 200 ml, có nút mài

4.3.13  Giấy lọc

4.3.14  Bút ghi kính.

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Dịch tễ học

Bonamia ostreae là nguyên nhân gây chết hàu hàng loạt tại các nước châu Âu (Pháp, Ai len, Ý, Hà Lan, Thổ Nhĩ Kì, Tây Ban Nha, Anh) và tại Canada, Mỹ, Úc và New Zealand.

Bonamia ostreae được phát hiện cảm nhiễm tự nhiên và có khả năng gây bệnh trên hàu Ostrea edulis, vật chủ trung gian của ký sinh trùng này là sao biển (Ophiothrix fragilis) và hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas).

Giai đoạn cảm nhiễm: Bonamia ostreae có thể cảm nhiễm ở các giai đoạn khác nhau của hàu, từ ấu trùng đến trưởng thành, tuy nhiên tỷ lệ nhiễm và cường độ cảm nhiễm trên hàu ở giai đoạn 6 tháng tuổi cao hơn các giai đoạn khác.

Bonamia exitiosa đã được phát hiện trên hàu ở New Zealand, Úc, Tây Ban Nha, Ý, Pháp và Anh. Các loài hàu Ostrea chilensis, O. angasi, O. edulis, O. stentina cảm nhiễm với B. exitiosa. Có nghiên cứu cho rằng hàu C. gigas đóng vai trò là kí chủ trung gian mang mầm bệnh B. exitiosa.

Giai đoạn cảm nhiễm: Hàu có chiều dài ≥ 58 mm thường bị nhiễm với Bonamia exitiosa, ấu trùng của hàu cũng có thể bị nhiễm Bonamia exitiosa.

Bệnh lan truyền theo trục ngang từ con mang mầm bệnh sang con khỏe hoặc từ giá thể hàu đã bị nhiễm mầm bệnh trước đó.

Tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ chết ở hàu do Bonamia có thể lên tới 80 %, tùy thuộc vào yếu tố thời tiết và điều kiện môi trường. Tỷ lệ và cường độ nhiễm Bonamia thường có xu hướng tăng trong điều kiện thời tiết ấm.

Hoạt động của tế bào đại thực bào đóng vai trò quan trọng để bảo vệ hàu chống lại tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, B. ostreae có thể sống sót và nhân lên trong tế bào đại thực bào, sản sinh độc tố và hủy hoại tế bào máu. Bonamia phát triển ra ngoài tế bào, gây rối loạn sinh lý tế bào và làm chết hàu.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Hầu hết các trường hợp nhiễm bệnh thường không thể hiện dấu hiệu lâm sàng. Hàu có biểu hiện sinh trưởng phát triển chậm. Khi cường độ nhiễm Bonamia ở mức cao, hàu mở vỏ và chết.

5.3  Bệnh tích

- Hàu gầy, thịt mỏng nhiều nước, tim to, co màng áo;

- Tuyến tiêu hóa nhợt màu, đôi khi có tổn thương tạo thành áp xe;

- Trong một số trường hợp, hàu bị nhiễm Bonamia xuất hiện màu sắc nhợt ngả vàng trên mang và màng áo.

- Quan sát mô học dưới kính hiển vi quang học cho thấy sự xâm nhập các tế bào máu tại các mô liên kết bị tổn thương như mang, màng áo, dạ dày, tuyến ruột. Có thể quan sát thấy ký sinh trùng trong các tế bào máu, hoặc tại các mô liên kết có kích thước rất nhỏ từ 2 μm đến 5 μm hình cầu hoặc hình ovan.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu, bảo quản mẫu

6.1.1  Lấy mẫu

Lấy những hàu còn sống, sắp chết hoặc mới chết.

- Hàu giống: Lấy từ 10 con đến 15 con cho vào túi lynon (4.1.12)

- Hàu trưởng thành: Lấy từ 5 con đến 10 con cho vào túi lynon (4.1.12).

Đối với mẫu dùng cho xét nghiệm vi thể: Dùng pank, kéo vô trùng cắt mẫu bệnh phẩm của mô mang, màng áo, tuyến tiêu hóa với kích thước khoảng 3 mm và cố định mẫu tại hiện trường trong dung dịch formalin 10 % (3.3.1) hoặc dung dịch Davidson (3.3.3).

