Tiêu chuẩn TCVN 12195-1:2019 Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Yêu cầu chung

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12195-1:2019

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT

PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

Procedure for identification of plant disease caused by fungi

Part 1: General requirements

Lời nói đầu

TCVN 12195-1: 2019  do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12195 Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

- Phần 1: Yêu cầu chung

- Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz

- Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr

- Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano

- Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Ciborinia camelliae Kohn

- Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với Boeremia foveata (Foister) Aveskamp, Gruyter & Verkley

- Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada

- Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Tilletia indica Mitra

- Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT

PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

Procedure for identification of plant disease caused by fungi

Part 1: General requirements

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu chung trong quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật.

Tiêu chuẩn này cũng áp dụng đối với quy trình giám định các vi sinh vật giống nấm (sau đây gọi là nấm) gây bệnh thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các phiên bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8597: 2010. Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng

3  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:

3.1  Túi chứa mẫu:

3.2  Tủ lạnh: nhiệt độ từ 3 °C đến 8 °C

3.3  Giấy bản

3.4  Bìa các tông

3.5  Kẹp ép mẫu thực vật

3.6  Tủ lưu trữ mẫu

3.7  Hộp lưu trữ mẫu

3.8  Lọ đựng mẫu: Trong suốt, trơ với hóa chất, có nắp kín khí

3.9  Hộp chứa mẫu: sạch, kín khí

3.10  Hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam

3.11  Kim khêu nấm

3.12  Dao cắt mẫu

3.13  Lam kính

3.14  Kính hiển vi: độ phóng đại 40 lần đến 1 000 lần

3.15  Lamen

3.16  Đèn cồn

3.17  Giấy lọc kích thước lỗ lọc 11 μm

3.18  Hộp petri

3.19  Lưới nhựa

3.20  Dụng cụ để ẩm

3.21  Tủ cấy, tủ hút khí

3.22  Chày, cối: bằng sứ hoặc nhựa

3.23  Ống eppendorf

3.24  Máy trộn dịch

3.25  Máy chu trình nhiệt (PCR)

3.26  Kính lúp soi nổi độ phóng đại 40 lần đến 130 lần

3.27  Máy ly tâm: tốc độ từ 1 000 đến 4 000 vòng/phút

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

4.1  Dung dịch axit Sunfuric (H₂SO₄) 10 %

4.2  Glycerol (C₃H₈O₃)

4.3  Cồn (C₂H₅OH): 90 % hoặc 70 %

4.4  Silicagel

4.5  Parafin

4.6  Bôm Canada

4.7  Dung dịch Natri hypoclorit (NaOCl) 10 %

4.8  Natri Clorit (NaCl) 0,4 M

4.9  Đồng sunfat (CuSO₄)

4.10  Khoai tây

4.11  Nước cất

4.12  Xylene

4.13  Axit lactic (C₃H₆O₃)

4.14  Nước cất vô trùng

4.15  Phenol (C₆H₅OH)

4.16  Keo kết dính

4.17  Tris-HCl 10nM

4.18  EDTA 2M

4.19  Proteinase K

4.20  SDS

4.21  Natri Clorit (NaCl) 6M

4.22  Phenol: chloroform: isoamyalcohol (25:24:1)

4.23  Chloroform

4.24  Agarose

4.25  Isopropanol

4.26  TE

4.27  Axit sunfurơ (H₂SO₃)

4.28  Fomalin (C₂HO)

4.29  Dextrose

4.30  Agar

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

5.1.1  Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng

- Diện tích điều tra: phụ thuộc vào loại cây trồng, điều kiện cụ thể tại vùng điều tra và mục đích điều tra.

