Tiêu chuẩn TCVN 14471:2025 Phân bón - Xác định hàm lượng axit lactic bằng quang phổ hấp thụ phân tử

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14471 : 2025

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT LACTIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

Fertilizers - Determination of lactic acid content by spectrophotometric method

Lời nói đầu

TCVN 14471:2025 do Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban -Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT LACTIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

Fertilizers - Determination of lactic acid content by spectrophotometric method

CẢNH BÁO: Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định axit lactic có hàm lượng từ 0,1 % trở lên trong phân bón bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử.

Thông tin giới thiệu hoạt chất axit lactic xem Phụ lục A.

2 Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

TCVN 9595-3:2013 (ISO/IEC GUIDE 98-3:2008) Độ không đảm bảo đo - Phần 3: Hướng dẫn trình bày độ không đảm bảo đo (GUM:1995;

TCVN 9486:2018, Phân bón - Lấy mẫu

TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991), Phân bón rắn - Phương pháp chuẩn bị mẫu để xác định các chỉ tiêu hóa học và vật lý

TCVN 12105:2018, Phân bón vi sinh vật - Lấy mẫu

3 Nguyên tắc

Phân bón được hòa tan trong nước ấm. Sau đó dung dịch lọc được xử lý bằng enzym và các chất sinh hóa theo thứ tự sau:

L-lactat dehydrogenaza (L-LDH), D-lactat dehydrogenaza (D-LDH) trong sự có mặt của nicotinamit- adenin-dinucleotit (NAD) để oxi hóa axit L-lactic, D-lactic (lactat) thành pyruvat và chuyển hóa NAD thành Nicotinamit-adenin-dinucleotit dạng khử (NADH) (theo phản ứng 1 và 2).

Glutamat-pyruvat-transaminaza (GPT) trong sự có mặt L-glutamat để chuyển pyruvat thành L-alanin và chuyển L-glutamat thành a-xetoglutarat (theo phản ứng 3)

Lượng NADH tạo thành được xác định bằng phép đo quang phổ hấp thụ phân tử bước sóng 340 nm và lượng này tỷ lệ thuận với hàm lượng axit latic.

4 Thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, trong quá trình phân tích chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hai lần phù hợp với TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (độ dẫn điện < 10 μS/m); sau đây gọi là nước

4.1  Glycylglycine (C₄H₈N₂O₃).

4.2  Axit L-glutamic (C₅H₉NO₄).

4.3  Kali hexaxyanoferat (II) ngậm 3 phân tử nước (K₄[Fe(CN)₆].3H₂O) tinh thể

4.4  Dung dịch kali hexaxyanoferat (II) ngậm 3 phân tử nước c(K₄[Fe(CN)₆].3H₂O) = 35,9 g/L.

Cân 35,9 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm 3 phân tử nước (4.3) vào bình định mức dung tích 1000 mL có chứa sẵn nước, hòa tan, định mức đến vạch định mức bằng nước.

4.5  Kẽm sulfat ngậm bảy phân tử nước, (ZnSO₄.7H₂O) tinh thể.

4.6  Dung dịch kẽm sulfat, c(ZnSO₄.7H₂O) = 71,8 g/L.

Cân 71,8 g kẽm sulfat ngậm 7 phân tử nước (4.5) vào bình định mức dung tích 1000 mL có chứa sẵn nước, hòa tan, định mức đến vạch định mức bằng nước.

4.7  Natri hydroxit (NaOH), tinh thể.

4.8 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 10 mol/L.

Cân 40 g natri hydroxit (4.7) vào bình định mức dung tích 100 mL có chứa sẵn nước, hòa tan, định mức đến vạch định mức bằng nước.

4.9  Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 moI/L.

Hút 1 mL natri hydroxit, c(NaOH) = 10 mol/L (4.8), hòa tan với khoảng 60 mL nước trong bình định mức dung tích 100 mL. Thêm nước đến vạch định mức và lắc đều.

4.10  Glyxerin, (C₃H₈O₃).

4.11 Dung dịch glyxerin (C₃H₈O₃) 50%(v/v).

Hòa tan 1 phần thể tích glyxerin (4.10) với 1 phần thể tích nước.

4.12  Amoni sulfat, ((NH₄)2SO₄) tinh thể.

4.13  Dung dịch amoni sulfat, c((NH₄)2SO₄) =3,2 mol/L.

Cân 422,84 g amoni sulfat (4.12) vào bình định mức dung tích 1000 mL, hòa tan, định mức đến vạch định mức bằng nước.