6.1.2  Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C và vận chuyển tới phòng thí nghiệm trong vòng 24 h.

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (4.1.7), hoặc trong etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1).

Tất cả các mẫu phải được dán nhãn, ghi kí hiệu và gửi kèm theo phiếu gửi mẫu bệnh phẩm và các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của ca bệnh.

Đối với mẫu cho xét nghiệm vi thể, nếu không có dung dịch bảo quản mẫu cho xét nghiệm vi thể tại hiện trường thì vận chuyển sống cả con về phòng thí nghiệm (không được bảo quản trong điều kiện lạnh).

6.2  Phát hiện Bonamia bằng phương pháp Realtime PCR

6.2.1  Chuẩn bị mẫu

Đối với hàu còn sống hoặc chưa tách vỏ:

- Dùng dao mổ (4.1.9) cắt cơ, mở vỏ và tách làm hai. Dùng pank, kéo vô trùng cắt lấy khoảng 1 g mẫu bệnh phẩm từ mang, màng áo, ruột và các vị trí mô thương tổn khác.

- Mẫu được đồng nhất với dung dịch PBS (3.1.2) để tạo thành huyễn dịch 10 %. Mẫu được chia thành hai phần: Một phần cho thực hiện xét nghiệm và một phần lưu trữ trong tủ lạnh đông ở - 20 °C (4.1.7).

CHÚ THÍCH: Dùng panh, kéo vô trùng tại các mô khác nhau để tránh lây nhiễm.

6.2.2  Tách chiết ADN

- Hỗn dịch mẫu (6.2.1) dùng để tách chiết ADN. Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của kít sử dụng (tham khảo Phụ lục B). Mẫu ADN thu được dùng cho phản ứng Realtime PCR.

6.2.3  Chuẩn bị mồi, đoạn dò

Trình tự cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu cho Bonamia sp., B. ostreae và B. exitiosa (xem Bảng C.1, Phụ lục C). Cách chuẩn bị mồi và mẫu dò như sau:

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm bằng máy ly tâm nhanh 8 000 rpm (4.2.3) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò gốc ở nồng độ 100 μM.

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 μM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (20 μl mồi gốc và 80 μl dung dịch TE (3.2.9) hoặc nước tinh khiết không có nuclease).

6.2.4  Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã chuẩn bị (6.2.3) và pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) theo hướng dẫn của bộ kít (tham khảo Bảng C.2, Phụ lục C).

- Hỗn hợp nhân gen: Cho 20 μl vào mỗi ống PCR 0,2 ml (4.2.8);

- Mẫu đối chứng dương chuẩn (3.2.13): Cho 5 μl mẫu ADN vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước cất vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu xét nghiệm: Cho 5 μl ADN vừa tách chiết (6.2.2) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Trộn đều và ly tâm nhanh (4.2.5), đặt ống PCR vào máy Realtime PCR (4.2.2);

- Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt đã được cài đặt (xem Bảng C.3, Phụ lục C).

Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

CHÚ THÍCH: Để tiết kiệm chi phí xét nghiệm, sử dụng cặp mồi, mẫu dò phát hiện Bonamia sp. trước, nếu âm tính thì kết luận âm tính. Trường hợp dương tính, tiến hành xác định loài bằng các cặp mồi và mẫu dò đặc hiệu tương ứng.

6.2.5  Đánh giá kết quả

Phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct ≤ 30 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính;

2) Mẫu không có giá trị Ct là âm tính;

3) Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại. Nếu vẫn còn nghi ngờ, cần lấy mẫu lại để xét nghiệm kết hợp với điều tra dịch tễ học để đưa ra kết luận cuối cùng.

6.3  Phát hiện Bonamia bằng phương pháp PCR

6.3.1  Tách chiết ADN

Thực hiện theo 6.2.2.