- Chọn điểm điều tra: Có thể chọn điểm điều tra theo một trong số các phương pháp sau

+ Chọn điểm theo đường chéo góc

+ Chọn điểm theo ô bàn cờ

+ Chọn điểm hình rẻ quạt

+ Chọn điểm ngẫu nhiên

+ Điều tra toàn bộ ruộng theo băng. Tại ruộng điều tra, điều tra toàn bộ ruộng theo phương pháp cuốn chiếu theo băng. Mỗi ruộng được chia ra làm các băng nhỏ, mỗi băng có chiều rộng 2 m, điều tra lần lượt từ đầu tới cuối băng và kiểm tra toàn bộ cây trồng trong mỗi băng điều tra.

- Số lượng mẫu: số lượng mẫu phụ thuộc vào mục đích điều tra và phương pháp lấy mẫu.

+ Cây ăn quả, cây lâu năm, cây công nghiệp: số lượng cây điều tra tại một điểm tối thiểu từ 3 cây đến 5 cây.

+ Cây hàng năm, rau màu, cây ngắn ngày: mỗi điểm có diện tích tối thiểu là 1 m².

5.1.2  Đối với vật thể thuộc diện kiểm dịch thực vật xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước

Lấy mẫu theo TCVN 8597:2010.

5.2  Bảo quản mẫu

5.2.1  Các bộ phận tươi có triệu chứng bệnh hoặc nghi nhiễm nấm (cành, lá, thân, rễ, củ...)

Mẫu được để trong các túi chứa mẫu (3.1) có đính nhãn và bảo quản trong tủ lạnh (3.2) ở nhiệt độ từ 3 °C đến 5°C.

Các mẫu tươi sau khi giám định hoặc gửi đi giám định có thể xử lý bằng các phương pháp sau

Ép khô

Bộ phận nhiễm bệnh được ép khô bằng cách đặt giữa các lớp giấy bản (3.3) thường là từ 4 đến 5 tờ.

Các lớp giấy bản (3.3) (có chứa mẫu) được đặt giữa 2 miếng bìa các tông (3.4) và đặt vào kẹp ép mẫu thực vật (3.5) sau đó nén chặt bằng dây hoặc vật nặng.

Trong quá trình làm khô mẫu giấy bản (3.3) nên thay thường xuyên khoảng 1 lần/ngày.

Kẹp ép mẫu thực vật (3.5)(có chứa mẫu) có thể phơi nắng, để trong phòng có điều hòa hoặc máy sưởi để tăng hiệu quả làm khô mẫu.

Thời gian làm khô mẫu hoàn toàn thông thường là từ 5 đến 10 ngày.

Mẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không bị mốc, khô hoàn toàn, không bị gập gãy hoặc nhăn nheo. Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt trong các túi chứa mẫu (3.1) vô trùng, bên ngoài đề rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).

Các túi chứa mẫu (3.1) bằng giấy được lưu trữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc các hộp lưu trữ mẫu (3.7)) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng các vật liệu chống ẩm như silicagel (4.4)...)

Ngâm mẫu

Bộ phận nhiễm bệnh được rửa nhẹ dưới vòi nước chảy sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng (4.14).

Mẫu được để chỗ thoáng để bề mặt khô hoàn toàn.

Có thể ngâm mẫu vào dung dịch H₂SO₄ 10 % (4.1) bổ sung thêm từ 2 đến 3 giọt glycerol (4.2) và từ 2 đến 3 giọt cồn 90 % (4.3) trong vòng 24 giờ.

Vớt mẫu vật ra, rửa trong nước lạnh.

Chuyển mẫu vào lọ đựng mẫu (3.8) có chứa dung dịch bảo quản (Xem phụ lục A) và đậy chặt nắp.

Thay dung dịch bảo quản khi thấy hiện tượng dung dịch bị vẩn đục (hoặc 6 tháng 1 lần) cho đến khi dung dịch bảo quản không bị vẩn đục nữa thì gắn chặt lọ mẫu bằng parafin (4.5).

Dán nhãn bên ngoài lọ đựng mẫu (3.8) ghi rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).

