Tiêu chuẩn TCVN 12195-2-18:2025 Quy trình giám định nấm đốm đen Phyllosticta citicarpa

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12195-2-18:2025

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT - PHẦN 2-18: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM ĐỐM ĐEN PHYLLOSTICTA CITRICARPA (MCALPINE) AA

Procedure for identification of plant disease caused by fungi - Part 2-18 - Particular requirements for Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Aa

 

Lời nói đầu

TCVN 12195-2-18:2025 do Cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ thẩm định, công bố.

Bộ TCVN 12195 Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật gồm các phần sau:

- Phần 1: Yêu cầu chung

- Phần 2-1 : Yêu cầu cụ thể đối với nấm Guignardia bidwellii (Ellis) Viala & Ravaz

- Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr

- Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Claviceps africana Frederickson, Mantle & De Milliano

- Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Ciborinia camelliae Kohn

- Phần 2-5: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Boeremia foveata (Foister) Aveskamp, Gruyter & Verkley

- Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada

- Phần 2-7: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Tilletia indica Mitra

- Phần 2-8: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Phoma tracheiphila (Perth) Kantachveli & Gikachvili

- Phần 2-9: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Balansia oryzae - sativae Hashioka

- Phần 2-10: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Synchytrium endobioticum (Schilb) Percival

- Phần 2-11: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Microcyclus ulei (Henn) Arx

- Phần 2-12: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Puccinia psidii G. Winter

- Phần 2-13: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Polyscytalum pustulans (M.N. Owen & Makef) M.B Ellis

- Phần 2-14: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Phymatotrichopsis omnivora (Duggar)

- Phần 2-15: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Verticillium albo-atrum Reinke & Berthold.

- Phần 2-16: Yêu cầu cụ thể đối với nấm Mycena citricolor (Berk & Curtis) Sacc.

- Phần 2-17: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định nấm thối rễ Phytophthora cinnamomi Rands

- Phần 2-18: Yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định nấm đốm đen Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Aa

 

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT - PHẦN 2-18: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH NẤM ĐỐM ĐEN PHYLLOSTICTA CITRICARPA (MCALPINE) AA

Procedure for identification of plant disease caused by fungi - Part 2-18 - Particular requirements for Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Aa

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu cụ thể đối với quy trình giám định nấm đốm đen Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Aa trên các bộ phận của cây ký chủ.

2 Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 12195-1:2019, Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật. Phần 1: Yêu cầu chung.

3 Thiết bị, dụng cụ

3.1 Bể ổn nhiệt, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C, sai số ± 1 °C

3.2 Chày nhựa

3.3 Dao cắt mẫu

3.4 Găng tay sử dụng một lần

3.5 Hệ thống thiết bị đọc bản gel UV tiêu chuẩn

3.6 Kim khêu nấm

3.7 Kính hiển vi, có độ phóng đại từ 40 lần đến 1000 lần

3.8 Máy chu trình nhiệt (PCR), cho phép thực hiện phản ứng PCR có dung tích mẫu 10 ~ 100 μl

3.9 Máy điện di, có công suất tới 150W, điện áp tới 300V và dòng tới 700mA

3.10 Máy ly tâm, ly tâm tốc độ cao lên tới 15 000 vòng/phút

3.11 Máy minispin, máy ly tâm tốc độ lên tới 6 000 vòng/phút

3.12 Máy ổn nhiệt khô, có thể duy trì ở nhiệt độ từ 25 °C đến 100 °C, sai số ± 1 °C

3.13 Máy realtime PCR, cho phép thực hiện phản ứng PCR thời gian thực có dung tích mẫu 10 ~ 100 μl

3.14 Máy trộn mẫu (máy vortex), tốc độ trộn đạt 1 000 vòng/ phút

3.15 Óng Eppendorf, dung tích 1,5 ml, 2 ml

3.16 Pipet và micropipet, có các loại dung tích 10 ml, 1000 μl, 100 μl, 10 μl, 1 μl

3.17 Tủ lạnh sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ từ- 80 °C đến - 20 °C

3.18 Lò vi sóng, có thể tạo nhiệt độ lên đến 160 °C

4 Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích trừ khi có quy định khác. Hóa chất sử dụng theo điều 4 của TCVN 12195-1:2019 và các hóa chất dưới đây. Phương pháp pha các loại dung dịch xem phụ lục B.