6.3.2  Thực hiện phản ứng PCR

Phản ứng PCR phát hiện Bonamia sp. và xác định các loài B. ostreae và B. exitiosa. Các bước được thực hiện như sau:

- Chuẩn bị mồi ở nồng độ 15 μM với nước không có Dnase/Rnase: Thực hiện theo 6.2.3.

Trình tự mồi phát hiện Bonamia sp., B. ostreae và B. exitiosa (xem Bảng D.1, Phụ lục D). Pha hỗn hợp phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng (xem Bảng D.2, phụ lục D).

- Hỗn hợp nhân gen: Cho 17,5 μl vào mỗi ống PCR 0,2 ml (4.2.8);

- Mẫu đối chứng dương chuẩn (3.2.13): Cho 2,5 μl mẫu ADN vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 2,5 μl nước cất vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Mẫu xét nghiệm: Cho 2,5 μl ADN vừa tách chiết vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen;

- Trộn đều và ly tâm nhanh (4.2.5), đặt ống PCR vào máy PCR (4.2.1);

- Chạy phản ứng PCR theo chu trình nhiệt được cài đặt (xem Bảng D.3, Phụ lục D). Sản phẩm thu được sau phản ứng PCR đem điện di (xem 6.3.3) để đọc kết quả.

Mẫu đối chứng dương và đối chứng âm phải được tiến hành cùng với mẫu xét nghiệm.

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian của phản ứng PCR có thể thay đổi tùy theo kít nhân gen. Khi sử dụng các bộ kít khác nhau cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.3.3  Chạy điện di

6.3.3.1  Chuẩn bị thạch điện di

Cân 1,5 g thạch agarose (3.2.12) vào bình chứa 100 ml dung dịch 1 X TBE hoặc TAE (3.2.6). Đun bình chứa dung dịch trong lò vi sóng cho đến khi thạch agarose tan hoàn toàn. Khi dung dịch thạch nguội khoảng 50 °C, cho chất nhuộm màu (3.2.7) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó đổ thạch vào khay và cắm lược (4.2.6), độ dày bản gel khoảng 3 mm đến 4 mm, để thạch đông lại trong khoảng 1 h, rút lược ra. Cho dung dịch đệm TBE 1 X hoặc TAE 1 X (loại cùng với dung dịch pha thạch (3.2.6)) vào bể điện di cho đến khi bản gel được ngập hoàn toàn trong dung dịch.

6.3.3.2  Điện di

- Mẫu sau khi khuếch đại (6.3.2) được nhuộm với chất đệm tải mẫu (3.2.8) rồi trộn đều.

- Cho 2 μl ladder (3.2.10) vào giếng đầu tiên.

- Cho 5 μl đến 10 μl mẫu đối chứng dương, đối chứng âm và mẫu xét nghiệm vào các giếng tiếp theo.

- Tiến hành điện di trong khoảng 45 min ở hiệu điện thế 90 V đến 100 V.

Sau khi điện di xong, đặt gel đã điện di vào máy đọc gel (4.2.7) có bước sóng 590 nm để đọc kết quả.

6.3.3.3  Đọc kết quả

- Mẫu dương tính: Hiển thị vạch sản phẩm có kích thước giống với đối chứng dương (xem Bảng D1, Phụ lục D).

- Mẫu âm tính: Không có vạch sản phẩm, hoặc có hiển thị vạch sản phẩm nhưng có kích thước khác với đối chứng dương.

- Mẫu nghi ngờ: Hiển thị vạch sản phẩm không rõ, hoặc xuất hiện nhiều hơn một vạch sản phẩm so với đối chứng dương. Những mẫu nghi ngờ cần phải xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp Realtime PCR để khẳng định lại hoặc thu mẫu xét nghiệm lại, kết hợp với điều tra dịch tễ học để đưa ra kết luận cuối cùng.

Điều kiện của phản ứng:

Phản ứng PCR chỉ có giá trị khi đáp ứng các yêu cầu sau:

- Đối chứng dương: Dương tính với sản phẩm điện di có kích thước đã biết.

- Đối chứng âm: Âm tính và không có sản phẩm điện di.