5.2.2  Các sản phẩm khô có triệu chứng bệnh hoặc nghi nhiễm nấm (hạt, quả khô,...)

Mẫu được để trong các túi chứa mẫu (3.1) hoặc hộp chứa mẫu (3.9) kín có nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

5.2.3  Mẫu đất

Đất được cho vào túi chứa mẫu (3.1) không thấm nước, có lỗ thông khí, có đính nhãn và để ở những nơi thoáng mát hoặc ở nhiệt độ phòng.

5.2.4  Tiêu bản lam của nấm

Tiêu bản lam được dán nhãn, để trong hộp chuyên dụng đựng tiêu bản lam (3.10) và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

6  Phát hiện bệnh

Phát hiện và thu thập mẫu bệnh dựa vào một số đặc tính sinh học quan trọng của loài dịch hại là phân bố, ký chủ và triệu chứng hại.

- Phân bố: Mỗi loài nấm hoặc vi sinh vật giống nấm chỉ có khả năng tồn tại và gây hại tại vùng có điều kiện khí hậu phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của loài đó.

- Ký chủ: Mỗi loài nấm hoặc vi sinh vật giống nấm có phổ ký chủ rộng hoặc hẹp khác nhau.

- Triệu chứng bệnh: Triệu chứng do nấm hoặc vi sinh sinh vật giống nấm gây hại trên thực vật thường rất đặc trưng và khác nhau tùy thuộc vào loài nấm/vi sinh vật giống nấm, loài ký chủ, bộ phận bị hại và giai đoạn hại.

7  Giám định nấm bệnh

7.1  Giám định bằng đặc điểm hình thái

7.1.1  Kiểm tra trực tiếp

7.1.1.1  Kiểm tra mẫu tươi

7.1.1.1.1  Quan sát hình thái sợi nấm

Dùng kim khêu nấm (3.11) hoặc dao cắt mẫu (3.12) thu nấm trực tiếp từ các phần nghi ngờ nhiễm bệnh hoặc có triệu chứng điển hình (tốt nhất là khêu tại phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe), đặt lên lam kính (3.13) đã có một giọt lactophenol (xem phụ lục A).

Đặt lam lên kính hiển vi (3.14), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có.

Đặc biệt chú ý thu nấm từ những bộ phận có triệu chứng bệnh điển hình.

7.1.1.1.2  Quan sát hình thái cấu trúc của nấm

- Dùng kim khêu nấm (3.11) hoặc dao cắt mẫu (3.12) thu nấm trực tiếp từ các phần nghi ngờ nhiễm bệnh hoặc có triệu chứng điển hình.

- Cắt lát mỏng tiêu bản nấm: Muốn quan sát cấu tạo bên trong của nấm ở kính hiển vi (3.14), phải cắt những cấu tạo trên thành những lát cắt rất mỏng. Bề dày của lát cắt chỉ nên gồm vài lớp tế bào và phải trong suốt để có thể quan sát bằng cách nhìn xuyên qua.

Cách cắt mẫu: Cầm vật cắt bằng một tay, kẹp giữa hai ngón cái và ngón giữa, ngón trỏ được dùng như điểm tựa cho lưỡi dao. Tay còn lại cầm dao cắt mẫu (3.12) để cắt. Chú ý khi cắt mẫu quan sát trước phần mô bệnh có chứa cấu tạo cần quan sát để cắt cho chính xác. Nên cắt dưới kính lúp soi nổi (3.26) để có lát cắt mỏng, chính xác thuận tiện hơn cho việc quan sát dưới kính hiển vi.

- Đặt mẫu đã cắt lát mỏng lên lam kính đã có một giọt lactophenol (xem phụ lục A).

- Đặt lam lên kính hiển vi (3.14), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có.

7.1.1.2  Cố định tiêu bản lam

- Nấm được làm tiêu bản lam cố định trước khi quan sát, đo đếm hình thái.

- Cách làm tiêu bản lam: có thể sử dụng một trong hai phương pháp sau:

Phương pháp 1: cố định lam sử dụng chất kết dính:

Nhỏ 1 giọt dung dịch soi kính (có thể sử dụng một trong hai loại dung dịch soi kính: axit lactic (4.13) 85 %, lactoglycerol (Xem phụ lục A) hoặc lactophenol (Xem phụ lục A)) lên một lam kính (3.13) sạch.