4.1 Agarose: tiêu chuẩn phân tích

4.2 Axit acetic (CH₃COOH): nồng độ 100 %

4.3 Axit boric (H₃BO₃): tinh thể

4.4 Axit clohidric (HCl): nồng độ 37 %

4.5 Cặp mồi đặc hiệu để giám định bằng phương pháp PCR thông thường kết hợp phân tích trình tự gen (DNA sequencing) phát hiện nấm P. citricarpa

GCN: 5'- CTG AAA GGT GAT GGA AGG GAG G -3'

GCMR: 5 '- CAT TAC TTA TCG CAT TTC GCT GC -3'

4.6 Cặp mồi đặc hiệu để giám định bằng phương pháp Realtime PCR phát hiện nấm P. citricarpa

Gc F2: 5' - AGG TGA TGG AAG GGA GGC CTT

Gc R2: 5’ - CAG GCG TCC TGG CCT AGA G -3'

4.7 Cetrimonium bromide (CTAB) (C₁₉H₄₂BrN): bột tinh thể

4.8 Chloroform: isoamyl alcohol (24:1)

4.9 Cồn (C₂H₅OH): 70 %

4.10 Cồn (C₂H₅OH) tuyệt đối: 99,7 %

4.11 Dung dịch đệm điện di TAE

4.12 Dung dịch đệm điện di TBE

4.13 Dung dịch đệm TE

4.14 Dung dịch đệm tách chiết CTAB

4.15 Dung dịch EDTA 0,5 M (pH 8)

4.16 Dung dịch NaCl 5 M

4.17 Dung dịch NaOH 10 M

4.18 Dung dịch Tris-HCl 1 M (pH 8)

4.19 Đệm nhuộm điện di

4.20 Axit ethylenedinitrilotetraacetic disodium salt dihydrate (EDTA) (C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂.2H₂O): tinh thể

4.21 Isopropanoi (C₃H₈O)

4.22 Kit tách chiết DNA thương mại

4.23 Kit thực hiện phản ứng PCR tiêu chuẩn

4.24 Kit thực hiện phản ứng Realtime PCR

4.25 Mẫu dò (Probe)

Gc P: 5' - FAM - AAA AAG CCG CCC GAC CTA CCT TCA - TAMRA -3'

4.26 Mẫu đối chứng âm: mẫu không nhiễm nấm P.citricarpa

4.27 Mẫu đối chứng dương: mẫu nhiễm nấm P.citricarpa

4.28 Mẫu trắng: mẫu nước sử dụng trong phản ứng PCR/ Realtime PCR

4.29 Môi trường PDA (potato dextrose agar): thương mại dạng bột

4.30 Natri hydroxit (NaOH): tinh thể

4.31 Natri clorua 99 % (NaCl): tinh thể

4.32 Nước cất

4.33 Thang chuẩn DNA ladder/marker

4.34 Thuốc nhuộm axit nucleic

4.35 Tris-Base (C₄H₁₁NO₃): bột tinh thể

4.36 2-mercaptoethanol (HOCH₂CH₂SH)

4.37 Nước khử ion (Nuclease-free water)

5 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1 Lấy mẫu

Lấy mẫu theo điều 5.1 của TCVN 12195-1:2019.

5.2 Bảo quản mẫu

Bảo quản mẫu khi giám định hoặc sau khi giám định: theo điều 5.2.2.1 của TCVN 12195-1:2019.

6 Phát hiện và triệu chứng điển hình của bệnh

- Triệu chứng trên quả: triệu chứng trên quả rất đa dạng, dễ bị nhầm lẫn với triệu chứng do các tác nhân gây bệnh khác hoặc do côn trùng gây ra. Có bốn loại triệu chứng chính thường xuất hiện là:

+ Đốm cứng: vết bệnh nông, ở giữa màu từ nâu vàng đến nâu, viền màu nâu sẫm, đường kính từ 3 đến 10 mm. Các vết đốm cứng riêng lẻ có kích thước nhỏ hoặc liên kết lại tạo thành các vết bệnh lớn hơn. Xung quanh vết bệnh có thể xuất hiện quầng màu vàng (khi quả xanh) hoặc màu xanh (khi quả chín). Quả cành hình thành ở tâm các vết đốm và có thể quan sát được bằng kính lúp cầm tay hoặc kính hiển vi soi nổi. Đây là dấu hiệu điển hình nhất do nấm P.citricarpa gây ra.

+ Đốm tàn nhang: vết bệnh là các đốm màu xám, nâu vàng nhạt hoặc đỏ nhạt, đường kính 1 đến 3 mm, hơi lõm ở tâm và không có quầng bao quanh, vết đốm sẽ chuyển sang màu nâu theo thời gian và không xuất hiện quả cành. Đốm tàn nhang thường phát triển sau khi quả bắt đầu chín và có thể xuất hiện xung quanh các vết đốm cứng. Đốm tàn nhang có thể liên kết lại tạo thành các vết bệnh lớn hơn.

+ Đốm đen giả: thường xuất hiện trên quả còn nhỏ hoặc quả xanh, có màu nâu sẫm đến đen, thường được bao quanh bởi các đốm chấm màu đen. vết bệnh không xuất hiện quả cành và có thể liên kết lại với nhau, vết bệnh lớn dần theo kích thước sự phát triển của quả.