6.4  Phát hiện Bonamia bằng phương pháp nhuộm HE

6.4.1  Chuẩn bị mẫu

Đối với hàu còn sống hoặc chưa tách vỏ:

- Dùng dao mổ vô trùng (4.1.9) cắt cơ mở vỏ ra và tách làm hai.

- Dùng pank, kéo vô trùng cắt mẫu bệnh phẩm của mô mang, màng áo, tuyến tiêu hóa với kích thước khoảng 3 mm. Mẫu cố định mẫu trong dung dịch Davidson (3.3.3) theo tỷ lệ 1:10 khoảng từ 24 h đến 72 h. Mẫu được chuyển sang cồn etanol 70 %.

CHÚ THÍCH: dùng panh, kéo vô trùng tại các mô khác nhau, tránh lây nhiễm.

6.4.2  Xử lý mẫu

Lấy bệnh phẩm (6.4.1; 6.1.1) đã cố định trong cồn hoặc Davidson cho vào khuôn nhựa (4.3.1).

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm etanol 70 % (3.1.1) trong thời gian từ 30 min đến 60 min.

Ngâm sang etanol 95 % (3.1.1) trong thời gian 30 min đến 60 min.

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 min đến 60 min.

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ 30 min đến 60 min.

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ nhất trong thời gian từ 60 min đến 90 min.

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ hai trong thời gian từ 60 min đến 90 min.

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ nhất trong thời gian 90 min.

Ngâm tẩm parafin (3.3.6) lần thứ hai, thời gian từ 120 min.

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.3.2). Nếu làm thủ công, cần thực hiện các bước xử lý mẫu trong tủ hút khí độc (4.1.3).

6.4.3  Đúc khuôn

Đưa mẫu vào khung đúc parafin: Rót parafin đã nóng chảy từ nồi đun (4.3.3) vào khay (4.3.4). Gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.3.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.4.3  Cắt tiêu bản

Cắt gọt khối parafin cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.3.5).

Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.3.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức.

Cắt lấy tiêu bản với độ dày lát cắt từ 2 μm đến 3 μm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào bể điều nhiệt (4.3.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C.

Dùng phiến kính (4.3.8) vớt những lát cắt bằng phẳng, chuyển sang máy sấy mẫu (4.3.11) ở 40 °C trong 2 h đến 3 h.

6.4.4  Nhuộm tiêu bản

Tẩy parafin trên các lát cắt tiêu bản (xem 6.4.3) trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong etanol 100 % (3.1.1) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong etanol 95 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong etanol 70 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min.

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm Haematoxylin (3.3.4) từ 3 min đến 5 min.

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm Eosin (3.3.5) từ 3 min đến 5 min.

Nhúng qua etanol 70 % (3.1.1) để từ 2 min đến 3 min; sau đó nhúng qua etanol 100 % (3.1.1) 3 lần (3 cốc), mỗi lần để từ 2 min đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần từ 2 min đến 3 min; lau sạch xung quanh và gắn lamen (4.3.9) bằng keo (3.3.7).

Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 10 X và 100 X (4.3.10).

6.4.5  Đọc và đánh giá kết quả

6.4.5.1  Đọc kết quả

Dưới kính hiển vi quang học, Bonamia sp. xuất hiện ở dạng hình trứng hoặc hình cầu, có kích thước rất nhỏ 2 μm đến 5 μm bắt màu kiềm (basophilic) ký sinh trong tế bào máu, hoặc tồn tại tự do trong mô liên kết của mang, tế bào biểu mô của màng áo và ruột. B. exitiosa thường xuất hiện với nhân ở giữa và có kích thước lớn hơn B. ostreae.

6.4.5.2  Đánh giá kết quả

Đánh giá kết quả dựa trên cường độ nhiễm Bonamia khi quan sát tiêu bản nhuộm HE:

- Âm tính: Không quan sát thấy Bonamia trong tiêu bản

- Dương tính (mức độ 1): Quan sát thấy từ 1 đến 5 vùng xâm nhiễm tế bào máu cục bộ trong mô liên kết, trong đó có một vài Bonamia ký sinh trong tế bào máu.