Dùng kim khêu nấm (3.11) hoặc dao cắt mẫu (3.12) lấy nấm trên bề mặt vết bệnh hoặc các lát cắt mỏng của mẫu bệnh đặt vào giọt dung dịch soi kính.

Đặt lamen (3.15) lên giọt dung dịch soi kính có chứa mẫu nấm.

Hơ nhanh qua ngọn lửa đèn cồn (3.16) để đuổi bọt khí.

Nếu dịch soi kính tràn ra phía ngoài lamen (3.15) quá nhiều sử dụng giấy thấm lau khô trước khi gắn cố định mẫu.

Dùng keo kết dính (4.16) gắn chặt viền lamen (3.15) và lam kính (3.13).

Đặt lam kính đã cố định ở nơi khô ráo.

CHÚ THÍCH: phương pháp này có thể lưu trữ tiêu bản lam trong vòng vài năm.

Phương pháp 2: sử dụng keo Bôm Canada (Canada balsam)

Nhỏ 1 giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene (Xem phụ lục C) lên một lam kính (3.13) sạch.

Dùng kim khêu nấm (3.11) hoặc dao cắt mẫu (3.12) lấy nấm trên bề mặt vết bệnh hoặc các lát cắt mỏng của mẫu bệnh đặt vào giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene.

Đặt lamen (3.15) lên giọt dung dịch keo Bôm Canada-Xylene có chứa mẫu nấm.

Nếu trong lam có bọt khí có thể đuổi bọt khí bằng cách đặt lam lên một bàn gia nhiệt.

CHÚ THÍCH: Đây là phương pháp cố định lam lâu dài, thời gian lưu trữ có thể lên tới vài chục năm.

- Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.14), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có.

7.1.2  Kiểm tra mẫu để ẩm

7.1.2.1  Cách làm

Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ để ẩm

Các dụng cụ để ẩm được rửa sạch để khô sau đó khử trùng bằng cách rửa lại bằng cồn 70 %(4.3) hoặc dung dịch Natri hypoclorit 10 %(4.7) rồi để khô.

Giấy lọc (3.17) đã được hấp khử trùng được đặt vào hộp petri (3.18) rồi thêm vào từ 3 ml đến 5 ml nước vô trùng (4.11). Có thể đặt một lưới nhựa sạch (3.19) (đã rửa sạch và khử trùng bằng cồn 70 % (4.3) hoặc Natri hypoclorit 10 % (4.7) rồi để khô) lên trên miếng giấy lọc (3.17) đã làm ẩm.

Bước 2: Khử trùng bề mặt bộ phận nghi nhiễm bệnh

- Nếu mẫu đã bị các tế bào hoại sinh gây tổn thương, thoa nhẹ bằng cồn 70 % (4.3)

- Dùng dao (3.12) cắt một mẩu mô bộ phận nghi nhiễm bệnh (cánh hoa, nụ hoa, lá, cành, rễ, quả...) nghi nhiễm bệnh và đặt vào dung dịch khử trùng (cồn 70 % (4.3) hoặc Sodium hypochloride 10 % (4.7)). Thời gian khử trùng từ 1 đến 5 phút.

- Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng (4.14).

Bước 3: Để ẩm và theo dõi

- Đặt mẫu đã khử trùng bề mặt lên lưới nhựa (3.19) hoặc lên bề mặt giấy lọc (3.17) ẩm trong hộp petri (3.18) và để trong dụng cụ để ẩm (3.20). Dụng cụ để ẩm (3.20) (có chứa mẫu) nên đặt nơi không bị ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp và có điều kiện thích hợp cho nấm phát triển.

- Kiểm tra mẫu sau khi để ẩm 3 ngày, mỗi ngày 1 lần trong khoảng 3 tuần.