+ Đốm độc tính: triệu chứng là các vết tổn thương lõm xuống, không đều, có màu đỏ đến nâu hoặc không màu, xuất hiện trên quả chín vào cuối vụ. Khi gặp điều kiện ẩm độ cao, các quả cành phát triển bên trong vết bệnh. Các đốm này phát triển rất nhanh, có thể bao phủ 2/3 bề mặt quả chỉ trong vòng 4 đến 5 ngày. Đốm độc tính và đốm cứng là hai triệu chứng gây hại nghiêm trọng nhất vì chúng lan sâu vào lớp trung bì, đôi khi toàn bộ độ dày của vỏ quả, dẫn đến hiện tượng rụng quả sớm và tổn thất nặng giai đoạn sau thu hoạch.

- Triệu chứng bệnh trên lá và cành non:

+ Trên lá: nấm P.citricarpa thường tồn tại trong lá dưới dạng nhiễm tiềm ẩn, không biểu hiện triệu chứng rõ ràng. Nếu xuất hiện triệu chứng, bắt đầu dưới dạng các đốm nhỏ li ti có thể quan sát được ở cả hai mặt lá. Các đốm này có thể lớn dần, đường kính lên đến 3 mm, hình tròn, tâm vết bệnh chuyển sang màu xám hoặc nâu nhạt, viền ngoài màu nâu sẫm đến đen và bao quanh bởi một quầng vàng. Quả cành có thể xuất hiện ở tâm các vết bệnh ở mặt trên của lá.

+ Trên cành non: triệu chứng tương tự như trên lá. Các triệu chứng này có kích thước nhỏ, đường kính từ 0,5 đến 2 mm, có hình tròn, hơi lõm xuống, viền màu nâu đến đen, tâm vết bệnh có màu xám đến nâu nhạt. Quả cành có thể xuất hiện ở tâm vết bệnh.

Thông tin về phân bố, đặc điểm sinh học của nấm đốm đen P.citricarpa và triệu chứng điển hình của bệnh xem phụ lục A.

7 Giám định nấm gây bệnh

7.1 Giám định nấm gây bệnh bằng đặc điểm hình thái

7.1.1 Kiểm tra trực tiếp

- Dùng kim khêu nấm (3.6) hoặc dao cắt mẫu (3.3) thu nấm trực tiếp từ các phần mẫu có triệu chứng của bệnh.

- Lát cắt ngang của mẫu bệnh nên có độ dày dưới 0,5 mm và độ dài từ 1 mm đến 2 mm để có hiệu quả quan sát tốt nhất.

- Quan sát hình thái của nấm thu được bằng một trong hai cách:

+ Kiểm tra mẫu tươi: theo điều 7.1.1.1.1 của TCVN 12195-1:2019

+ Soi tiêu bản lam cố định: Làm tiêu bản lam theo điều 7.1.1.2 của TCVN 12195-1:2019

- Quan sát dưới kính hiển vi (3.7) đặc điểm hình thái nấm và so sánh với đặc điểm hình thái của P.citricarpa (theo điều 7.1.2 của tiêu chuẩn này).

7.1.2 Đặc điểm hình thái định loại của Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Aa