4.14  Nicotinamit-adenin dinucleotit (C₂₁H₂₇N₇O₁₄P₂) (NAD).

4.15  Huyền phù glutamat-pyruvat transaminase (GPT), 10 mg/L

Huyền phù 20 mg GPT trong 1 mL dung dịch amoni sulfat 3,2 mol/L (4.13), pH khoảng 7. Hoạt tính riêng của huyền phù (GPT) phải ít nhất là 1600 đơn vị/mL ở 25 °C. Nếu không, phải chuẩn bị huyền phù GPT mới.

Cho 1,0 mL dung dịch amoni sulfat 3,2 mol/L (4.13) vào 1 mL huyền phù chứa 20 mg GPT và trộn đều. Ly tâm trong khoảng 10 min với gia tốc 4 000 r/min, hút bỏ 1,0 mL phần dịch trong suốt phía trên.

Dung dịch huyền phù có thể giữ được ít nhất 1 năm nếu bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

Khi sử dụng huyền phù này, nên thực hiện trong môi trường nhiệt độ khoảng ±10 °C.

4.16 Dung dịch L-lactat dehydrogenase (L-LDH).

Hòa tan 10 mg huyền phù L-LDH trong 1 mL dung dịch glyxerin 50 % (theo thể tích) (4.11), pH của dung dịch thu được ở khoảng 7. Hoạt tính riêng của dung dịch L-lactat dehydrogenaza (L-LDH) nên ít nhất là 5500 đơn vị/mL ở 25 °C. Nếu không, phải chuẩn bị huyền phù L-LDH mới.

Dung dịch có thể bền được ít nhất 1 năm nếu bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

Khi sử dụng huyền phù này, nên thực hiện trong môi trường nhiệt độ khoảng ±10 °C.

4.17 Dung dịch D-lactat dehydrogenase (D-LDH) từ huyền phù Lactobacillus leichmannii

Hoà tan 5 mg huyền phù D-LDH trong 1 mL dung dịch amoni sulfat 3,2 mol/L (4.13). pH của dung dịch huyền phù thu được ở khoảng 6. Hoạt tính riêng của D - lactat dehydrogenaza (D-LDH) nên ít nhất là 1 500 đơn vị/mL ở 25 °C. Nếu không phải chuẩn bị huyền phù D-LDH mới.

Dung dịch huyền phù có thể giữ được ít nhất 1 năm nếu bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.

Khi sử dụng huyền phù này, nên thực hiện trong môi trường nhiệt độ khoảng ±10 °C.

4.18  Dung dịch đệm, pH = 10,0.

Cân 4,75 g glycylglycine (4.1) và 0,88 g axit L-glutamic (4.2) vào bình định mức dung tích 100 mL có sẵn khoảng 50 mL nước. Chỉnh đến pH 10,0 bằng khoảng 4,6 mL natri hydroxit 10 mol/L (4.8) và thêm nước đến vạch, lắc đều. Dung dịch đệm này bền được ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ 4 °C.

4.19  Dung dịch nicotinamit-adenin dinucleotit

Dùng cân phân tích (5.1) cân chính xác 420 mg NAD (4.14), hòa tan trong 12 mL nước. Dung dịch bền được ít nhất 4 tuần ở nhiệt độ 4 °C.

Khi sử dụng huyền phù này, nên thực hiện trong môi trường nhiệt độ khoảng ±10 °C.

4.20  Axit L-lactic, (C₃H₅O₃) tinh thể.

4.21  Dung dịch chuẩn gốc axit L-lactic, 1,0 mol/L.

Dùng cân phân tích (5.1) cân 9,008 g axit L-lactic (4.20), chính xác đến 0,0001 g vào bình định mức dung tích 100 mL (5.5), hoà tan và định mức đến vạch bằng bằng natri hydroxit 10 mmoI/L (4.8).

4.22  Dung dịch chuẩn làm việc axit L-lactic, 0,5 mmol/L.

Pha loãng 2000 lần dung dịch chuẩn axit L-lactic 1,0 mol/L (4.21) bằng natri hydroxit 10 mmol/L (4.8). Chuẩn bị dung dịch trước khi sử dụng.