7.1.2.2  Quan sát đặc điểm hình thái của nấm

7.1.2.2.1  Kiểm tra mẫu tươi

- Quan sát hình thái sợi nấm: Dùng kim khêu nấm (3.11) thu nấm trên mẫu đã để ẩm đặt lên lam trong có một giọt lactophenol rồi đậy lamen (3.15) lên. Đặt lam lên kính hiển vi tìm và quan sát, đo đếm các đặc điểm hình thái của nấm (bào tử, sợi nấm, tản nấm...) và so sánh với đặc điểm hình thái nấm trong khóa phân loại.

- Quan sát hình thái cấu trúc: Dùng kim khêu nấm (3.11) hoặc dao cắt mẫu thu nấm trên mẫu đã để ẩm. Cắt lát mỏng tiêu bản nấm như điều 7.1.1.1.2 và đặt mẫu đã cắt lát mỏng lên lam kính đã có một giọt lactophenol (xem phụ lục A). Đặt lam lên kính hiển vi (3.14), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có.

7.1.2.2.2  Cố định tiêu bản lam

- Thu mẫu nấm hoặc mẫu cắt lát mỏng tiêu bản nấm từ mẫu để ẩm để làm tiêu bản lam cố định.

- Làm tiêu bản lam cố định như điều 7.1.1.2

- Đặt tiêu bản lam lên kính hiển vi (3.14), quan sát đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có.

7.1.3  Phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

7.1.3.1  Cách làm

Bước 1: Khử trùng mẫu nuôi cấy

- Lựa chọn các mô bệnh mới và đặc trưng nhất (không nên lựa chọn các mô quá cũ).

- Khử trùng bề mặt vết bệnh:

+ Rửa mẫu bệnh bằng vòi nước chảy để loại bỏ đất, cát, các chất bẩn bám trên bề mặt. Nếu mẫu đã bị các tế bào hoại sinh gây tổn thương, thoa nhẹ vết bệnh bằng cồn 70 % (4.3). Có thể cắt nhỏ mẫu nếu mẫu quá lớn.

+ Đặt mẫu vào dung dịch khử trùng (cồn 70 % (4.3) hoặc Natri hypoclorit 10 % (4.7)), thời gian khử trùng từ 1 phút đến 5 phút.

+ Rửa sạch thật kỹ các mẫu bằng nước cất vô trùng (4.14).

- Để mẫu khô tự nhiên trong tủ cấy/tủ hút (3.21) hoặc thấm khô bằng giấy lọc (3.17) vô trùng

Bước 2: Cấy trên môi trường

- Cấy một mẩu nhỏ (kích thước (1 đến 2) mm x (1 đến 2) mm phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe) mô bệnh lên đĩa petri có chứa môi trường nuôi cấy nhân tạo (xem phụ lục B).

- Đặt các đĩa petri nói trên trong điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thích hợp để nấm phát triển.

Bước 3: Cấy truyền làm thuần nấm

Khi tản nấm phát triển lan rộng, lấy phần ở rìa ngoài của tản nấm đang phát triển cấy truyền sang đĩa petri có chứa môi trường mới, tiếp tục nuôi cấy làm thuần để phục vụ cho việc giám định. Các đĩa petri cấy truyền làm thuần này cũng được để trong điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thích hợp để nấm phát triển.

7.1.3.2  Trình tự giám định

- Quan sát đặc điểm hình thái của nấm như điều 7.1.2.2

- Quan sát đặc điểm, màu sắc, kích thước của tản nấm trên môi trường nuôi cấy.

- So sánh với đặc điểm hình thái của nấm trong khóa phân loại hiện có.

7.2  Giám định bằng phương pháp PCR

7.2.1  Tách chiết DNA

DNA của nấm có thể tách chiết bằng kít thương mại hoặc có thể tách chiết bằng các phương pháp sau:

- Tách chiết DNA tổng số từ mô cây

Bước 1: Nghiền 500 mg mô cây bằng chày và cối sứ (3.22) trong nitơ lỏng.