Các tiêu chí đánh giá	Mô tả đặc điểm
Tản nấm trên môi trường PDA (potato dextrose agar)	Tản nấm có rìa không đều bao quanh bởi hệ sợi nấm không màu trong suốt; trung tâm tản nấm có màu xám đen với sợi nấm khí sinh màu xám đến xanh xám, thường có nhiều búi nhỏ. Ở mặt sau, trung tâm của tản nấm màu xám đen đến đen, được bao quanh bởi vùng màu xám, nâu sẫm. Cấu trúc stromata (lớp đệm/cơ chất - được tạo thành từ các sợi nấm đan xen, nâng đỡ và chứa các cơ quan sinh sản hoặc bào tử) bắt đầu hình thành sau 7 đến 8 ngày, quả cành (pycnidia) và bào tử phân sinh thường được hình thành trong vòng 10 đến 14 ngày.
Quả thể (Perithecia)	Chỉ hình thành trên lá nhiễm bệnh bị rụng, không xuất hiện trên quả hoặc lá trên cành hoặc trên môi trường nhân tạo. Quả thể mọc riêng lẻ hoặc tập hợp lại, hình cầu hoặc hình quả lê, nằm hoàn toàn trong mô ký chủ, màu nâu sẫm đến đen, đường kính từ 125 đến 360 μm; chứa 5 túi xếp chặt nhau ở bên trong; quả thể có miệng nhỏ, hình tròn, đường kính từ 10 đến 17,5 μm. Bề mặt quả thể thường được bao phủ bởi các sợi nấm mọc không đều (quả thể giả chứa nhiều lông bao quanh). Lớp vỏ ngoài của quả thể gồm các tế bào có góc cạnh với thành tế bào dày màu nâu, lớp trong gồm các tế bào có dạng hình góc cạnh đến hình cầu với thành tế bào mỏng và không màu.
Túi bào tử (Asci.)	Túi bào tử mọc thành bó hoặc cụm, có 02 lớp vỏ, hình chuỳ; kích thước trước khi lớp vỏ ngoài bị vỡ là 40 - 65 μm × 12 - 15 μm và chiều dài từ 120 đến 150 μm ngay trước khi tách vỏ để phóng thích bào tử ra môi trường. Mỗi túi chưa 08 bào tử hữu tính.
Bào tử túi (Ascospores)	Đơn bào không có vách ngăn, trong suốt, hình trụ, phình nhẹ ở giữa, hơi cong nhẹ, kích thước 12,5 - 16 × 4,5 - 6,5 μm, hai đầu tù không đều (không đối xứng).
Quả cành (Pycnidia)	Quả cành được hình thành trên quả, lá trên cây, cành chết, lá rụng, và trong cả môi trường nuôi cấy. Chúng tồn tại riêng rẽ hoặc tụ lại thành nhóm, có hình cầu, nằm chìm trong mô, màu nâu đến nâu sẫm, đường kính 70 đến 330 μm. Vách dày tối đa 4 lớp tế bào, bên ngoài dạng mô bảo vệ cứng, bên trong dạng giả như mô. Lỗ mở có màu sẫm hơn, hình trốn, hơi lồi dạng núm, đường kính 10 đến 15 μm.
Bào tử phân sinh (Conidia)	Đơn bào, hình trứng hoặc hình elip, trong suốt, có nhiều đốm màu, phần đỉnh hơi dẹt ra giống cây giùi, kích thước 9,4 - 12,7 × 5 - 8,5 μm; bào tử được bao quanh bởi một lớp vở nhày trong suốt có thể nhìn thấy được (độ dày nhỏ hơn 1,5 μm) tạo thành một lớp choàng không màu, một tế bào, có phần phụ thể hình trụ dài 9 μm.
Bào tử giống (Spermatia)	Hình thành trên môi trường giàu dinh dưỡng và trên ký chủ; bào tử giống có hình dạng quả tạ (phần giữa hẹp, hai đầu phình to hơn), hiếm khi hình trụ, dạng thẳng hoặc hơi cong, kích thước 5 - 8 × 0,5 - 1 μm.

Hình 1 - Tản nấm P.citricarpa trên môi trường PDA (Nguồn: Boughalleb và cs., 2020)

Hình 2 - Quả cành của nấm P.citricarpa (Nguồn: Glienke và cs., 2011)

Hình 3 - Quả cành của nấm P.citricarpa (Nguồn: CISEH, 2018)

Hình 4 - Bào tử phân sinh nấm P.citricarpa (Nguồn: EPPO, 2020 & Glienke và cs., 2011)

7.2 Giám định bằng phương pháp phân tích trình tự gen (DNA sequening)

7.2.1 Tách chiết DNA tổng số

- Đối với mẫu lá, vỏ cành, vỏ quả: thực hiện tách chiết mẫu nghi nhiễm nấm theo điều 7.2.1 của TCVN 12195-1:2019 hoặc theo hướng dẫn của Kit tách chiết DNA thương mại (4.22).

- Đối với mẫu nấm đã phân lập thuần trên môi trường PDA (4.29): thực hiện tách chiết theo hướng dẫn của Kit tách chiết DNA thương mại (4.22) hoặc có thể tách chiết bằng phương pháp sau:

Bước 1: Thu 50 mg sợi nấm trên môi trường PDA (4.29) bằng kim khêu nấm (3.6), cho vào ống eppendorf 1,5 ml (3.15), đặt ở nhiệt độ - 20 °C trong tủ lạnh sâu (3.17) khoảng 01 - 02 giờ.

Bước 2: Thêm 300 μl dung dịch đệm CTAB (4.14) đã bổ sung thêm 2-mercaptoethanol (4.36) với tỷ lệ 0,2% (v/v) vào ống eppendorf có chứa sợi nấm. Nghiền nát bằng chày nhựa (3.2).

Bước 3: Ủ dịch nghiền nấm ở 65 °C bằng bể ổn nhiệt (3.1) trong 30 phút (cứ 10 phút lại đảo nhẹ ống eppendorf để trộn đều dung dịch bên trong).

Bước 4: Ly tâm 05 phút ở tốc độ 13 000 vòng/ phút bằng máy ly tâm (3.10). Thu dịch trên tủa, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

Bước 5: Cho một lượng thể tích tương đương Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) (4.8) vào ống eppendorf chứa dịch trên kết thu được ở Bước 4 và lắc mạnh.

Bước 6: Ly tâm 05 phút ở tốc độ 13 000 vòng/ phút bằng máy ly tâm (3.10). Thu dịch trên tủa, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới.

