Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8710-4:2019 Quy trình chẩn đoán bệnh đầu vàng ở tôm

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 4: BỆNH ĐẦU VÀNG Ở TÔM

Aquatic animal diseases - Diagnostic procedure - Part 4: Yellow head disease in shrimp

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh đầu vàng do vi rút đầu vàng genotype 1 (YHV1) gây ra ở tôm.

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh đầu vàng (Yellow head disease - YHV) ở tôm do vi rút đầu vàng genotype 1.

Vi rút đầu vàng genotype 1 (YHV1) là 1 trong 8 genotype của phức hợp đầu vàng và cũng là tác nhân duy nhất gây bệnh đầu vàng. Vi rút YHV1 có dạng hình que kích thước 40-50 nm x 150-180 nm, thuộc giống Okavirus, họ Roniviridae, bộ Nidovirales. Cấu trúc acid nhân là ARN, sợi đơn dương (+; ssRNA).

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích được công nhận, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1  Etanol, từ 70 % đến 100 % (C₂H₆O).

3.1.2  Dung dịch muối đệm phosphate (PBS)

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và realtime RT - PCR

3.2.1  Cặp mồi RT - PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.2  Cặp mồi Realtime RT - PCR, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò (Probe).

3.2.3  Kít tách chiết ARN

3.2.4  Kít nhân gen RT - PCR

3.2.5  Kít nhân gen (Realtime RT-PCR).

3.2.6  Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.7  Thang chuẩn AND (Ladder)

3.2.8  Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.9  Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A.1).

3.2.10  Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.2.11  Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.12  Agarose

4.  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR và Realtime RT- PCR

4.1.1  Máy nhân gen PCR.

4.1.2  Máy nhân gen Realtime PCR

4.1.3  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

4.1.4  Máy lắc trộn vortex

4.1.5  Máy spindown

4.1.6  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.1.7  Máy đọc gel

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

Những loài tôm mẫn cảm với vi rút đầu vàng (YHV1) gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) và một số loại tôm khác.

Tôm sú mẫn cảm với YHV1 từ giai đoạn hậu ấu trùng (PL15). Các loài tôm khác có thể nhiễm bệnh ở các giai đoạn khác nhau nhưng thường xảy ra ở giai đoạn từ 40 ngày đến 70 ngày tuổi. Tỉ lệ chết có thể đến 100% trong vòng từ 3 ngày đến 5 ngày kể từ khi quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý.

Vi rút đầu vàng (YHV1) có thể lây truyền theo chiều ngang từ thức ăn nhiễm vi rút, tôm nhiễm bệnh bài tiết vi rút ra môi trường hoặc một số tôm tự nhiên nhiễm YHV1 lây truyền cho các tôm trong ao nuôi. Những cá thể nhiễm bệnh mạn tính có thể truyền vi rút sang con cháu qua đường sinh sản.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Tôm ăn nhiều bất thường rồi đột ngột ngừng ăn và chết sau 2 ngày đến 4 ngày. Tỷ lệ chết có thể lên đến 100% sau 3 ngày đến 5 ngày nhiễm bệnh.

Tôm bị bệnh tập trung ở rìa ao hoặc gần mặt nước, toàn than màu nhợt nhạt.

Phần giáp đầu ngực có màu vàng và toàn thân nhợt nhạt.

5.3  Bệnh tích

Mang chuyển màu trắng, vàng hoặc nâu.

Gan tụy sưng và chuyển màu vàng.

Trong một số trường hợp tôm không xuất hiện dấu hiệu bệnh lí nhưng quan sát các tế bào gan tụy, tế bào máu, cơ quan lympho, ruột, mang, tuyến anten, mô liên kết thấy các thể vùi trong tế bào chất, nhân tế bào co rúm hoặc vỡ thành nhiều mảnh.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Phương pháp RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

6.1.1  Lấy mẫu

Số lượng tôm trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích cỡ của tôm:

- Giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng: 100 mg

- Tôm trưởng thành, tôm bố mẹ: lấy từ 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu.

CHÚ THÍCH: Lấy tôm còn sống, sắp chết hoặc mới chết có biểu hiện bệnh lý.

6.1.2  Bảo quản mẫu

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1).

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1).

6.1.3  Chuẩn bị mẫu

Giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng: Sử dụng nguyên con.

Tôm trưởng thành: Lấy mang, máu, gan tụy.

Lượng mẫu cần chuẩn bị: Khoảng 30 mg.

Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm PBS (3.1.2), để tạo thành huyễn dịch 10 %, chia thành hai phần: một phần cho thực hiện xét nghiệm và một phần lưu trữ ở tủ âm (-80 °C).

6.1.4  Cách tiến hành

6.1.4.1  Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ARN: PureLinK Viral RNA/DNA Mini kít (50) (Lot 1361246)^[1]) (xem phụ lục B).

6.1.4.2  Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 10F/144R (3.2.1) để phát hiện YHV1. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc;

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 10 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 90 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.1.4.3  Thực hiện phản ứng RT - PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy PCR (4.1.1) theo phương pháp RT PCR sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.1) sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục C).

6.1.4.4  Điện di

6.1.4.4.1  Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.12) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.9) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi.

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.11) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược, không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.4.4.2  Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.10) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.6), chạy kèm theo thang chuẩn DNA (ladder) (3.2.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.7) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 25 min.

6.1.5  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 135 bp.