Bước 2: Chuyển 100 mg mô nghiền vào ống eppendorf (3.23) chứa 450 μl dịch chiết cây (NaCl0,4 M (4.8); Tris-HCl 10 mM pH 8,0 (4.17); EDTA 2,0 mM pH 8,0 (4.18); proteinase K400 μg/ mL (4.19); SDS2 % (4.20)).Trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 3: Ủ ở 65 °C trong 1 giờ.

Bước 4: Thêm vào ống 300 μl NaCl 6M (4.21) và trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 5: Ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nổi vào ống mới.

Bước 6: Thêm phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) (4.22) vào ống với một thể tích tương đương và trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 7: Ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi.

Bước 8: Thêm chloroform (4.23) vào ống với một thể tích tương đương và trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 9: Ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi.

Bước 10: Thêm isopropanol (4.25) vào ống một thể tích tương đương.

Bước 11: Ly tâm 12 000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa DNA loại bỏ dịch.

Bước 12: Thêm vào ống 100 μl Cồn 70% (4.3) để rửa tủa DNA.

Bước 13: Loại bỏ Cồn 70 % (4.3) để kết tủa DNA khô tự nhiên trong 10 phút.

Bước 14: Hòa tan kết tủa DNA trong 100 μl TE (4.26) pH8 bảo quản ở 4 °C.

- Tách chiết DNA tổng số từ sợi nấm nuôi cấy trên môi trường

Bước 1: Dùng kim khêu nấm (3.11) vô trùng chuyển sợi nấm từ đĩa nuôi cấy vào ống eppendorf (3.23).

Bước 2: Nghiền nhỏ nấm bằng chày (3.22) nhựa vô trùng trong nitơ lỏng.

Bước 3: Chuyển hỗn hợp nghiền vào ống eppendorf mới đã chứa 400 μl dịch chiết nấm (NaCl 0,4 M(4.8); Tris-HCl 10 mM pH 8,0 (4.17); EDTA 2 mM (4.18); SDS20 g/l (4.20)). Trộn đều bằng máy trộn dịch (3.24).

Bước 4: Thêm vào ống 8 μl Proteinase K 20 mg/ml (4.18) lắc nhẹ.

Bước 5: Ủ ở 65 °C trong 2 giờ hoặc qua đêm.

Bước 6: Thêm vào 300 μl NaCl 6M (4.21) trộn bằng máy trộn dịch trong 30 giây.

Bước 7: Ly tâm 13 000 vòng/phút trong 30 phút thu dịch phía trên.

Bước 8: Thêm isopropanol (4.25) vào ống với một thể tích tương đương lắc nhẹ.

Bước 9: Ủ ở âm 20 °C trong 1 giờ hoặc lâu hơn.

Bước 10: Ly tâm 13 000 vòng/phút trong 15 phút thu tủa DNA loại bỏ dịch.

Bước 11: Thêm vào 100 μl cồn 70 % (4.3) để rửa kết tủa DNA.

Bước 12: Loại bỏ cồn 70 % (4.3), để tủa DNA khô tự nhiên trong 10 phút.

Bước 13: Hòa tan tủa DNA trong 100 μl TE (4.26) pH8 bảo quản ở 4 °C.

7.2.2  Nhân gen bằng máy chu trình nhiệt (PCR)

Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu với nấm

7.2.3  Đọc kết quả

Sản phẩm nhân gen được điện di trong gel agarose (4.24).

Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước như hướng dẫn.

8  Báo cáo

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Tên loài

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

Phụ lục A

(Quy định)

Dung dịch bảo quản và dung dịch cố định mẫu

A.1  Dung dịch bảo quản

Có thể sử dụng một trong những dung dịch quản sau:

Dung dịch 1:

Dung dịch 2:

Dung dịch 3:

Dung dịch 4:

Cách pha dung dịch muối bão hòa:

Hòa tan muối trong nước nóng đến mức độ bão hòa.