Bước 7: Cho một lượng thể tích tương đương Isopropanol (4.21) lạnh vào ống eppendorf chứa dịch trên tủa. Đảo nhẹ nhàng và để ở nhiệt độ - 20 °C trong 01 giờ hoặc qua đêm ở nhiệt độ 0 °C. Ly tâm 05 phút ở tốc độ 13 000 vòng/ phút bằng máy ly tâm (3.10). Loại bỏ phần dịch phía trên.

Bước 8: Rửa 02 lần bằng cồn 70% (4.9). Hòa tan kết tủa bằng 50 μl dung dịch đệm TE (4.13).

7.2.2 Nhân gen

DNA tổng số thu được sau khi tách chiết tiến hành nhân gen trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.8).

Mẫu đối chứng dương (hoặc mẫu nấm P.citricarpa) (4.27), mẫu đối chứng âm (mẫu không nhiễm nấm P.citricarpa) (4.26) và mẫu trắng (mẫu nước sử dụng để chuẩn bị phản ứng PCR) (4.28) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để giám định nấm đốm đen nấm P.citricarpa (4.5)

Thành phần và dung tích các chất trong phản ứng như sau:

Thành phần	Dung tích
Kit thực hiện phản ứng PCR	10 μl
Mồi xuôi GCN (10 μM)	1 μl
Mồi ngược GCMR (10 μM)	1 μl
DNA tổng số	1 μl
Nước khử ion (Nuclease-free water)	7 μl
Tổng	20 μl

Chu trình nhiệt:

94 °C trong 2 phút	Lặp lại 39 chu kì
94 °C trong 30 giây
64 °C trong 30 giây
72 °C trong 60 giây
72 °C trong 10 phút

CHÚ THÍCH 1: Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm sử dụng của nhà sản xuất.

7.2.3 Kiểm tra kết quả nhân gen

Sản phẩm PCR được trộn với đệm nhuộm điện di (4.19), sau đó điện di bằng máy điện di (3.9) sử dụng gel agarose 1,5 % (4.1) đã có sẵn thuốc nhuộm axit nucleic (4.34) trong dung dịch đệm điện di TAE (4.11) hoặc TBE (4.12) với thời gian 30 phút ở hiệu điện thế 110 V.

Đọc kết quả điện di bằng hệ thống đọc bản gel UV (3.5).

Các loại đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Đối chứng dương: xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~ 300 bp.

+ Đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện vạch trên bản agarose gel Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nghi ngờ nhiễm nấm P.citricarpa) khi xuất hiện một vạch duy nhất có kích thước ~ 300 bp.

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính (không nhiễm nấm P.citricarpa) khi không xuất hiện vạch trên bản agarose gel.

+ Thực hiện giám định lại nếu mẫu cho kết quả PCR không rõ ràng.

7.2.4 Phân tích trình tự gen (DNA sequencing)

Sản phẩm PCR của mẫu nghi ngờ nhiễm nấm P.citricarpa (đã kiểm tra theo điều 7.1.3 của tiêu chuẩn này) được gửi trực tiếp đi giải trình tự gen hoặc được tinh sạch bằng bộ kit thương mại (4.22) theo hướng dẫn của nhà sản xuất trước khi gửi đi phân tích tự gen.

Trình tự mẫu được so sánh với trình tự tiêu chuẩn của nấm P.citricarpa đã công bố sử dụng ứng dụng tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) để định danh loài. Nếu mẫu nghi ngờ nhiễm nấm P.citricarpa có mức đồng nhất trình tự > 99% thì mẫu đó kết luận là nhiễm nấm P.citricarpa.

7.3 Giám định bằng phương pháp Realtime PCR

7.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Thực hiện tách chiết mẫu nghi nhiễm nấm theo điều 7.1.1 của tiêu chuẩn này.

7.3.2 Phản ứng Realtime PCR

DNA tổng số thu được sau khi tách chiết tiến hành phản ứng Realtime PCR trong máy Realtime PCR (3.14).

Đối chứng dương (hoặc mẫu nấm P.citricarpa) (4.27), đối chứng âm (mẫu không nhiễm nấm P.citricarpa) (4.26) và mẫu trắng (mẫu nước sử dụng để chuẩn bị phản ứng PCR) (4.28) được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu (4.6) và mẫu dò probe (Taqman) (4.25):

Thành phần và dung tích các chất trong phản ứng như sau:

Thành phần	Dung tích
Kit thực hiện phản ứng Reatime PCR	5 μl
Mồi xuôi Gc F2 (10 μM)	1 μl
Mồi ngược Gc R2 (10 μM)	1 μl
Mẫu dò (5 pM)	0, 5 μl
DNA tổng số	0,5 μl
Nước khử ion (Nuclease-free water)	2 μl
Tổng	10 μl

Chu trình nhiệt:

95 °C trong 10 phút
95 °C trong 15 giây	Lặp lại 40 chu kì
60 °C trong 60 giây

CHÚ THÍCH 2: Nhiệt độ của từng giai đoạn trong chu trình nhiệt có thể thay đổi tùy theo sinh phẩm sử dụng của từng nhà sản xuất.