4.23  Muối natri D-lactat (C₃H₅NaO₃).

4.24  Dung dịch chuẩn gốc axit D-lactic, 5 mmol/L.

Dùng cân phân tích (5.1) cân 0,056 g muối natri D-lactat (4.23), chính xác đến 0,0001 g vào bình định mức dung tích 100 mL (5.5), hoà tan và định mức đến vạch bằng nước.

4.25  Dung dịch chuẩn làm việc axit D-lactic, 0,5 mmol/L.

Pha loãng dung dịch chuẩn axit D-lactic 5 mmol/L (4.24) bằng nước với tỷ lệ 1:9 (thể tích). Chuẩn bị dung dịch trước khi sử dụng.

5 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và các thí bị, dụng cụ sau:

5.1 Cân phân tích, có độ chính xác đến ± 0,001 g; ± 0,0001 g.

5.2  Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS) có dải đo được bước sóng 340 nm.

5.3  Máy ly tâm tốc độ > 4000 r/min.

5.4  Giấy lọc, giấy lọc Whatman 0,45 μm hoặc tương đương.

5.5  Bình định mức, dung tích 10mL; 50 mL; 100 mL; 1000 mL.

5.6  Pipet, pipet thủy tinh chia vạch dung tích 1 mL; 2 mL; 10mL.

5.7  Micropipet các loại dung tích 100-1000 μL

6 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1  Lấy mẫu

Đối với mẫu phân bón bình thường, lấy mẫu theo TCVN 9486:2018. Đối với mẫu phân bón vi sinh, lấy mẫu theo TCVN 12105:2018.

6.2  Chuẩn bị mẫu

6.2.1  Mẫu dạng rắn

Mẫu dạng rắn được chuẩn bị theo TCVN 10683:2015 (ISO 8358:1991).

6.2.2  Mẫu dạng lỏng, huyền phù

6.2.2.1  Dạng lỏng: Mấu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được lắc đều.

6.2.2.2  Dạng huyền phù: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn đều.

7 Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

7.1.1  Dùng cân phân tích (5.1) cân khoảng 1 g đến 2 g (chính xác đến 0,001 g) mẫu đã được chuẩn bị (6.2.1 và 6.2.2.2). Đối với mẫu dạng lỏng (6.2.2.1), dùng pipet (5.6) hút khoảng 1 mL đến 2 mL dung dịch mẫu và cân chính xác để xác định khối lượng cho vào bình định mức dung tích 100 mL (5.5).

7.1.2  Thêm khoảng 30 mL nước ấm (40 °C đến 50 °C) khuấy đều hoặc siêu âm trong 10 min, để nguội đến nhiệt độ phòng.

7.1.3  Thêm tiếp vào dung dịch theo trật tự sau: 5,0 mL dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (4.4), 5,0 mL dung dịch kẽm sunfat (4.6) và 10,0 mL dung dịch natri hydroxit 0,1 mol/L. (4.9), lắc kỹ bình sau mỗi lần thêm. Thêm nước đến vạch 100 mL. Lắc kỹ, ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 min. Dung dịch thu được dùng để xác định axit lactic (dung dịch A).

7.1.4 Pha loãng dung dịch A sao cho hàm lượng axit lactic trong dung dịch mẫu thử chứa khoảng từ 20 mg/L đến 350 mg/L.

CHÚ THÍCH 1: Sử dụng mẫu pha loãng kể cả khi mẫu có màu nhạt.

7.1.5  Mẫu trắng được tiến hành đồng thời trong cùng một điều kiện với cùng một lượng các dung dịch và thuốc thử nhưng không chứa mẫu cần xác định.

7.2  Thử kiểm tra hoạt tính của thuốc thử

7.2.1  Bất kỳ mỗi mẻ thuốc thử mới (từ 4.16 đến 4.19) được chuẩn bị hoặc khi các thuốc thử đó đã được bảo quản trong tủ lạnh chưa sử dụng quá 2 tuần, hoặc khi tiếp tục phân tích sau một thời gian gián đoạn hoặc khi các điều kiện khác đều đáp ứng, thì tiến hành phân tích về độ thu hồi lactic.