Với điều kiện phản ứng trên:

Kết quả mẫu thử dương tính khi:

- Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 135 bp.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi:

- Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng

6.2  Phương pháp Realtime RT - PCR

6.2.1  Lấy mẫu (Theo 6.1.1)

6.2.2  Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2)

6.2.3  Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3)

6.2.4  Cách tiến hành

6.2.4.1  Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ARN: PureLinK Viral RNA/DNAMini kit (50) (Lot 1361246)^[2]) (xem phụ lục B)

6.2.4.2  Chuẩn bị mồi

Phương pháp Realtime RT-PCR sử dụng cặp mồi YHV 141F / YHV 206R và YHV p (3.2.2) để phát hiện vi rút đầu vàng YHV1. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục D, Bảng D.1).

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: Pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

Đoạn dò YHV-p sử dụng nồng độ 6 µM: Pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (3 µl mồi gốc và 47 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.2.4.3  Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime PCR (4.1.2) theo phương pháp Realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút đầu vàng YHV1 sử dụng cặp mồi YHV 141F / YHV 206R và YHV p (3.2.2) (xem phụ lục D).

6.2.4.4. Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct);

- Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct dao động ± 2.

Với điều kiện phản ứng như trên:

- Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính;

- Mẫu không có giá trị Ct là âm tính;

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ Ý: - Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả;

- Phản ứng realtime RT-PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

7  Kết luận

Tôm được xác định nhiễm bệnh vi rút đầu vàng khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh đầu vàng và:

- Có kết quả dương tính với YHV1 bằng phương pháp RT PCR, hoặc;

- Có kết quả dương tính với YHV1 bằng phương pháp Realtime RT- PCR.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1  Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.2.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl) 8 g

Natri hydro photphat dihydrat (Na₂HPO₄.2H₂O) 2,9 g

Kali dihydro photphat (KH₂PO₄) 0,2 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Nước cất 1000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B.1  Chuẩn bị hóa chất

VÍ DỤ: Kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit, Cat. No: 12280-050

Các hóa chất cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit, với thể tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

- Proteinase K;

- Dung dich đệm Lysis Buffer;

- Dung dịch Carrier ARN;

- Dung dich Wash buffer (W5);

- Nước RNAse-free (E3).

Cách pha hỗn hợp dung dịch Carrier và Lysis Buffer

N x 0,21 mL = A mL

A mL x 28 µL/mL = B µL

Trong đó:

- N là số mẫu cần tách chiết;

- A là tổng số mL Lysis Buffer cần cho N mẫu;

- B là tổng số µL Carrier ARN cần cho N mẫu.

B.2  Tiến hành

- Cho 25 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml.

- Cho 200 µL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K.

(Nếu thể tích mẫu <200 µL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 µL bằng dung dịch PBS hoặc 0.9% NaCl).

- Cho hỗn hợp dung dịch Lysis Buffer và Carrier ARN vào ống chứa mẫu; đóng nắp ống và vortex 15 s.

- Ủ mẫu ở 56°C trong 15 min.

- Cho thêm 250 µL cồn 96 - 100 % vào ống mẫu; đóng nắp và vortex 15 s.

- Để ở nhiệt độ phòng 5 min.

(Mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên).

- Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc.

- Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 min đến 3 min, chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Cho 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) vào cột lọc; ly tâm 12.000 vòng trong 2 min đến 3 min. Chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Lặp lại bước 9 với 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) một lần nữa.

- Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới.

- Ly tâm khô 12000v trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5.

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 µL.

- Cho 10 - 50 µL nước ARNse-free (E3) (có sẵn) vào cột lọc.

- Để ở nhiệt độ phòng 1 min; Ly tâm cột lọc ở 12000 vòng trong 1 min đến 2 min.

- Lấy sản phẩm dưới cột lọc; Bảo quản ARN ở nhiệt độ âm 80 °C.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh đầu vàng.

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp RT PCR phát hiện YHV1

C.1  Trình tự cặp mồi

Bảng C.1 - Trình tự cặp mồi ^[2]

C.2  Thực hiện phản ứng RT - PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng C.2).

VÍ DỤ: RT-PCR dùng kít nhân gen SuperScript^® III One-Step RT-PCR with Platinum^®Taq.Cat: 12574-026 ^[3])

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng RT - PCR

Chuyển 22,0 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: Cho 3 µl mẫu ARN tách chiết đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 3 µl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 3µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng RT - PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Bảng C.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng RT PCR

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp realtime RT - PCR phát hiện YHV1

D.1  Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Bảng D.1- Trình tự cặp mồi và đoạn dò^[3]

D.2  Thực hiện phản ứng Realtime RT- PCR

Phương pháp Realtime RT-PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của YHV1, sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (3.2.2) và kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: theo kít SuperScript III Platinum^® one step qRT-PCR System, Cat.No: 11732-020^[4])

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng D.2).

Bảng D.2 - Thành phần phản ứng Realtime RT- PCR

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ARN được tách chiết từ mẫu dương tính chuẩn với YHV1;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease;

- Mẫu thử: Cho 5 pl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng realtime PCR bằng máy nhân gen (4.1.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.3).

Bảng D.3 - Chu trình nhiệt của phản ứng realtime - PCR

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] FAO/NACA. 2001. Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fish. Pap. No.402/2:

[2] OIE 2017 Chapter 2. 2. 9- Infection with yellow head virus genotype 1

[3] Tang K.F.J. and Lightner D.V., 2001. Development of real-time PCR assays for detection of White spot syndrome virus, Yellow head virus, Taura syndrome virus and Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp.

[4] Tiêu chuẩn cơ sở TCCS 01:2017/TY-TS Quy trình xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh đầu vàng (YHV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR

[5] TCVN 8710-4-2011 Quy trình chẩn đoán bệnh đầu vàng (YHV) ở tôm.

[6] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn - Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.