7.3.3 Đọc kết quả

Kết quả phản ứng Realtime PCR được hiển thị trên màn hình máy Realtime PCR.

Các loại đối chứng được sử dụng trong mỗi lần thực hiện giám định đáp ứng các điều kiện sau:

+ Đối chứng dương: xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 35.

+ Đối chứng âm và mẫu trắng: không xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct).

Khi đó, mẫu giám định sẽ được đọc kết quả như sau:

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả dương tính (nhiễm nấm p.citricarpa) khi xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct). Giá trị Ct ≤ 35.

+ Mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính (không nhiễm nấm P.citricarpa) khi không xuất hiện đường chuẩn (đường cong) khuếch đại theo hàm số mũ (giá trị chu kỳ ngưỡng Ct).

+ Mẫu kiểm tra có giá trị chu kỳ ngưỡng 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ nhiễm nấm. Những mẫu nghi ngờ này cần được thực hiện giám định lại để khẳng định kết quả.

7.4 Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là nhiễm nấm đốm đen P.citricarpa khi:

+ Nấm có đặc điểm hình thái phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở điều 7.1.2 của tiêu chuẩn này. Hoặc

+ Có kết quả dương tính với phương pháp giám định bằng Realtime PCR Hoặc

+ Trình tự gen có mức đồng nhất trình tự ≥ 99% với các trình tự tiêu chuẩn của nấm P.citricarpa có trên GenBank bằng ứng dụng Nucleotide Blast.

8 Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

Thông tin về mẫu giám định

Tên loài nấm

Phương pháp giám định

Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu kết quả giám định chi tiết xem phụ lục C.

 

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1 Tên khoa học và vị trí phân loại

Tên tiếng Việt: nấm đốm đen

Tên khoa học: Phyllosticta citricarpa (McAlpine) Aa

Tên tiếng Anh: citrus black spot

Vị trí phân loại:

Bộ: Botryosphaeriales

Họ: Botryosphaeriaceae

Chi: Phyllosticta

A.2 Phân bố

Châu Á: Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Myanmar, Philippine, Trung Quốc; Châu Âu: Nga; Bắc Mỹ: Cuba, Hoa Kỳ; Châu Đại dương: Úc; Châu Phi: Ai Cập, Angola, Ghana, Kenya, Nam Phi, Tunisia, Uganda, Zimbabwe; Nam Mỹ: Argentina, Brazil, Uruguay.

A.3 Ký chủ chính

Cam chua (Citrus aurantium), Chanh vàng (Citrus limon), Bưởi (Citrus maxima), Quýt (Citrus reticulata), Cam ngọt (Citrus sinensis), Chanh yên (Citrus medica).

A.4 Đặc điểm sinh học

Dịch tễ học của bệnh đốm đen cây có múi bị ảnh hưởng bởi sự sẵn có của nguồn bệnh, sự xuất hiện của các điều kiện môi trường thuận lợi cho lây nhiễm của nấm (điều kiện ấm và ẩm ướt), chu kỳ sinh trưởng của cây có múi và tuổi của quả liên quan đến tính mẫn cảm với sự lây nhiễm của nấm (Kotzé, 2000). Ở những khu vực có mưa theo mùa, quả thể và bào tử túi chỉ sinh ra trên tàn dư cây bệnh, là nguồn bệnh chính trên đồng ruộng, ở những khu vực mưa nhiều, nơi quả trái mùa có tổn thương vẫn còn trên cây, hoặc nơi ra hoa liên tiếp và không đều, bào tử phân sinh của P.citricarpa là nguồn bệnh quan trọng (Spósito và cs., 2011).

Nấm P.citricarpa phát triển tốt ở nhiệt độ từ 24 °C đến 27 °C và phát triển thích hợp nhất trong môi trường PDA (ở 27 °C). Quá trình nảy mầm của bào tử bị kích thích bởi axit citric ở nồng độ 0,1 đến 0,5%. Nảy mầm tối đa, đạt gần 80%, khi sử dụng dung dịch axit citric nồng độ 0,3% và bào tử ủ bệnh trong 4 ngày ở nhiệt độ 25 °C trong phòng thí nghiệm (EPPO, 2020). Quả thể (Pseudothecia) hình thành sau 40 đến 180 ngày kể từ khi lá rụng, tùy thuộc vào điều kiện ẩm ướt, khô ráo xen kẽ và nhiệt độ trong giai đoạn đó. Nhiệt độ tối ưu cho sự hình thành quả thể là 21 °C đến 28 °C; quả thể không được hình thành khi nhiệt độ dưới 7°C hoặc trên 35°C (Lee & Huang, 1973).