Để dung dịch nguội trong 3 giờ.

Lọc bỏ phần không tan hết

A.2  Dung dịch keo Bôm Canada-Xylene

Tùy theo độ đặc của của keo Bôm Canada mà tỉ lệ pha có thể khác nhau, thường tỉ lệ như sau:

A.3  Dung dịch Lactoglycerol

A.4  Dung dịch Lactophenol

Dung dịch lactophenol có thể mua dưới dạng pha chế sẵn hoặc có thể tự pha chế theo tỉ lệ sau:

CHÚ THÍCH: Xylene, phenol là các chất độc hại, tránh tiếp xúc trực tiếp với da trần, sử dụng găng tay, khẩu trang và dụng cụ bảo hộ lao động trong thời gian tiếp xúc với các hóa chất này

Phụ lục B

(Quy định)

Chuẩn bị và điều chế môi trường nhân tạo

B.1  Hấp, sấy khử trùng

B.1.1  Sấy khử trùng

Dùng phương pháp này để khử trùng hộp lồng và dụng cụ thủy tinh. Dụng cụ phải được rửa sạch và gói riêng rẽ bằng giấy nhôm rồi đặt vào hộp bằng chất liệu phù hợp để có thể sấy được. Tránh không nên sử dụng giấy để gói vì sẽ làm dính kết vào dụng cụ và có thể gây cháy trong quá trình sấy. Dụng cụ thủy tinh có thể được sấy trong tủ sấy bằng không khí nóng, các đồ sấy không nên xếp quá chật để đảm bảo không khí nóng đối lưu, khí nóng phải đảm bảo tiếp xúc đều tất cả các phần của dụng cụ để quá trình sấy đạt hiệu quả tốt.

Có thể sử dụng các nhiệt độ và cách sấy sau:

B.1.2  Hấp khử trùng bằng nồi hấp

Dùng phương pháp này để khử trùng môi trường nhân tạo. Các nồi hấp vô trùng tự động kiểu mới (autoclave) hoặc các nồi áp suất kiểu cũ đều có thể sử dụng để hấp vô trùng. Các môi trường nhân tạo sau khi điều chế được đựng trong các bình thủy tinh có nắp. Các bình này được đặt trong các lồng, hộp của nồi hấp vô trùng và đặt vào nồi hấp. Không nên để nghiêng hay rót môi trường quá đầy tránh làm trào môi trường trong quá trình khử trùng. Không nên xếp chồng chéo hoặc quá đầy ảnh hưởng tới luồng không khí đối lưu trong nồi hấp. Hấp khử trùng thường ở nhiệt độ 121 °C áp suất 1,5 atm trong thời gian 30 phút.

Khi vận hành nồi hấp vô trùng cần sự giám sát cẩn thận và tuân thủ hướng dẫn sử dụng máy.

B.2  Điều chế môi trường nhân tạo

Môi trường PDA

Thành phần

Nước chiết khoai tây: Khoai tây không cần gọt vỏ, rửa sạch, thái nhỏ thành từng miếng vuông khoảng 1cm. Đun khoai tây trong nước cho đến khi mềm (khoảng 1 đến 2 giờ), lọc bằng vải màn để lấy dịch trong.

Pha 1 000 ml dịch nước khoai tây với các thành phần còn lại (agar và đường) đun cho đến khi hòa tan hoàn toàn.

CHÚ THÍCH: Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại môi trường nhân tạo để nuôi cấy nấm như: PDA, CMA, NA, V8 agar... có thể mua các loại môi trường này sau đó điều chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc tự điều chế theo phương pháp nêu trên.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist's Pocketbook.

[2] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.

[3] Viện Nấm học quốc tế IMI, (1994), Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng, Lớp tập huấn 08-15/12/1994, tại Viện Bảo vệ thực vật, Hà Nội.

[4] QCVN 01-175:2014. Lưu giữ, bảo quản và vận chuyển mẫu trong kiểm dịch thực vật.