- Dương tính (mức độ 2): Quan sát thấy từ 6 đến 10 vùng xâm nhiễm tế bào máu trong mang và tuyến tiêu hóa hoặc tuyến sinh sản. Có nhiều Bonamia ký sinh trong tế bào máu và một số tồn tại ngoài tế bào máu và trong các mô liên kết.

- Dương tính (mức độ 3): Quan sát thấy tế bào máu bị nhiễm tràn lan với hơn 01 Bonamia trong tế bào máu bị nhiễm. Có hiện tượng xâm nhiễm tế bào máu toàn thân trong mang và tuyến tiêu hóa hoặc tuyến sinh sản. Các tế bào mô bị vỡ và hoại tử.

7  Kết luận

Hàu được xác định bị bệnh do Bonamia khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và có kết quả dương tính với Bonamia bằng một trong các phương pháp sử dụng trong tiêu chuẩn này.

Hàu được xác định bị nhiễm Bonamia sp. khi không có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng của bệnh, nhưng có kết quả dương tính bằng một trong các phương pháp sử dụng trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1  Thành phần

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10 X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch Davidson

A.2.1  Thành phần

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan axit axetic, formalin và etanol trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.3  Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer)

A.3.1  Thành phần

CHÚ THÍCH: Có thể dùng kali nhôm sulfat [KAl(SO₄)₂] thay thế cho amoni nhôm sulfat [NH₄Al(SO₄)₂]

A.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni nhóm sulfat hoặc kali nhôm sulfat, khuấy đều cho tan hoàn toàn, tiếp tục cho axit xitric và cloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc (4.3.13). Bảo quản dung dịch đã pha trong lọ tối màu (4.3.12).

A.4  Thuốc nhuộm Eosin

A.4.1  Thành phần

A.4.2  Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa tan eosin trong etanol, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc (4.3.13).

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu (4.3.12).

A.5  Dung dịch muối đệm PBS

A.5.1  Thành phần

A.5.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH (7,4 ± 0,2) bằng dung dịch natri hydroxit 1 N (3.1.3) hoặc dung dịch axit clohydric 1 N (3.1.4).

Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min (4.1.1).

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN bằng bộ kít DNeasy Blood Tissue Kit (Code: 69504) 2)

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B.1  Chuẩn bị

- Thêm Etanol (3.1.1) vào đệm AW1* và AW2+ trước khi sử dụng, theo hướng dẫn trên nhãn.

- Các đệm ATL and AL* có thể kết tủa khi bảo quản. Trong trường hợp có kết tủa, làm nóng dung dịch đệm ở 56 °C cho đến khi tan hết.

B.2  Cách tiến hành

B.2.1  Hút 250 μl mẫu huyễn dịch (6.2.1) cho vào ống eppendort 1,5 ml (4.2.9).

B.2.2  Thêm 180 μl đệm ATL vào ống B.2.1.

B.2.3  Thêm 20 μl proteinase K, trộn nhẹ bằng máy lắc trộn Vortex (4.2.4), ủ ở bể điều nhiệt (4.1.8) cho đến khi mẫu bị dung giải hoàn toàn.

B.2.4  Lắc trộn vortex 15 s. Thêm 200 μl đệm AL vào ống mẫu (B.2.3), trộn vortex 15 s. Thêm 200 μl etanol (96 % đến 100 %), lắc trộn Vortex 15 s.

B.2.5  Hút toàn bộ hỗn hợp (B.2.4) vào ống cột lọc đặt trong ống thu. Ly tâm 10 000 rpm trong máy ly tâm (4.2.3) trong thời gian 1 min. Bỏ ống thu cùng dịch đã qua ly tâm.

B.2.6  Đặt cột lọc vào ống thu mới. Thêm 500 μl đệm AW1. Ly tâm 10 000 rpm trong thời gian 1 min. Bỏ ống thu và dịch đã qua ly tâm.

B.2.7  Đặt cột lọc trong ống thu mới. Thêm 500 μl đệm AW2. Ly tâm 10 000 rpm trong thời gian 3 min. Bỏ ống thu và dịch đã qua ly tâm.