Sau khi cây bị xâm nhiễm, nấm thường tồn tại ở trạng thái không hoạt động cho đến khi quả phát triển hoàn toàn hoặc chín, và các triệu chứng chỉ trở nên rõ rệt sau nhiều tháng kể từ thời điểm nhiễm. Quả cành (Pycnidia) chứa bào tử được hình thành trên quả, lá, cành đã chết và cuống quả (Kotzé, 2000). Trên quả đã trưởng thành, sự biểu hiện triệu chứng có xu hướng nghiêm trọng hơn khi gặp điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, ánh sáng mạnh, khô hạn hoặc cây có sức sống yếu. Những cây già thường có số lượng đốm đen cam quýt nhiều hơn so với cây non. Việc lây lan của P.citricarpa sang các khu vực mới chủ yếu xảy ra thông qua cây giống hoặc vật liệu trồng bị nhiễm bệnh (Kotzé, 2000; Timmer, 2004).

Hình 5 - Triệu chứng đốm “hard spot” kèm theo quả cành do nấm P.citricarpa gây ra trên quả (Nguồn: Andrew và cs., 2019)

Hình 6 - Triệu chứng đốm “freckle spot” do nấm P.citricarpa gây ra trên quả (Nguồn: Andrew và cs., 2019)

Hình 7 - Triệu chứng đốm “hard spot” (mũi tên trắng) và “freckle spot” (mũi tên đen) xuất hiện trên quả bị nhiễm nấm (Nguồn: EPPO, 2020)

Hình 8 - Quả cành của nấm P.citricarpa xuất hiện cùng với triệu chứng đốm “hard spot” khi gây hại trên quả (Nguồn: EPPO, 2020)

Hình 9 - Triệu chứng đốm “virulent spot” do nấm P.citricarpa gây ra trên quả [Nguồn: Andrew và cs., 2019]

Hình 10 - Triệu chứng “false melanose” do nấm P.citricarpa gây ra trên quả [Nguồn: Andrew và cs., 2019]

Hình 11 - Triệu chứng kết hợp giữa “virulent spot” (khoanh tròn) và “freckle spot” (mũi tên) do nấm P.citricarpa gây ra trên quả [Nguồn: Andrew và cs., 2019]

Hình 12 - Quả cành của nấm P.citricarpa hình thành trên vết bệnh “virulent spot” gây hại trên quả [Nguồn: Andrew và cs., 2019]

Hình 13 - Triệu chứng do nấm P.citricarpa gây hại trên lá cây chanh [Nguồn: EPPO, 2020]

Hình 14 - Triệu chứng do nấm P.citricarpa gây hại trên cành cây chanh [Nguồn: EPPO, 2020]

 

Phụ lục B

(Quy định)

Cách pha các dung dịch

B.1 Dung dịch EDTA 0,5 M (pH 8)

EDTA (4.20)	18,61 g
Nước cất (4.32)	vừa đủ 100 ml

Hoà tan lượng EDTA trong 40 ml - 60 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH 10M (B.7). Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.2 Dung dịch đệm điện di TAE

EDTA 0,5 M (B.1)	2 ml
Tris-Base (4.35)	4,84 g
Axit acetic (4.2)	1,15 ml
Nước cất (4.32)	vừa đủ 1000 ml

Hoà tan các thành phần trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.3 Dung dịch đệm điện di TBE

EDTA 0,5 M (B.1)	4 ml
Tris-Base (4.35)	10,8 g
Axit boric (4.3)	5,5 g
Nước cất (4.32)	vừa đủ 1000 ml

Hoà tan các thành phần trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.4 Dung dịch đệm TE

EDTA (B.1)	0,2 ml
Tris-HCl 1 M (B.8)	1 ml
Nước cất (4.32)	vừa đủ 100 ml

Hoà tan các thành phần trên trong 40 ml - 60 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.5 Dung dịch đệm tách chiết CTAB

EDTA 0,5 M (B.1)	40 ml
Tris-HCl 1 M (B.8)	100 ml
NaCl 5 M (B.6)	280 ml
CTAB (4.7)	20 g
Nước cất (4.32)	vừa đủ 1000 ml

Hoà tan các thành phần trên trong 400 ml - 600 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 1000 ml. Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.6 Dung dịch NaCl

NaCl (4.31)	29,22 g
Nước cất (4.32)	vừa đủ 100 ml

Hoà tan lượng NaOH trên trong 40 ml - 60 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.7 Dung dịch NaOH 10 M

NaOH (4.30)	40 g
Nước cất (4.32)	vừa đủ 100 ml

Hoà tan lượng NaOH trên trong 40 ml - 60 ml nước cất trước, khuấy đều. Thêm lượng nước cất cho đủ 100 ml. Bảo quản ở ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.8 Dung dịch Tris-HCl (pH 8)

Tris-Base (4.35)	66,55 g
Nước cất (4.32)	vừa đủ 500 ml

Hoà tan lượng Tris-Base trên trong 200 ml - 300 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng axit clohydric 37 % (HCl) (4.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 500 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng.