7.2.2  Dùng pipet (5.6) hút 10 mL dung dịch axit L-lactic (4.22) cho vào hai bình định mức một vạch dung tích 100 mL (5.5), mỗi bình 10 mL. Dùng pipet (5.6) hút 10 mL dung dịch axit D-lactic (4.25) cho vào hai bình định mức một vạch dung tích 100 mL (5.5) khác. Xác định hàm lượng axit L-lactic và axit D-lactic của các dung dịch trong các cặp bình 100 mL, tiến hành như quy định trong 7.1.2, 7.1.3, 7.1.4 và 7.3.

7.2.3  Hàm lượng L-lactic và axit D-lactic được tính theo công thức (5) để đánh giá độ thu hồi của phương pháp. Nếu độ thu hồi không nằm trong khoảng 100 % ± 5 % thì cần kiểm tra lại thuốc thử, kỹ thuật thao tác, độ chính xác của pipet, các điều kiện của máy quang phổ hấp thụ phân tử. Lặp lại các kết quả để thu được kết quả phù hợp.

7.3  Xác định axit lactic bằng quang phổ hấp thụ phân tử

7.3.1  Quy trình thực hiện

Dùng pipet lấy các dung dịch lần lượt theo Bảng 1.

Bảng 1 - Quy trình thực hiện

Hàm lượng axit L- lactic hoặc D-lactic có thể xác định riêng rẽ bằng cách thêm L-LDH (4.16) hoặc D- LDH (4.17).

7.3.2  Tính độ chênh lệch hấp thụ quang A để tính trong công thức (4)

Độ chênh lệch hấp thụ quang A cần để tính trong công thức (5), được tính theo công thức (4):

trong đó

A_s60 là độ hấp thụ quang của dung dịch thử đo được trong 7.3.1 sau 60 min;

A_s0 là độ hấp thụ quang của dung dịch thử đo được trong 7.3.1;

A_s45 là độ hấp thụ quang của dung dịch thử đo được trong 7.3.1 sau 45 min;

Ab₆₀ là độ hấp thụ quang của dung dịch thử trắng đo được trong 7.3.1 sau 60 min;

Ab₀ là độ hấp thụ quang của dung dịch thử trắng đo được trong 7.3.1;

Ab₄₅ là độ hấp thụ quang của dung dịch thử trắng đo được trong 7.3.1 sau 45 min;

CHÚ THÍCH 2: Nếu độ hấp thụ quang tính được trong 7.3.2 tăng quá 0,500 đơn vị, thì lặp lại qui trình quy định trong 7.3.1, sử dụng độ pha loãng thích hợp của dịch lọc thu được từ phần mẫu thử (7.1.4) và cả dung dịch thử trắng (7.1.5).

8 Tính kết quả

8.1  Hàm lượng axit lactic, X, biểu thị bằng miligam trên kg (mg/kg) được tính theo công thức (5):

trong đó:

V₁ là thể tích cuối cùng (thể tích trong cuvet), tính bằng mililit (mL);

M là khối lượng phân tử của axit lactic (90,1 g/moL);

V₂ là thể tích của dung dịch mẫu thử, tính bằng mililit (mL);

L là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm):

ε hệ số hấp thụ phân tử của NADH ở 340 nm, tức là 6,3 x 10⁶ cm²/moL;

m lượng mẫu cân, tính bằng gam (g);

V thể tích dung dịch định đã chuẩn bị trong 6.3, tính bằng mililit (mL);

A là chênh lệch độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, tính được trong 7.3.2,
ε = 6,3 [l x mmol^-1 x cm^-1];

F là hệ số pha loãng.

8.2 Hàm lượng axit lactic, X’, biểu thị bằng phần trăm (%) được tính theo công thức (6)

trong đó:

10^-4 là hệ số chuyển đổi.

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của ít nhất hai lần thử được tiến hành song song. Nếu sai lệch giữa các lần thử lớn hơn 5% giá trị tương đối thì phải tiến hành thực hiện lại.

9 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;

b) Đặc điểm nhận dạng mẫu;

c) Kết quả thử nghiệm lấy chữ số có nghĩa sau dấu phẩy phù hợp với TCVN 9595-3:2013;

d) Mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn và các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) Ngày thử nghiệm.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin về hoạt chất axit lactic

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/612

[2] TCVN 8904:2011 (EN 12631:1999) Nước rau quả - Xác định hàm lượng axit D- và L-lactic (lactat) bằng enzym - Phương pháp đo phổ NAD

[3] TCVN 6836:2007 (ISO 8069:2005) Sữa bột - Xác định hàm lượng axit lactic và lactat