B.2.8  Đặt cột lọc vào trong ống eppendorf (4.2.9). Thêm 200 μl đệm AE thẳng vào màng ống cột lọc (không được chạm đầu típ vào màng). Để ở nhiệt độ phòng 1 min, rồi ly tâm 10 000 rpm trong 1 min. Bỏ cột lọc, thu ADN trong ống eppendorf (4.2.9) và bảo quản mẫu trong tủ lạnh đông (4.1.7)

CHÚ THÍCH:

1) Bước B.2.1 và B.2.8 ghi mã hiệu mẫu ở cả nắp và thân ống nghiệm để tránh mất nhãn mẫu. Ống nghiệm ở bước B.2.8 là ADN tổng số dùng cho phản ứng PCR và lưu mẫu ở - 20 °C, nên có thể ghi thêm các thông tin khác nếu cần.

2) Khi chuyển mẫu vào cột lọc (B.2.5), thì không được ghi mã hiệu mẫu vào phần thân cột, để tránh tạp nhiễm mẫu.

3) Chuyển ống cột lọc ra (B.2.7) phải rất cẩn thận, không nên chạm đáy ống vào dung dịch ở ống thu. Nếu chạm vào, cần ly tâm lại. Nếu dung dịch không xuống hết ống thu, thay ống thu mới và ly tâm ở tốc độ tối đa 14 000 rpm thêm 1 min nữa.

4) Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu kiểm tra.

Phụ lục C

(Quy định)

Trình tự các cặp mồi, mẫu dò, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR phát hiện Bonamia

Bảng C.1 - Trình tự các cặp mồi, mẫu dò cho phản ứng Realtime PCR

CHÚ THÍCH: trình tự cặp mồi và mẫu dò trong Bảng C.1 được tiêu chuẩn khuyến cáo sử dụng. Các phòng thí nghiệm có thể sử dụng các cặp mồi, mẫu dò khác được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) hoặc Phòng Thí nghiệm tham chiếu của OIE về bệnh khuyến cáo sử dụng.

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng Realtime PCR

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR

Phụ lục D

(Quy định)

Trình tự các cặp mồi, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng PCR phát hiện Bonamia

Bảng D.1 - Trình tự các cặp mồi cho phản PCR

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng PCR

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE (Office International des Epizooties). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (2019). Chapter 2.4.2. Infection with Bonamia exitiosa.

[2] OIE (Office International des Epizooties). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (2019). Chapter 2.4.3. Infection with Bonamia ostreae.

[3] Andrea Ramilo, J. Ignacio Navas, Antonio Villalba, Elvira Abollo. Species-specific diagnostic assays for Bonamia ostreae and B. exitiosa in European flat oyster Ostrea edulis: conventional, real-time and multiplex PCR. Vol. 104: 149-161, 2013 doi: 10.3354/dao02597.

[4] Carnegie RB, Barber BJ, Culloty SC, Figueras AJ, Distel DL. Development of a PCR assay for detection of the oyster pathogen Bonamia ostreae and support for its inclusion in the Haplosporidia. Dis Aquat Org 42: 199-20, 2000.

[5] Corbeil S, Arzul I, Diggles B, Heasman M, Chollet B, Berthe FCJ, Crane MS. Development of a TaqMan PCR assay for the detection of Bonamia species. Dis Aquat Org 71: 75-80; 2006

[6] Marty G, Bower SM, Clarke K, Meyer G, Geoff Lowe, Andrea L.Osborn, Eric P.Chow, Heather Hannah, Sean Byrne, KenSojonky, John H.Robinson. Histopathology and a real-time PCR assay for detection of Bonamia ostreae in Ostrea edulis cultured in western Canada. Aquaculture 261: 33-42; 2006.

[7] Narcisi V, Arzul I, Cargini D, Mosca F and others. Detection of Bonamia ostreae and B. Exitiosa (Haplo -sporidia) in Ostrea edulis from the Adriatic Sea (Italy). Dis Aquat Org 89: 79-85; 2010.

[8] IFREMER- European Union Reference Laboratory for Mollusc Diseases. Bonamia ostreae and Bonamia exitiosa detection by Taqman® Real Time Polymerase Chain Reaction. Edition N° 1; 2019.