B.9 Agarose gel 1,5 %

Agarose (4.1)	1,5 g
Dung dịch TAE (B.20 hoặc dung dịch TBE (B.3)	100 ml

Hoà tan lượng Tris-Base trên trong 200 ml - 300 ml nước cất trước, khuấy đều và chỉnh pH 8,0 bằng axit clohydric 37 % (HCl) (4.4). Thêm lượng nước cất cho đủ 500 ml. Bảo quản ở 4 °C. Thời hạn sử dụng: 03 tháng

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Tổ chức giám định ....................................	CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc ---------------
	............... ngày ... tháng ... năm 20........

 

KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH SINH VẬT GÂY HẠI

Kính gửi: ........................................................................................

1. Tên mẫu:

2. Mã số mẫu:

3. Tình trạng mẫu:

4. Ngày nhận mẫu:

5. Nội dung giám định:

TT	Chỉ tiêu giám định	Phương pháp giám định	Kết quả giám định
1	Nấm đốm đen Phyllosticta citricarpa	TCVN 12195-2-18: 2025	Nhiễm/ không nhiễm

 

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ và tên)

LÃNH ĐẠO TỔ CHỨC GIÁM ĐỊNH (ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

Ghi chú:

- Kết quả ghi trong phiếu này chỉ có giá trị đối với mẫu giám định tại phòng thí nghiệm.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Andrew K. Miles, Malcolm W. Smith, Nga T. Tran, Timothy A. Shuey, Megan M. Dewdney, and André Drenth (2019). Identification of Resistance to Citrus Black Spot Using a Novel In-field Inoculation Assay. HORTSCIENCE 54(10): 1673-1681.

[2] Boughalleb-M'Hamdi, A. Fathallah, N. Benfradj, S. Ben Mahmoud, A. Bel Hadj All, L. Medhioub, I. Jaouadi, J. Huber, C. Jeandel, R. loos (2020). First report of citrus black spot disease caused by Phyllosticta citricarpa on Citrus limon and C.sinensis in Tunisia. New Disease Reports Volume 41, Issue, Pages1-38.

[3] CABl (2024). Crop Protection Compendium (https://www.cabidigitallibrary.org/. Ngày truy cập: 14/11/2024).

[4] CISEH (2018). Center for Invasive Species and Ecosystem Health (https://www.invasive.org/browse/detail.cfm?imgnum=5498985. Ngày truy cập: 16/11/2024).

[5] EFSA (European Food Safety Authority), Parnell, S., Schenk, M., Schrader, G., Vicent, A., Delbianco, A. & Vos, S. (2020) Pest survey card on Phyllosticta citricarpa. EFSA supporting publication, 17(6), 35.

[6] EPPO (2024). https://gd.eppo.int/ (Ngày truy cập: 02/12/2024).

[7] Glienke, O.L. Pereira, D. stringari, J. Fabris, V. Kava-Cordeiro, L. Galli-Terasawa, J. Cunnington, R.G. Shivas, J.Z. Groenewald, P.W. Crous (2011). Endophytic and pathogenic Phyllosticta species, with reference to those associated with Citrus Black Spot. Persoonia 26, 2011:47-56.

[8] Kotze, J.M. 2000. Black spot. In L.W. Timmer, S.M. Garnsey & J.H. Graham, eds. Compendium of Citrus Diseases, 2nd edn, pp. 23-25. Saint Paul, MN, USA, APS Press. 128 pp.

[9] Lee, Y.S. & Huang, C.S. 1973. Effect of climatic factors on the development and discharge of ascospores of the citrus black spot fungus. Journal of Taiwan Agricultural Research, 22: 135- 144.

[10] Spósito, M.B., Amorim, L., Bassanezi, R.B., Yamamoto, P.T., Felippe, M.R. & Czermainski, A.B.C. 2011. Relative importance of inoculum sources of Guignardia citricarpa on the citrus black spot epidemic in Brazil. Crop Protection, 30: 1546-1552.

[11] Timmer, L.W. 2004. Evaluating the risks of introduction of citrus black spot into the U.S. In 2004 Annual Report, pp. 36-38. Visalia, CA, USA, California Citrus Research Board.

[12] Trần Thị Nga, Andrew K Miles, Ralf G Dietzgen, André Drenth. 2017. Nghiên cứu phương pháp để kích thích sinh sản hữu tính của Phyllosticta citricarpa tác nhân gây bệnh đốm đen cây có múi trong điều kiện thí nghiệm. Tạp chí BVTV - Số 1/2017.

[13] Truter, M., Labuschagne, P.M., Kotze, J.M., Meyer, L. & Korsten, L. 2007. Failure of Phyllosticta citricarpa pycnidiospores to infect Eureka lemon leaf litter. Australasian Plant Pathology, 36: 87-93.